Name: Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 44 s
Description: Poznaj metodę sortowania jednokomórkowego mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich zębów mlecznych przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika FACS zapewnia 99% czystość izolowanych populacji komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Obiektowi Komórek Przepływowych w Centrum Zaawansowanych Badań Naukowych Jawaharlala Nehru, Bengaluru, Indie, za korzystanie z głównego urządzenia do cytometrii przepływowej. Kriosekcję hodowli osadów zróżnicowanych komórek przeprowadzono w Laboratorium Referencyjnym Neuberg Anand w Bengaluru w Indiach. Prace te były wspierane przez UC z Manipal Academy of Higher Education (MAHE) w Indiach. AG jest wdzięczna za wsparcie stypendium dr T. M. A. Pai od MAHE.

Fluorescence-Activated Single-Cell Sorting of Human Mesenchymal Stem Cells

<ol><li>Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+Identification%2C+phenotypic+characterization%2C+biological+properties+and+potential+for+regenerative+medicine+through+biomaterial+micro-engineering+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche.</a> Methods. 99, 62-68 (2016).</li>
<li>Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplicity+of+mesenchymal+stromal+cells%3A+finding+the+right+route+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multiplicity of mesenchymal stromal cells: finding the right route to therapy.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1112(2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+biological+characteristics+of+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+exfoliated+deciduous+teeth%2C+bone+marrow%2C+gingival+tissue%2C+and+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of the biological characteristics of human mesenchymal stem cells derived from exfoliated deciduous teeth, bone marrow, gingival tissue, and umbilical cord.</a> Molecular Medicine Reports. 18 (6), 4969-4977 (2018).</li>
<li>McLeod, C. M., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+and+impact+of+mesenchymal+stem+cell+heterogeneity%3A+new+insights+and+emerging+tools+for+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">On the origin and impact of mesenchymal stem cell heterogeneity: new insights and emerging tools for single cell analysis.</a> European Cells & Materials. 34, 217-231 (2017).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Wang, J., Liao, L., Wang, S., Tan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells-how+the+disease+process+impacts+clinical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Cell therapy with autologous mesenchymal stem cells-how the disease process impacts clinical considerations.</a> Cytotherapy. 15 (8), 893-904 (2013).</li>
<li>Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+mesenchymal+stem+cells+from+bone+marrow%2C+umbilical+cord+blood%2C+or+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue.</a> Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).</li>
<li>Dunn, C. M., Kameishi, S., Grainger, D. W., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+address+mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+heterogeneity+in+immunomodulatory+profiles+to+improve+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Strategies to address mesenchymal stem/stromal cell heterogeneity in immunomodulatory profiles to improve cell-based therapies.</a> Acta Biomaterialia. 133, 114-125 (2021).</li>
<li>Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+phenotype+and+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells+aging+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131(2018).</li>
<li>Costa, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+mesenchymal+stem+cells+from+natural+niches+to+culture+conditions%3A+implications+for+further+clinical+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (2), 447-467 (2021).</li>
<li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Fluorescence activated cell sorting.</a> Review of Scientific Instruments. 43 (3), 404-409 (1972).</li>
<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
<li>Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+for+purification+of+plasmacytoid+dendritic+cells+from+the+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Roda, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+stem+cell+tag-less+sorting+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel stem cell tag-less sorting method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (4), 420-427 (2009).</li>
<li>Hall, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+small+CD44-negative+mesenchymal+stem%2Fprogenitor+cells+from+human+bone+marrow+using+elutriation+and+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of small CD44-negative mesenchymal stem/progenitor cells from human bone marrow using elutriation and polychromatic flow cytometry.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (8), 567-578 (2013).</li>
<li>Eggleton, M. J., Sharp, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+counting+using+the+Coulter+electronic+counter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Platelet counting using the Coulter electronic counter.</a> Journal of Clinical Pathology. 16 (2), 164-167 (1963).</li>
<li>Porwit-Ksiazek, A., Aman, P., Ksiazek, T., Biberfeld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leu+7%2B+%28HNK-1%2B%29+cells.+II.+Characterization+of+blood+Leu+7%2B+cells+with+respect+to+immunophenotype+and+cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Leu 7+ (HNK-1+) cells. II. Characterization of blood Leu 7+ cells with respect to immunophenotype and cell density.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 18 (6), 495-449 (1983).</li>
<li>Hewitt, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+single+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells.</a> Cloning and Stem Cells. 8 (3), 225-234 (2006).</li>
<li>Singh, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protocol+for+single-cell+cloning+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An efficient protocol for single-cell cloning human pluripotent stem cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 11(2019).</li>
<li>Wilson, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+single-cell+functional+and+gene+expression+analysis+resolves+heterogeneity+within+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations.</a> Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).</li>
<li>Zhou, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mesenchymal+stem%2Fprogenitor+cells%3A+the+immunomodulatory+masters%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Inernational%22%5BJournal%5D)">Oral mesenchymal stem/progenitor cells: the immunomodulatory masters.</a> Stem Cells Inernational. 2020, 1327405(2020).</li>
<li>Fawzy El-Sayed, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells+explored+in+the+dental+field%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells explored in the dental field.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 130, 89-103 (2013).</li>
<li>Hardy, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+networks+in+single+perivascular+cells+sorted+from+human+adipose+tissue+reveal+a+hierarchy+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transcriptional networks in single perivascular cells sorted from human adipose tissue reveal a hierarchy of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 35 (5), 1273-1289 (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22FACSAria+Fusion+User%27s+Guide%22">FACSAria Fusion User's Guide</a>. , https://www.uk-essen.de/fileadmin/user_upload/IFZ/1_Institut/Zellsortierer/23-14816-01_BD_FACSAria_Fusion_ug.pdf (2018).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

W dziedzinie inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej, wśród źródeł pourodzeniowych, MSC pochodzące z tkanek jamy ustnej cieszą się dużym zainteresowaniem ze względu na ich minimalne zobowiązania etyczne i znaczny potencjał różnicowania wieloliniowego21. Komórki macierzyste miazgi zębowej (DPSC) z dotkniętego trzeciego zęba trzonowego i SHED przyciągnęły największą uwagę wśród stomatologów MSC ze względu na ich potencjał terapeutyczny w chorobach neurodegeneracyjnych i urazowych<sup class="x...

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mogą być uważane za skalowalne źródło komórek odpowiednich do terapii komórkowych i mogą być uważane za złoty standard w medycynie regeneracyjnej. Komórki te mogą być izolowane z różnych źródeł w organizmie o różnym pochodzeniu tkankowym1. W zależności od tkanki źródłowej, każdy typ MSC wykazuje niejednoznaczne zachowanie in vitro2. Widać to dobrze w ich właściwościach morfologicznych i funkcjonalnych3. Wiele badań wykazało wewnątrzklonalną zmienność wymiarów, w tym różnicowanie tkanek dorosłych, stan genomu oraz architekturę metaboliczną i komórkową MSCs2,4.
Immunofenotypowanie komórek było powszechnym zastosowaniem cytometrii przepływowej do identyfikacji komórek macierzystych i zostało wykorzystane przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowej i Genowej (ISCT) w 2006 roku do przepisania listy minimalnych kryteriów identyfikacji komórek jako MSC. Stwierdzono, że wraz z przyleganiem do plastiku i zdolnością do różnicowania się w trzy linie (osteogenną, chondrogeniczną i adipogenną) in vitro, ≥95% populacji komórek musi wykazywać ekspresję CD105, CD73, CD90, a komórki te muszą nie mieć ekspresji (≤2% dodatniej) CD34, CD45, CD11b, CD14 i HLA-DR, mierzonej za pomocą cytometrii przepływowej5. Chociaż MSCs zostały zdefiniowane za pomocą zestawu biomarkerów zgodnie z minimalnymi kryteriami ISCT, ich właściwości immunologiczne nie mogły być porównane z tymi biomarkerami i istniała potrzeba więcej niż te kryteria, aby ułatwić ilościowe porównania między badaniami i zmiany klonów2.
Pomimo wytycznych ustalonych przez ISCT, obszerne badania nad MSC wykazały, że w tej populacji istnieje heterogeniczność, która może wynikać z wielu czynników, głównie ze względu na wszechobecny charakter heterogeniczności powstającej między dawcami MSC6, źródła tkanek7, pojedyncze komórki w populacji klonalnej8, oraz warunki hodowli2,9,10. Charakterystyka i oczyszczanie tych pierwotnych komórek z różnych źródeł tkanek w celu zapewnienia jakości i losu komórek są kluczowymi etapami ich produkcji. Potrzeba zrozumienia wyświetlanych różnic w populacji wymaga skutecznej metody podziału na subpopulacje, które można podzielić i zebrać oddzielnie11. Analizy na poziomie pojedynczej komórki pomagają przezwyciężyć wyzwania związane ze zmiennością między komórkami, redukują szum biologiczny wynikający z niejednorodnej populacji oraz oferują możliwość badania i charakteryzowania rzadkich komórek12.
W oparciu o cel i wybrane parametry, można zastosować kilka metod do sortowania i wzbogacania wybranych populacji. Techniki sortowania komórek mogą obejmować zarówno metody sortowania zbiorczego, jak i sortowania jednokomórkowego. Podczas gdy sortowanie zbiorcze może wzbogacić populacje docelowe poprzez sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS)13, fractionation14 i elutriation15, sortowanie pojedynczych komórek może wzbogacić bardziej jednorodne populacje za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)11. W tabeli 1 przedstawiono analizę porównawczą każdej z tych metod wraz z własnym zestawem zalet i wad.
Tabela 1: Analizy porównawcze różnych technik: MACS, Frakcjonowania, Elutriacji i FACS podkreślające różnice w ich zasadzie oraz zalety i wady wyboru jednej techniki nad inną. Skróty: MACS = sortowanie komórek aktywowane magnetycznie; FACS = sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65723/65723_Table_1_.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Od czasu pojawienia się tej techniki, jednokomórkowa cytometria przepływowa odgrywa główną rolę w wyliczaniu16, wykrywaniu i charakterystyce określonej populacji komórek w heterogenicznej próbce17. Hewitt i in. w 2006 roku położyli podwaliny pod metodologię automatycznego sortowania komórek w celu zwiększenia izolacji jednorodnych pul zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC)18. Sortowanie pojedynczych komórek wzbogaciło populację hESC transdukowanych metodą GFP, ułatwiając izolację genetycznie zmodyfikowanych klonów, co otworzyło nowy wymiar badań klinicznych. Aby poprawić wydajność sortowania, zasadniczo stosuje się dwa podejścia; Albo pożywki zbiorcze posortowanych populacji są modyfikowane w celu utrzymania żywotności i proliferacji komórek po posortowaniu19 lub algorytm/oprogramowanie sortowania komórek jest odpowiednio modyfikowane12.
Wraz z postępem technologicznym, komercyjne cytometry przepływowe i sortery komórek były w stanie pomóc sprostać wyzwaniom, które zostały spełnione podczas aseptycznego sortowania delikatnych i rzadkich populacji komórek, zwłaszcza komórek macierzystych różnego pochodzenia. Jednym z głównych wyzwań biologów zajmujących się komórkami macierzystymi było klonalne wyizolowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych zgodnie z protokołami transfekcji wymaganymi w badaniach nad edycją genów19. Rozwiązano ten problem poprzez sortowanie pojedynczych komórek na 96-dołkowe płytki, które pokryto mysimi fibroblastami embrionalnymi (MEF) wraz z suplementami i dostępnymi na rynku małocząsteczkowymi inhibitorami ROCK. Jednak strategie izolacji komórek można w znacznym stopniu udoskonalić za pomocą sortowania indeksowego, funkcji algorytmu sortowania, która identyfikuje immunofenotyp poszczególnych komórek sortowanych12. Ta udoskonalona metoda sortowania pojedynczych komórek pomogła nie tylko w zwiększeniu wydajności sortowania komórek macierzystych, zwłaszcza w odniesieniu do rzadkich populacji krwiotwórczych komórek macierzystych, ale także skutecznie powiązała klony pojedynczych komórek z ich dalszymi testami funkcjonalnymi20.
Ten artykuł skupia się na sortowaniu pojedynczych komórek immunofenotypowanych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych (SHEDs) w celu wzbogacenia subpopulacji w celu zbadania ich funkcjonalnych zdolności różnicowania. Korzystając z kombinacji dwóch markerów MSC-dodatnich, CD90 i CD73, oraz ujemnego markera hematopoetycznego CD45, MSCs poddano immunofenotypowaniu i zidentyfikowano ekspresory dim i zero. Na podstawie ich immunofenotypu subpopulacje zidentyfikowano jako czyste MSC, populacje pojedyncze dodatnie i podwójnie ujemne. Zostały one posortowane przy użyciu trybu sortowania pojedynczych komórek, aby uzyskać czyste i wzbogacone subpopulacje do dalszych badań funkcjonalnych w celu określenia, czy zróżnicowana ekspresja markerów była artefaktem warunków hodowli in vitro, czy też ma również jakikolwiek wpływ na właściwości funkcjonalne. Komórki, które nie były jednorodnymi ekspresjami "dodatnich markerów MSC", zostały posortowane w celu zbadania ich właściwości funkcjonalnych.

<table><tbody><tr><td>Alcian Blue Stain</td><td>HiMedia</td><td>CCK029-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100x)&nbsp;</td><td>Gibco by ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, &kappa;/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 &micro; m) Zestaw cząstek</td><td>BD Biosciences</td><td>560497</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Accudrop Beads&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td>Służy do ustawiania opóźnienia lasera po otwarciu modułu sortowania.</td></tr><tr><td>BD FACS Aria Fusion Flow cytometr</td><td>BD Biosciences</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva 9.4</td><td>BD Biosciences</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Płyn osłonowy</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td>Używany jako płyn osłonkowy zarówno do analizy, jak i sortowania eksperymentów w BD FACSAria Fusion</td></tr><tr><td>BD FACSDiva CS& T Koraliki badawcze</td><td>BD Biosciences</td><td>655050</td><td>Służy do konfiguracji instrumentu w zależności od rozmiaru dyszy.</td></tr><tr><td>Mysz BD Horizon V450 Anti-Human CD44</td><td>BD Biosciences</td><td>561292</td><td></td></tr><tr><td>Mysz BD Horizon V450 IgG2b itp.; Kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>560374</td><td>Izotyp CD44-V450</td></tr><tr><td>BD Pharmingen APC Mysz Anti-Human CD105</td><td>BD Biosciences</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen APC Mysz IgG1 i kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>555751</td><td>CD105-APC izotyp</td></tr><tr><td>BD Pharmingen DAPI Solution</td><td>BD Biosciences</td><td>564907</td><td>DAPI Roztwór podstawowy 1 mg/ml</td></tr><tr><td>BD Pharmingen FITC Mysz anty-ludzka CD90</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen FITC Mysz IgG1, &kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>555748</td><td>CD90-FITC izotyp</td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE Mysz anty-ludzka CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>555483</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE Mysz IgG1 i kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>555749</td><td>CD45-PE izotyp</td></tr><tr><td>BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mysz Anti-Human CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>561260</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mysz IgG1, &kappa; Kontrola izotypu</td><td>BD Biosciences</td><td>550795</td><td>Izotyp CD73-PerCP-Cy 5,5</td></tr><tr><td>BD Pharmingen Oczyszczona mysia antywimentyna</td><td>BD Biosciences</td><td>550513</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Hi-Media&nbsp;</td><td>TC548-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kryształowy fiolet</td><td>Nice chemical pvt ltd&nbsp;</td><td>C33809</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td>Sigma-aldrich&nbsp; &nbsp;</td><td>D5652-50L</td><td>dPBS używany do prac hodowlanych i konserwacji.</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy&nbsp;</td><td>---</td><td>---</td><td>Służy do ogólnej sterylizacji.</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Gibco firmy ThermoFisher&nbsp;</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (H + L) z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>KO-DMEM</td><td>Gibco firmy ThermoFisher&nbsp;</td><td>10829018</td><td>Pożywka bazowa dla niezróżnicowanych hESC, stosowana do przygotowania pożywek hodowlanych</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM (100x)</td><td>Gibco by ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, do biologii molekularnej&nbsp;</td><td>Hi-Media&nbsp;</td><td>MB113</td><td></td></tr><tr><td>Czerwony olejowy O</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>CCK013-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>loba chemie</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina Streptomycyna (100x)</td><td>Gibco firmy ThermoFisher&nbsp;</td><td>15140- 122</td><td></td></tr><tr><td>Falloidyna (odczynnik ActinGreen 488 ReadyPromes)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>R37110</td><td></td></tr><tr><td>Azotan srebra</td><td>HiMedia&nbsp;</td><td>MB156-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu pentahydrat</td><td>Chemport</td><td>10102-17-7</td><td></td></tr><tr><td>Sphero Tęczowe cząstki fluorescencyjne, 3,0 - 3,4 i mikro; m</td><td>BD Biosciences</td><td>556291</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do barwienia&nbsp;</td><td>Sporządzono w MIRM&nbsp;</td><td>----</td><td>Został przygotowany przy użyciu 2% FBS w PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>StemPro Adipogeneza Różnicowanie Podłoża podstawowe&nbsp;</td><td>Gibco firmy ThermoFisher&nbsp;</td><td>A10410-01</td><td>Pożywki podstawowe dla pożywek adipogennych</td></tr><tr><td>StemPro Adipogenesis Suplement</td><td>Gibco firmy ThermoFisher&nbsp;</td><td>A10065-01</td><td>Pożywki indukcyjne do pożywek adipogennych</td></tr><tr><td>StemPro Chondrogenesis</td><td>Suplement Gibco firmy ThermoFisher&nbsp;</td><td>A10064-01</td><td>Pożywka indukcyjna do pożywek chondrogennych</td></tr><tr><td>StemPro Osteogenesis Suplement</td><td>Gibco firmy ThermoFisher&nbsp;</td><td>A10066-01</td><td>Pożywki indukcyjne dla pożywek osteoogennych</td></tr><tr><td>StemPro Osteogeneza/Chondrogeneza Różnicowanie Podłoża podstawowe&nbsp;</td><td>Gibco firmy ThermoFisher&nbsp;</td><td>A10069-01</td><td>Pożywki bazowe zarówno dla pożywek ostegenicznych, jak i chondrogennych</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Hi-Media&nbsp;</td><td>MB031</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy&nbsp;</td><td>Gibco od life technologies&nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna - Roztwór EDTA 1x</td><td>Hi-media&nbsp;</td><td>TCL049</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>MERCK&nbsp;</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

Single-Cell Sorting of Immunophenotyped Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) organizmu posiadają niezwykłą zdolność do różnicowania się w wiele linii dorosłych komórek w ciele i są znane ze swoich właściwości immunomodulujących i przeciwzapalnych. Wykorzystanie tych komórek macierzystych jest dobrodziejstwem dla dziedziny biologii regeneracyjnej, ale jednocześnie zmorą dla medycyny regeneracyjnej i terapii ze względu na wiele niejasności komórkowych z nimi związanych. Niejasności te mogą wynikać z różnorodności źródeł pochodzenia tych komórek macierzystych oraz z warunków ich wzrostu in vitro, które odbijają się na ich funkcjonalnej niejednorodności.
To gwarantuje metodologie dostarczania oczyszczonych, jednorodnych populacji MSCs do zastosowań terapeutycznych. Postępy w dziedzinie cytometrii przepływowej umożliwiły wykrywanie populacji pojedynczych komórek przy użyciu podejścia wieloparametrycznego. Protokół ten określa sposób identyfikacji i oczyszczania komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych (SHED) poprzez sortowanie pojedynczych komórek wspomagane fluorescencją. Jednoczesna ekspresja markerów powierzchniowych, a mianowicie izotiocyjanianu fluoresceiny CD90 (FITC), białka CD73-perydyniny-chlorofilu (PerCP-Cy5.5), CD105-allofikocyjaniny (APC) i CD44-V450, zidentyfikowała "jasne", dodatnie ekspresory MSC za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej. Zaobserwowano jednak znaczny spadek odsetka poczwórnych ekspresorów tych dodatnich markerów od pasażu 7 i nowszych pasaży.
Subpopulacje poddane immunofenotypowaniu zostały posortowane przy użyciu trybu sortowania pojedynczej komórki, gdzie tylko dwa pozytywne i jeden negatywny marker stanowiły kryteria włączenia. Metodologia ta zapewniła żywotność posortowanych populacji i utrzymała proliferację komórek po sortowaniu. Dalsza aplikacja do takiego sortowania może być wykorzystana do oceny zróżnicowania specyficznego dla linii dla bramkowanych subpopulacji. Podejście to można zastosować do innych systemów jednokomórkowych w celu poprawy warunków izolacji i uzyskania informacji o markerach na powierzchni wielu komórek.

Charakterystykę komórek SHEDs przeprowadzono za pomocą standardowych testów immunofluorescencji, które wykazały ekspresję wimentyny (kolor czerwony, filamenty pośrednie typu III), filamentów aktynowych (sondy Alexa fluor 488 Phalloidin) oraz jąder komórkowych barwionych DAPI (Rysunek 1A). W celu oszacowania ich zdolności do proliferacji i tworzenia kolonii przeprowadzono standardowe krótkoterminowe testy wzrostu komórek. 14,3-krotny wzrost tempa proliferacji od 2. do 8. dnia przedstawiono na...

Ten protokół opisuje zastosowanie aktywowanego fluorescencją sortowania komórek ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych przy użyciu metody sortowania pojedynczych komórek. W szczególności zastosowanie sortowania pojedynczych komórek może osiągnąć 99% czystość komórek immunofenotypowanych z niejednorodnej populacji w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrycznej cytometrii przepływowej.

Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

The mesenchymal stem cells (MSCs) of an organism possess an extraordinary capacity to differentiate into multiple lineages of adult cells in the body and ...

Protokół ten szczegółowo opisuje kluczową metodę dokładnego charakteryzowania i oczyszczania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych na jednej platformie, umożliwiając efektywne dalsze zastosowania, takie jak przeszczep komórek macierzystych. Jest to szczególnie istotne dla laboratoriów klinicznych usprawniających testy molekularne i cytogenetyczne poprzez precyzyjne sortowanie pojedynczych komórek zmodyfikowanych lub naturalnych komórek macierzystych. Powszechnie stosowane metody izolacji oczyszczonych populacji komórek macierzystych odnoszą się do technik takich jak separacja immunomagnetyczna, gradient gęstości lub mikroprzepływowe sortowanie komórek.Technika taka jak sortowanie indeksowe pozwala na powiązanie jej z profilowaniem RNA pojedynczej komórki, które może wyodrębnić informacje transkryptomiczne z każdej posortowanej komórki. Kluczowe wyzwania obejmują utrzymanie jakości próbki, optymalizację warunków hodowli komórkowych, w tym gęstości komórek i żywotności w trakcie i po sortowaniu. Dodatkowo rozważany byłby również wybór odpowiednich rozmiarów dysz dla urządzenia i zapewnienie terminowego dostępu do sortowników.Protokół ten ilustruje precyzyjny panel barwienia do immunofenotypowania i sortowania pożądanej populacji komórek. Zapewnia ustandaryzowaną jakość próbki, optymalną gęstość żywotności komórek dla sortowania populacji komórek i definiuje eksperymentalne parametry sortowania w oprogramowaniu FACSDiva. Metoda ta umożliwia prostą selekcję i immunofenotypowanie populacji komórek macierzystych wykazujących ekspresję określonych biomarkerów.Ta prosta platforma umożliwia wydajne sortowanie w oparciu o populację docelową, pomagając i uzyskując oczyszczone próbki do kolejnych zastosowań. Na początek umieść mezenchymalne komórki macierzyste w kolbach T75, 100-milimetrowych szalkach i dwóch 48-dołkowych płytkach do wszystkich eksperymentów. Dodaj 200 mikrolitrów 10% pożywki hodowlanej MSC do dołków 48 płytek dołkowych.Gdy monowarstwa komórki osiągnie 90% konfluencji, zastąp istniejące pożywki z wyznaczonych studzienek kontrolnych 2% pożywką surowicy. Dodaj pożywki różnicujące o linii adipogennej lub osteogennej do dwóch ostatnich studzienek oznaczonych testem. Tego samego dnia spróbuj sprepsynizować zlewającą się naczynie o średnicy 100 mm i przenieś zawiesinę komórek do dwóch oznaczonych 15-mililitrowych probówek.Odwirować probówki o stężeniu 300 G przez sześć minut. Następnie odpipetować dwa mililitry odpowiedniego podłoża do probówki kontrolnej i probówki. Umieść luźno zakorkowane probówki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza poniżej 5% dwutlenku węgla na 21 dni, z wymianą pożywki co trzy dni.SHED scharakteryzowano za pomocą standardowych testów immunofluorescencyjnych wykazujących ekspresję wimentyny, filamentów aktynowych i jąder barwionych DAPI. Krótkoterminowe testy wzrostu komórek wykazały zwiększone tempo proliferacji od drugiego do ósmego dnia. Test jednostki tworzącej kolonię i barwienie fioletem krystalicznym potwierdziły zdolność SHED do tworzenia kolonii po 14 dniach.Aby wybarwić linię adipocytów 2D, dodaj 200 mikrolitrów roztworu przepuszczalnego z zestawu na płytkę. Następnie inkubuj komórki w 200 mikrolitrach roztworu roboczego Oil Red O przez 10 minut. Następnie po usunięciu plamy umyj komórki pięć razy 200 mikrolitrami wody destylowanej.Aby zabarwić linię osteoblastów 2D, dodaj 200 mikrolitrów 5% świeżego azotanu srebra do każdej studzienki. Następnie umieść płytkę w świetle ultrafioletowym na godzinę. Inkubować komórki w 200 mikrolitrach 2,5% tiosiarczanu sodu przez pięć minut przed płukaniem wodą destylowaną.W przypadku kultur 3D najpierw uzyskaj sekcje kriogeniczne kultur granulowanych. Aby zabarwić komórki linii chondrocytów, dodaj od jednego do dwóch mililitrów roztworu myjącego do wysuszonych na powietrzu sekcji. Następnie inkubuj je w roztworze utrwalającym przez 30 minut.Po umyciu wodą destylowaną umieść komórki w jednym do dwóch mililitrów roztworu barwiącego na 30 minut. Przepłucz komórki trzykrotnie 0,1 zwykłym kwasem solnym przed spłukaniem wodą destylowaną. Po 21 dniach MSCs w warunkach in vitro różnicowały się w adipocyty, osteoblasty i linie kondregenne.Na początek odwiruj trypsynizowane mezenchymalne komórki macierzyste w stężeniu 300 G przez sześć minut, aby uzyskać osad komórkowy. Następnie ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki MSC przed zliczeniem komórek. Ponownie odwirować zawiesinę komórkową.Następnie, po odrzuceniu supernatantu, ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu barwiącyego. W celu przygotowania kontroli kompensacji oznacz siedem probówek FACS jako niebarwione, DAPI, V450, FIT, PE, PerCP Cy5.5 i APC. Następnie przygotuj pojedyncze rurki barwiące do kompensacji i inkubuj je w ciemności przez 30 minut.Po inkubacji umyj komórki w każdej probówce dwa razy, a kulki jeden raz jednym mililitrem buforu barwiącego. Następnie odwirować zwirowane probówki o sile 200 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu barwiącego.Inkubować probówkę DAPI w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie 15-minutową inkubację na lodzie w celu wywołania włączenia barwnika. Dodać pięć mikrolitrów DAPI do zawiesiny i inkubować aż do nabycia. Przygotuj zawiesinę komórek i przeciwciał w pięciu znakowanych probówkach FACS zgodnie z tabelą.Delikatnie zwiruj rurki przed inkubacją. Następnie umyj każdą probówkę dwa razy jednym mililitrem buforu barwiącego. Odwirować zwirowaną probówkę o stężeniu 200 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie ponownie zawieś pozostały granulat w 500 mikrolitrach buforu barwiącego. Na początek oznacz dwie nowe probówki FACS jako probówki mieszane pierwsza i druga. Przygotować zawiesinę komórek i przeciwciał zgodnie z podaną tabelą do analizy cytometrii przepływowej.Po inkubacji probówek przez 30 minut, umyj każdą probówkę dwa razy jednym mililitrem buforu barwiącego. Odwirować zwirowane probówki o stężeniu 200 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach buforu barwiącego.Pokryj dołki 48-dołkowej płytki 200 do 500 mikrolitrami FBS i trzymaj przez godzinę. Następnie pipetować od 200 do 500 mikrolitrów pożywki 10% MSC po usunięciu resztek FBS. Aby przygotować próbki do sortowania jednokomórkowego, należy odpipetować jeden mililitr FBS do dwóch nowych probówek FACS.Zwiń rurki, aby uzyskać równomierną warstwę FBS na wewnętrznej powierzchni tuby. Przygotuj zawiesinę komórek i przeciwciał w mieszanych probówkach pierwszej i drugiej zgodnie z tabelą do eksperymentu sortowania. Następnie inkubuj probówki w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Po umyciu buforem barwiącym odwirować probówki o stężeniu 200 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach buforu barwiącego i inkubuj przez 15 minut w pięciu mikrolitrach DAPI przed sortowaniem. Aby skonfigurować matrycę kompensacyjną, użyj pojedynczych rurek kompensacyjnych plam.Kliknij na eksperyment na pasku narzędzi w oprogramowaniu instrumentu. Następnie kliknij Ustawienia wynagrodzeń, a następnie utwórz kontrolki wynagrodzeń. Następnie kliknij niezabarwioną probówkę, a następnie parametry w oknie dialogowym cytometru.Dostosuj napięcia, edytując wartości dla każdego parametru. Kliknij załaduj na pulpicie nawigacyjnym pobierania, a następnie kliknij nabierz. Przeciągnij bramkę P1 do populacji komórek i zastosuj ją do wszystkich elementów sterujących kompensacją, aby ustawić napięcie i bramkę ujemną dla każdego parametru.Teraz załaduj pojedyncze rurki do kompensacji plam pojedynczo. Zapisz dane i zapisz je. Wybierz bieżący eksperyment, kliknij go prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Oblicz wartości wynagrodzenia, a następnie połącz i zapisz.Uruchom mieszaną probówkę i nagraj 10 000 komórek. Ustaw bramki w interesującej populacji, które mają być sortowane za pomocą odpowiedniej strategii bramkowania. Następnie załaduj płytkę zbiorczą do urządzenia i ustaw docelową liczbę komórek w zakresie od 2 500 do 5 000 komórek na studzienkę.Następnie wybierz maskę czystości sortowania pojedynczej komórki. Zbierz posortowane populacje komórek w urządzeniu do zbierania, trzymając je na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu sortowania. Na koniec przenieś płytki do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla, aby utrzymać kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wykresy wieloparametrycznej cytometrii przepływowej nie wykazały ekspresji izotypu FITC przeciwciał CD90 FITC. Dodatnia ekspresja markerów CD90 i CD73 oraz ujemna ekspresja CD45 są porównywalne z ich niebarwionymi i FMO kontrolami. Fenotypy immunologiczne wykazały rozkład markerów z jednego z wczesnych pasaży z markerami zalecanymi przez ISCT i CD44, określając populacje rodzicielskie jako MSC.Szopy z późnym przejściem były używane do sortowania pojedynczych komórek ekspresorów o wysokiej i ciemnej średnicy. Posortowane komórki zebrane na 48-dołkowej płytce wykazywały przyleganie i proliferację, podobnie jak ich populacja rodzicielska. Komórki posortowane po zróżnicowaniu różnicowały się w obecności adipogennych czynników wzrostu.

single-cell-sorting-immunophenotyped-mesenchymal-stem-cells-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) szczura wyizolowano z kości udowych i piszczeli, a następnie wzbogacono za pomocą magnetycznej separacji komórek. Ekspresję markerów powierzchniowych w posortowanych komórkach potwierdzono metodą cytometrii przepływowej. Komórki te hodowano również w gęstości klonalnej w celu utworzenia pojedynczych kolonii, które następnie oddzielono za pomocą cylindrów do klonowania.

Izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) szczura oraz separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania zróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które są zaangażowane w ostateczną endodermę w celu poprawy dalszych zastosowań i dalszego różnicowania.

Szybka i skuteczna metoda oczyszczania komórek endodermy generowanych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje przejściową inżynierię genetyczną komórek macierzystych zębów pobranych z ludzkiego mieszków zębowych. Zastosowana strategia modyfikacji niewirusowej może stać się podstawą do udoskonalenia terapeutycznych produktów z wykorzystaniem komórek macierzystych.

Izolacja, charakterystyka i modyfikacja genetyczna ludzkich komórek pęcherzyków zębowych w oparciu o mikroRNA

Tutaj prezentujemy strategię immunofenotypowania do charakterystyki różnicowania megakariocytów i pokazujemy, jak ta strategia pozwala na sortowanie megakariocytów na różnych etapach za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją. Metodologia ta może być stosowana do pierwotnych tkanek ludzkich, ale także do megakariocytów wytwarzanych w hodowli in vitro.

Immunofenotypowanie i sortowanie komórek ludzkich MK ze źródeł pierwotnych u ludzi lub zróżnicowanych in vitro z progenitorów hematopoetycznych

Obecny protokół przedstawia szybką, efektywną i delikatną metodę izolowania pojedynczych komórek odpowiednich do analizy sekwencyjnego RNA pojedynczej komórki z ciągle rosnących siekaczy, mysich zębów trzonowych i ludzkich zębów.

Szybka izolacja pojedynczych komórek z zębów myszy i ludzi

Ten protokół kładzie nacisk na ekstrakcję, hodowlę i zachowanie multipotencjalnych komórek macierzystych z miazgi zębowej poprzez trawienie enzymatyczne. Dodatkowo wykazano ich potencjał do różnicowania się w osteoblasty, adipocyty i chondrocyty, podkreślając znaczenie precyzji i spójności w tym procesie.

Izolacja, hodowla i charakterystyka komórek macierzystych miazgi zębowej z ludzkich zębów mlecznych i stałych

Mezenchymalne komórki macierzyste ze szpiku kostnego szczęki pełnią znaczące funkcje w różnorodnym różnicowaniu, samoodnawianiu i modulacji immunologicznej. Stały się one kluczowym rezerwuarem komórek prekursorowych w terapii genowej, inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. W tym miejscu przedstawiamy unikalną metodę izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szczęki u szczurów.

Technika izolacji i hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szpiku szczurów

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Ten protokół opisuje metodę sortowania opartą na magnesowych kulkach z wykorzystaniem przeciwciał cytometrii przepływowej oznaczonych fykoerytryną (PE) i przeciwciał anty-PE w celu izolacji określonych subpopulacji komórek macierzystych mezenchymalnych o wysokiej dodatniości markera posortowania i zachowanej proliferacji/aktywności metabolicznej opartej na CCK-8 w badanych warunkach, bez konieczności stosowania drogich sorterów komórkowych lub specyficznych dla celu niestandardowych kulek.

Izolacja i Walidacja Podpopulacji Komórek Macierzystych Mezenchymalnych Pozytywnych na Podoplaniny za Pomocą Pośredniej Strategii Używającej Magnesycznych Cząstek

Poznaj metodę sortowania jednokomórkowego mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich zębów mlecznych przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika FACS zapewnia 99% czystość izolowanych populacji komórkowych.

Sortowanie jednokomórkowe immunofenotypowanych mezenchymalnych komórek macierzystych z ludzkich złuszczonych zębów mlecznych

Przeglądaj więcej filmów