Name: Zamrożenie urazu mięśnia żwacza myszy w celu ustalenia modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj protokół zamrażania urazu mięśnia żwacza myszy w celu ustalenia modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych. Ta metoda pozwala porównać regenerację mięśnia żwacza z mięśniem piszczelowym przednim.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Komitetu Zdrowia i Dobrego Samopoczucia Prowincji Sichuan (Numer grantu: 21PJ063) oraz Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (Numer grantu: 82001031).

Wszystkie procedury na zwierzętach w tym badaniu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Zachodniochińskiej Szkoły Stomatologii, Uniwersytetu Sichuan (WCHSIRB-D-2020-114). Samce myszy C57BL/6 (w wieku 5 tygodni) były hodowane w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności (53 ± 2%) i temperaturze (23 ± 2 °C) i znajdowały się w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów używanych w tym protokole można znaleźć w Tabeli materiałów.
1. Uraz spowodowany zamrożeniem
<ol>
	<li>Znieczulenie: Uspokoić myszy wacikami nasączonymi izofluranem i wstrzyknąć tiletaminę-zolazepam dootrzewnowo w dawce 50 mg/kg. Znieczulenie przed- i pooperacyjne zapewniono poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie meloksykamu w dawce 1 mg/kg. Chroń ich oczy maścią weterynaryjną. Poduszka grzewcza utrzymywana w temperaturze 38 °C była umieszczana pod serwetą chirurgiczną podczas całego zabiegu, aby zapewnić zwierzęciu wsparcie termiczne. Przymocuj myszy taśmą klejącą po ułożeniu ich na boku na stole operacyjnym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Oceń wystarczalność znieczulenia na podstawie utraty odruchu powiekowego, odruchu prostowania i odruchu wycofania pedału. 
	UWAGA: Podczas stosowania znieczulenia izofluoranowego trzymaj mysz w jednej ręce, a wacik nasączony izofluoranem w drugiej. Upewnij się, że wacik jest trzymany w pewnej odległości od zwierzęcia, aby uniknąć dyskomfortu i podrażnienia skóry.</li>
	<li>Depilacja przedoperacyjna: Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby ogolić włosy na łydce i twarzy myszy i nałóż pastę do depilacji za pomocą bawełnianego wacika na skórę, zakrywając mięsień żwacz i mięsień piszczelowy przedni. Po 1-2 minutach zmyj pastę chusteczką chirurgiczną na bazie etanolu (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A i <silna klasa="xfig">Ryc. 2G). Miejsca operacyjne zostały zdezynfekowane trzema rundami peelingu na bazie jodu i 75% etanolu. 
	UWAGA: Sama elektryczna maszynka do golenia nie wystarczała do depilacji, szczególnie w obszarze żwaczy. Podczas nakładania pasty do depilacji ważne jest, aby nie używać nadmiernej ilości pasty. Podczas zmywania pasty delikatnie przetrzyj skórę, aby uniknąć oparzeń skóry.</li>
	<li>Ekspozycja pola operacyjnego: Przykryj się obłożeniami chirurgicznymi przed zabiegiem chirurgicznym. W przypadku mięśnia MAS najpierw obmacuj wzdłuż dolnej krawędzi żuchwy. W odległości 5 mm od krawędzi wykonaj 7 mm nacięcie wzdłuż linii łączącej spoidło ustne z tragusem (linia przerywana wskazuje miejsce nacięcia w <silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>W przypadku mięśnia TA najpierw wykonaj badanie palpacyjne wzdłuż łydki, aby zlokalizować przednią krawędź kości piszczelowej. Przeciąć skalpelem 2 mm za krawędzią przez skórę, zaczynając od kolana i kończąc na kostce (przerywana linia wskazuje miejsce nacięcia w <silna klasa="xfig">Rysunek 2H). Dla każdej myszy, jeśli MAS i mięsień TA po lewej stronie są uszkodzone, użyj drugiego mięśnia po stronie przeciwnej jako kontrolnego. 
	UWAGA: To cięcie jest bardzo powierzchowne, aby zapewnić, że mięśnie nie zostaną uszkodzone podczas nacięcia. Nacięcie na twarzy nie powinno znajdować się zbyt blisko tragusa. W przeciwnym razie ślinianka przyuszna zostanie odsłonięta, co doprowadzi do nadmiernego krwawienia podczas następnego procesu zamrażania.</li>
	<li>Zamrażanie suchym lodem: Przytrzymaj jeden kawałek suchego lodu za pomocą wstępnie schłodzonych kleszczyków wzdłuż długich osi mięśni MAS i TA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2I, odpowiednio). Umieść suchy lód bezpośrednio na powierzchni mięśnia na 5 sekund. Upewnij się, że mięsień wydaje się sztywny i bladobiały natychmiast po usunięciu suchego lodu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D i <silna klasa="xfig">Rysunek 2J), ale wraca do normalnego koloru i tekstury w ciągu 22-25 s, podobnie jak sąsiedni nieuszkodzony mięsień (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E i <silna klasa="xfig">Rysunek 2K). 
UWAGA: Kleszcze przytrzymujące suchy lód powinny być wstępnie schłodzone, aby uniknąć szybkiej sublimacji suchego lodu. Timer jest obowiązkowy przy przeprowadzaniu 5-sekundowej kontuzji zamrażania i liczeniu 22-25 s czasu regeneracji mięśnia. Każdy mięsień, którego czas regeneracji jest krótszy niż 22 s lub dłuższy niż 25 s, powinien zostać porzucony. Ten krok wymaga praktyki.</li>
	<li>Zamknięcie rany: Po całkowitym wyzdrowieniu mięśnia, zamknij ranę skóry co najmniej trzema szwami 7-0 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2L).</li>
	<li>Resuscytacja: Po zakończeniu zakładania szwu umieść myszy w klatce ze wsparciem termicznym i monitoruj je w sposób ciągły, aż wszystkie odruchy prostowania zostaną odzyskane.</li>
</ol>
2. Pobieranie mięśni
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji za pomocą przedawkowania izofluranu, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Zbierz mięśnie MAS i TA po obu stronach do analizy histologicznej.</li>
	<li>Rozwarstwienie mięśnia MAS: Rozetnij skórę na twarzy myszy i usuń śliniankę przyuszną, aby odsłonić tylną część mięśnia MAS. Wypreparuj MAS od jego przedniego przyczepu aż do tylnego przyczepu na żuchwie. Biały przerywany obszar wskazuje odsłoniętą część MAS (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). 
	UWAGA: Mięsień MAS składa się z głębokich i powierzchownych przedziałów, oba ściśle przylegające do powierzchni żuchwy. Pamiętaj, aby przycisnąć nożyczki do żuchwy podczas sekcji, aby zapewnić całkowitą izolację MAS. Należy uważać, aby odróżnić jarzmowo-żuchwowy od MAS na podstawie granic między jarzmową a żuchwą.</li>
	<li>Rozwarstwienie mięśnia TA: Rozetnij skórę od kostki do kolana i usuń powięź, aby odsłonić mięsień TA. Użyj końcówki kleszczy do mikropreparacji, aby odizolować ścięgno TA i przesuń je aż do kolana, aby oderwać włókna przyczepiające się do kości piszczelowej. Następnie przetnij ścięgno na kostce (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). 
	UWAGA: W przypadku mięśnia TA wokół kostki myszy znajduje się kilka ścięgien mięśniowych; wymagałoby to praktyki, aby dostrzec ścięgno TA, które jest największe i najbliżej kości piszczelowej.</li>
	<li>Izopentan schładzający wstępnie: Przygotuj dwie beczki izolacyjne; napełnij małą beczkę izopentanem, a dużą beczkę ciekłym azotem. Umieść małą beczkę w dużej beczce na 10 minut przed rozwarstwieniem mięśni (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D).</li>
	<li>Przygotowanie formy do zatapiania: Wykonaj cylindryczną formę z folii aluminiowej dla każdej próbki i wypełnij je związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT).</li>
	<li>Świeżo zamrożone: Zanurz mięsień w OCT, trzymając go prostopadle do związku OCT (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C). Użyj uchwytu na igłę, aby przenieść formę do wstępnie schłodzonego izopentanu. Poczekaj 40 sekund, aż OCT stanie się biały i stały (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D). 
	UWAGA: Upewnij się, że pozycja formy nie jest zbyt niska. W przeciwnym razie izopentan zmiesza się z OCT i zaburzy proces zamrażania mięśni. Poziom OCT w formie powinien być porównywalny z wysokością próbki mięśniowej. Unikaj nadmiernej ilości OCT, aby zapewnić szybkie i wydajne zamrażanie.</li>
	<li>Przechowywanie próbek: Świeże mrożone próbki mięśni należy przechowywać na wyraźnie oznakowanych płytkach 24-dołkowych. Próbki należy natychmiast podzielić na części lub przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego użytkowania.</li>
</ol>
3. Analiza histologiczna
<ol>
	<li>Za pomocą kriostatu wyciąć skrawki o grubości 10 μm z próbki mięśni na szkiełka poddane obróbce powierzchniowej.</li>
	<li>Umieść szkiełka w lodowatym acetonie na 20 minut i wysusz je na powietrzu w dygestorium przez 20 minut.</li>
	<li>Myć szkiełka przez 3 x 5 minut solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). 
	UWAGA: Od tego momentu szkiełka były przechowywane w komorze wilgotnościowej, aby uniknąć wysuszenia.</li>
	<li>Czerwone barwienie Syriusza
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór roboczy Sirius Red, rozpuszczając 0,5 g proszku Sirius Red w 500 ml nasyconego kwasu pikrynowego.</li>
		<li>Szkiełka barwić roztworem roboczym Sirius Red przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Myć szkiełka przez 2 x 5 minut 0,5% kwasem octowym.</li>
		<li>Po procesie barwienia próbki należy najpierw odwodnić w 95% etanolu przez 15 s, a następnie odwodnić w bezwodnym etanolu przez 1 minutę. Ostatnim krokiem jest zamontowanie zjeżdżalni z neutralnym balsamem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunohistologiczne
	<ol>
		<li>Przepuszczać skrawki 0,3% Trytonu w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć PBS.</li>
		<li>W przypadku barwienia Pax7 należy zablokować skrawki odczynnikiem dostarczonym z zestawem referencyjnym; w przypadku barwienia lamininą i Pdgfrα należy zablokować 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 5% surowicą osła w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować skrawki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko Pax7, lamininie i Pdgfrα przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przemywać PBS przez 3 x 5 min.</li>
		<li>Inkubować skrawki z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z barwnikiem fluorescencyjnym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemywać PBS przez 3 x 5 min.</li>
		<li>Inkubować z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przemywać PBS przez 3 x 5 min.</li>
		<li>Umieść podłoże montażowe na sekcji, umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Establishing an Orofacial Muscle Fibrosis Model in Mice via a Freezing Injury

<ol><li>Yoshioka, K., Kitajima, Y., Seko, D., Tsuchiya, Y., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+body+region+specificity+in+murine+models+of+muscle+regeneration+and+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">The body region specificity in murine models of muscle regeneration and atrophy.</a> Acta Physiologica. 231 (1), e13553(2021).</li>
<li>Worley, M. L., Patel, K. G., Kilpatrick, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleft+lip+and+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Cleft lip and palate.</a> Clinics in Perinatology. 45 (4), 661-678 (2018).</li>
<li>Pai, B. C. J., Hung, Y. -T., Wang, R. S. H., Lo, L. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+patients+with+complete+unilateral+cleft+lip+and+palate%3A+20-year+follow-up+of+a+treatment+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Outcome of patients with complete unilateral cleft lip and palate: 20-year follow-up of a treatment protocol.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 359e-367e (2019).</li>
<li>Parsaei, Y., Chandler, L., Smetona, J. T., Lopez, J., Steinbacher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aesthetic+repair+of+unilateral+cleft+lip+using+the+modified+inferior+triangle+and+adjunctive+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Aesthetic repair of unilateral cleft lip using the modified inferior triangle and adjunctive techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 149 (1), 70e-73e (2022).</li>
<li>Schubert, F. R., Singh, A. J., Afoyalan, O., Kioussi, C., Dietrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+roll+the+eyes+and+snap+a+bite+-+function%2C+development+and+evolution+of+craniofacial+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+In+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">To roll the eyes and snap a bite - function, development and evolution of craniofacial muscles.</a> Seminars In Cell & Developmental Biology. 91, 31-44 (2019).</li>
<li>Vyas, B., Nandkishore, N., Sambasivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+cranial+mesoderm%3A+developmental+trajectory+and+evolutionary+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Vertebrate cranial mesoderm: developmental trajectory and evolutionary origin.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (10), 1933-1945 (2020).</li>
<li>Sambasivan, R., Kuratani, S., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eye+on+the+head%3A+the+development+and+evolution+of+craniofacial+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An eye on the head: the development and evolution of craniofacial muscles.</a> Development. 138 (12), 2401-2415 (2011).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Head+muscle+fibro-adipogenic+progenitors+account+for+the+tilted+regeneration+towards+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Head muscle fibro-adipogenic progenitors account for the tilted regeneration towards fibrosis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 589, 131-138 (2022).</li>
<li>Pavlath, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+among+muscle+precursor+cells+in+adult+skeletal+muscles+with+differing+regenerative+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities.</a> Developmental Dynamics. 212 (4), 495-508 (1998).</li>
<li>Camacho-Alonso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+lingual+musculature+in+rats+using+myoblasts+over+porcine+bladder+acellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Regeneration of lingual musculature in rats using myoblasts over porcine bladder acellular matrix.</a> Oral Diseases. 27 (6), 1580-1589 (2021).</li>
<li>LeBoff, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinician%27s+guide+to+prevention+and+treatment+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">The clinician's guide to prevention and treatment of osteoporosis.</a> Osteoporosis International. 33 (10), 2049-2102 (2022).</li>
<li>Julien, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+contribution+of+skeletal+muscle+mesenchymal+progenitors+to+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct contribution of skeletal muscle mesenchymal progenitors to bone repair.</a> Nature Communications. 12 (1), 2860(2021).</li>
<li>Mahdy, M. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol-induced+injury+as+a+new+model+of+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Glycerol-induced injury as a new model of muscle regeneration.</a> Cell and Tissue Research. 374 (2), 233-241 (2018).</li>
<li>Guardiola, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+acute+skeletal+muscle+regeneration+by+cardiotoxin+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Induction of acute skeletal muscle regeneration by cardiotoxin injection.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), 54515(2017).</li>
<li>Larouche, J. A., Wallace, E. C., Spence, B. D., Buras, E., Aguilar, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+mapping+of+immune+and+stem+cell+dysregulation+after+volumetric+muscle+loss%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal mapping of immune and stem cell dysregulation after volumetric muscle loss.</a> JCI Insight. 8 (7), e162835(2023).</li>
<li>Anderson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+a+critical+size+threshold+for+volumetric+muscle+loss+in+the+mouse+quadriceps%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of a critical size threshold for volumetric muscle loss in the mouse quadriceps.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 25 (2), 59-70 (2019).</li>
<li>Lukjanenko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+disrupts+muscle+stem+cell+function+by+impairing+matricellular+WISP1+secretion+from+fibro-adipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446.e7 (2019).</li>
<li>Dong, J., Dong, Y., Chen, Z., Mitch, W. E., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathway+to+muscle+fibrosis+depends+on+myostatin+stimulating+the+differentiation+of+fibro%2Fadipogenic+progenitor+cells+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The pathway to muscle fibrosis depends on myostatin stimulating the differentiation of fibro/adipogenic progenitor cells in chronic kidney disease.</a> Kidney International. 91 (1), 119-128 (2017).</li>
<li>Lemos, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nilotinib+reduces+muscle+fibrosis+in+chronic+muscle+injury+by+promoting+TNF-mediated+apoptosis+of+fibro%2Fadipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors.</a> Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).</li>
<li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro-adipogenic+progenitors+cross-talk+in+skeletal+muscle%3A+the+social+network%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+In+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: the social network.</a> Frontiers In Physiology. 10, 1074(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Istnieje wiele modeli urazów do badania regeneracji mięśni szkieletowych, w tym wykorzystanie bodźców fizycznych, chemicznych i chirurgicznych 10,11,12,13,14,15,16. Kardiotoksyna i chlorek baru to dwie najczęściej stosowane substancje chemiczne inicjujące regenerację mięśni...

Mięśnie ustno-twarzowe są kluczowe w codziennych czynnościach fizjologicznych, takich jak żucie, mowa, oddychanie i wyraz twarzy1. Jednak w wrodzonych deformacjach ustno-twarzowych mięśnie te wykazują zmiany zanikowe i zwłóknieniowe, co prowadzi do upośledzenia zdrowia ciała i poznania społecznego2. Chirurgia rekonstrukcyjna twarzy pozostaje leczeniem pierwszego rzutu, ale do 30-70% pacjentów pooperacyjnych nadal cierpi na utratę mięśni i dysfunkcję mięśni3,4 Niepowodzenie regeneracji mięśni ustno-twarzowych przypisuje się czynnikom wewnętrznym, których nie można skorygować za pomocą samej operacji. 
Pojawienie się mięśni ustno-twarzowych jest ewolucyjną nowością, towarzyszącą złożonej głowie kręgowców i komorowemu sercu5,6. W przeciwieństwie do swoich odpowiedników kończyn wywodzących się z somitów, mięśnie ustno-twarzowe wywodzą się z łuku skrzelowego7. Te cechy filogenetyczne i ontogenetyczne mogą predysponować je do odrębnych zachowań regeneracyjnych8. Doniesiono, że mięsień żwaczy (MAS) rozwinął ciężkie zwłóknienie w czasie, gdy mięsień piszczelowy przedni (TA) w pełni zregenerował się po ekspozycji na ten sam stopień urazu1,9. Jednak mechanizm leżący u podstaw regeneracji pozostaje słabo poznany. 
W tym badaniu, model uszkodzenia mięśnia żwacza myszy został stworzony, aby ułatwić badanie regeneracji mięśni ustno-twarzowych. Wybraliśmy 14 dni po urazie jako punkt czasowy do oceny fenotypu zwłóknienia, ponieważ był to najwcześniejszy punkt, w którym można było wykryć zauważalną rozbieżność między dwoma mięśniami. Całkowita regeneracja MAS po urazie wymaga co najmniej 40 tygodni1. Konsekwentnie, badanie to ujawniło niezwykłe odkładanie się kolagenu po zamrożeniu MAS w porównaniu z regularną regeneracją TA po 14 dniach od urazu. Za pomocą tego modelu można przeprowadzić dalsze badania mechanistyczne nad zanikiem i zwłóknieniem mięśni, co z kolei pomoże w opracowaniu potencjalnych dróg terapeutycznych wspomagających regenerację mięśni ustno-twarzowych po operacji.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Aparatura i instrument medyczny Shifeng (Chengdu, Syczuan, Chiny)</td><td>Strzykawka 1 ml</td><td>/</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Chron Chemicals</td> Szkiełka mikroskopowe <td>acetonowe</td><td>/</td></tr><tr><td>adhezyjne</td><td>Citotest Scientific</td><td>188105</td><td>/</td></tr><tr><td>Depilator dla zwierząt</td><td>Phygene Scientific</td><td>PH1877</td><td>/</td></tr><tr><td>BSA (albumina surowicy bydlęcej)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>A8010</td><td>/</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>C0065</td><td>/</td></tr><tr><td>Osioł anty-koza Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab150129</td><td>1:200</td></tr><tr><td>surowica osła</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SL050</td><td>/</td></tr><tr><td>Suchy lód</td><td>Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, Chiny)</td><td>suchy lód w kształcie ryżu</td><td>/</td></tr><tr><td>IFKine Czerwony osioł anty-królik</td><td>Abbkine Firma naukowa</td><td>A24421</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Beczki izolacyjne (duże)</td><td>Termos</td><td>D600</td><td>/</td></tr><tr><td>Beczki izolacyjne (małe)</td><td>Polar Ware</td><td>250B</td><td>/</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Technology Company (Shenzhen, Guangdong, Chiny)</td><td>R510-22</td><td>/</td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>MACKLIN</td><td>M813375</td><td>/</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, Chiny)</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Zestaw M.O.M</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>Myszy&nbsp;</td><td>&nbsp; Dashuo Biological Technology Company (Chengdu, Sichuan, Chiny)</td> <td>5 tygodni</td><td></td></tr>/<tr><td>podłoże montażowe</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>S2100</td><td>/</td></tr><tr><td>Balsam nerwowy</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>G8590</td><td>/</td></tr><tr><td>PAX7</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank&nbsp;</td><td>Pax7</td><td>1:5</td></tr><tr><td>Pdgfra</td><td>R& Systemy D</td><td>AF1062</td><td>1:40</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia Sirus Red</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>G1472</td><td>/</td></tr><tr><td>Narzędzia chirurgiczne (kleszcze, nożyczki, uchwyt igły, skalpel i szew)</td><td>Instrument medyczny Zhuoyue (Suqian, Jiangsu, Chiny)</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Tissue-tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>/</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Shanghai Scigrace Biotech</td><td>ABIO-Biofroxx-0006A</td><td>/ </td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td>Zoletil 50</td><td>/</td></tr></tbody></table>

zamrożenie urazu mięśnia żwacza myszy w celu ustalenia modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych

Freezing Injury in Mouse Masseter Muscle to Establish an Orofacial Muscle Fibrosis Model

Mięsień ustno-twarzowy stanowi podzbiór tkanki mięśni szkieletowych, o odrębnej trajektorii ewolucyjnej i pochodzeniu rozwoju. W przeciwieństwie do mięśni kończyn wywodzących się z somitów, mięśnie ustno-twarzowe wywodzą się z łuków skrzelowych, z wyłącznym wkładem grzebienia nerwowego czaszki. Niedawne badania wykazały, że regeneracja przebiega również inaczej w grupie mięśni ustno-twarzowych. Podstawowy mechanizm regulacyjny nie został jednak jeszcze odkryty. Obecne modele regeneracji mięśni szkieletowych koncentrują się głównie na mięśniach kończyn i tułowia. W tym protokole suchy lód został użyty do wywołania zamarzania w mięśniu żwacza myszy i mięśniu piszczelowym przednim w celu stworzenia modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych. Dynamika czasowa komórek satelitarnych mięśni i włóknisto-adipogennych komórek progenitorowych była różna między tymi dwoma mięśniami, co prowadziło do upośledzonej regeneracji włókien mięśniowych i nadmiernego odkładania się macierzy zewnątrzkomórkowej. Za pomocą tego modelu można będzie przeprowadzić dokładniejsze badania nad regeneracją mięśni w okolicy ustno-twarzowej w celu opracowania podejść terapeutycznych dla pacjentów z chorobami ustno-twarzowymi.

Barwienie HE i Sirius Red (Rysunek 4 oraz Rysunek dodatkowy S1) wykazało całkowitą regenerację mięśnia TA w tym modelu urazu mrozowego. W przeciwieństwie do tego, MAS wykazywał upośledzoną regenerację włókien mięśniowych oraz nadmierne odkładanie macierzy zewnątrzkomórkowej. Histologia nienaruszonego mięśnia MAS i TA przedstawiona jest na Rysunku 4A,B, gdzie włókna mięśniowe są wyrównane, a obszary włókniste poj...

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych. Porównanie histologii między żwaczem myszy a mięśniem piszczelowym przednim po urazie spowodowanym zamarznięciem potwierdziło zwłóknienie mięśni żwaczy. Model ten ułatwi dalsze badania nad mechanizmem leżącym u podstaw zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych.

Zamrożenie urazu mięśnia żwacza myszy w celu ustalenia modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych

Orofacial muscle constitutes a subset of skeletal muscle tissue, with a distinct evolutionary trajectory and development origin. Unlike the somite-derived ...

Obecne badania nad regeneracją mięśni szkieletowych koncentrują się jedynie na kończynie i mięśniach tułowia, pozostawiając charakterystykę i mechanizm regeneracji mięśni ustno-twarzowych w dużej mierze niezbadany. Celem tych badań jest stworzenie łatwiejszego i bardziej wiarygodnego modelu mysiego, który ułatwi dalsze badania nad regeneracją mięśni w okolicy ustno-twarzowej. Ostatnie odkrycia wskazują, że mięśnie ustno-twarzowe stanowią unikalny podzbiór mięśni szkieletowych o wyraźnej trajektorii ewolucyjnej i pochodzeniu rozwojowym.Wykazują również inne zdolności regeneracyjne w porównaniu z ich odpowiednikami kończynowymi. Głębsze badania nad regeneracją mięśni ustno-twarzowych są uzasadnione, aby zrozumieć mechanizm leżący u podstaw tych wyraźnych różnic. W pracy przedstawiono szybką i powtarzalną metodę badania regeneracji mięśni ustno-twarzowych.Cały proces zamrożenia trwał 20 minut, a proces zbioru trwał tylko 10 minut dla każdej myszy, a myszy mogą dobrze tolerować uraz bez upośledzenia lokomocji. Ponieważ nasz model pozwala na późniejsze porównanie zwłóknieniowego mięśnia żwacza z w pełni zregenerowanym mięśniem piszczelowym przednim z aspektów morfologii, histologii i regulacji molekularnej. Służy nam jako potężne narzędzie do głębszego zagłębienia się w mechanizm leżący u podstaw tego mechanizmu.Nasze przyszłe badania skupią się na skutkach przyczynowych między zmianami rezydentnych komórek macierzystych mięśni i wielu komórek niszowych oraz odpowiednio opracowanych interwencjach w procesie zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych. Aby rozpocząć, połóż znieczuloną mysz na stole operacyjnym. Za pomocą bawełnianego wacika nałóż pastę do depilacji na skórę, pokrywając mięsień żwacz i mięsień piszczelowy przedni.Po odczekaniu jednej do dwóch minut zmyj pastę chusteczką chirurgiczną. Aby odsłonić mięsień żwacz, najpierw wykonaj badanie dotykowe wzdłuż dolnej krawędzi żuchwy. W odległości pięciu milimetrów od krawędzi rozetnij skórę wzdłuż linii, łącząc spoidło ustne z tragusem.Aby wykonać zamrażanie, użyj wstępnie schłodzonych kleszczy, aby przytrzymać kawałek suchego lodu. Umieść suchy lód wzdłuż długich osi mięśni żwaczy bezpośrednio na powierzchni mięśnia i przytrzymaj przez pięć sekund. Upewnij się, że mięsień wydaje się sztywny i bladobiały natychmiast po usunięciu suchego lodu, a następnie powraca do normalnego koloru i tekstury w ciągu 22 do 25 sekund.Po pełnej regeneracji mięśnia zamknij ranę skóry za pomocą co najmniej trzech szwów 7-0. W przypadku mięśnia piszczelowego przedniego palpuj wzdłuż łydki, aby zlokalizować przednią krawędź kości piszczelowej. Dwa milimetry za krawędzią rozetnij skórę, zaczynając od kolana, a kończąc na kostce.Aby wykonać zamrażanie, użyj wstępnie schłodzonych kleszczy, aby przytrzymać kawałek suchego lodu. Umieść suchy lód wzdłuż długich osi mięśni piszczelowych przednich bezpośrednio na powierzchni i przytrzymaj przez pięć sekund. Upewnij się, że mięsień wydaje się sztywny i bladobiały natychmiast po usunięciu suchego lodu, a następnie powraca do normalnego koloru i tekstury w ciągu 22 do 25 sekund.Po zszyciu rany skórnej umieść mysz na płytce grzewczej utrzymywanej w temperaturze około 38 stopni Celsjusza. Monitoruj w sposób ciągły, aż mysz odzyska odruch prostowania. Przygotuj formy do zatapiania, tworząc cylindryczne folie aluminiowe dla każdej próbki.Napełnij formy optymalną temperaturą cięcia lub związkiem OCT. Następnie przygotuj dwie beczki izolacyjne. Napełnij małą beczkę izopentanem, a dużą beczkę ciekłym azotem.Umieść małą beczkę w większej 10 minut przed rozwarstwieniem mięśni. Zacznij od przygotowania myszy do sekcji. Rozetnij skórę na twarzy myszy, aby odsłonić mięsień żwaczy.Usuń śliniankę przyuszną, aby całkowicie odsłonić tylną część mięśnia żwacza. Wypreparuj mięsień żwacza od jego przedniego przyczepu do tylnego przyczepu na żuchwie. Następnie zanurz tkankę mięśniową w OCT, trzymając ją prostopadle do związku.Przenieś formę do wstępnie schłodzonego izopentanu za pomocą uchwytu na igłę. Poczekaj 40 sekund, aż OCT stanie się biały i stały. Przechowuj świeżo mrożone próbki mięśni na oznakowanych płytkach 24-dołkowych.Próbki należy natychmiast podzielić na części w temperaturze 20 stopni Celsjusza lub przechowywać je w temperaturze 80 stopni Celsjusza do długotrwałego użytkowania. Następnie rozetnij skórę od kostki do kolana i usuń powięź, aby odsłonić mięsień piszczelowy przedni. Użyj końcówki kleszczy do mikrodysekcji, aby odizolować ścięgno kości piszczelowej przedniej i przesuń je do kolana, aby zerwać włókna przyczepiające się do kości piszczelowej, przeciąć ścięgno w kostce.Zabarwienie HE i Sirius Red ujawniło, że po zamrożeniu mięśnie piszczelowe przednie wykazywały pełną regenerację po 14 dniach, z morfologią podobną do nienaruszonej kontroli. Natomiast mięsień żwacza wykazywał upośledzoną regenerację włókien mięśniowych, nadmierne odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej po 14 dniach zamarznięcia. Barwienie immunohistologiczne Pax7 po 14 dniach urazu wykazało gęsto wypełnione jądra, ale bez proporcjonalnie zwiększonych komórek satelitarnych mięśni.Dużą liczbę centralnie położonych włókien mięśniowych wykryto w mięśniu piszczelowym przednim po 14 dniach od urazu. Podczas gdy kontur włókien mięśniowych był ledwo zauważalny w mięśniu żwacza w uszkodzonym obszarze. Zamiast tego zaobserwowano infiltrację Pdgfr-alpha+FAP.

freezing-injury-mouse-masseter-muscle-to-establish-an-orofacial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Różne mysie modele zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) są szeroko stosowane w eksperymentalnych badaniach mózgu. W tym miejscu demonstrujemy model przezczaszkowego stałego dystalnego MCAO, który powoduje konsekwentny zawał kory mózgowej o wielkości odpowiadającej uszkodzeniom spowodowanym przez większość udarów niedokrwiennych u ludzi.

Modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu

Prezentujemy protokół chirurgiczny szczegółowo opisujący, jak wykonać aksotomię cięcia lub zgniecenia nerwu twarzowego u myszy. Akskotomia nerwu twarzowego może być wykorzystana do badania fizjologicznej reakcji na uszkodzenie nerwu i testowania technik terapeutycznych.

Aksotomia nerwu twarzowego u myszy: model do badania reakcji neuronów ruchowych na uraz

Ten protokół krok po kroku pokazuje, jak wydobyć pierwszy ząb trzonowy żuchwy u myszy. Stanowi alternatywną metodę dla badaczy zajmujących się gojeniem i regeneracją kości szczęki.

Opracowanie modelu gojenia zębodołu po ekstrakcji zębów trzonowych żuchwy u myszy

Tutaj opisujemy protokół chirurgicznego tworzenia urazu objętościowej utraty mięśni (VML) u żwacza szczura, dostarczając powtarzalnego i dostępnego modelu do badania urazów mięśni twarzoczaszki i ich leczenia za pomocą biomateriałów, takich jak nowy hydrożel.

Model utraty objętości mięśni żwaczy u gryzoni do badania materiałów bioinżynieryjnych

Tutaj prezentujemy protokół, który łączy elektroporację in vivo i denerwację mięśnia dźwigacza długiego czaszki (LAL). Zabieg ten umożliwia badanie potencjalnej roli białek pochodzenia mięśniowego w regeneracji synapsy nerwowo-mięśniowej.

Połączona elektroporacja in vivo i krótkotrwałe unerwienie mięśnia szkieletowego dźwigacza bocznego zorza długiego czaszki

Ten protokół przedstawia kompleksową i efektywną metodę analizy naprawy kości żuchwy. Opisujemy powtarzalną technikę nieustabilizowanego złamania żuchwy w modelu mysim, pozwalającą na analizę procesu naprawy kości śródchrzęstnej przy minimalnym uszkodzeniu tkanek i ubytku kości.

Mniej inwazyjna technika niestabilizowanego złamania żuchwy w modelach mysich

Urazy objętościowe utraty mięśni (VML) przekraczają endogenne zdolności regeneracyjne, skutkując trwałymi deficytami funkcjonalnymi. Obecne badania nad VML koncentrują się głównie na mięśniach kończyn i tułowia. Aby rozszerzyć badania mechanistyczne VML na mięśnie czaszkowo-twarzowe, niniejszy artykuł opisuje metodę in vivo do podłużnej oceny funkcji mięśni żwaczowych przed i po urazie VML.

Funkcjonalna ocena in vivo mięśnia masetera szczura po chirurgicznym utworzeniu urazu objętościowego (VML)

Ortotopowe modele zwierzęce raka jajnika lepiej odwzorowują przebieg choroby u ludzi, a tym samym zwiększają naszą wiedzę na temat progresji nowotworu i odpowiedzi guza na terapię. W modelu mysim wykonuje się wstrzyknięcie do wnętrza woreczka otrzewnej komórek nowotworu jajnika wykazujących ekspresję lucyferazy. Leczenie podaje się poprzez zgłębnik żołądkowy. Wzrost guza monitoruje się za pomocą systemu obrazowania in vivo.

Obrazowanie in vivo i leczenie terapeutyczne w ortotopowym modelu raka jajnika u myszy

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Opisujemy metodę bezpośredniego pomiaru siły mięśniowej, mocy mięśniowej, kinetyki skurczu oraz podatności na zmęczenie izolowanych mięśni szkieletowych w układzie in vitro z wykorzystaniem stymulacji polowej. Dzięki zastosowaniu różnych protokołów stymulacji można uzyskać cenne informacje na temat właściwości gospodarki Ca2+ oraz mechanizmu skurczowego mięśnia.

Ex Vivo ocena kurczliwości, męczliwości i alternansu w izolowanych mięśniach szkieletowych

Poznaj protokół zamrażania urazu mięśnia żwacza myszy w celu ustalenia modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych. Ta metoda pozwala porównać regenerację mięśnia żwacza z mięśniem piszczelowym przednim.

Zamrożenie urazu mięśnia żwacza myszy w celu ustalenia modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych

Przeglądaj więcej filmów