Name: Generowanie modeli uszkodzeń siatkówki w kijankach Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj mechanizmy regeneracji siatkówki u kijanek Xenopus laevis. Badanie roli komórek glialnych Müllera i neurozapalenia w procesie naprawy tkanek oka. Metoda ta umożliwia zrozumienie regeneracji nerwowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty dla M.P. od Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) i UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) we współpracy z ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Generating Retinal Degeneration to Investigate Cellular Repair Strategies in Xenopus

<ol><li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>García-García, D., Locker, M., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+M%C3%BCller+glia+regenerative+potential+for+retinal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).</li>
<li>Todd, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+stimulation+of+retinal+regeneration+from+M%C3%BCller+glia+in+adult+mice+using+combinations+of+proneural+bHLH+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors.</a> Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li>
<li>Langhe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reactivation+in+Xenopus+models+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration.</a> Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).</li>
<li>Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+chemogenetic+ablation+of+photoreceptor+cells+in+Xenopus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-specific+ablation+using+the+nitroreductase%2Fmetronidazole+system+to+investigate+regeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).</li>
<li>Zahn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Table+of+Xenopus+development%3A+a+new+graphical+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource.</a> Development. 149 (14), (2022).</li>
<li>McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Husbandry%2C+general+care%2C+and+transportation+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).</li>
<li>Parain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+models+of+retinitis+pigmentosa+reveal+differential+proliferative+response+of+M%C3%BCller+cells+between+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Cells. 11 (5), 807(2022).</li>
<li>Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+care+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).</li>
<li>Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+from+three+cellular+sources+and+ectopic+mini-retina+formation+upon+neurotoxic+retinal+degeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+the+Xenopus+laevis+tadpole%3A+a+new+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system.</a> Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).</li>
<li>Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+tadpoles+can+regenerate+neural+retina+lost+after+physical+excision+but+cannot+regenerate+photoreceptors+lost+through+targeted+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+homeobox+%28Rx%29+gene+is+necessary+for+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration.</a> Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Zalety i wady różnych paradygmatów uszkodzenia siatkówki u kijanek Xenopus
Mechaniczne uszkodzenie siatkówki U kijanek Xenopus rozwinęły się różne chirurgiczne urazy siatkówki nerwowej. Siatkówka nerwowa może być albo całkowicie usunięta15,16, albo tylko częściowo wycięta16,17. Przedstawiony tutaj uraz mechaniczny nie pol...

Miliony ludzi na całym świecie cierpią na różne choroby zwyrodnieniowe siatkówki prowadzące do ślepoty, takie jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, retinopatia cukrzycowa czy zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). Do tej pory schorzenia te pozostają w dużej mierze nieuleczalne. Obecnie oceniane podejścia terapeutyczne obejmują terapię genową, przeszczepy komórek lub tkanek, leczenie neuroprotekcyjne, optogenetykę i urządzenia protetyczne. Inna pojawiająca się strategia opiera się na samoregeneracji poprzez aktywację komórek endogennych o potencjale komórek macierzystych. Komórki glejowe Müllera, główny typ komórek glejowych siatkówki, należą do komórkowych źródeł zainteresowania w tym kontekście. Po urazie mogą się deróżnicować, namnażać i generować neurony1,2,3. Chociaż proces ten jest bardzo skuteczny u danio pręgowanego lub ksenopusa, jest w dużej mierze nieefektywny u ssaków.
Niemniej jednak wykazano, że odpowiednie leczenie białkami mitogennymi lub nadekspresją różnych czynników może wywołać ponowne wejście w cykl komórkowy komórek glejowych Müllera u ssaków, a w niektórych przypadkach wywołać ich późniejsze zaangażowanie w neurogenezę1,2,3,4,5. Jest to jednak w dużej mierze niewystarczające w przypadku leczenia. W związku z tym poszerzenie naszej wiedzy na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw regeneracji jest niezbędne do zidentyfikowania cząsteczek zdolnych do skutecznego przekształcania właściwości komórek macierzystych Müllera w nowe komórkowe strategie terapeutyczne.
W tym celu opracowaliśmy kilka paradygmatów uszkodzeń w Xenopus, które wywołują degenerację komórek siatkówki. W tym miejscu przedstawiamy (1) mechaniczne uszkodzenie siatkówki, które nie jest specyficzne dla typu komórki, (2) warunkowy i odwracalny model ablacji komórek przy użyciu systemu NTR-MTZ, który celuje w komórki pręcikowe, (3) nokaut rodopsyny za pośrednictwem CRISPR/Cas9, model barwnikowego zwyrodnienia siatkówki, który wyzwala postępującą degenerację komórek pręcikowych, oraz (4) CoCl2-indukowany model cytotoksyczny, który w zależności od dawki może być ukierunkowany na czopki lub prowadzić do szerszego zwyrodnienia komórek siatkówki. Podkreślamy specyfikę, zalety i wady każdego paradygmatu.

<table><tbody><tr><td>1,2-propanodiol (propyl&egrave; ne glikol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398039</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol &ge; 99,8%</td><td>Chemikalia VWR</td><td>20821-365</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw rozszczepieniu kaspazy 3 (królik)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9661S</td><td>Rozcieńczenie 1/300</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFP (kurczak)</td><td>Aveslabs</td><td>GFP-1020</td><td>Rozcieńczenie 1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-M-opsyny (królik)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5405</td><td>Rozcieńczenie 1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciwko myszy, Alexa Fluor 594 (koza)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11005</td><td>Rozcieńczenie 1/1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Otx2 (królik)</td><td>Abcam</td><td>Ab183951</td><td>Rozcieńczenie 1/100</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciw królikowi, Alexa Fluor 488 (koza)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11008</td><td>Rozcieńczenie 1/1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne anty-królika, Alexa Fluor 594 (koza)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11012</td><td>Rozcieńczenie 1/1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Recoverin (królik)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5585</td><td>Rozcieńczenie 1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-rodopsyny (mysz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN15</td><td>Rozcieńczenie 1/1,000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-S-Opsyny (królik)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5407</td><td>Rozcieńczenie 1/500</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania Apoptotis (ślepy zaułek fluorymetryczny system TUNEL)</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Benzokaina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Roztwór podstawowy 10%</td></tr> <tr><td>bisBenzimide H 33258 (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2883</td><td>Roztwór podstawowy 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Butanol-1 &ge; 99,5%</td><td>Chemikalia VWR</td><td>20810.298</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2, 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.02382</td><td>Użyj na 0.1 M</td></tr><tr><td>Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0646T</td><td></td></tr><tr><td>Clark Model szkła kapilarnego GC100TF-10</td><td>Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>30-0038</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek kobaltu(II) sześciowodny (CoCl2, 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td>Roztwór podstawowy 100 mM</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Dako REAL ab rozcieńczalnik&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>S202230-2</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczny mikrotom rotacyjny</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 340E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna 1% wodnista</td><td>RAL Diagnostyka</td><td>312740</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran lizyny fluoresceiny&nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>D1822</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZX 200</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Euromedex</td><td>EU0410-B</td><td></td></tr><tr><td>Albumina glicerynowa wg. Mallory</td><td>Diapath</td><td>E0012</td><td>Stosować w stężeniu 3% w wodzie</td></tr><tr><td>Hematoksylina (Hemalun Mayera)</td><td>RAL Diagnostics</td><td>320550</td><td></td></tr><tr><td>Sól potasowa</td> <td>HEPESSigma-Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki hormon gonadotropiny kosmówkowej</td><td>MSD Zdrowie zwierząt</td><td>Chorulon 1500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny dymiący, 37% (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich (SAFC)</td><td>1.00314</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat chlorowodorku L-cysteiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880</td><td>Stosować w stężeniu 2% w 0,1x MBS (pH 7,8 - 8,0)</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4, 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>M3761</td><td>Zastosowanie przy</td></tr><tr><td>końcówkach do mikroładowarek</td><td></td> 10 <td>mM Ściągacz</td> do mikropipet Eppendorf 5242956003 <td></td></tr><tr><td>(P-97 Flaming/Brown)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td>Program: Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500</td></tr><tr><td>Medium montażowe do zachowania fluorescencji, FluorSave Reagent</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe, Eukitt</td><td>Chem-Lab</td><td>CL04.0503.0500</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Ultra Microtome blade</td><td>Epredia</td><td>3053835</td><td></td></tr><tr><td>Igła Agani 25 G x 5/8''</td><td>Terumo</td><td>AN*2516R1</td><td></td></tr><tr><td>Niklowany uchwyt na szpilki</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowa tkanka filtracyjna (tkanina do przesiewania) NITEX, otwór siatki 1,000 &mikro; m</td><td>Sefar</td><td>06-1000/44</td><td></td></tr><tr><td>Histowax parafinowy bez DMSO</td><td>Histolab</td><td>00403</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu (32%)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>EM-15714-S Stosować</td><td>przy 4% w 1x PBS pH 7,4</td></tr><tr><td>Jednorazowe formy do zatapiania Peel-A-Way</td><td>Epredia</td><td>2219</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 100 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>SB93-101</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 55 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>BP53-06</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy roztwór soli fizjologicznej (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330-A</td><td></td></tr><tr><td>System mikroiniekcji PicoSpritzer</td><td>Produkty oprzyrządowania Parker</td><td>PicoSpritzer III</td><td></td></tr><tr><td>Kołki&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Polisacharoza (Ficoll PM 400 )</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td>Stosować w stężeniu 3% w 0,1x MBS</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Sproszkowany pokarm do smażenia : sera Micron Nature</td><td>sera</td><td>45475 (00720)</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do rozwarstwiania</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Slide Superfrost&nbsp;</td><td>&nbsp; Szkło KNITTEL</td><td>VS11171076FKA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz do slajdów</td><td>Instrumenty Kunz</td><td>HP-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sól trisodowa cytrynianu sodu dwuwodna (C6H5Na3O7, 2H2O)</td><td>VWR chemicals</td><td>27833.294</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.06329</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu 30% roztwór wodny (NaOH)</td><td>VWR chemicals</td><td>28217-292</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki jednorazowe Omnifix-F Solo 1</td><td>mL B-BRAUN</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>transaktywujący crRNA (tracrRNA)</td><td>Zintegrowane technologie</td> <td>DNA</td><td></td>1072533</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 200DC Oświetlacz fluorescencyjny</td><td>X-Cite&nbsp;</td><td>Ksylen 200DC</td><td></td></tr><tr><td>&ge; 98.5%&nbsp;</td><td>Chemikalia VWR</td><td>28975-325</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie modeli uszkodzeń siatkówki w kijankach xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Choroby neurodegeneracyjne siatkówki są główną przyczyną ślepoty. Spośród wielu badanych strategii terapeutycznych, stymulacja samonaprawy okazała się ostatnio szczególnie atrakcyjna. Komórkowym źródłem zainteresowania naprawą siatkówki jest komórka glejowa Müllera, która kryje w sobie potencjał komórek macierzystych i niezwykłą zdolność regeneracyjną u anamniotów. Potencjał ten jest jednak bardzo ograniczony u ssaków. Badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw regeneracji siatkówki w modelach zwierzęcych o zdolnościach regeneracyjnych powinno dostarczyć informacji na temat tego, w jaki sposób odblokować utajoną zdolność komórek Müllera ssaków do regeneracji siatkówki. Jest to kluczowy krok w rozwoju strategii terapeutycznych w medycynie regeneracyjnej. W tym celu opracowaliśmy kilka paradygmatów uszkodzenia siatkówki w Xenopus: mechaniczne uszkodzenie siatkówki, transgeniczną linię pozwalającą na warunkową ablację fotoreceptorów za pośrednictwem nitroreduktazy, model barwnikowego zwyrodnienia siatkówki oparty na nokaucie rodopsyny za pośrednictwem CRISPR/Cas9 oraz model cytotoksyczny napędzany przez wewnątrzgałkowe wstrzyknięcia CoCl2. Podkreślając ich zalety i wady, opisujemy tutaj tę serię protokołów, które generują różne stany zwyrodnieniowe i pozwalają na badanie regeneracji siatkówki u Xenopus.

Mechaniczne uszkodzenie siatkówki 
Przekroje siatkówki kijanek poddanych mechanicznemu uszkodzeniu opisanemu w sekcji 1 protokołu wykazują, że zmiana w siatkówce obejmuje wszystkie warstwy tkanki, pozostając ograniczoną do miejsca nakłucia (Rycina 2A,B).
Warunkowa ablacja komórek pręcikowych z wykorzystaniem systemu NTR-MTZ 
Oczy znieczulonych kijanek transgenicznych Tg(rho:GFP-NTR) poddanych działa...

Opracowaliśmy kilka protokołów do wywoływania uszkodzeń siatkówki lub degeneracji siatkówki u kijanek Xenopus laevis. Modele te dają możliwość badania mechanizmów regeneracji siatkówki.

Generowanie modeli uszkodzeń siatkówki w kijankach Xenopus

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

Moje laboratorium zajmuje się regeneracją siatkówki. Używamy żaby Xenopus jako systemu modelowego. Ten jest rzeczywiście dość fascynujący, ponieważ w przeciwieństwie do ssaków takich jak my, może bardzo skutecznie zregenerować siatkówkę w przypadku urazu.Badamy mechanizm leżący u podstaw tego zjawiska, ponieważ w przyszłości może on być przydatny do wywołania regeneracji siatkówki u pacjentów cierpiących na choroby neurodegeneracyjne siatkówki. Niedawno odkryliśmy, że oprócz komórek macierzystych na obrzeżach siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki, komórki glejowe Mullera mogą być również rekrutowane do regeneracji siatkówki w przypadku urazu. Badamy teraz powiązania między zapaleniem nerwów a zdolnościami regeneracyjnymi tych komórek.Rzeczywiście, wydaje się, że nisza neurozapalna jest kluczowym graczem w modulacji regeneracji siatkówki. Aby zbadać podobne i molekularne mechanizmy związane z regeneracją siatkówki, opracowaliśmy kilka paradygmatów uszkodzeń siatkówki w Xenopus. Pierwszym z nich jest mechaniczne uszkodzenie siatkówki.Druga to linia transgeniczna pozwalająca na warunkową ablację fotoreceptorów za pośrednictwem nitroreduktazy. Trzeci to model barwnikowego zwyrodnienia siatkówki, oparty na nokaucie rodopsyny CRISPR-Cas9. I na koniec, model cytotoksyczny napędzany przez wstrzyknięcie do gałki ocznej chlorku kobaltu lub CoCl2.Moje laboratorium macierzyste wykazało, że chociaż Xenopus regeneruje swoją siatkówkę, wydajność jest bardzo zmienna i zależy od etapów kijanki lub gatunku, Xenopus laevis lub tropicalis. To sprawia, że Xenopus jest fantastycznym modelem do zilustrowania mechanizmów molekularnych, które uruchamiają lub ograniczają regenerację siatkówki. Zacznij od użycia siatki zanurzeniowej, aby złapać kijanki z ich zbiorników i przenieść je do świeżego zbiornika wypełnionego 0,005% roztworem benzokainy do znieczulenia.Następnie odczekaj kilka minut, aby kijanki przestały reagować na bodźce. Teraz złap znieczuloną kijankę łyżką i ostrożnie umieść ją grzbietową stroną do góry na środku małej szalki Petriego wyłożonej wilgotną tkanką. Następnie umieść preparat pod mikroskopem stereoskopowym.Za pomocą szpilki o średnicy 0,2 milimetra przymocowanej do uchwytu na szpilkę, ostrożnie włóż narzędzie po grzbietowej stronie prawego oka, przekłuwając siatkówkę i przechodząc całkowicie. Następnie obróć szalkę Petriego o 180 stopni i przebij lewe oko. Ostrożnie zanurz szalkę Petriego zawierającą uszkodzoną kijankę w dużym zbiorniku z jednym litrem wody do hodowli.Monitoruj kijanki, aż zostaną w pełni obudzone. Odcinki siatkówki kijanek poddanych urazom mechanicznym wykazywały zmianę siatkówki we wszystkich warstwach tkanki, pozostając przy tym ograniczonym do miejsca wkłucia. Na początek użyj linii transgenicznej, wyrażającej GFP i reduktazę nitro lub NTR pod promotorem specyficznym dla fotoreceptorów pręcików.NTR przekształca pro lek metronidazol (MTZ) w środek cytotoksyczny do selektywnej ablacji pałeczek wykazujących ekspresję NTR. Do monitorowania GFP użyj łyżki, aby delikatnie złapać jedną znieczuloną kijankę i ostrożnie umieść ją na wilgotnej chusteczce na małej szalce Petriego. Obserwuj fluorescencję GFP pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym i uchwyć obrazy fotograficzne oczu.Ostrożnie zanurz szalkę Petriego z kijanką w dużym zbiorniku z wodą do odchowywania, aż do całkowitego przebudzenia. W celu indywidualnego monitorowania zwyrodnienia siatkówki umieść każdą kijankę w małym pojemniku, zawierającym 30 mililitrów 10-milimolowego MTZ lub transgenicznego rodzeństwa w roztworze kontrolnym. W celu obróbki wsadowej umieść transgeniczne kijanki w większym pojemniku z jednym litrem MTZ lub roztworu kontrolnego.Podnoś kijanki przez tydzień w temperaturze 20 stopni Celsjusza w ciemności, aby uniknąć degradacji MTZ. Po siedmiu dniach obserwuj GFP pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym i uchwyć obrazy fotograficzne oka. Spadek intensywności fluorescencji lub nawet praktycznie brak fluorescencji wskazuje na degradację pręcików.Oczy transgenicznych kijanek leczonych MTZ wykazały spadek fluorescencji GFP w porównaniu z kontrolą, co jest dodatkowo potwierdzone na odcinkach siatkówki przez barwienie immunologiczne GFP. Na początek weź zaostrzoną kapilę, użyj końcówki mikroładowarki, aby załadować od dwóch do 10 mikrolitrów kompleksu rybonukleoproteinowego CRISPR Cas9 lub roztworu kontrolnego. Następnie umieść napełnioną kapilę w uchwycie mikrowtryskiwacza.Odłam końcówkę kapilary drobnymi kleszczami, aby wyregulować objętość wyrzutu na 10 nanolitrów. Umieść zarodki w stadium 1-komórkowym na siatce przyklejonej do 100-milimetrowej szalki Petriego z 3% roztworem polisacharozy. Za pomocą mikroiniektora i pod mikroskopem stereoskopowym wstrzyknąć 10 nanolitrów roztworu do obszaru korowego, szczególnie na poziomie bieguna zwierzęcego pod błoną cytoplazmatyczną.Po 24 godzinach zobrazuj fluoresceinę, lizynę, dekstrynę pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym i wybierz dobrze wstrzyknięte zarodki rho crispant. Znakowanie kaspazą 3 siatkówki kijanek rho crispant wykazało, że niektóre pręciki ulegają apoptozie. Barwienie histologiczne wykazało globalne zachowanie warstw jądrowych, ale znaczne skrócenie zewnętrznych segmentów fotoreceptorów.Dalsza analiza barwienia immunologicznego za pomocą markerów fotoreceptorowych wykazała zwyrodnienie zewnętrznych segmentów pręcika. Użyj siatki zanurzeniowej, aby złapać kijanki z ich zbiorników i przenieść je do 50-mililitrowego roztworu 0,005% benzokainy. Pozwól im pozostać w roztworze, dopóki nie przestaną reagować na bodźce.Użyj łyżki, aby delikatnie podnieść kijankę i umieść ją grzbietową stroną do góry na małej szalce Petriego zawierającej wilgotną tkankę. Następnie umieść preparat pod mikroskopem stereoskopowym. Aby rozpocząć, weź zaostrzoną kapilarę, użyj końcówki mikroładowarki, aby załadować 10 mikrolitrów roztworu chlorku kobaltu.Następnie umieść napełnioną kapilę w manipulatorze mikrowtryskiwaczy, aby oderwać końcówkę kapilarną, aby dostosować objętość wyrzutu na około 30 nanolitrów. Za pomocą mikroiniektora i mikroskopu stereoskopowego wprowadzić kapilarnę wypełnioną chlorkiem kobaltu przez soczewkę do oka. Po dotarciu końcówką kapilarną do wnętrza oka wyrzuć dwie krople po około 30 nanolitrów na oko.Po wstrzyknięciu prawego oka obrócić szalkę Petriego pod kątem 180 stopni, aby wstrzyknąć lek do lewego oka. Przenieść szalkę Petriego zawierającą wstrzykniętą kijankę do dużego zbiornika zawierającego jeden litr wody z chowu. Obserwuj kijanki, aż w pełni się obudzą.Wstrzyknięcie 10-milimolowego chlorku kobaltu doprowadziło do specyficznej śmierci komórek fotoreceptorów czopków, podczas gdy 25 milimolowych doprowadziło do śmierci komórek siatkówki szerokiej. Barwienie immunologiczne wykazało brak czopków w 10-milimolowych siatkówkach wstrzykniętych chlorkiem kobaltu, podczas gdy pręciki były w dużej mierze zachowane. Po wstrzyknięciach 25-milimolowego chlorku kobaltu zarówno fotoreceptory, jak i komórki dwubiegunowe były poważnie dotknięte.

generating-retinal-injury-models-in-xenopus-tadpoles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano metodę warunkowego wyciszania ekspresji białka docelowego w siatkówce dorosłego danio-zebry, która polega na dokonywaniu iniekcji domięśniowych morfolino antysensownych oraz ich elektroporacji do siatkówki. W wyniku tego procesu ekspresja białka jest wyciszona przez kilka dni, co umożliwia zbadanie roli tego białka w regenerującej się lub nienaruszonej siatkówce.

In vivo elektroporacja morfolin do siatkówki dorosłego danio pręgowanego

Xenopus laevis dostarcza idealnego systemu modelowego do badania specyfikacji losu komórki i funkcji fizjologicznych poszczególnych komórek siatkówki w pierwotnej hodowli komórkowej. Tutaj przedstawiamy technikę preparowania tkanek siatkówki i generowania pierwotnych kultur komórkowych, które są obrazowane pod kątem aktywności wapnia i analizowane przez hybrydyzację in situ.

Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis

Film demonstruje metodę hodowli pierwotnych komórek zwojowych siatkówki z zarodków danio pręgowanego. Zarodki we wczesnym stadium są poddawane sekcji w celu wyizolowania oczu, które są następnie mechanicznie dysocjowane w zawiesinę komórek zwojowych siatkówki. Ta zawiesina komórkowa jest hodowana na szkiełkach nakrywkowych pokrytych białkami adhezyjnymi, aby ułatwić rozwój aksonów.

Wytwarzanie pierwotnych kultur komórek zwojowych siatkówki z zarodków danio pręgowanego

Ten film demonstruje procedurę wywoływania zwyrodnienia siatkówki u dorosłych ryb pręgowanych za pomocą uszkodzenia laserowego. Laser celuje w komórki fotoreceptorowe w siatkówce, wywołując śmierć komórki i proces zwyrodnieniowy. To uszkodzenie aktywuje komórki glejowe Müllera (MG), prowadząc do ich odróżnicowania w komórki progenitorowe komórek macierzystych, które pomagają w regeneracji siatkówki.

Modelowanie zwyrodnienia i regeneracji siatkówki u danio pręgowanego za pomocą ogniskowego urazu laserowego

Opisano wiele protokołów uszkodzeń światłem, które uszkadzają fotoreceptory i w konsekwencji wywołują reakcję regeneracji siatkówki u dorosłych ryb pręgowanych. Protokół ten opisuje ulepszoną metodę, która może być stosowana u zwierząt pigmentowanych i która uszkadza zdecydowaną większość fotoreceptorów pręcików i czopków w całej siatkówce.

Nowy paradygmat uszkodzeń spowodowanych światłem do wykorzystania w badaniach nad regeneracją siatkówki u dorosłych danio pręgowanych

Kijanki Xenopus laevis preferują pływanie po białej stronie czarno-białego zbiornika. W tym zachowaniu kieruje się ich wizją. Opierając się na tym zachowaniu, przedstawiamy prosty test do testowania funkcji wzrokowej kijanek.

Prosty test behawioralny do badania funkcji wzrokowych u Xenopus laevis

Ten protokół opisuje metodę preparowania, eksperymentalnego manipulowania i hodowli całych eksplantatów siatkówki z zarodków kurczaka. Kultury eksplantatów są przydatne, gdy potrzebny jest wysoki wskaźnik sukcesu, skuteczność i odtwarzalność w celu przetestowania wpływu plazmidów na elektroporację i/lub substancje odczynnikowe, tj. inhibitory enzymatyczne.

Całe eksplantaty siatkówki z zarodków kurczaka do elektroporacji i zabiegów odczynnikami chemicznymi

Regeneracja siatkówki danio pręgowanego była głównie badana przy użyciu stałych siatek oka. Jednak dynamiczne procesy, takie jak interkinetyczna migracja jądrowa, zachodzą podczas odpowiedzi regeneracyjnej i wymagają obrazowania żywych komórek w celu zbadania mechanizmów leżących u ich podstaw. W tym miejscu opisujemy warunki hodowli i obrazowania w celu monitorowania międzykinetycznej migracji jądrowej (INM) w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii wielofotonowej.

Hodowla dorosłych transgenicznych eksplantatów siatkówki danio pręgowanego do obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii wielofotonowej

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Ten protokół opisuje metodologię genetycznej ablacji nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) przy użyciu transgenicznego modelu danio pręgowanego. Dostosowanie protokołu w celu włączenia modulacji szlaku sygnałowego za pomocą związków farmakologicznych jest bardzo szczegółowe. Opracowano platformę MATLAB do ilościowego określania regeneracji RPE na podstawie pigmentacji, która została zaprezentowana i omówiona.

Ablacja za pośrednictwem nitroreduktazy/metronidazolu oraz platforma MATLAB (RpEGEN) do badania regeneracji nabłonka barwnikowego siatkówki danio pręgowanego

Poznaj mechanizmy regeneracji siatkówki u kijanek Xenopus laevis. Badanie roli komórek glialnych Müllera i neurozapalenia w procesie naprawy tkanek oka. Metoda ta umożliwia zrozumienie regeneracji nerwowej.

Generowanie modeli uszkodzeń siatkówki w kijankach Xenopus

Przeglądaj więcej filmów