Name: Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnej izolacji mikroglii, oligodendrocytów i innych komórek OUN od myszy z EAE. Protokół umożliwia analizę sieci komórkowych i ścieżek zapalnych przy zmniejszonej liczbie zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Figurki zostały stworzone przy użyciu Adobe Illustrator (wersja 2023) i Servier Medical Art (https://smart.servier.com). Antonię Henes wspierała fundacja Jürgen Manchot Stiftung.

Isolating All CNS Resident Cell Types Simultaneously from Autoimmune Mice

Wszyscy autorzy deklarują, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Do tej pory metody mapowania komórek rezydujących w OUN ex vivo poprzez połączenie spektrometrii mas i sekwencjonowania RNA oferują bardzo precyzyjne profilowanie komórkowe w zdrowiu i chorobie, ale wymagają ambitnej wiedzy technicznej i doświadczenia w tej dziedzinie50,51. Ponadto nie pozwalają na analizy funkcjonalne i są bardzo drogie. Poza tym mikroprzepływowe systemy typu brain-on-a-chip zapewniają szybkie i niedrogie badania przesiewowe pod kątem mechanizmów chorobowych oraz testowanie nowych podejść terapeutycznych z ograniczeniem wzrostu i migracji komórek 52,53,54,55. Organoidy OUN mogą również stanowić równoważną alternatywę w przyszłości do badania modelowania komórkowego, połączeń międzykomórkowych i interakcji podczas przebiegu choroby 56,57,58,59. Jednak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i magnetycznie jest obecnie najskuteczniejszą metodą generowania czystych i żywotnych zawiesin jednokomórkowych ex vivo 35,60,61. Nawet jeśli inne ustalone protokoły produkcyjne dotyczące izolacji typów komórek rezydujących w OUN są podobne w odniesieniu do poszczególnych etapów izolacji magnetycznej i wcześniejszej dysocjacji komórek, przewiduje się je przeprowadzić dla każdego typu komórek osobno. W przeciwieństwie do tego, obecny protokół integruje różne metody izolacji dla każdego typu komórek rezydujących w OUN w logicznym kontekście, tak aby można je było wykonywać jednocześnie i z jednej zawiesiny komórek OUN (Tabela 1, Tabela 2). W ten sposób umożliwia analizy multiomiczne z pojedynczej zawiesiny komórek OUN, a ostatecznie eksplorację złożonych sieci neuronowych. Nawet jeśli nie jest konieczne zebranie kilku tkanek od wielu zwierząt w celu wykonania tego protokołu, to połączenie zapewnia odpowiednią liczbę izolowanych komórek do dalszej analizy. Wykorzystanie różnych myszy do izolacji pojedynczych typów komórek wykluczyłoby możliwość analizy potencjalnych interakcji komórkowych. Poza tym połączenie indywidualnych metod izolacji dla różnych typów komórek OUN, z których wszystkie są zgodne z wcześniejszą dysocjacją OUN, pozwala zaoszczędzić koszty materiałowe dzięki zastosowaniu jednej zdysocjowanej zawiesiny komórek OUN dla wszystkich kolejnych etapów izolacji magnetycznej. Dodatkowo zminimalizowane jest potencjalne odchylenie techniczne spowodowane użyciem różnych myszy.
Jednym z ograniczeń protokołu może być prawie wyłączne użycie samic myszy C57BL/6J. Protokół szczepień EAE został zaprojektowany i ustalony dla samic myszy, więc ten protokół izolacji komórek został wdrożony również u samic myszy C57BL / 6J. Niemniej jednak naiwne samce myszy zostały również wykorzystane podczas opracowywania tego protokołu, nie rozpoznając żadnego wpływu na wynikową liczbę komórek lub czystość. Kolejne ograniczenie wpływa na magnetyczną izolację komórek neuronów, ponieważ nie ma specyficznych mikrokulek do izolacji neuronów pod względem selekcji pozytywnej. Założono, że czystą zawiesinę jednokomórkową można uzyskać poprzez znakowanie biotyną i zubożenie wszystkich komórek nieneuronalnych (tab. 2). Założenie to zostało zweryfikowane poprzez zastosowanie NeuN jako specyficznego markera jądrowego dla neuronów, zintegrowanego ze wspomnianym panelem czystości cytometrii przepływowej. Kolejne ograniczenie dotyczy izolacji mikrogleju u myszy EAE. W tym przypadku wynikowa wydajność komórek jest zmniejszona w porównaniu z innymi typami komórek ze względu na dodatkowy etap sortowania po protokole MACS. Co więcej, można argumentować, że sortowanie zwiększa naprężenia mechaniczne mikrogleju w porównaniu z innymi populacjami komórek. Indywidualne strategie sortowania mogą prowadzić do różnej wydajności komórek. Jeśli liczba izolowanych komórek jest mniejsza niż oczekiwana lub pożądana, zaleca się dostosowanie konfiguracji bramkowania i/lub poprawę dyskryminacji żywych/martwych.
Krytycznym krokiem w protokole jest usuwanie gruzu. Gradient musi być nakładany bardzo powoli i delikatnie, aby utworzyć trzy pożądane oddzielne fazy (rysunek 2A). Tylko wtedy, gdy mielina i inne pozostałości w dwóch górnych fazach zostaną całkowicie usunięte (ryc. 2E), można wytworzyć czyste zawiesiny jednokomórkowe i zmniejszyć dalsze zanieczyszczenie. Jeśli powstałe zawiesiny komórkowe nie mają czystości, jest to prawdopodobnie ta sekcja protokołu, która powinna zostać poprawiona w pierwszej kolejności, obok zapewnienia prawidłowego użycia wszystkich mikrokulek.
Uzyskanie wysokiego poziomu czystości i żywotności może być wyzwaniem w tego typu eksperymencie. Oto kilka zaleceń dotyczących rozwiązywania problemów:
-Praca w sterylnych warunkach jest obowiązkowa, aby zapobiec zanieczyszczeniu różnych mikrokulek i umożliwić wielokrotne użycie, zwłaszcza do późniejszej uprawy. -Zdecydowanie zaleca się oznakowanie każdej tuby, aby zapobiec pomieszaniom. -Unikać stosowania niechłodzonych odczynników/. Przechowuj wszystkie zawiesiny komórek na lodzie podczas całego eksperymentu, aby zapewnić wysoką żywotność. -Utrzymuj czas między różnymi krokami pracy tak krótki, jak to możliwe. W protokole nie ma określonej części, w której zaleca się wstrzymanie eksperymentu. -Bardzo istotne jest przestrzeganie określonych okresów inkubacji.
Podsumowując, ten obecny protokół jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN z jednej repliki OUN oferuje możliwość analizy złożonych sieci neuronalnych i szlaków neurozapalnych ex vivo z jednej zawiesiny komórek OUN. W ten sposób komórki rezydujące w OUN mogą być badane na różnych etapach przebiegu choroby, np. podczas zapalenia nerwów, neurodegeneracji i/lub remisji w EAE. Co więcej, interakcje komórka-komórka i szlaki biochemiczne mogą być badane na poziomie indywidualnym, a zmienność w grupach eksperymentalnych może zostać zmniejszona. Istnieje również możliwość hodowli frakcji wyizolowanych komórek OUN w monokulturach w celu dalszych testów funkcjonalnych i walidacji. Podsumowując, protokół ten oferuje znaczące postępy, które mogą mieć wpływ na podejścia do badań przedklinicznych i klinicznych.

Stwardnienie rozsiane (SM) jest przewlekłą autoimmunologiczną chorobą zapalną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) charakteryzującą się demielinizacją, uszkodzeniem aksonów, glejozą i neurodegeneracją. Pomimo licznych podejść badawczych w tej dziedzinie, patofizjologia stwardnienia rozsianego nadal nie jest w pełni poznana1,2,3,4. Najpowszechniejszym modelem zwierzęcym do badania stwardnienia rozsianego jest eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) wywołane peptydem glikoproteiny oligodendrocytów mieliny 35-55 (MOG35-55), które ma wiele wspólnych cech klinicznych i patofizjologicznych5,6,7,8,9. Opiera się na odpowiedzi układu odpornościowego na antygeny specyficzne dla OUN, co prowadzi do stanu zapalnego, demielinizacji i zwyrodnienia neuroaksonów. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest odpowiednim modelem do badania szlaków neurozapalnych i kaskad sygnałowych występujących w stwardnieniu rozsianym.
Obecne opcje terapii stwardnienia rozsianego są tylko częściowo skuteczne i koncentrują się głównie na początkowej fazie zapalnej choroby. Jednak neurodegeneracyjny komponent SM wydaje się być głównym wyzwaniem dla długoterminowych podejść terapeutycznych. W związku z tym potrzebne są powtarzalne i precyzyjne protokoły izolacji komórek, aby kompleksowo zbadać mechanizmy molekularne i komórkowe w chorobach autoimmunologicznych. Nawet jeśli istnieją pewne protokoły izolacji jednego typu komórki10,11,12,13,14,15, istnieje niezaspokojona potrzeba jednoczesnej izolacji kilku populacji komórek rezydujących w OUN jednocześnie. Poprzednie protokoły izolacji komórek rezydujących w OUN nie zapewniały zachowania funkcjonalności i czystości komórek, co skutkowało współhodowlą z sąsiednimi komórkami16,17,18 lub nieprzydatność do złożonych analiz sieci wewnątrzkomórkowych ex vivo19,20,21,22.
Celem tego protokołu było ustanowienie powtarzalnej i wszechstronnej metody jednoczesnej izolacji czystych, żywotnych jednokomórkowych zawiesin wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN, stosowanych u dorosłych, zdrowych myszy i EAE. Różne typy komórek zostały wyizolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS)23. Separacja komórek może być osiągnięta albo przez selekcję pozytywną, tj. Znakowanie magnetyczne markerów powierzchniowych specyficznych dla typu komórki, albo przez selekcję negatywną poprzez biotynylację i zubożenie wszystkich niepożądanych komórek. Zastosowano cytometrię przepływową w celu zapewnienia czystości powyżej 90% i żywotności co najmniej 80% izolowanych zawiesin jednokomórkowych.
Podsumowując, głównym celem było ustanowienie protokołu do jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN jako wszechstronnego narzędzia do badania szlaków neurozapalnych, oferującego kompleksową i precyzyjną analizę złożonych sieci komórkowych i biochemicznych kaskad sygnalizacyjnych u zdrowych myszy i myszy EAE.

<table><tbody><tr><td>70 &mu; m sitka komórkowe</td><td>Corning, MA, USA</td><td>352350</td><td>Dysocjacja tkanek OUN</td></tr><tr><td>ACSA-2 Przeciwciało, anty-mysie, PE-Vio 615 (klon REA-969)</td> <td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-116-244</td><td>Cytometria przepływowa, przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji mózgu dla dorosłych, mysz i szczur</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-107-677</td><td>Dysocjacja tkanek, zawiera zanieczyszczenia i roztwory do usuwania czerwonych krwinek; przygotować podwielokrotności enzymu A i P po przybyciu i przechowywać je w temperaturze -20 stopni; C; Przechowuj pozostały zestaw w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mysz</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-097-678</td><td>MACS astrocytów, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD16/32&nbsp;</td><td>BioLegend, Londyn, Wielka Brytania</td><td>101301</td><td>Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Mikrokulki anty-O4, człowiek, mysz, szczur</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-094-543</td><td>MACS oligodendrocytów, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>AstroMACS Bufor separacyjny</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-091-221</td><td>MACS astrocytów, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Przeciwciało biotyny, PE (klon Bio3-18E7)</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-113-853</td><td>Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>BRAND Komora licząca Neubauer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10195580</td><td>Liczenie komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD45 Brilliant Violet 510 (klon 30-F11)</td><td>BioLegend, Londyn, Wielka Brytania</td><td>103137</td><td>Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>CD11b MicroBead, człowiek, mysz</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-049-601</td><td>MACS mikrogleju, przechowywać pod 4 stopniami; C</td></tr><tr><td>DNAse I, rekombinowany, wolny od rnazy</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>4716728001</td><td>Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze -20&deg; C</td></tr><tr><td>D-PBS z wapniem, magnezem, glukozą, pirogronatem</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>14287080</td><td>Bufor do przechowywania, w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>D-PBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>14190250</td><td>Bufor do przechowywania, w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>65-0865-14</td><td>Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3/Zestaw do barwienia czynnikiem transkrypcyjnym</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>00-5523-00</td><td>Cytometria przepływowa, przechowywać w 4&deg; C</td></tr><tr><td>Falcon (15 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td>11507411</td><td>Rurka komórkowa</td></tr><tr><td>Falcon (50 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td><td></td><td>10788561 Rurka komórkowa&nbsp;</td></tr><tr><td>Sokół&nbsp; Probówki z polistyrenu o okrągłym dnie z zatrzaskiem z sitkiem do komórek, 5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>08-771-23</td><td>Cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR, mysz&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-092-575</td><td>MACS oligodendrocytów, przechowywać w temperaturze 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Samica myszy C57BL/6J</td><td>Charles River Laboratories, Sulzfeld, Niemcy</td><td></td><td>Aktywna indukcja EAE&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>F2442-50ML</td><td>Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze od -5 do -20 stopni; C</td></tr><tr><td>FITC Szczur Anty-CD 11b&nbsp; (klon M1/70)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td><td>553310</td><td>Cytometria przepływowa, przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Freund' s Kompletny adiuwant</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>AR001</td><td>Aktywna indukcja EAE, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>GentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-093-237</td><td>Dysocjacja tkanek CNS</td></tr><tr><td>GentleMACS Octo Disocjator z grzałkami</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-096-427</td><td>Dysocjacja tkanek OUN</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 8.4.3</td><td>Graphpad firmy Dotmatics</td><td></td><td>Analiza graficzna</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>AbbVie, Północne Chicago, IL, USA</td><td></td><td>Aktywna indukcja EAE, przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy Kaluza V2.1.1</td><td>Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA</td><td></td><td>Analiza cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-042-401</td><td>MACS</td></tr><tr><td>MACS BSA Roztwór podstawowy</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-091-376</td><td>PB-buffer</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-042-303</td><td>MACS&nbsp;</td></tr><tr><td>MOG35&ndash; 55 peptyd</td><td>Charit&eacute;, Berlin, Niemcy; alternatywy: Genosphere Biotechnologies (Paryż, Francja) lub sb-Peptide (Saint Egr&egrave; ve, Francja)</td><td></td><td>Aktywna indukcja EAE, przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis szczep H37 Ra Becton</td><td>, Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USA</td><td></td><td>Aktywna indukcja EAE, sklep pod kątem 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji neuronów, mysz&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-115-390</td><td>MACS neuronów, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; Przeciwciało C</td></tr><tr><td>O4, anty-ludzkie/mysie/szczurze, APC, (klon REA-576)</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-119-897</td><td>Cytometria przepływowa, przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Toksyna krztuścowa w glicerolu</td><td>Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA</td><td>BT-0105</td><td>Aktywna indukcja EAE; przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>pluriSitko Mini 100 &mu; m&nbsp;</td><td>pluriSelect Life Science UG, Lipsk, Saksonia, Niemcy</td><td>43-10100-40</td><td>Separator cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>QuadroMACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane przeciwciało anty-NeuN MACS Alexa Fluor 647 (klon EPR12763)</td><td>Abcam, Cambridge, Wielka Brytania</td><td>EPR12763</td><td>Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Matryce mózgowe ze stali nierdzewnej, 1 mm</td><td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td><td>15067</td><td>Sekcja tkanek CNS</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15250061</td><td>Liczenie komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5&nbsp; M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15575020</td><td>Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr></tbody></table>

jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Simultaneous Isolation of Principal Central Nervous System-Resident Cell Types from Adult Autoimmune Encephalomyelitis Mice

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest najczęstszym mysim modelem stwardnienia rozsianego (SM) i jest często wykorzystywane do dalszego wyjaśnienia wciąż nieznanej etiologii SM w celu opracowania nowych strategii leczenia. Model EAE glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych 35-55 (MOG35-55) odtwarza samoograniczający się monofazowy przebieg choroby z rosnącym paraliżem w ciągu 10 dni po szczepieniu. Myszy są codziennie badane przy użyciu systemu punktacji klinicznej. Stwardnienie rozsiane jest napędzane przez różne patomechanizmy o określonym wzorcu czasowym, dlatego badanie roli typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) podczas progresji choroby jest bardzo interesujące. Unikalną cechą tego protokołu jest jednoczesna izolacja wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN (mikroglej, oligodendrocyty, astrocyty i neurony) mających zastosowanie u dorosłych EAE i zdrowych myszy. Po dysocjacji mózgu i rdzenia kręgowego od dorosłych myszy następuje sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS) w celu wyizolowania mikrogleju, oligodendrocytów, astrocytów i neuronów. Cytometria przepływowa została wykorzystana do przeprowadzenia analiz jakościowych oczyszczonych zawiesin jednokomórkowych, potwierdzających żywotność po izolacji komórek i wskazujących na czystość każdego typu komórek na poziomie około 90%. Podsumowując, protokół ten oferuje precyzyjny i kompleksowy sposób analizy złożonych sieci komórkowych u zdrowych myszy i myszy EAE. Co więcej, wymaganą liczbę myszy można znacznie zmniejszyć, ponieważ wszystkie cztery typy komórek są izolowane od tych samych myszy.

Obecny protokół umożliwia jednoczesną izolację wszystkich głównych komórek zamieszkujących OUN, tj. mikrogleju, oligodendrocytów, astrocytów i neuronów z jednej pojedynczej replikacji OUN. Jest to istotne dla zmniejszenia liczby myszy potrzebnych do tego rodzaju eksperymentów oraz dla zapewnienia porównywalności analiz molekularnych i biochemicznych na poziomie komórkowym. Jeśli poszczególne typy komórek są izolowane z różnych replikacji OUN, interakcje komórkowe nie mogą być wiernie odwzorowane, a potencjalne odchylenia techniczne podczas procesów izolacji mogłyby zaburzyć dalsze analizy. Ponadto wyniki molekularne i biochemiczne z każdego typu komórek nie byłyby ze sobą porównywalne, ponieważ nie pochodziłyby z tego samego kontekstu EAE. W celu umożliwienia jednoczesnej izolacji wyżej wymienionych typów komórek zaadaptowano istniejący protokół MACS z wykorzystaniem komercyjnego systemu/zestawu.
Izolację mikrogleju przeprowadzono przy użyciu mikrokulek anty-CD11b, oligodendrocytów izolowano za pomocą mikrokulek anty-O4 (Tabela 1), a do izolacji astrocytów wykorzystano mikrokulki anty-ACSA-2 (Tabela 2). Z kolei izolacja neuronów stanowi selekcję negatywną i została przeprowadzona poprzez biotinylację oraz znakowanie magnetyczne wszystkich komórek nieneuronalnych (Tabela 2). Wszystkie komórki nieneuronalne (np. oligodendrocyty, mikroglej, astrocyty, komórki śródbłonka i fibroblasty), z wyjątkiem komórek krwi, mogą zostać znakowane magnetycznie przy użyciu przeciwciała sprzężonego z biotyną, skierowanego specyficznie przeciwko antygenowi powierzchniowemu ekspresjonowanemu na tych komórkach nieneuronalnych (Tabela 2). Poprzez usunięcie tych magnetycznie znakowanych komórek nieneuronalnych można uzyskać wysokiej czystości i żywotne populacje komórek neuronalnych30,42,43.
Zaprojektowano dwa nowe panele do cytometrii przepływowej w celu analizy czystości otrzymanych zawiesin pojedynczych komórek. Wykorzystano w nich swoiste dla typów komórek markery powierzchniowe i jądrowe w połączeniu z dyskryminacją komórek żywych i martwych.
Przeanalizowano uzyskaną liczbę komórek na mysz i typ komórki (Rysunek 3A), co pozwoliło uzyskać średnią wynoszącą 8. 4 x 105 ± 3 x 104 mikrogleju, 3.23 x 106 ± 1 x 105 oligodendrocytów, 8.6 x 105 ± 2 x 104 astrocytów oraz 4.5 x 105 ± 1 x 104 neuronów na mysz naiwną.
W ramach celu polegającego na zbadaniu modeli chorobowych neurostanu zapalnego, protokół zastosowano również w mysim modelu EAE. Myszy uśpiono w 16. dniu po indukcji EAE, co odpowiadało szczytowi choroby. W tym ustawieniu EAE wyizolowano około 2,9 x 106 ± 6,7 x 105 oligodendrocytów, 5,2 x 105 ± 9 x 104 astrocytów oraz 4,4 x 105 ± 4 x 104 neuronów. Wydajność uzyskania mikrogleju spadła do około 1,7 x 105 ± 4 x 104 komórek mikrogleju na mysz z EAE ze względu na dodatkowe sortowanie komórek po etapach MACS (Rycina 3A).
Po izolacji, charakterystyka fenotypowa różnych populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej wykazała, że możliwe jest uzyskanie żywych zawiesin pojedynczych komórek o czystości około 90% dla wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN (Rysunek 3B). Mikroglej wyznaczano (gate) jako CD45intCD11bhigh zgodnie z definicjami zawartymi w literaturze44,45,46,47.
W modelu EAE mikroglej musiał zostać wyselekcjonowany ze wszystkich komórek CD11b+, aby odróżnić go od innych immunologicznych komórek CD11b+, takich jak monocyty, neutrofile, komórki natural killer, granulocyty i makrofagi, które migrują do OUN podczas neurostanu zapalnego27,28,48. W związku z tym mikroglej wyselekcjonowano jako komórki CD45intCD11high z zawiesiny komórek CD11b+. Cała strategia sortowania mikrogleju przedstawiona jest na Rysunku 4. U myszy naiwnych populacja mikrogleju stanowiła 91,16% wszystkich żywych pojedynczych komórek (96% całkowitej populacji CD11b+) (Rysunek 4A). U myszy z EAE populacja mikrogleju stanowiła 46,85% wszystkich żywych pojedynczych komórek (55% całkowitej populacji CD11b+) (Rysunek 4B). Pomimo że zarówno procedury MACS, jak i FACS wywierają stres mechaniczny na pojedyncze komórki, 75,41% ± 8,63% wyselekcjonowanego, oczyszczonego mikrogleju było żywotne (Rysunek 3B).
Astrocyty i neurony izolowane bezpośrednio z początkowej zawiesiny komórek OUN wykazywały istotne zanieczyszczenie oligodendrocytami, co doprowadziło do założenia, że jednoczesna izolacja neuronów i astrocytów z frakcji ujemnej (flow-through) oligodendrocytów może zapobiec temu zanieczyszczeniu. Analizy cytometryczne potwierdziły, że astrocyty izolowane z frakcji ujemnej oligodendrocytów charakteryzowały się czystością na poziomie 89,23% ± 2,78% i przeżywalnością wynoszącą 80,56% ± 1,41%. Podobnie, czystość neuronów izolowanych z frakcji komórek O4- wynosiła 81,25% ± 3,31%, a przeżywalność 83,90% ± 2,61% (Rycina 3B). Wyniki te potwierdzają również, że jednoczesna izolacja tych dwóch typów komórek dopiero po uprzedniej izolacji oligodendrocytów nie wpływa na liczbę żywych, funkcjonalnych komórek.
Wyniki dotyczące żywotności i czystości wyizolowanych zawiesin pojedynczych komórek były bardzo zbliżone u myszy z EAE w porównaniu do wyników uzyskanych u myszy naiwnych, co potwierdza, że protokół ten jest odpowiedni zarówno dla myszy zdrowych, jak i w kontekście EAE (Ryc. 3B).
<img alt="Wykres analizy fenotypu komórek; warunki naiwne vs. EAE; mikroglej, oligodendrocyte, astrocyty, neurony." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wydajność uzyskiwania komórek i walidacja za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych komórek rezydentnych w OUN. (A) Wydajność uzyskiwania komórek na mysz i typ komórek po izolacji komórek rezydentnych w OUN u myszy naiwnych i z EAE. Wykresy słupkowe wizualizują ilość uzyskanych komórek na mysz i typ komórek po zastosowaniu przedstawionego protokołu. W celu uzyskania wyników dla myszy naiwnych przetworzono pięć powtórzeń biologicznych, a w przypadku myszy z EAE przeanalizowano cztery powtórzenia biologiczne. Przedstawiono odpowiednie średnie ± SEM. (B) Odpowiadające analizy czystości i żywotności oczyszczonych frakcji komórkowych. Wykresy słupkowe wskazują żywotność i czystość otrzymanych zawiesin pojedynczych komórek na podstawie ekspresji markerów specyficznych dla danego typu komórek. NeuN wykorzystano jako specyficzny dla typu komórek marker jądrowy dla neuronów. Dla każdego typu komórki, zarówno dla myszy zdrowych, jak i z EAE, pozyskano i porównano pięć powtórzeń biologicznych. Wskazano odpowiednie średnie ± SEM. Skróty: Anti-ACSA-2 = antygen powierzchniowy astrocyta 2; CD11b = kinaza zależna od cykliny 11B; CD45 = receptorowa fosfataza tyrozynowa C; CNS = ośrodkowy układ nerwowy; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia; MACS = magnetyczne sortowanie komórek; NeuN = białko wiążące RNA homolog 3 fox-1; O4 = marker oligodendrocytów O4; SEM = standardowy błąd średniej. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie literatury49. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej, wykresy kropkowe przedstawiają sortowanie komórek, analizę bramkowania, SSC-A/FSC-A, markery CD45/CD11b." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Strategia bramkowania dla sortowania mikrogleju po izolacji komórek CD11b+. (A) Strategia bramkowania u myszy naiwnych oraz (B) myszy z EAE. Górny rząd każdego panelu przedstawia wykresy kropkowe przed sortowaniem, a dolny rząd po sortowaniu. Po wyselekcjonowaniu żywych komórek (SSC-A / FSC-A) oraz pojedynczych komórek (FCS-H / FSC-W), populację komórek CD45intCD11b+ posortowano jako populację mikrogleju. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common murine model for multiple sclerosis (MS) and is frequently used to further elucidate ...

Aby zbadać mechanizmy molekularne i komórkowe w chorobach autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane, niezaspokojoną potrzebą jest stworzenie powtarzalnych i wyrafinowanych protokołów izolacji komórek. Większość obecnych technologii izolowania i analizy komórek rezydujących w OUN wykazuje poważne niedociągnięcia, takie jak skupienie się tylko na jednym typie komórek lub tylko na myszach po urodzeniu. Obecny protokół jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN z jednej repliki OUN daje możliwość analizy złożonych sieci neuronalnych i nowych szlaków zapalnych ex vivo z zawiesiny jednej komórki OUN, co ma zastosowanie u zdrowych myszy i tych z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego.Dodatkowo zmniejsza się liczba myszy. Nasz protokół jednoczesnej izolacji wszystkich czterech głównych typów komórek rezydujących w OUN u myszy zdrowych i myszy z EAE może być wykorzystany jako pomocne narzędzie dla grup badawczych badających nowe szlaki zapalne, umożliwiając znacznie dokładniejszą analizę złożonych mechanizmów biomolekularnych i sieci komórkowych ex vivo. Nowe pytania naukowe, na które można znaleźć odpowiedzi za pomocą naszego protokołu, to dynamiczne badania w EAE na różnych etapach przebiegu choroby, takich jak zapalenie nerwów, neurodegeneracja i remisja.Również interakcje komórka-komórka i szlaki biochemiczne mogą być badane na poziomie indywidualnym. Podobnie, testy funkcjonalne można przeprowadzić na hodowanych komórkach. Zamierzamy skupić się na dynamicznych badaniach kursu EAE do analizy multiomicznej z jednego pojedynczego homogenatu OUN na punkt czasowy EAE.Zacznij od umieszczenia myszy w pozycji leżącej na plecach i zamocowania kończyn za pomocą igieł. Nałóż 75% etanol na przednią część ciała zwierzęcia. Wykonaj przekrój podłużny przez skórę i powięź na brzuchu i klatce piersiowej.Przetnij żebra przymostkowe i złóż klatkę piersiową, aby uzyskać swobodny dostęp do serca. Przymocuj klatkę piersiową złożoną do góry za pomocą igieł. Otwórz prawe atrium za pomocą nożyczek.Za pomocą kaniuli nałóż 20 mililitrów jednorazowego PBS do lewej komory, aby wypłukać krew przez nacięty prawy przedsionek. Wykonaj przekrój podłużny, przecinając skórę na czubku głowy myszy, aby odsłonić czaszkę i przesunąć skórę wokół głowy za pomocą kleszczy. Naciąć czaszkę za pomocą nożyczek wzdłuż szwu strzałkowego.Włóż końcówkę nożyczek wzdłuż linii nacięcia, aby otworzyć kalotę. Usuń pozostałe części kalotki za pomocą kleszczy, aby mózg był w pełni odsłonięty. Ostrożnie usuń mózg i umieść go w mysiej macierzy mózgowej.Pokrój mózg na plastry strzałkowe o grubości jednego milimetra za pomocą żyletki. Za pomocą nożyczek przetnij kręgosłup tuż nad grzebieniem biodrowym. Włóż igłę o rozmiarze 20 G przymocowaną do 20-mililitrowej strzykawki zawierającej jednorazowy PBS do kanału kręgowego.Wypłucz rdzeń kręgowy z kanału kręgowego od ogonowego do czaszkowego. Przetnij rdzeń kręgowy na segmenty o długości 0,5 centymetra za pomocą skalpela. Zawiesinę komórek OUN składającą się z mózgu i odpowiadającego mu rdzenia kręgowego należy przechowywać na szalce Petriego zawierającej trzy mililitry zimnego DPBS.Na początek przeprowadź sekcję tkanki mózgu i rdzenia kręgowego i przechowuj zawiesinę komórkową na lodzie. Następnie przygotuj odpowiednią objętość mieszanki enzymatycznej jeden i dwa. Przenieś 1950 mikrolitrów enzymu, wymieszaj jeden z nich do probówki C i dodaj fragmenty tkanki zawiesiny komórek OUN.Następnie dodaj 30 mikrolitrów mieszanki enzymatycznej do probówki C. Zamknij szczelnie rurki C i przymocuj je do góry nogami na tulei dysocjatora ogniw z grzałkami. Uruchom odpowiedni program i obserwuj przez co najmniej pięć minut, aby upewnić się, że wszystkie rurki obracają się z tą samą prędkością.W międzyczasie umieść sitko o średnicy 70 mikronów na 50-mililitrowej tubie i wstępnie zwilż sitko dwoma mililitrami DPBS. Po zakończeniu programu należy odłączyć probówki C od dysocjacji i odwirować próbki o masie 300 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić próbkę i nałożyć ją na wstępnie zwilżone sitko.Dodaj 10 mililitrów zimnego DPBS do pustej probówki C, wymieszaj i dodaj zawiesinę na odpowiednie sitko. Po odrzuceniu sitek należy ponownie odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut, a następnie ostrożnie zassać supernatant w celu uzyskania osadu komórkowego. Na początek uzyskaj osad komórkowy po dysocjacji tkanki OUN i ponownie zawieś go z 3100 mikrolitrami DPBS w jednej 15-mililitrowej probówce, nie wiruj.Dodaj 1800 mikrolitrów roztworu do usuwania zanieczyszczeń z zestawu do dysocjacji mózgu dorosłego do dwóch zbiorczych zawiesin komórek OUN. Odwróć rurkę i wymieszaj zawiesinę, a następnie delikatnie pokryj ją czterema mililitrami zimnego DPBS i obserwuj wyraźny gradient. Wirować probówki przez 10 minut w temperaturze 3000 g w czterech stopniach Celsjusza z pełnym przyspieszeniem i bez przerwy.Po odwirowaniu powstają trzy fazy. Całkowicie odessaj dwie górne fazy i wyrzuć je, upewniając się, że nie pozostały żadne pozostałości mieliny. Napełnij rurkę zimnym DPBS do 14 mililitrów i zamknij ją.Odwróć rurkę z siłą na stole warsztatowym, aż granulka komórek oderwie się od dna rury. Odwirować próbkę i całkowicie odessać supernatant. W celu usunięcia czerwonych krwinek dodać jeden mililitr roztworu do usuwania czerwonych krwinek do granulki komórek.Po ponownym zawieszeniu osadu inkubować roztwór przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodać 10 mililitrów zimnego buforu PB, odwirować próbkę i całkowicie zassać supernatant. W celu zliczenia komórek rozcieńczyć zawiesinę komórek 50 razy w buforze PB, a następnie przez 1 do 10 rozcieńczeń w 0,4% roztworze błękitu trypanowego.Następnie określ liczbę komórek za pomocą ulepszonej komory zliczającej. Na początek podziel oczyszczoną, nierozcieńczoną zawiesinę komórek OUN myszy na dwie frakcje w celu dalszej izolacji mikrogleju i oligodendrocytów. Następnie dodaj znakowane magnetycznie mikrokulki specyficzne dla antygenu powierzchniowego dla różnych typów komórek OUN do odpowiedniej zawiesiny komórkowej.Umieść kolumnę w polu magnetycznym, zrównoważ kolumnę, a następnie dodaj powstałe zawieszenie komórek na kolumnę. Komórki oznaczone magnetycznie zostaną zachowane w kolumnie, a komórki nieoznaczone przejdą przez nią. Po usunięciu kolumny z pola magnetycznego należy wypłukać znakowane magnetycznie komórki z kolumny do rurki jako pozytywnie wybraną frakcję komórki.Podziel ujemny przepływ z oligodendrocytów na dwie frakcje w celu dalszej izolacji neuronów i astrocytów. Analiza cytometrii przepływowej przy użyciu markerów specyficznych dla typu komórki w połączeniu z dyskryminacją żywych lub martwych komórek pozwoliła uzyskać mikroglej, oligodendrocyty, astrocyty i neurony. Charakterystyka fenotypowa różnych populacji komórek dowodzi, że zawiesiny pojedynczych komórek o czystości i żywotności około 90% uzyskano dla wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN.

simultaneous-isolation-principal-central-nervous-system-resident-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie demonstrujemy, jak izolować komórki mononuklearne z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego.

Izolacja komórek mononuklearnych z ośrodkowego układu nerwowego szczurów z EAE

W tym filmie mysi model stwardnienia rozsianego jest tworzony za pomocą eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE). Myszowi wstrzykuje się emulsję zawierającą peptyd neuronalny i adiuwant, wywołując odpowiedź immunologiczną, która aktywuje autoreaktywne limfocyty T. Następnie podaje się wstrzyknięcie toksyny krztuścowej (PTX) w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg, umożliwiając autoreaktywnym limfocytom T infiltrację mózgu. Ten naciek inicjuje kaskadę...

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego w modelu mysim

Ten manuskrypt opisuje metody indukcji i oceny eksperymentalnego modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (EAE), wraz z oceną rozmieszczenia komórek odpornościowych i poziomów cytokin mRNA w węzłach chłonnych, śledzionie, krwi i rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowego PCR, odpowiednio, w różnych fazach choroby.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego u myszy i ocena zależnej od choroby dystrybucji komórek odpornościowych w różnych tkankach

Ten protokół opisuje, jak określić, czy farmakologiczne leczenie eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia wykazuje ochronę OUN w wyniku tłumienia infiltracji komórek odpornościowych, czy też są neuroprotekcyjne podczas ataku infiltracji komórek odpornościowych.

Określanie supresji układu odpornościowego w porównaniu z ochroną OUN dla interwencji farmakologicznych w demielinizacji autoimmunologicznej

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Ten manuskrypt przedstawia protokół indukcji aktywnego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy. Przedstawiono również metodę izolacji i charakterystyki naciekających limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), aby pokazać, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.

Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Ten artykuł przedstawia dwa zoptymalizowane protokoły badania rezydentnych i obwodowo pochodzących komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym mózgu, rdzeniu kręgowym i oponach mózgowych. Każdy z tych protokołów pomaga ustalić funkcję i skład komórek zajmujących te przedziały w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych.

Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych w celu dalszej analizy komórek odpornościowych

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) to zwierzęcy model stwardnienia rozsianego (MS), który dzieli z ludzką chorobą silną humoralną odpowiedź autoimmunologiczną. W tym miejscu przedstawiamy prosty i elastyczny protokół ELISA do ilościowego oznaczania autoprzeciwciał w surowicy myszy uodpornionych na EAE.

Kwantyfikacja przeciwciał autoreaktywnych u myszy po eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego

Przecięcie nerwu wzrokowego jest powszechnie stosowanym modelem uszkodzenia OUN u osobników dorosłych. Dziewięćdziesiąt procent komórek zwojowych siatkówki (RGCs), których aksony zostały całkowicie przecięte (aksotomia), obumiera w ciągu 14 dni po aksotomii. Model ten jest łatwy do manipulacji eksperymentalnych i wykazuje wysoką powtarzalność.

Przecięcie nerwu wzrokowego: Model apoptozy neuronów dorosłych w ośrodkowym układzie nerwowym

Poznaj metodę jednoczesnej izolacji mikroglii, oligodendrocytów i innych komórek OUN od myszy z EAE. Protokół umożliwia analizę sieci komórkowych i ścieżek zapalnych przy zmniejszonej liczbie zwierząt.

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia (Wideo) | JoVE Journal

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

Przeglądaj więcej filmów