Name: Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Poznaj interakcje bakteriofaga T4 z E. coli w jelicie myszy gnotobiotycznej. Metoda pozwala badać dynamikę gospodarz-bakteriofag in vivo oraz zrozumieć rolę fagów w zdrowiu jelit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy przyznają, że ziemia, na której przeprowadzili te badania, jest tradycyjnym, rodowym i niescedowanym terytorium Narodu xwməθkwəy̓əm (Musqueam). Ziemia, na której się znajduje, zawsze była miejscem nauki dla ludu Musqueam, który przez tysiąclecia przekazywał swoją kulturę, historię i tradycje z pokolenia na pokolenie w tym miejscu. Zachęcamy innych do bliższego poznania ojczyzny, w której żyją i pracują w https://native-land.ca. Autorzy potwierdzają wsparcie ze strony Kanadyjskiej Rady Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) Kanadyjskich Stypendiów dla Absolwentów - Magistra (NP), Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, do MH), Programu Discovery Grants Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) (RGPIN-2019-04591 do CT, RGPIN-2016-04282 do LCO), Kanadyjskiego Instytutu Badań Zaawansowanych / Ludzi i Mikrobiomu (FL-001253 Appt 3362, do CT), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, do CT), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 do LCO) oraz Canadian Foundation for Innovation (34673 do LCO i 38277 do CT). Jesteśmy wdzięczni za wsparcie techniczne ze strony Centrum Modelowania Chorób UBC i ubcFLOW, które jest wspierane przez Inicjatywę Odporności Biologicznej UBC GREx, a także członkom laboratoriów Osborne i Tropini za krytyczne dyskusje i ocenę manuskryptu. Rysunek 1A i Rysunek 2A zostały stworzone przy użyciu Biorender.com.

Exploring Gut Phage-Bacteria Dynamics in Murine Models Using T4 Phage

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Bakteriofagi lub fagi to wirusy, które infekują i zabijają bakterie o specyficzności gatunkowej i szczepowej1. Fagi odgrywają ważną rolę w złożonych społecznościach bakteryjnych, takich jak mikrobiota jelitowa, gdzie są zaangażowane w regulację dynamiki populacji i napędzanie sprawności bakterii2. W ciągu ostatniej dekady ponownie wzrosło zainteresowanie badaniami nad fagami ze względu na wzrost liczby patogenów opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe3 oraz potencjał terapii fagowej jako alternatywnej strategii leczenia. W ostatnich latach koktajle fagów litycznych były stosowane dożylnie z pewnym powodzeniem w poważnych, opornych na antybiotyki bakteryjnych infekcjach septycznych u ludzi3,4. Doustna terapia fagowa została również zaproponowana jako potencjalna alternatywa dla antybiotyków w leczeniu infekcji jelitowych i stanów zapalnych. Ponadto fagi są zaangażowane w sukces przeszczepów filtratu kałowego (FFT), które są preparatami mikrobioty kałowej, które zostały przefiltrowane w celu usunięcia bakterii, w leczeniu nawracających infekcji Clostridioides difficile (rCDI)5,6, choroby zapalne jelit (IBD)7,8 i martwicze zapalenie jelit u wcześniaków9. Biorąc pod uwagę te wyniki, ważne jest, aby wziąć pod uwagę interakcje zarówno między fagami a mikrobiotą jelitową, jak i fagami a gospodarzem ssaków, ponieważ dodanie nowych fagów do istniejącej wcześniej społeczności może mieć pośredni wpływ na społeczność jako całość, a nie tylko na bakterie docelowe2,10.
Badanie interakcji fagów z ich docelowymi bakteriami in vitro okazało się przydatne do zrozumienia mechanizmów i wpływu interakcji fagów i bakterii w jelitach. W tym ustawieniu wykazano, że fagi T4 specyficzne dla Escherichia coli z rzędu Caudovirales wymagają domen podobnych do immunoglobuliny (Ig) zlokalizowanych w wysoce antygenowych białkach kapsydu zewnętrznego (Hoc) na powierzchni wirionu, aby przylegać do śluzu jelitowego11. Dodatkowo, testy transwell wykazały, że fagi T4 są zdolne do interakcji z kulturami komórek nabłonkowych i przemieszczania się przez warstwy komórkowe przez makropinocytozę12,13. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że fagi mogą wchodzić w interakcje ze swoim gospodarzem metazoanowym, mimo że nie są zdolne do infekowania komórek eukariotycznych. Modele te, choć użyteczne, nie obejmują pełnego zakresu złożonych interakcji zachodzących w ekosystemie jelitowym, które są wymagane do kompleksowego zbadania trójstronnej interakcji między fagami, bakteriami i gospodarzem metazoanu.
Modele myszy są ważnym narzędziem do badania fagów w złożonych środowiskach. Pożądanym zastosowaniem podawania fagów jest alternatywna strategia leczenia zakażeń opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe lub patobiontów związanych z przewlekłymi chorobami zapalnymi, w tym IBD. Jednak pojawiająca się literatura sugeruje, że zachowanie fagów in vitro nie odzwierciedla w pełni funkcji in vivo. Buttimer i wsp.14 wykazali, że koktajl fagowy był w stanie zubożyć docelowe bakterie w uproszczonym konsorcjum mikrobioty ludzkiej in vitro, ale nie mógł być replikowany in vivo u myszy gnotobiotycznych skolonizowanych tym samym konsorcjum bakterio-. Co więcej, w konwencjonalnym mikrobiomie myszy T7 doprowadził do selektywnego zubożenia docelowych bakterii jelitowych, chociaż z czasem zaobserwowano stopniowe odzyskiwanie, co wskazuje na wyewoluowaną oporność15. Inne badania wykazały współistnienie podawanych doustnie fagów i ich docelowych szczepów bakteryjnych in vivo2,16. Rzeczywiście, poza współistnieniem fagów i bakterii, podawanie fagów doprowadziło do rozległych zmian w ogólnym składzie i funkcji społeczności mikrobioty2,16. Jest to istotne w warunkach chorobowych, ponieważ kilka badań wykazało powiązania między zwiększoną względną liczebnością Caudovirales a IBD7,8,17, które były niezależne od zmian w liczebności bakterii7. Nie wiadomo, czy jest to czynnik napędzający, czy konsekwencja patogenezy choroby.
Historyczne skupienie badań nad fagami skupiało się na związku między fagiem a jego docelową bakterią. Jednak ważne jest również, aby wziąć pod uwagę potencjalne interakcje między fagiem a błoną śluzową, nabłonkiem i układem odpornościowym gospodarza metazoan. Wszystkie te interakcje odgrywają ważną rolę w ogólnej odpowiedzi na zakażenie fagami jelitowymi. Aby to wykazać, fagi badano na myszach wolnych od zarazków (GF), aby wyjaśnić ich wpływ na układ odpornościowy bez ingerencji ze strony mikrobioty8. W tym systemie kwasy nukleinowe fagowe były wykrywane przez receptory Toll-podobne (TLR) zlokalizowane w endosomach fagocytarnych komórek odpornościowych (makrofagów i komórek dendrytycznych). To aktywowało sygnalizację w dół i stymulowało zależną od limfocytów T produkcję interferonu (IFN)-γ8 lub IFNs18. Co więcej, Fluckiger i wsp.19 angażowali limfocyty T CD8 + pamięci w rozpoznawanie antygenów kodowanych przez fagi (profagów), co skutkowało reaktywnością krzyżową limfocytów T z antygenami nowotworowymi, co skutkowało zmniejszeniem obciążenia guza. Wreszcie, produkcja przeciwciał specyficznych dla fagów została udokumentowana w badaniach na myszach, w których fagi były dostarczane do modeli zwierzęcych w sposób ciągły przez wodę pitną8,20, lub przez powtarzane doustne zgłębnik przez kilka miesięcy20, wykazując zdolność białek fagowych do promowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Chociaż te tryby inokulacji fagów pozwalają na optymalne i ciągłe pobudzanie układu odpornościowego, mogą nie reprezentować naturalnie występujących interakcji między fagami a środowiskiem jelitowym, ani kinetyki doustnej terapii fagowej. Do tej pory w ograniczonej liczbie badań analizowano interakcje faga z pojedynczym gatunkiem bakterii w monokolonizowanych modelach myszy21. Jednak monokolonizowane myszy okazały się kluczowe w rozszyfrowywaniu specyficznego dla mikroorganizmów wpływu poszczególnych gatunków na przewód pokarmowy (GI) i rozwój układu odpornościowego22,23,24, i mogą jeszcze okazać się przydatne w zrozumieniu trójstronnych interakcji między fagami, ich docelowymi bakteriami i gospodarzem metazoanu.
Ekscytujące, wciąż jest wiele do nauczenia się na temat interakcji między fagami jelitowymi a bakteriami komensalnymi jelit, a także interakcji, które zachodzą między gospodarzem metazoanu a fagami, które w nim rezydują. Protokół ten zapewnia zestaw procedur do badania izolowanego faga T4 i jego bakteryjnego odpowiednika, E. coli (K-12, BW25113), przy użyciu gnotobiotycznego modelu myszy. Te ustandaryzowane procedury stanowią również podstawę do optymalizacji innych diad fagowo-bakteryjnych poprzez dostosowanie parametrów wzrostu do par zainteresowania. Opisane tutaj metody określają: (1) Przygotowanie faga T4 i lizatów nośnika do doustnego zgłębnika myszy; (2) Doustne podawanie faga T4 monokolonizowanym myszom gnotobiotycznym E. coli; (3) Monitorowanie poziomów fagów T4 w kale i tkankach myszy w czasie.
Dla prezentowanych tutaj reprezentatywnych wyników, oczyszczone lizaty fagów T4 zostały rozmnożone z zapasów banku fagów utrzymywanego przez Rohwer Lab. Metoda rozmnażania faga T4 metodą Phage-on-Tap została dostosowana25, zgodnie z tym protokołem. Metoda pozwala w ciągu trzech dni uzyskać zapasy fagów o wysokim mianie i niskiej zawartości endotoksyn. Stosując to podejście, rutynowo zebrano 10 ml ≥10 10 jednostek tworzących płytkę (pfu)/ml faga T4 z < 0,5 jednostki endotoksyny (EU)/ml. Zalecane poziomy endotoksyn do podawania doustnego lub dożylnego myszom wynoszą odpowiednio ≤20 EU/ml i ≤ 5 EU/kg/h (lub 0,1 UE podawane w ciągu 1 godziny dla myszy o masie 20 g), co czyni ją odpowiednią metodą przygotowania fagów do inokulacji in vivo. Wszystkie stada fagów przechowywano w temperaturze 4 °C w buforze fagowym z soli magnezowej (SM) (receptura podana w kroku 1.1.5.1). E. coli była hodowana w pożywkach LB. Dla różnych par-bakteria na podstawie tego protokołu można dostosować różne podłoża hodowlane i warunki wzrostu. Fagi mogą być również pozyskiwane ze środowiska, takiego jak ścieki, woda morska, gleba i zawartość jelitowa, i mogą być izolowane i oczyszczane zgodnie z Sambrook and Russell26 przed przygotowaniem przy użyciu odpowiednich warunków wzrostu i rozmnażania dla każdej pary-gospodarz będącej przedmiotem zainteresowania25. Alternatywnie, fagi można uzyskać ze źródeł komercyjnych (patrz tabela materiałów) lub z banków fagów.

<table><tbody><tr><td>1-oktanol (99%)</td><td>Thermofisher</td><td>CAAAA15977-AP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml PES Steriflip Sterylne jednorazowe filtry próżniowe</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>SCGP00525</tr><tr><td>Agaroza (klasa nisko-EEO/wielozadaniowa/biologii molekularnej)</td><td>Odczynniki Fisher&nbsp;</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&reg; 100kDa Ultra-15 filtr odśrodkowy, Ultracel-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>BD Microtainer&reg; Rury, SST</td><td>BD Medyczne</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>hermetyczne klatki biowykluczające (klatki ISO)&nbsp;</td><td>Techiplast</td><td>1245ISOCAGE</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Dotyk&handel; Termocykler z 96-dołkowym modułem szybkiej reakcji</td><td>BioRad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia (białe kryształy do proszku)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510-500</td><td></td></tr> Cap <tr><td>Locks do probówki 1,5 ml 100/pk</td><td>Andwin Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>16812612</tr><tr><td>Chloroform (etanol jako środek konserwujący/certyfikowany ACS)</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki stalowe powlekane miedzią (4,5 mm)</td><td>Crosman Corporation</td><td>0767</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Zestaw chusteczek higienicznych (50)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy, roztwór soli disodowej, do biologii molekularnej, 0,5 M w H2O</td><td>Sigma</td><td>Aldrich E7889</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&handel; Agar, proszek / płatki, odczynniki Fisher BioReagents i handel; &nbsp;</td><td>Odczynniki Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki Fisher i handel; Pożywki mikrobiologiczne: bulion LB (proszek) - Lennox&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Green FastMix&reg; qPCR mix, 1250 rxns</td><td>QuantaBio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>Filtry HEPA do pokryw izoklatowych, AUTOKLAWOWALNE FILTRY H14 DO ISO NAPROMIENIOWANY LINIOWO</td><td>Techiplast</td><td>UISOHEPAXTBOX-300</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Wytrząsarka inkubowana</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>8354-30-0009</td><td></td></tr><tr><td>Podłoża mikrobiologiczne: bulion LB (proszek) - Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek z zatrzaskiem blokującym, 2ml</td><td>Fisher</td><td>14-666-315</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Zapasy fagów</td><td>Carolina Biological Supply&nbsp;</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>PicoLab&reg; Dieta mysia 20 EXT</td><td>LabDiet</td><td>5R58</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; Zestaw Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A39552S</tr><tr><td>RNaza A (17 500 U)</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNaz wolnych od RNaz</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (drobny biały proszek)</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (krystaliczny/certyfikowany ACS)</td><td>Sonikator Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>(sonda model CL-18; źródło zasilania model FB50)</td><td>Fisher scentific&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny izolator z elastyczną folią&nbsp;</td><td>Klasa Biologicznie czysta&nbsp;</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&trade; Bezpieczny barwnik żelowy DNA</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termocykler&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>starter fagowy T4, naprzód (CCACACATAGCGCGAGTATAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>starter fagowy T4, naprzód (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, roztwór 1M, pH 8,0, klasa biologii molekularnej, Ultrapure</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AAJ22638AE</tr><tr><td>Woda, (bez DNASE, RNAZY)</td><td>Odczynniki Fisher BP2484100</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

interakcja bakteriofaga t4 i e. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bakteriofagi (fagi) to wirusy, które infekują bakterie o specyficzności gatunkowej i szczepowej i są najliczniejszymi jednostkami biologicznymi we wszystkich znanych ekosystemach. W społecznościach bakteryjnych, takich jak te występujące w mikrobiocie jelitowej, fagi są zaangażowane w regulację dynamiki populacji mikrobioty i napędzanie ewolucji bakterii. W ostatniej dekadzie ponownie wzrosło zainteresowanie badaniami nad fagami, częściowo ze względu na specyficzne dla gospodarza zdolności fagów litycznych do zabijania, które stanowią obiecujące narzędzie do przeciwdziałania rosnącemu zagrożeniu ze strony bakterii opornych na środki przeciwdrobnoustrojowe. Co więcej, ostatnie badania wykazujące, że fagi przylegają do śluzu jelitowego, sugerują, że mogą one odgrywać ochronną rolę w zapobieganiu inwazji bakterii do leżącego poniżej nabłonka. Co ważne, podobnie jak mikrobiomy bakteryjne, zaburzone fageomy są związane z pogorszeniem wyników w chorobach takich jak nieswoiste zapalenie jelit. Wcześniejsze badania wykazały, że fagi mogą modulować mikrobiom zwierząt i ludzi poprzez przeszczepy filtratu kałowego, korzystnie wpływając na zdrowie gospodarza. Wraz z tą ostatnią falą badań pojawia się konieczność ustanowienia i standaryzacji protokołów badania fagów w kontekście mikrobiomu jelitowego. Protokół ten zapewnia zestaw procedur do badania izolowanych fagów T4 i ich gospodarza bakteryjnego, Escherichia coli, w kontekście mysiego przewodu pokarmowego. Opisane tutaj metody opisują, jak zacząć od lizatu fagowego, podawać go myszom i oceniać wpływ na poziom bakteryjnego gospodarza i faga. Protokół ten może być modyfikowany i stosowany do innych par-bakteria i stanowi punkt wyjścia do badania dynamiki gospodarz-in vivo.

W celu zbadania interakcji między diadą faga T4/E. coli w jelitach myszy, przygotowano, oczyszczono i spuryfikowano lizaty faga T4 oraz lizaty kontrolne (Rysunek 1A). Lizaty faga T4 zmiareczowano metodą płytkową i rozcieńczono do stężenia 2 x 107 pfu/mL (2 x 106 pfu/mysz) w buforze SM. Lizaty kontrolne również zmiareczowano, aby potwierdzić brak obecności żywych fagów, a następnie rozcieńczono w takiej samej objętości buforu SM, co lizat faga T4. Poziomy endotoksyn w rozcieńczonych lizatach określono ilościowo za pomocą chromogenicznego zestawu do oznaczania endotoksyn. Lizaty faga T4, faga inaktywowanego termicznie oraz lizaty kontrolne wykazały poziomy endotoksyn poniżej dopuszczalnych norm dla wody pitnej (&#60;20 EU/mL)25&#160;(Rysunek 1B). Ponieważ lizat kontrolny zawierał podobną ilość endotoksyn co lizat faga T4, uznano go za odpowiednią kontrolę. Lizat faga inaktywowanego termicznie (2 x 107&#160; pfu/mL przed obróbką termiczną) zawierał mniej endotoksyn niż zarówno lizat kontrolny, jak i lizat faga T4. Zgodnie z instrukcją zestawu, próbki poddane działaniu 1-oktanolu przetestowano pod kątem inhibicji testu poprzez dodanie standardu endotoksyn do lizatu kontrolnego (kontrola wzbogacona), aby uzyskać stężenie końcowe 0,5 EU/mL. Poziomy endotoksyn w kontroli wzbogaconej pomniejszone o poziomy endotoksyn w kontroli wynosiły 0,5 EU/mL ±25%, zgodnie z zaleceniami producenta (Rysunek 1B). Wykazano tym samym, że 1-oktanol został skutecznie usunięty i że lizaty nie powodowały inhibicji testu, która mogłaby wpłynąć na wyniki analizy.
E. coli Myszy C57BL/6 monokolonizowane szczepem K-12 (BW2513) hodowano w sterylnym izolatorze z elastycznej folii winylowej w warunkach gnotobiotycznych (Rysunek 2A). Myszy pokolenia F0 zostały skolonizowane przez E. coli poprzez wprowadzenie ich do środowiska oraz wspólne przetrzymywanie. Tylko potomstwo (pokolenia F1 i F2), które zostało skolonizowane przez E. coli do eksperymentów wykorzystano zwierzęta, które zostały zainfekowane od urodzenia poprzez transmisję pionową oraz wspólne kwaterowanie. Strategia ta pozwoliła kontrolować zmiany w układzie odpornościowym, produkcji śluzu oraz rozwoju przewodu pokarmowego, które następują w odpowiedzi na inokulację bakteryjną.22,37co pozwala na pomiar zmian występujących wyłącznie w wyniku wprowadzenia fagów. Po osiągnięciu dojrzałości myszy eksperymentalne przeniesiono do sterylnych klatek izolacyjnych (isocages), gdzie każda z nich otrzymała 2 x 106 pfu faga T4 lub równą objętość lizatu nośnika poprzez zgłębnik żołądkowy w wieku 6–8 tygodni. Fag T4 i E. coli obfitość monitorowano przez cztery tygodnie poprzez pobieranie pelletów fekalnych oraz przeprowadzanie testów z wysiewem punktowym odpowiednio na agarze 0,5% (miękki) lub 1,5%. W trakcie tego eksperymentu fagi T4 i E. coli były w stanie współistnieć bez wyczerpania którejkolwiek z populacji (Rycina 2B, C). Doustne podanie bakteriofaga T4 w niższych dawkach 2 x 102 oraz 2 x 104 pfu/mysz nie zmniejszyło zdolności faga T4 do kolonizacji jelit w porównaniu z 2 x 106 pfu (Rycina 2D). Podobnie, efekt zależny od dawki inokulacji T4 na E. coli poziomów nie zaobserwowano (Rycina 2E).
Kluczowe okazało się zachowanie spójności procesu wysiewania próbek w odniesieniu do liczby plam pływkowych. Na przykład ustalono, że podczas dodawania bakterii do miękkiego agaru gęstość bakterii miała istotny wpływ na wynik analizy. Dodanie E. coli poddano subkulturze przez 1 h, 1,5 h lub 2 h, skutkowało niższą liczbą placków niż w przypadku dodania E. coli podzeszpikowane przez 2,8 h lub dłużej. Co więcej, kwantyfikacja plam ustabilizowała się na poziomie ~1 x 109 pfu/ml&#160;kiedy E. coli poddano pasażowi przez okres od 2,8 h do 16 h (przez noc), co stanowiło około 5-krotny wzrost w porównaniu z wartością obliczoną dla 1-godzinnego pasażu (~2 x 108 pfu/ml) (Rycina 3A). Zamiast&#160;podłoża, docelowe bakterie można zaszczepić do miękkiego agaru z kultur nocnych. W tym przypadku objętość 16-godzinnej (nocnej) E. coli kultura zaszczepiona do miękkiego agaru wpłynęła na liczbę placków (Rycina 3B). Wyniki te wskazują, że gęstość E. coli wewnątrz agaru może wpływać na&#160;liczba płytek w teście plackowym. W obu podejściach wyniki ilościowe fagów osiągnęły plateau na tym samym poziomie (109 pfu/ml), co sugeruje, że bakterie docelowe muszą występować w agarze miękkim w dostatecznie wysokiej gęstości, aby zapewnić dokładność zliczania placków.
Wszystkie razem wzięte wyniki te podkreślają znaczenie wypracowania zrozumienia kinetyki interakcji fagi-bakterie poprzez pilotażowe eksperymenty in vitro oraz in vivo przed przeprowadzeniem manipulacji eksperymentalnych.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig01v2.jpg" /> 
Rycina 1: Przygotowanie lizatów fagowych. (A) Schemat przygotowania lizatu fagowego z zapasu fagów o wysokim mianie. Lizaty były propagowane, oczyszczane, zagęszczane, a endotoksyny usuwane. Zanieczyszczający 1-oktanol usunięto za pomocą wirówki próżniowej. (B) Ilość endotoksyn w lizatach fagowych oraz lizatach kontrolnych (nośnikach) została określona za pomocą chromogenicznego zestawu do ilościowego oznaczania endotoksyn. Przerywane niebieskie linie wskazują górną i dolną granicę służącą do wykluczenia inhibicji produktu w kontroli inhibicji produktu (0,5 EU/mL ± 25%). Każdy punkt reprezentuje jeden z dwóch powtórzeń technicznych. Wysokość słupka przedstawia średnią z powtórzeń. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig02v2.jpg" /> 
Rycina 2Generowanie myszy monokolonizowanych oraz monitorowanie poziomu fagów i bakterii w odchodach. (A) Schemat kolonizacji myszy wolnych od mikroorganizmów pojedynczym gatunkiem bakterii oraz generowania monokolonizowanych myszy F1 i F2. (B-E) Poziomy fagów T4 i *E. coli* wykryte w odchodach myszy C57BL/6, które urodziły się monokolonizowane przez E. coli Następnie w wieku 6–8 tygodni zaszczepiono je fagiem T4. W dniu 0. (przed kolonizacją) oraz we wskazanych dniach po kolonizacji zmierzono poziomy faga T4 za pomocą metody spot plating oraz testów plackowych z wykorzystaniem metody pojedynczej warstwy agaru. *E. coli* poziomy mierzono metodą spot platingu na 1,5% agarze LB.B, C) Kinetyka (B) fage T4 i (C) E. coli poziomy w odzyskanych pelletach kałowych po inokulacji dawką 2 x 106&#160;pfu fagów T4 lub lizatu kontrolnego (znormalizowanego pod względem objętości i poziomu endotoksyn). (D,&#160;E) (D) faga T4 i (E) E. coli poziomy w odzyskanych odchodach po inokulacji dawką 2 x 102 pfu, 2 x 104 pfu lub 2 x 106 pfu faga T4. Słupki błędów reprezentują średnią oraz błąd standardowy średniej (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig02largev2.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig03v2.jpg" /> 
Rysunek 3: Rozwiązywanie problemów z dokładnością w testach plaque assay. (A) Miano lizatu faga T4 z wykorzystaniem nocnych kultur lub subkultur E. coli do przygotowania miękkiego agaru (0,5% agaru, LB). Subkultury przygotowano poprzez rozcieńczenie 1:50 nocnej kultury E. coli w świeżej pożywce LB. Do 5 mL przygotowanego miękkiego agaru wprowadzono 10 µL E. coli oraz 20 µL faga T4. CaCl2&#160;i MgSO4 nie były dodawane do miękkiego agaru w tych testach, ale mogą zostać dodane w razie potrzeby. Czas inkubacji subkultury E. coli poniżej 2,8 h prowadził do niższego pozornego miana faga. (B) Miano lizatu faga T4 z wykorzystaniem różnych gęstości E. coli w przygotowaniu miękkiego agaru. Dodawanie różnych objętości E. coli z kultury nocnej (bez subkulturowania, jak w punkcie A) do miękkiego agaru skutkowało różnymi pozornymi mianami faga. Słupki błędów przedstawiają obliczoną niepewność miana faga. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig03largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Bakteriofagi (fagi), wirusy infekujące bakterie, są integralnym składnikiem mikrobiomu jelitowego. Chociaż ci symbiotyczni mieszkańcy napędzają sprawność bakterii i dynamikę populacji, niewiele wiadomo o tym, jak wpływają na homeostazę i choroby jelit. W tym protokole bada się izolowane fagi T4 w modelu mysim, które można dostosować do innych par-bakteria.

Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Nasze badania mają na celu zrozumienie trójstronnych interakcji między bakteriofagami, bakteriami i układem odpornościowym ssaków w kontekście jelit, gnotobiotycznego jelita myszy. Mamy nadzieję, że uda nam się uzyskać wgląd w te interakcje w warunkach zdrowotnych i chorobowych, aby lepiej zrozumieć znaczenie mikrobiomu jelitowego. Ostatnie odkrycia wykazały, że bakteriofagi mogą być wykrywane przez układ odpornościowy ssaków.Sugeruje się, że ludzki fageom jelitowy może być rozregulowany w stanach chorobowych, takich jak nieswoiste zapalenie jelit, a stymulacja immunologiczna przez fagi może zaostrzyć fenotypy choroby. Naszym celem jest dostarczenie innym ustandaryzowanego protokołu produkcji lizatu fagowego T4 do inokulacji i liczenia w gnotobiotycznych modelach mysich. Protokoły te można oprzeć i zmodyfikować do stosowania z innymi parami bakteriofagów Na początek posadź Escherichia coli w 5 mililitrach pożywki Luria-Bertani lub LB w sterylnej probówce polistyrenowej lub szklanej.Inkubować probówkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przy 200 obr./min. Subkultura wyhodowana przez noc 1-50 w 100 mililitrach LB w stożkowej kolbie. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez około 1,5 godziny.Następnie dodaj 100 mikrolitrów faga T4 o wysokim mianie do kultury E. coli i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przez trzy godziny. Gdy lizat faga T4 jest klarowny, zbierz je w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Odwirować zestaw lizatu 4 000 G przez 20 minut, aby osadzać wszelkie pozostałe bakterie i resztki komórkowe.Filtr: Wysterylizuj powstały supernatant za pomocą nylonowego filtra o grubości 0,22 mikrona i zbierz filtrat do nowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 0,1 objętości chloroformu do przefiltrowanego lizatu fagowego T4, aby zabić pozostałe bakterie i zapobiec rozwojowi bakterii. Krótko wirować i inkubować lizat w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Odwirować lizat przy 4 000 G przez 5 minut w celu oddzielenia chloroformu od lizatu. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie przenieś górną warstwę lizatu do nowej 50-mililitrowej probówki. Dodaj 13 mililitrów lizatu fagowego do górnego zbiornika 100-kilodaltonowego odśrodkowego urządzenia filtrującego.Zagęścić lizat w stężeniu 4 000 G przez 5 minut lub do momentu, gdy większość lizatu przejdzie przez filtr. Za pomocą pipety P200 lub P1000 delikatnie odpipetuj pozostałe 2 mililitry lizatu w górę iw dół w górnym zbiorniku, aby odblokować membranę filtra. Wylać filtrat z dolnego zbiornika do pojemnika na odpady.Powtórz zatężanie i zatrzymaj około 2 mililitry skoncentrowanego faga w górnym zbiorniku. Po ostatnim wirowaniu delikatnie odpipetuj pozostały lizat w górę iw dół w górnym zbiorniku. Aby przepłukać lizat faga, dodaj 12 mililitrów soli magnezowej lub buforu SM do górnego zbiornika i odwiruj przy 4 000 G przez 10 minut.Po drugim płukaniu ponownie zawiesić pozostałe 2 mililitry lizatu w buforze SM do końcowej objętości 10 mililitrów. Przenieś lizat do 50-mililitrowej probówki i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Aby usunąć zanieczyszczające endotoksyny, dodaj 0,4 objętości 1-oktanolu do całkowitej objętości lizatu.Uszczelnij pokrywę probówki folią uszczelniającą i wstrząsaj z prędkością 120 obr./min przez 1 godzinę, a następnie inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny bez wstrząsania. Odwirować w celu oddzielenia lizatu oczyszczonego z endotoksyn od 1-oktanolu. Ostrożnie usuń jak najwięcej 1-oktanolu za pomocą pipety P1000 i wyrzuć go do odpowiedniego pojemnika na odpady.Za pomocą igły o rozmiarze 18 G i strzykawki o pojemności 10 mililitrów zbierz lizat fagowy pod pozostałą warstwą 1-oktanolu. Przenieś 1 mililitr podwielokrotności lizatu fagowego T4 do sterylnych 1,5 mililitrowych probówek wirówek. Szybko odkurzyć probówki z otwartymi pokrywkami na 4 000 G, aby odparować resztki 1-oktanolu z lizatu.Przygotować seryjne rozcieńczenie lizatu fagowego w czynnikach 10. Następnie naniec 5 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytki agarowe LB i inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia policz tabliczki, aby obliczyć jednostki tworzące płytki nazębne lub PFU.Rozcieńczyć powstały lizat w buforze SM do pożądanego stężenia i ponownie mianować w celu potwierdzenia. Skoncentrowany lizat należy przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu użycia. Na początek zbierz granulki kału od myszy monokolonizowanych Escherichia coli zaszczepionych fagami T4 do sterylnej, wstępnie zważonej probówki mikrowirówkowej.Zapisz końcową masę probówki i oblicz masę próbki, odejmując początkową masę probówki. Dodaj 1 mililitr sterylnego buforu SM do probówki i wiruj z maksymalną prędkością, aby homogenizować granulki kału. Zapisać objętość buforu SM dodanego do każdej próbki dla jednostek tworzących kolonie lub obliczeń CFU lub PFU na gram.Przygotować serię ośmiu seryjnych rozcieńczeń po 20 mikrolitrów każdej próbki w buforze SM o pojemności 180 mikrolitrów. Umieścić 5 mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytce agarowej LB zawierającej E. coli lub tylko płytki agarowe LB w celu określenia stężenia faga T4 i E. coli. Pozostaw każde miejsce do wyschnięcia przed odwróceniem płytek i inkubacją przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia wybierz rozcieńczenie z 3-30 policzalnymi blaszkami na plamkę. Policz i zapisz liczbę użytych blaszek i rozcieńczeń. Podziel liczbę blaszek przez objętość platerowanych w każdym miejscu, aby uzyskać PFU na mikrolitr.Pomnóż to przez współczynnik rozcieńczenia i objętość buforu SM dodanego do każdej próbki dla PFU na próbkę. Na koniec podzielić przez masę próbki, aby uzyskać PFU na gram próbki. Poziomy faga T4 i E. coli wykryte u myszy, którym wstrzyknięto 2 na 10 do 6. PFU faga T4 lub lizatu nośnika, wykazały współistnienie faga T4 i E. coli bez uszczuplenia którejkolwiek populacji w ciągu czterech tygodni.Niższe dawki faga T4 nie wpływały na kolonizację w porównaniu do 2 na 10 do 6. PFU i nie zaobserwowano wpływu zależnego od dawki na poziomy E. coli.

t4-bacteriophage-e-coli-interaction-murine-intestine-prototypical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy artykuł opisuje procedurę przygotowania znakowanej fluorescencyjnie wersji bakteriofaga lambda, zakażania bakterii E. coli, obserwowania efektów zakażenia pod mikroskopem oraz analizy wyników infekcji.

Śledzenie losów komórek E. coli po infekcji fagiem lambda

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024).This video demonstrates the in vivo interaction between T4 bacteriophage and E. coli in the murine intestine, and the fecal spot plating method to quantify their coexistence by measuring bacterial colonies and phage plaques.

Assessing the Coexistence of T4 Bacteriophage and E. coli in Murine Fecal Samples

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate

Ten protokół opisuje solidną metodę korzystania z ustawień o wysokiej przepustowości do badania skuteczności przeciwbakteryjnej koktajli bakteriofagowych.

Skuteczność bakteriofagów w biokontroli patogenów przenoszonych przez żywność oceniana za pomocą ustawień o wysokiej przepustowości

Opisujemy protokół służący do identyfikacji kluczowych ról cząsteczek sygnałowych gospodarza w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa, gamma herpeswirusa 68 (γHV68). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy oraz fibroblasty zarodkowe do litycznej replikacji γHV68, protokół ten umożliwia zarówno charakterystykę fenotypową, jak i analizę molekularną oddziaływań wirus-gospodarz podczas litycznej replikacji wirusa.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Członkowie rodzaju Burkholderia są patogenami o znaczeniu klinicznym.  Opisujemy metodę całkowitej ekstrakcji białek bakteryjnych, wykorzystującą mechaniczne rozerwanie i elektroforezę żelową 2D do późniejszej analizy proteomicznej.

Metody ekstrakcji białka całkowitego i elektroforezy żelowej 2D dla gatunków Burkholderia

Tutaj opisana jest procedura przeprowadzania infekcji ogólnoustrojowej u noworodka szczura za pomocą kultur Escherichia coli K1. Ten nieinwazyjny zabieg pozwala na kolonizację przewodu pokarmowego, translokację patogenu do krążenia ogólnoustrojowego oraz inwazję ośrodkowego układu nerwowego w splocie naczyniówkowym.

Nieinwazyjny model neuropatogennego zakażenia Escherichia coli u nowonarodzonego szczura

Obecne badanie opisuje rozwój i zastosowania genetycznie modyfikowanego systemu testowego opartego na transfekcji komórek białaczki bazofilnej szczurów z genem FcεRIα konia. Transfekowane komórki wyrażają funkcjonalny receptor, w którym uwalnianie mediatorów odpowiedzi alergicznej może być aktywowane przez IgE i antygen.

Opracowanie systemu modelowego in vitro do badania interakcji Equus caballus IgE z jego receptorem o wysokim powinowactwie FcεRI

Poznaj interakcje bakteriofaga T4 z E. coli w jelicie myszy gnotobiotycznej. Metoda pozwala badać dynamikę gospodarz-bakteriofag in vivo oraz zrozumieć rolę fagów w zdrowiu jelit.

Interakcja bakteriofaga T4 i E. coli w jelicie myszy: prototypowy model do badania dynamiki gospodarz-bakteriofag in vivo

Przeglądaj więcej filmów