Generowanie modeli uszkodzeń siatkówki w kijankach Xenopus

Moje laboratorium zajmuje się regeneracją siatkówki. Używamy żaby Xenopus jako systemu modelowego. Ten jest rzeczywiście dość fascynujący, ponieważ w przeciwieństwie do ssaków takich jak my, może bardzo skutecznie zregenerować siatkówkę w przypadku urazu.

Badamy mechanizm leżący u podstaw tego zjawiska, ponieważ w przyszłości może on być przydatny do wywołania regeneracji siatkówki u pacjentów cierpiących na choroby neurodegeneracyjne siatkówki. Niedawno odkryliśmy, że oprócz komórek macierzystych na obrzeżach siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki, komórki glejowe Mullera mogą być również rekrutowane do regeneracji siatkówki w przypadku urazu. Badamy teraz powiązania między zapaleniem nerwów a zdolnościami regeneracyjnymi tych komórek.

Rzeczywiście, wydaje się, że nisza neurozapalna jest kluczowym graczem w modulacji regeneracji siatkówki. Aby zbadać podobne i molekularne mechanizmy związane z regeneracją siatkówki, opracowaliśmy kilka paradygmatów uszkodzeń siatkówki w Xenopus. Pierwszym z nich jest mechaniczne uszkodzenie siatkówki.

Druga to linia transgeniczna pozwalająca na warunkową ablację fotoreceptorów za pośrednictwem nitroreduktazy. Trzeci to model barwnikowego zwyrodnienia siatkówki, oparty na nokaucie rodopsyny CRISPR-Cas9. I na koniec, model cytotoksyczny napędzany przez wstrzyknięcie do gałki ocznej chlorku kobaltu lub CoCl2.

Moje laboratorium macierzyste wykazało, że chociaż Xenopus regeneruje swoją siatkówkę, wydajność jest bardzo zmienna i zależy od etapów kijanki lub gatunku, Xenopus laevis lub tropicalis. To sprawia, że Xenopus jest fantastycznym modelem do zilustrowania mechanizmów molekularnych, które uruchamiają lub ograniczają regenerację siatkówki. Zacznij od użycia siatki zanurzeniowej, aby złapać kijanki z ich zbiorników i przenieść je do świeżego zbiornika wypełnionego 0,005% roztworem benzokainy do znieczulenia.

Następnie odczekaj kilka minut, aby kijanki przestały reagować na bodźce. Teraz złap znieczuloną kijankę łyżką i ostrożnie umieść ją grzbietową stroną do góry na środku małej szalki Petriego wyłożonej wilgotną tkanką. Następnie umieść preparat pod mikroskopem stereoskopowym.

Za pomocą szpilki o średnicy 0,2 milimetra przymocowanej do uchwytu na szpilkę, ostrożnie włóż narzędzie po grzbietowej stronie prawego oka, przekłuwając siatkówkę i przechodząc całkowicie. Następnie obróć szalkę Petriego o 180 stopni i przebij lewe oko. Ostrożnie zanurz szalkę Petriego zawierającą uszkodzoną kijankę w dużym zbiorniku z jednym litrem wody do hodowli.

Monitoruj kijanki, aż zostaną w pełni obudzone. Odcinki siatkówki kijanek poddanych urazom mechanicznym wykazywały zmianę siatkówki we wszystkich warstwach tkanki, pozostając przy tym ograniczonym do miejsca wkłucia. Na początek użyj linii transgenicznej, wyrażającej GFP i reduktazę nitro lub NTR pod promotorem specyficznym dla fotoreceptorów pręcików.

NTR przekształca pro lek metronidazol (MTZ) w środek cytotoksyczny do selektywnej ablacji pałeczek wykazujących ekspresję NTR. Do monitorowania GFP użyj łyżki, aby delikatnie złapać jedną znieczuloną kijankę i ostrożnie umieść ją na wilgotnej chusteczce na małej szalce Petriego. Obserwuj fluorescencję GFP pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym i uchwyć obrazy fotograficzne oczu.

Ostrożnie zanurz szalkę Petriego z kijanką w dużym zbiorniku z wodą do odchowywania, aż do całkowitego przebudzenia. W celu indywidualnego monitorowania zwyrodnienia siatkówki umieść każdą kijankę w małym pojemniku, zawierającym 30 mililitrów 10-milimolowego MTZ lub transgenicznego rodzeństwa w roztworze kontrolnym. W celu obróbki wsadowej umieść transgeniczne kijanki w większym pojemniku z jednym litrem MTZ lub roztworu kontrolnego.

Podnoś kijanki przez tydzień w temperaturze 20 stopni Celsjusza w ciemności, aby uniknąć degradacji MTZ. Po siedmiu dniach obserwuj GFP pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym i uchwyć obrazy fotograficzne oka. Spadek intensywności fluorescencji lub nawet praktycznie brak fluorescencji wskazuje na degradację pręcików.

Oczy transgenicznych kijanek leczonych MTZ wykazały spadek fluorescencji GFP w porównaniu z kontrolą, co jest dodatkowo potwierdzone na odcinkach siatkówki przez barwienie immunologiczne GFP. Na początek weź zaostrzoną kapilę, użyj końcówki mikroładowarki, aby załadować od dwóch do 10 mikrolitrów kompleksu rybonukleoproteinowego CRISPR Cas9 lub roztworu kontrolnego. Następnie umieść napełnioną kapilę w uchwycie mikrowtryskiwacza.

Odłam końcówkę kapilary drobnymi kleszczami, aby wyregulować objętość wyrzutu na 10 nanolitrów. Umieść zarodki w stadium 1-komórkowym na siatce przyklejonej do 100-milimetrowej szalki Petriego z 3% roztworem polisacharozy. Za pomocą mikroiniektora i pod mikroskopem stereoskopowym wstrzyknąć 10 nanolitrów roztworu do obszaru korowego, szczególnie na poziomie bieguna zwierzęcego pod błoną cytoplazmatyczną.

Po 24 godzinach zobrazuj fluoresceinę, lizynę, dekstrynę pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym i wybierz dobrze wstrzyknięte zarodki rho crispant. Znakowanie kaspazą 3 siatkówki kijanek rho crispant wykazało, że niektóre pręciki ulegają apoptozie. Barwienie histologiczne wykazało globalne zachowanie warstw jądrowych, ale znaczne skrócenie zewnętrznych segmentów fotoreceptorów.

Dalsza analiza barwienia immunologicznego za pomocą markerów fotoreceptorowych wykazała zwyrodnienie zewnętrznych segmentów pręcika. Użyj siatki zanurzeniowej, aby złapać kijanki z ich zbiorników i przenieść je do 50-mililitrowego roztworu 0,005% benzokainy. Pozwól im pozostać w roztworze, dopóki nie przestaną reagować na bodźce.

Użyj łyżki, aby delikatnie podnieść kijankę i umieść ją grzbietową stroną do góry na małej szalce Petriego zawierającej wilgotną tkankę. Następnie umieść preparat pod mikroskopem stereoskopowym. Aby rozpocząć, weź zaostrzoną kapilarę, użyj końcówki mikroładowarki, aby załadować 10 mikrolitrów roztworu chlorku kobaltu.

Następnie umieść napełnioną kapilę w manipulatorze mikrowtryskiwaczy, aby oderwać końcówkę kapilarną, aby dostosować objętość wyrzutu na około 30 nanolitrów. Za pomocą mikroiniektora i mikroskopu stereoskopowego wprowadzić kapilarnę wypełnioną chlorkiem kobaltu przez soczewkę do oka. Po dotarciu końcówką kapilarną do wnętrza oka wyrzuć dwie krople po około 30 nanolitrów na oko.

Po wstrzyknięciu prawego oka obrócić szalkę Petriego pod kątem 180 stopni, aby wstrzyknąć lek do lewego oka. Przenieść szalkę Petriego zawierającą wstrzykniętą kijankę do dużego zbiornika zawierającego jeden litr wody z chowu. Obserwuj kijanki, aż w pełni się obudzą.

Wstrzyknięcie 10-milimolowego chlorku kobaltu doprowadziło do specyficznej śmierci komórek fotoreceptorów czopków, podczas gdy 25 milimolowych doprowadziło do śmierci komórek siatkówki szerokiej. Barwienie immunologiczne wykazało brak czopków w 10-milimolowych siatkówkach wstrzykniętych chlorkiem kobaltu, podczas gdy pręciki były w dużej mierze zachowane. Po wstrzyknięciach 25-milimolowego chlorku kobaltu zarówno fotoreceptory, jak i komórki dwubiegunowe były poważnie dotknięte.