Name: Izolacja komórek z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi z próbek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej za pomocą mikrodysekcji laserowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Naucz się izolacji komórek z próbek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej za pomocą mikrodysekcji laserowej. Ta metoda umożliwia analizę wieloomiczną tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty badawcze z Narodowej Fundacji Nauk o Naturze Chin (81671006, 81300894), Funduszu Innowacji CAMS dla Nauk Medycznych (2019-I2M-5-038), Krajowego projektu budowy kluczowej dyscypliny klinicznej (PKUSSNKP-202102), Funduszu Innowacji dla Wybitnych Doktorantów Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Pekińskiego (BMU2022BSS001).

To badanie zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Szkoły i Szpitala Uniwersytetu Pekińskiego. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów. Próbki tkanek użyte w tym badaniu zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację. Schemat badania jest pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Pociąć utrwalone w formalinie tkanki zwłóknienia podśluzówkowego jamy ustnej zanurzone w parafinie na ciągłe odcinki o grubości 3 μm i 10 μm na mikrotomie.</li>
	<li>Rozłóż sekcje w wodzie, a następnie wyłowij na zjeżdżalnie. Zamocuj sekcje 3 μM i 10 μm odpowiednio na szkiełkach mikroskopowych adhezyjnych (slajd A) i szkiełkach z membraną PEN (slajd B).</li>
	<li>Umieść szkiełka na płycie grzejnej w temperaturze 60 °C na 2 godziny.</li>
</ol>
2. Barwienie hematoksyliną-eozyną
<ol>
	<li>Umieść szkiełka A i B w ksylenie (UWAGA) na 10 minut i powtórz ten krok trzykrotnie.</li>
	<li>Hydrate szkiełka A i B w stopniowanych roztworach etanolu w kolejności 100%, 100%, 90%, 80% i 70% przez 1 minutę w każdym stężeniu.</li>
	<li>Umieść szkiełka A i B w ultraczystej wodzie destylowanej na 30 s</li>
	<li>Umieść szkiełka A i B w roztworze barwnika hematoksyliny Harris na 90 s.</li>
	<li>Umieść szkiełka A i B w ultraczystej wodzie destylowanej na 30 s i powtórz ten krok trzykrotnie.</li>
	<li>Umieść szkiełka A i B w roztworze div-hematoksyliny (UWAGA) na 2 s.</li>
	<li>Umieść szkiełka A i B w ultraczystej wodzie destylowanej na 30 s i powtórz ten krok trzykrotnie.</li>
	<li>Umieść szkiełka w A i B w 1% roztworze re-blue na 2 sekundy.</li>
	<li>Umieść szkiełka A i B w ultraczystej wodzie destylowanej na 30 s i powtórz ten krok trzykrotnie.</li>
	<li>Umieść szkiełka w roztworze eozyny na 2 sekundy.</li>
	<li>Umieść szkiełka A i B w ultraczystej wodzie destylowanej na 30 s i powtórz ten krok trzykrotnie.</li>
	<li>Odwodnić szkiełka w stopniowanych roztworach etanolu w kolejności 70%, 80%, 90%, 100% i 100% przez 2 s w każdym stężeniu.</li>
	<li>Umieść szkiełko A w ksylenie na 3 minuty i powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Dodaj kroplę podłoża montażowego (UWAGA) do suwaka A i przykryj go szkłem nakrywkowym.</li>
</ol>
3. Obserwacja morfologii histologicznej i mikrodysekcja laserowa
<ol>
	<li>Zainicjuj system i oprogramowanie do mikrodysekcji laserowej (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2).</li>
	<li>Umieść szkiełko A na stoliku szkiełkowym i obserwuj morfologię histologiczną, aby zidentyfikować obszar zainteresowania dla mikrodysekcji laserowej.</li>
	<li>Wyjmij slajd A i umieść slajd B odwrotnie na stoliku slajdu.</li>
	<li>Kliknij przycisk Unload (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), aby wypchnąć urządzenie zbierające. Włóż probówkę z reakcją łańcuchową polimerazy (PCR) do urządzenia zbierającego i upewnij się, że probówka jest zamocowana. Kliknij przycisk OK (Rysunek 3).</li>
	<li>Wybierz nasadkę, klikając odpowiednie czerwone kółko oznaczające Urządzenie zbierające: Zaślepki rur. Wybrane kółko zmieni kolor na zielony.</li>
	<li>Kliknij przycisk Rysuj i przycisk Rysuj + Wytnij i użyj myszy, aby naszkicować obszar zainteresowania.</li>
	<li>Kliknij przycisk Start Cut, aby uchwycić obszar zainteresowania; przechwycona próbka zostanie pobrana przez nasadkę (Rysunek 4).</li>
	Kliknij dolny przycisk, aby upewnić się, że przechwycona próbka została zebrana (Rysunek 5).<li></li>
	<li>Kliknij przycisk Próbka, aby przechwycić następną próbkę.</li>
	<li>Kliknij przycisk Rozładuj, aby rozładować probówkę PCR z pobraną próbką.</li>
</ol>

Capturing Oral Submucous Fibrosis Tissue Samples for Spatial-Omics Analysis

<ol><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+submucous+fibrosis%3A+A+clinicopathological+study+of+674+cases+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).</li>
<li>Cai, X., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathological+factors+associated+with+progression+of+oral+submucous+fibrosis%3A+A+population-based+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study.</a> Oral Oncology. 130, 105949(2022).</li>
<li>Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+submucous+fibrosis%3A+A+global+challenge.+Rising+incidence%2C+risk+factors%2C+management%2C+and+research+priorities%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities.</a> Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).</li>
<li>Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+submucous+fibrosis%3A+A+Review+on+etiopathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940(2019).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preliminary+exploration+of+immune+microenvironment+in+oral+leukoplakia+concomitant+with+oral+submucosal+fibrosis%3A+A+comparative+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Pathology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study.</a> Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).</li>
<li>Warnakulasuriya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+potentially+malignant+disorders%3A+A+consensus+report+from+an+international+seminar+on+nomenclature+and+classification%2C+convened+by+the+WHO+Collaborating+Centre+for+Oral+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer.</a> Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).</li>
<li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+nomogram+prediction+model+for+malignant+transformation+of+oral+potentially+malignant+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders.</a> Oral Oncology. 123, 105619(2021).</li>
<li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+rate+of+oral+submucous+fibrosis%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis.</a> Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793(2022).</li>
<li>Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+of+oral+submucous+fibrosis%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis.</a> Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).</li>
<li>Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+submucous+fibrosis%3A+Etiological+mechanism%2C+malignant+transformation%2C+therapeutic+approaches+and+targets%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992(2023).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+dissection+of+precancerous+lesions+underlying+the+initiation+process+of+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma.</a> Cell Discovery. 9 (1), 28(2023).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+the+dynamic+evolution+from+preneoplasia+to+invasive+lung+adenocarcinoma+by+integrating+single-cell+RNA+sequencing+and+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics.</a> Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).</li>
<li>Ji, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+analysis+of+composition+and+spatial+architecture+in+human+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma.</a> Cell. 182 (2), 497-514 (2020).</li>
<li>Van den Bossche, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-driven+intratumoral+heterogeneity+in+head+and+neck+cancers%3A+clinical+challenges+and+opportunities+for+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resistance+Updates%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine.</a> Drug Resistance Updates. 60, 100806(2022).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+in+the+risk+assessment+of+oral+leukoplakia+through+morphology-related+copy+number+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China.+Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis.</a> Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).</li>
<li>Watkins, T. B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+chromosomal+instability+and+karyotype+order+in+tumour+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution.</a> Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).</li>
<li>Odell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+and+loss+of+heterozygosity+as+risk+markers+for+malignant+transformation+in+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa.</a> Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).</li>
<li>Wood, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+road+to+invasion-examining+the+similarities+and+differences+in+the+genomes+of+associated+oral+pre-cancer+and+cancer+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples.</a> Genome Medicine. 9 (1), 53(2017).</li>
<li>Venugopal, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomics+based+on+2D+gel+electrophoresis+and+mass+spectrometry+with+validations%3A+Identification+of+a+biomarker+compendium+for+oral+submucous+fibrosis-An+indian+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Personalized+Medicine%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study.</a> Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208(2022).</li>
<li>Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+methylation+changes+in+oral+submucous+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis.</a> Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).</li>
<li>Cai, X., Zhang, H., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-target+pharmacological+mechanisms+of+Salvia+miltiorrhiza+against+oral+submucous+fibrosis%3A+A+network+pharmacology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach.</a> Archives of Oral Biology. 126, 105131(2021).</li>
<li>Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content+abnormality+in+oral+submucous+fibrosis+concomitant+leukoplakia%3A+A+preliminary+evaluation+of+the+diagnostic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Cytopathology%22%5BJournal%5D)">DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications.</a> Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+expression+profile+associated+with+malignant+progression+of+oral+submucous+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis.</a> Journal of Oncology. 2019, 6835176(2019).</li>
<li>Lunde, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+chromosomal+changes+in+potentially+malignant+and+malignant+oral+mucosal+lesions+from+South+and+Southeast+Asia+using+array-comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genomics+%26+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization.</a> Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).</li>
<li>Sun, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+resolved+metabolomics+to+discover+tumor-associated+metabolic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+alteration+profiling+facilitates+differential+diagnosis+between+ossifying+fibroma+and+fibrous+dysplasia+of+the+jaws%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oral+Science%22%5BJournal%5D)">Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws.</a> International Journal of Oral Science. 13 (1), 21(2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W protokole tym poinformowano o procesie pozyskiwania próbek tkanek OSF wraz z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi w celu dalszych analiz przestrzenno-omicznych za pomocą mikrodysekcji laserowej. Na podstawie reprezentatywnych wyników zidentyfikowaliśmy różne wzorce CNA wśród różnych próbek związanych z morfologią.
OSF, rodzaj OPMD, jest częstym stanem przedrakowym raka płaskonabłonkowego jamy ustnej6. Doniesiono, że niestabilność genomu jest związana z rozwoj...

Zwłóknienie błony podśluzówkowej jamy ustnej (OSF) jest przewlekłą, podstępną chorobą, która rozwija się głównie w błonie śluzowej policzka i powoduje ograniczone otwieranie ust1. Podczas gdy OSF jest chorobą wieloczynnikową, żucie orzechów areki lub betelu jest główną przyczyną OSF2,3. Ze względu na ten specyficzny geograficznie zwyczaj, OSF jest skoncentrowany głównie w populacjach w Azji Południowo-Wschodniej i Południowej3. Typowe cechy histologiczne OSF obejmują nieprawidłowe odkładanie się kolagenu w tkance łącznej pod nabłonkiem błony śluzowej jamy ustnej, zwężenie naczyń i okluzję1. Tkanka nabłonkowa OSF może wykazywać objawy atrofii lub przerostu, a nawet dysplazji w połączeniu z leukoplakią jamy ustnej4,5.
OSF jest zdefiniowany przez Światową Organizację Zdrowia jako powszechne potencjalnie złośliwe zaburzenie jamy ustnej (OPMD), które wykazuje potencjał do progresji do raka płaskonabłonkowego jamy ustnej ze współczynnikiem transformacji złośliwej 4%-6%6,7,8,9. Mechanizm leżący u podstaw złośliwej transformacji OSF jest złożony10. Nieprawidłowy rozrost nabłonka, w tym zarówno dysplazja, jak i atrofia, zwiększa potencjał kancerogenezy, a starcze fibroblasty w zrębie mogą być zaangażowane w złośliwą progresję OSF poprzez indukowanie przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT) przez reaktywne formy tlenu (ROS) i inne cząsteczki10.
Technologie analiz przestrzenno-omicznych wygenerowały dane multiomiczne z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi, które dostarczyły wglądu w mechanizmy raka11,12,13. W tym miejscu przedstawiamy protokół przechwytywania populacji komórek związanych z morfologią z tkanki OSF zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie za pomocą mikrodysekcji laserowej. Analizy multiomiczne tych próbek mogą przezwyciężyć wyzwania związane z heterogenicznością wewnątrztkankową i zwiększyć zrozumienie patologii molekularnej i mechanizmów transformacji złośliwej w OSF14.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka mikroskopowe adhezyjne</td><td>CITOTEST</td><td>REF.188105</td><td></td></tr><tr><td>Div-haematoxylin</td><td>YiLi</td><td>20230326</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór eozyny</td><td>BASO</td><td>BA4098</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik</td><td>do PEKINGU</td> etanolu <td>nr 32061</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór barwnika hematoksyliny Harris</td><td>YiLi</td><td>20230326</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>LEICA</td><td>HI1220</td><td></td></tr><tr><td>System mikrodysekcji laserowej</td><td>Maszyna LEICA</td><td>LMD7</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosystem mikroanalizy laserowej</td><td>LEICA</td><td>8.2.3.7603</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Micromount medium montażowe</td><td>LEICA</td><td>REF.3801731</td><td></td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu</td><td>CITOTEST</td><td>REF.10212450C</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>LEICA</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do PCR</td><td>Szkiełka membranowe AXYGEN</td><td>16421959</td><td></td></tr><tr><td>PEN</td><td>LEICA</td><td>No.11505158</td><td></td></tr><tr><td>Re-blue solution</td><td>YiLi</td><td>20230326</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda destylowana</td><td>Invitrogen</td><td>REF.10977-015</td><td></td></tr><tr><td>ODCZYNNIK DO PEKINGOWANIA</td><td>KSYLENU</td><td>NR 33535</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi z próbek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej za pomocą mikrodysekcji laserowej

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Zwłóknienie podśluzówkowe jamy ustnej (OSF) jest powszechnym rodzajem potencjalnie złośliwego zaburzenia w jamie ustnej. Zanik nabłonka i zwłóknienie blaszki właściwej i błony podśluzowej często stwierdza się na szkiełkach histopatologicznych. Zaproponowano, że dysplazja nabłonkowa, atrofia nabłonka i fibroblasty starcze są związane ze złośliwą transformacją OSF. Jednak ze względu na niejednorodność potencjalnie złośliwych chorób jamy ustnej i raka płaskonabłonkowego jamy ustnej trudno jest zidentyfikować specyficzne mechanizmy molekularne transformacji złośliwej w OSF. W tym miejscu przedstawiono metodę uzyskania niewielkiej liczby komórek nabłonkowych lub mezenchymalnych przenoszących dane morfologiczne i informacje przestrzenne za pomocą mikrodysekcji laserowej na szkiełkach tkankowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie. Za pomocą mikroskopu możemy precyzyjnie uchwycić w mikroskali (~500 komórek) dysplastyczną lub zanikową tkankę nabłonkową oraz zwłóknioną tkankę podnabłonkową. Wyekstrahowane komórki można ocenić za pomocą sekwencjonowania genomu lub transkryptomu w celu uzyskania danych genomowych i transkryptomicznych z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi. Takie podejście eliminuje niejednorodność masowego sekwencjonowania tkanek OSF i interferencję powodowaną przez komórki w obszarach niezmienionych chorobowo, umożliwiając precyzyjną analizę przestrzenno-omiczną tkanki OSF.

Poprzez wykonanie mikrodysekcji laserowej tkanek OSF pobrano próbki nabłonka dysplastycznego, zrębu pod nabłonkiem dysplastycznym, nabłonka zanikowego oraz zrębu pod tkanką nabłonkową zanikową (Rycina 1). Dzięki ekstrakcji DNA i sekwencjonowaniu całego genomu o niskiej głębokości możliwe było przeanalizowanie zmian liczby kopii (CNA) powiązanych z morfologią15. CNA są powszechną formą niestabilności genomicznej związanej ze zwiększonym ryzykiem transformacji złośliwej...

Laserowe mikrodyparowanie tkanek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej pozwala na precyzyjne pobieranie komórek z interesujących obszarów histologicznych w celu analizy danych multi-omicznych z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi.

Izolacja komórek z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi z próbek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej za pomocą mikrodysekcji laserowej

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...

Nasze główne zainteresowania badawcze to mechanizmy transformacji złośliwej oraz opracowywanie modeli predykcyjnych chorób potencjalnie złośliwych jamy ustnej, takich jak leukoplakia jamy ustnej i zwłóknienie podśluzówkowe jamy ustnej. Analizy sekwencjonowania genomicznego, transkryptomicznego, proteomicznego i inne wieloomiczne analizy sekwencjonowania oraz modele sztucznej inteligencji oparte na głębokim uczeniu są wykorzystywane do badania progresji od potencjalnie złośliwych chorób jamy ustnej do raka jamy ustnej. Obecne sekwencjonowanie i analizy multiomiczne opierają się głównie na zamrożonych próbkach, ale potencjalnie złośliwe choroby jamy ustnej to głównie tkanki zatopione w parafinie utrwalonej w formalinie, często za pomocą biopsji, i istnieje potrzeba opracowania technik eksperymentalnych opartych na próbkach parafiny.Próbki tkanki parafinowej z potencjalnie złośliwych chorób jamy ustnej i raka płaskonabłonkowego są dostępne w dużych ilościach i z różnych źródeł, co czyni je bardzo cennym źródłem do badań. Nasz protokół może pomóc w pełnym wykorzystaniu tych zasobów, aby zrozumieć mechanizmy rozwoju choroby i transformacji nowotworowej. Na początek, za pomocą mikrotomu, pokrój utrwalone w formalinie tkanki zwłóknienia błony śluzowej jamy ustnej zanurzone w parafinie na ciągłe odcinki o grubości trzech i 10 mikrometrów, a następnie rozłóż skrawki w wodzie.Umieść trzy sekcje mikronów na szkiełku mikroskopu adhezyjnym lub szkiełku A. i 10 mikronów na szkiełku membranowym PEN lub szkiełku B. Umieść oba szkiełka na płycie grzejnej w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Po dwóch godzinach umieść szkiełka A i B w ksylenie na 10 minut, a następnie uwodnij szkiełka w stopniowanych stężeniach etanolu przez jedną minutę w każdym stężeniu. Następnie umieść szkiełka w ultraczystej wodzie destylowanej na 30 sekund.Namocz szkiełka w roztworze barwnika Harris Hematoxylin przez 90 sekund. Ponownie umyj szkiełka trzykrotnie w ultraczystej wodzie destylowanej przez 30 sekund każda. Następnie zanurz szkiełka w roztworze div-hematoksyliny na dwie sekundy.Powrót wsuwa się do ultraczystej wody destylowanej na 30 sekund, powtarzając trzy razy. Następnie zanurz szkiełka A i B w 1% ponownie niebieskim roztworze na dwie sekundy. Po umyciu szkiełek wodą destylowaną umieść je w roztworze eozyny na dwie sekundy.Ponownie zanurz szkiełka w ultraczystej wodzie destylowanej na 30 sekund przed odwodnieniem i zwiększeniem stężenia etanolu. Następnie zanurz szkiełko A w ksylenie na trzy minuty. Na koniec nanieś kroplę medium montażowego na szkiełko A i przykryj je szklaną osłoną.Aby rozpocząć, włącz system i oprogramowanie do mikrodysekcji laserowej. Umieścić szkiełko A zawierające barwione trzymikronowe odcinki tkanek zwłóknienia podśluzówkowego jamy ustnej na stoliku szkiełkowym. Obserwuj morfologię histologiczną, aby zidentyfikować obszar zainteresowania dla mikrodysekcji laserowej.Wyjmij szkiełko A i umieść szkiełko B stroną z tkanką skierowaną w dół na szkiełku stage. Następnie kliknij przycisk rozładowywania, aby wypchnąć urządzenie zbierające. Włóż probówkę do PCR do urządzenia do pobierania i upewnij się, że probówka jest zamocowana, a następnie kliknij przycisk OK.Wybierz nasadkę, klikając odpowiednie czerwone kółko, oznaczając urządzenie zbierające do nasadek rur i poczekaj, aż wybrane kółko zmieni kolor na zielony, a następnie kliknij przycisk rysowania i przycisk rysowania plus cięcia i użyj myszy, aby naszkicować obszar zainteresowania. Kliknij rozpocznij cięcie, aby uchwycić obszar zainteresowania, który zostanie zebrany przez nasadkę. Następnie naciśnij dolny przycisk, aby upewnić się, że pobrana próbka została zebrana.Kliknij przycisk próbki, aby przechwycić następną próbkę. Na koniec kliknij przycisk rozładuj, aby rozładować probówkę do PCR z przechwyconą próbką. W tym badaniu, za pomocą mikrodysekcji laserowej zwłóknienia podśluzówkowego jamy ustnej, wychwytuje się tkanki nabłonka i zrębu o różnych wzorach.Zmiany liczby kopii były obecne w próbkach nabłonkowych, ale nie w próbkach zrębu. Wzorzec zmian liczby kopii w nabłonku dysplastycznym zaobserwowano w chromosomach trzecim i ósmym, podczas gdy zmiany liczby kopii wykryto z mniejszą częstością w chromosomie ósmym w nabłonku zanikowym.

isolation-cells-with-morphological-spatial-information-from-oral

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Mikroskopia z przechwytywaniem laserowym, znana również jako laserowa mikrodysekcja (LMD), umożliwia użytkownikowi izolację niewielkiej liczby komórek lub tkanek z zamrożonych lub ...

Mikrorozcięcie laserowe z wychwytem (Laser Capture Microdissection) tkanek ssaków

Film opisuje laserową sekcję 3D organotypowego modelu współhodowli z precyzją na poziomie mikronów. W modelach organotypowych 3D składniki zrębu, takie jak fibroblasty, są trójwymiarowo współhodowane z komórkami nabłonka nowotworowego. Model 3D służy jako narzędzie eksperymentalne, które umożliwia badanie inwazji i interakcji rak-zrąb w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Mikrodysekcja laserowa: technika izolowania inwazyjnych komórek raka jelita grubego z modelu hodowli organotypowej 3D

Profilowanie molekularne laserowo mikrowypreparowanych komórek i zrębu z syntetycznych, tkankowo modyfikowanych modeli raka jelita grubego stanowi nowatorskie i podatne na manipulację podejście do charakterystyki i analizy charakterystycznej biologii na styku komórek nowotworowych na froncie inwazyjnym i komórek zrębu związanych z rakiem.

Profilowanie molekularne inwazyjnego mikrośrodowiska nowotworu w trójwymiarowym modelu komórek raka jelita grubego i fibroblastów ex vivo

Mikrodysekcja jest szeroko stosowana do badania DNA, RNA i białek w tkance.   Mikroskopia laserowa (LCM) jest najczęściej stosowaną metodą, ale od niedawna dostępna jest nowa technika mielenia, mezodysekcja.  Pokazujemy ekstrakcję RNA z mezorozpreparowanych szkiełek tkankowych zatopionych w parafinie w formalinie ziarniniaków Mycobacterium tuberculosis.

Nowatorskie podejście do mikrodysekcji w celu odzyskania specyficznych transkryptów Mycobacterium tuberculosis z ziarniniaków płuc zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie

Izolacja pojedynczych neuronów dopaminowych lub brzusznego obszaru nakrywki za pomocą bezpośredniej lub pośredniej immunohistochemii jest demonstrowana za pomocą mikrodysekcji laserowej. Omówiono parametry izolacji tkanki ze szkiełka podstawowego za pomocą lasera na podczerwień oraz od szkiełek membranowych z wykorzystaniem kombinacji lasera podczerwonego i ultrafioletowego.

Mikrodysekcja laserowa - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Tutaj prezentujemy protokół do wspomaganej laserem mikrodysekcji określonych typów komórek roślinnych do profilowania transkrypcyjnego. Chociaż protokół jest odpowiedni dla różnych gatunków i typów komórek, nacisk kładziony jest na wysoce niedostępne komórki żeńskiej linii zarodkowej, ważne dla rozmnażania płciowego i apomiktycznego w rodzaju krzyżowych Boechera.

Mikrodysekcja wspomagana laserowo (LAM) jako narzędzie do profilowania transkrypcji poszczególnych typów komórek

Celem tego protokołu jest uzyskanie próbek RNA o wysokiej integralności z zwojów jelitowych wyizolowanych z nieutrwalonej, świeżo wyciętej tkanki jelita ludzkiego za pomocą mikrodysekcji laserowej (LCM). Protokół ten obejmuje przygotowanie błyskawicznie zamrożonych próbek ludzkiej tkanki jelitowej, kriosekcję, barwienie i odwodnienie etanolowe, LCM i ekstrakcję RNA.

Optymalizacja mikrodysekcji laserowej w celu izolacji zwojów jelitowych ze świeżo zamrożonej tkanki ludzkiej

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.

Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

Naucz się izolacji komórek z próbek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej za pomocą mikrodysekcji laserowej. Ta metoda umożliwia analizę wieloomiczną tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie.

Izolacja komórek z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi z próbek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej za pomocą mikrodysekcji laserowej (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja komórek z informacjami morfologicznymi i przestrzennymi z próbek zwłóknienia błony podśluzówkowej jamy ustnej za pomocą mikrodysekcji laserowej

Przeglądaj więcej filmów