Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia
October 6th, 2023
Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.
Aby zbadać mechanizmy molekularne i komórkowe w chorobach autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane, niezaspokojoną potrzebą jest stworzenie powtarzalnych i wyrafinowanych protokołów izolacji komórek. Większość obecnych technologii izolowania i analizy komórek rezydujących w OUN wykazuje poważne niedociągnięcia, takie jak skupienie się tylko na jednym typie komórek lub tylko na myszach po urodzeniu. Obecny protokół jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN z jednej repliki OUN daje możliwość analizy złożonych sieci neuronalnych i nowych szlaków zapalnych ex vivo z zawiesiny jednej komórki OUN, co ma zastosowanie u zdrowych myszy i tych z eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia
kręgowego.Dodatkowo zmniejsza się liczba myszy. Nasz protokół jednoczesnej izolacji wszystkich czterech głównych typów komórek rezydujących w OUN u myszy zdrowych i myszy z EAE może być wykorzystany jako pomocne narzędzie dla grup badawczych badających nowe szlaki zapalne, umożliwiając znacznie dokładniejszą analizę złożonych mechanizmów biomolekularnych i sieci komórkowych ex vivo. Nowe pytania naukowe, na które można znaleźć odpowiedzi za pomocą naszego protokołu, to dynamiczne badania w EAE na różnych etapach przebiegu choroby, takich jak zapalenie nerwów, neurodegeneracja i remisja.
Również interakcje komórka-komórka i szlaki biochemiczne mogą być badane na poziomie indywidualnym. Podobnie, testy funkcjonalne można przeprowadzić na hodowanych komórkach. Zamierzamy skupić się na dynamicznych badaniach kursu EAE do analizy multiomicznej z jednego pojedynczego homogenatu OUN na punkt czasowy EAE.
Zacznij od umieszczenia myszy w pozycji leżącej na plecach i zamocowania kończyn za pomocą igieł. Nałóż 75% etanol na przednią część ciała zwierzęcia. Wykonaj przekrój podłużny przez skórę i powięź na brzuchu i klatce piersiowej.
Przetnij żebra przymostkowe i złóż klatkę piersiową, aby uzyskać swobodny dostęp do serca. Przymocuj klatkę piersiową złożoną do góry za pomocą igieł. Otwórz prawe atrium za pomocą nożyczek.
Za pomocą kaniuli nałóż 20 mililitrów jednorazowego PBS do lewej komory, aby wypłukać krew przez nacięty prawy przedsionek. Wykonaj przekrój podłużny, przecinając skórę na czubku głowy myszy, aby odsłonić czaszkę i przesunąć skórę wokół głowy za pomocą kleszczy. Naciąć czaszkę za pomocą nożyczek wzdłuż szwu strzałkowego.
Włóż końcówkę nożyczek wzdłuż linii nacięcia, aby otworzyć kalotę. Usuń pozostałe części kalotki za pomocą kleszczy, aby mózg był w pełni odsłonięty. Ostrożnie usuń mózg i umieść go w mysiej macierzy mózgowej.
Pokrój mózg na plastry strzałkowe o grubości jednego milimetra za pomocą żyletki. Za pomocą nożyczek przetnij kręgosłup tuż nad grzebieniem biodrowym. Włóż igłę o rozmiarze 20 G przymocowaną do 20-mililitrowej strzykawki zawierającej jednorazowy PBS do kanału kręgowego.
Wypłucz rdzeń kręgowy z kanału kręgowego od ogonowego do czaszkowego. Przetnij rdzeń kręgowy na segmenty o długości 0,5 centymetra za pomocą skalpela. Zawiesinę komórek OUN składającą się z mózgu i odpowiadającego mu rdzenia kręgowego należy przechowywać na szalce Petriego zawierającej trzy mililitry zimnego DPBS.
Na początek przeprowadź sekcję tkanki mózgu i rdzenia kręgowego i przechowuj zawiesinę komórkową na lodzie. Następnie przygotuj odpowiednią objętość mieszanki enzymatycznej jeden i dwa. Przenieś 1950 mikrolitrów enzymu, wymieszaj jeden z nich do probówki C i dodaj fragmenty tkanki zawiesiny komórek OUN.
Następnie dodaj 30 mikrolitrów mieszanki enzymatycznej do probówki C. Zamknij szczelnie rurki C i przymocuj je do góry nogami na tulei dysocjatora ogniw z grzałkami. Uruchom odpowiedni program i obserwuj przez co najmniej pięć minut, aby upewnić się, że wszystkie rurki obracają się z tą samą prędkością.
W międzyczasie umieść sitko o średnicy 70 mikronów na 50-mililitrowej tubie i wstępnie zwilż sitko dwoma mililitrami DPBS. Po zakończeniu programu należy odłączyć probówki C od dysocjacji i odwirować próbki o masie 300 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić próbkę i nałożyć ją na wstępnie zwilżone sitko.
Dodaj 10 mililitrów zimnego DPBS do pustej probówki C, wymieszaj i dodaj zawiesinę na odpowiednie sitko. Po odrzuceniu sitek należy ponownie odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut, a następnie ostrożnie zassać supernatant w celu uzyskania osadu komórkowego. Na początek uzyskaj osad komórkowy po dysocjacji tkanki OUN i ponownie zawieś go z 3100 mikrolitrami DPBS w jednej 15-mililitrowej probówce, nie wiruj.
Dodaj 1800 mikrolitrów roztworu do usuwania zanieczyszczeń z zestawu do dysocjacji mózgu dorosłego do dwóch zbiorczych zawiesin komórek OUN. Odwróć rurkę i wymieszaj zawiesinę, a następnie delikatnie pokryj ją czterema mililitrami zimnego DPBS i obserwuj wyraźny gradient. Wirować probówki przez 10 minut w temperaturze 3000 g w czterech stopniach Celsjusza z pełnym przyspieszeniem i bez przerwy.
Po odwirowaniu powstają trzy fazy. Całkowicie odessaj dwie górne fazy i wyrzuć je, upewniając się, że nie pozostały żadne pozostałości mieliny. Napełnij rurkę zimnym DPBS do 14 mililitrów i zamknij ją.
Odwróć rurkę z siłą na stole warsztatowym, aż granulka komórek oderwie się od dna rury. Odwirować próbkę i całkowicie odessać supernatant. W celu usunięcia czerwonych krwinek dodać jeden mililitr roztworu do usuwania czerwonych krwinek do granulki komórek.
Po ponownym zawieszeniu osadu inkubować roztwór przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodać 10 mililitrów zimnego buforu PB, odwirować próbkę i całkowicie zassać supernatant. W celu zliczenia komórek rozcieńczyć zawiesinę komórek 50 razy w buforze PB, a następnie przez 1 do 10 rozcieńczeń w 0,4% roztworze błękitu trypanowego.
Następnie określ liczbę komórek za pomocą ulepszonej komory zliczającej. Na początek podziel oczyszczoną, nierozcieńczoną zawiesinę komórek OUN myszy na dwie frakcje w celu dalszej izolacji mikrogleju i oligodendrocytów. Następnie dodaj znakowane magnetycznie mikrokulki specyficzne dla antygenu powierzchniowego dla różnych typów komórek OUN do odpowiedniej zawiesiny komórkowej.
Umieść kolumnę w polu magnetycznym, zrównoważ kolumnę, a następnie dodaj powstałe zawieszenie komórek na kolumnę. Komórki oznaczone magnetycznie zostaną zachowane w kolumnie, a komórki nieoznaczone przejdą przez nią. Po usunięciu kolumny z pola magnetycznego należy wypłukać znakowane magnetycznie komórki z kolumny do rurki jako pozytywnie wybraną frakcję komórki.
Podziel ujemny przepływ z oligodendrocytów na dwie frakcje w celu dalszej izolacji neuronów i astrocytów. Analiza cytometrii przepływowej przy użyciu markerów specyficznych dla typu komórki w połączeniu z dyskryminacją żywych lub martwych komórek pozwoliła uzyskać mikroglej, oligodendrocyty, astrocyty i neurony. Charakterystyka fenotypowa różnych populacji komórek dowodzi, że zawiesiny pojedynczych komórek o czystości i żywotności około 90% uzyskano dla wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN.
Przegląd
Niniejsza praca przedstawia nowatorski protokół umożliwiający jednoczesną izolację wszystkich głównych typów komórek stacjonarnych w układzie nerwowym centralnym (CNS) z jednego myszy, stosowalny w modelach zarówno zdrowych, jak i eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu (EAE). Metoda ta ma na celu rozwiązanie ograniczeń obecnych technologii izolacji komórek, umożliwiając naukowcom badanie złożonych interakcji komórkowych podczas neurozapalenia przy jednoczesnym minimalizowaniu liczby używanych myszy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórkowa
- Badania nad autoimmunologią
Tło
- Istniejące protokoły często koncentrują się na jednym typie komórek lub tylko na myszach postnatalnych.
- Izolacja komórek stacjonarnych w CNS może istotnie wzmocnić nasze zrozumienie procesów neurozapalnych.
- Potrzeba kompleksowego i reprodukowalnego protokołu izolacji komórek staje się coraz ważniejsza w kontekście chorób autoimmunologicznych.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu izolacji wszystkich głównych typów komórek stacjonarnych w CNS z jednej myszy.
- Ułatwienie analizy sieci komórkowych w zdrowiu i chorobie.
- Umożliwienie bardziej dokładnych badań ścieżek zapalnych w neurozapaleniach.
Wykorzystane metody
- Badanie wykorzystuje metodę dysocjacji komórkowej, która ma zastosowanie zarówno do myszy zdrowych, jak i z EAE.
- Myszom zakłada się pozycję na brzuchu, a szczegółowy, etapowy protokół dissekowania służy do uzyskania tkanki mózgu i rdzenia kręgowego.
- Protokół opadania, płukania i oczyszczania komórek jest skrupulatnie opisany, zapewniając wysokie wydajności typów komórek CNS.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia jednoczesną izolację mikrogleju, oligodendrocytów i innych typów komórek stacjonarnych w CNS do dalszych analiz.
- Oczekuje się, że ta metoda dostarczy informacji na temat dynamiki komórkowej w różnych stadiach EAE.
- Krytyczne ulepszenia obejmują zmniejszenie zużycia zwierząt i poprawę jakości danych z preparatów CNS pobranych od jednej myszy.
Wnioski
- Badanie to demonstruje nowatorską technikę izolacji komórek, która wzmacnia możliwości badawcze w neuroimmunologii.
- Możliwość analizy złożonych mechanizmów biomolekularnych z mniejszej liczby próbek ma istotne implikacje dla badania modeli chorób CNS.
- Ogólnie rzecz biorąc, protokół może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące neurozapalenia i interwencji terapeutycznych w chorobach autoimmunologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Simultaneous isolation of all principal CNS-resident cell types from adult EAE mice enables comprehensive interrogation of neuroinflammatory mechanisms in a single experiment. This approach supports high-content, multiomic analyses while reducing animal usage, directly impacting early discovery and target validation in neuroimmunology portfolios. The protocol enhances predictive confidence for pathway de-risking and translational biomarker development in autoimmune CNS disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables ex vivo analysis of complex neuronal and glial networks from individual CNS samples.
- Supports mechanistic de-risking by allowing dynamic investigation of neuroinflammation, neurodegeneration, and remission stages.
- Facilitates functional target validation through isolation of viable, high-purity CNS cell populations.
- Reduces biological variability by sourcing all cell types from the same animal.
Screening & Assay Development
- Provides validated, high-viability single-cell suspensions for downstream functional and phenotypic assays.
- Standardizes cell isolation across CNS cell types, improving reproducibility and assay comparability.
- Enables scalable preparation of CNS-resident cells for compound screening and pathway interrogation.
- Supports quantitative flow cytometry-based purity and viability assessments for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant EAE models for translational biomarker discovery and validation.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling multi-stage disease analysis.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by providing comprehensive cellular data from single animals.
- Supports investigation of cell-cell interactions and biochemical pathways relevant to human CNS autoimmunity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling simultaneous multi-cell-type analyses from EAE and healthy mice, supporting both hypothesis-driven and exploratory research.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by enabling dynamic, stage-specific CNS cell analysis.
- Screening: Delivers reproducible, high-purity cell suspensions for robust assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative viability and purity metrics via flow cytometry for cross-condition comparisons.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by supporting biomarker alignment in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for CNS cell isolation applicable across neuroinflammatory research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS autoimmune research.
- Operational Value: Standardizes cell isolation, enhances reproducibility, and minimizes animal usage.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling multi-parametric analyses from single animals.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuroinflammatory targets and biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CNS dissection, cell dissociation, and magnetic-activated cell sorting (MACS).
- Demands access to flow cytometry and cell sorting instrumentation for quality control.
- Necessitates cross-team standardization of tissue handling and analytical protocols.
- Adaptable to both EAE and healthy adult mouse models for broad applicability.
- Dependent on careful handling to maintain cell viability and purity as supported by source data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:58
Preparation of CNS Tissue for Isolating Cells in EAE Mice
3:54
Dissociation of CNS Tissue for Isolating Cells in EAE Mice
5:25
Removal of Debris and Red Blood Cells from CNS Cell Suspension of EAE Mice
7:18
Isolation of CNS Cell Types Using Magnetic Beads in Naive and EAE Mice
