Name: Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj metodę krystalizacji białek i zbierania danych dyfrakcyjnych in situ przy użyciu linii badawczej VMXi w temperaturze pokojowej. Protokół umożliwia analizę struktur białek bez konieczności kriochłodzenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wielu naukowcom z Diamentowego Źródła Światła i członkom zespołu wsparcia, którzy przyczynili się do zaprojektowania, budowy i działania linii badawczej VMXi. Jesteśmy wdzięczni użytkownikom linii badawczych, którzy wnieśli swoje pomysły do rozwoju rurociągów krystalizacji i gromadzenia danych. Zakład krystalizacji w Harwell jest wspierany przez Diamond Light Source Ltd, Rosalind Franklin Institute i Radę Badań Medycznych.

Automated Protein Crystallization and Real-Time Data Collection

<ol><li>Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((20+years+of+crystal+hits%3A+Progress+and+promise+in+ultrahigh-throughput+crystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 3), 198-205 (2023).</li>
<li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+room+temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, 1(2021).</li>
<li>Helliwell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+structural+chemistry+of+the+living+organism+at+its+temperature+and+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">What is the structural chemistry of the living organism at its temperature and pressure.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (Pt 2), 87-93 (2020).</li>
<li>Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+biomolecular+structures+near+room+temperature+using+x-ray+crystallography%3A+Concepts%2C+methods+and+future+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Determining biomolecular structures near room temperature using x-ray crystallography: Concepts, methods and future optimization.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 1), 78-94 (2023).</li>
<li>Keedy, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+cryocooling+distorts+conformational+heterogeneity+in+a+model+michaelis+complex+of+dhfr%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal cryocooling distorts conformational heterogeneity in a model michaelis complex of dhfr.</a> Structure. 22 (6), 899-910 (2014).</li>
<li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+ligand+binding+of+endothiapepsin+by+%27temperature-resolved%27+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing ligand binding of endothiapepsin by 'temperature-resolved' macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 8), 964-974 (2022).</li>
<li>Sanchez-Weatherby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vmxi%3A+A+fully+automated%2C+fully+remote%2C+high-flux+in+situ+macromolecular+crystallography+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Vmxi: A fully automated, fully remote, high-flux in situ macromolecular crystallography beamline.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26 (Pt 1), 291-301 (2019).</li>
<li>Jacquamet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+vapor+diffusion+crystallization+drops+with+an+x-ray+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of vapor diffusion crystallization drops with an x-ray beam.</a> Structure. 12 (7), 1219-1225 (2004).</li>
<li>Mikolajek, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-to-structure+pipeline+for+ambient-temperature+in+situ+crystallography+at+vmxi%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Protein-to-structure pipeline for ambient-temperature in situ crystallography at vmxi.</a> IUCrJ. 10, 420-429 (2023).</li>
<li>Douangamath, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+efficient+fragment+screening+at+xchem+facility+at+diamond+light+source%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualised+Experiments%22%5BJournal%5D)">Achieving efficient fragment screening at xchem facility at diamond light source.</a> Journal of Visualised Experiments. (171), (2021).</li>
<li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ispyb%3A+An+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Ispyb: An information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li>
<li>Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., Mcauley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchweb%3A+A+modern+interface+for+ispyb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Synchweb: A modern interface for ispyb.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (Pt 3), 927-932 (2015).</li>
<li>Jenkins, J., Cook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito%C2%AE%3A+An+accurate+nanoliter+dispensing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%3A+Journal+of+the+Association+for+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Mosquito®: An accurate nanoliter dispensing technology.</a> JALA: Journal of the Association for Laboratory Automation. 9 (4), 257-261 (2016).</li>
<li>Gildea, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xia2.Multiplex%3A+A+multi-crystal+data-analysis+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Xia2.Multiplex: A multi-crystal data-analysis pipeline.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 6), 752-769 (2022).</li>
<li>Winter, G., Mcauley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+data+collection+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Automated data collection for macromolecular crystallography.</a> Methods. 55 (1), 81-93 (2011).</li>
<li>Jumper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+accurate+protein+structure+prediction+with+alphafold%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly accurate protein structure prediction with alphafold.</a> Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dials+as+a+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Dials as a toolkit.</a> Protein Science. 31 (1), 232-250 (2022).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Opisaliśmy pełną procedurę od momentu przybycia próbki białka do CF do pobrania przez użytkownika danych końcowych do dalszych zastosowań. Krytycznymi etapami są produkcja wysokiej jakości próbki białka i odpowiednich ekranów krystalicznych, przy użyciu komercyjnych rzadkich ekranów matrycowych lub ekranów optymalizacyjnych opartych na ustalonych warunkach. Proces ten może odbywać się w CF, lub użytkownicy mogą przeprowadzić procedury krystalizacji w domowych laboratoriach i przynieść na linię badawcze odpowiednie płytki krystalizacyjne. Określenie odpowiednich parametrów gromadzenia danych może być ważne w przypadku niektórych próbek, szczególnie tam, gdzie problemem jest uszkodzenie przez promieniowanie. W większości przypadków zautomatyzowane przetwarzanie danych jest w pełni wystarczające, aby odpowiedzieć na pytanie naukowe, chociaż użytkownicy zachowują możliwość ponownego przetwarzania za pomocą narzędzi linii badawczej, na przykład gdy grupa kosmiczna jest niejednoznaczna lub wykorzystuje się tylko początkową część zebranych danych w celu zminimalizowania skutków uszkodzeń radiacyjnych.
Jeśli odpowiednie kryształy nie zostaną wytworzone w początkowych próbach krystalizacji, wówczas można zbadać zmiany w stężeniu białka, czystości lub ekranizacji krystalizacji, podobnie jak zastosowanie zasiewania kryształów. Jeśli kryształy nie ulegają dyfrakcji do użytecznej rozdzielczości na linii badawczej, wówczas skany siatkowe mogą być używane z wiązką nietłumioną do oceny nieodłącznej granicy dyfrakcji i komórki elementarnej kryształów w celu kierowania działaniami optymalizacyjnymi. Kryształy, które są zbyt małe, aby można je było zebrać na płytkach (np. <10 μm), mogą zamiast tego nadawać się do krystalografii szeregowej lub eksperymentów nanofokusowych (np. na linii badawczej Diamond VMXm). Rozwiązywanie struktur przy użyciu danych VMXi jest na ogół proste dzięki zastąpieniu molekularnemu, szczególnie od czasu pojawienia się Alphafold16 , który zapewnia skuteczne modele wyszukiwania. Jeśli to się nie powiedzie, kryształy mogą być zbierane i kriochłodzone z płytek, aby umożliwić konwencjonalne eksperymenty z dyfrakcją anomalną na jednej długości fali, dyfrakcją anomalną na wielu długościach fal lub fazami na długich długościach fal.
Do zalet tej metody należy możliwość uzyskania szybkich, wysokiej jakości zbiorów danych i informacji zwrotnych bezpośrednio z płytek krystalizacyjnych bez konieczności zakłócania kryształów ze środowisk, w których rosły. Tak zwany "renesans temperatury pokojowej" w biologii strukturalnej kładzie nacisk na struktury uzyskane w warunkach niekriogenicznych, aby umożliwić zbadanie większego znaczenia fizjologicznego i dynamiki białek2. Zwykle osiąga się nieco niższą rozdzielczość niż w przypadku zoptymalizowanego kryształu chłodzonego kriogenicznie, ale tylko wtedy, gdy ustalono odpowiednie warunki kriogeniczne i jeśli kryształy są odporne na mechaniczne przenoszenie i otwieranie kropli krystalizacji3. Nadchodzącym zastosowaniem, do którego ta linia produkcyjna jest bardzo dobrze dopasowana, jest badanie przesiewowe na dużą skalę kompleksów białko-ligand lub kampanii fragmentów w temperaturze pokojowej w procesie odkrywania leków. Ligandy lub fragmenty mogą być kokrystalizowane lub dodawane za pomocą pipety lub akustycznego wyrzutu kropli przed zebraniem danych w temperaturze pokojowej. Innym zastosowaniem jest szybki pomiar danych z wielu setek lub tysięcy kryształów w bardzo wydajny sposób, a następnie użycie oprogramowania DIALS17 multiplex14 do ekstrakcji izomorficznych klastrów, które mogą reprezentować różne jednostki biologiczne lub do ustalenia statystycznie istotnych różnic między populacjami kryształów, które zostały potraktowane w inny sposób lub wystawione na działanie różnych ligandów lub sygnału.

Krystalografia rentgenowska pozostaje kluczowym narzędziem do zrozumienia struktury i funkcji białek, dostarczając struktury białek lub ich kompleksów o wysokiej rozdzielczości, na przykład z substratami lub kandydatami na leki. Jednak w wielu przypadkach uzyskanie kryształów o pożądanych właściwościach - wysoce dyfrakcyjnych, krystalicznej formie podatnej na nasiąkanie i bez patologii kryształów, takich jak bliźniacze - pozostaje znaczącym wąskim gardłem1. Ponieważ na ogół nie można przewidzieć odpowiednich warunków chemicznych do produkcji kryształów białkowych, standardem jest badanie przesiewowe krystalizacji badające tysiące potencjalnych mieszanin chemicznych, często wspomagane przez automatykę/robotykę w ustawianiu ekranów i hoteli kryształowych do monitorowania, często zdalnie, zarejestrowanych obrazów kropli krystalizacji.
Gdy pojawiają się kryształy, zazwyczaj muszą być zebrane ze środowiska krystalizacji za pomocą pętli nylonowej lub kaptonowej, a następnie przeniesione do kropli zawierającej środek krioprotekcyjny (którego poszukiwanie jest dodatkową zmienną) przed zanurzeniem w ciekłym azocie. Te dodatkowe etapy między krystalizacją a zbieraniem danych rentgenowskich mogą obejmować między innymi odwodnienie kropli krystalizacji, gdy jej uszczelnione środowisko zostanie przerwane, naprężenia mechaniczne kryształu podczas obchodzenia się z nim oraz uszkodzenia sieci krystalicznej przez środki kriopekcyjne (zwykle powodujące zwiększone rozprzestrzenianie się mozaiki)2. Ponadto zbieranie kryształów jest czasochłonne i pracochłonne i może prowadzić do niejednorodności między próbkami, zwłaszcza gdy podczas procesu zbioru tworzy się skórka na kroplach. Linia badawcza VMXi zapewnia dostęp do użytecznych danych z kryształów, które są przyklejone do płytki, a które w przeciwnym razie zostałyby odrzucone w celu zbierania danych.
Zdecydowana większość struktur krystalicznych promieniowania rentgenowskiego jest określana w temperaturze 100K przy użyciu powyższego podejścia, co umożliwia prosty transport i obsługę kryształów oraz zwiększa czas życia kryształów w wiązce rentgenowskiej o rzędy wielkości. Rośnie jednak zainteresowanie wyznaczaniem struktur w warunkach niekriogenicznych, czyli znacznie bliższych warunkom fizjologicznym istotnym dla funkcji białek2,3,4. Umożliwia to znacznie lepsze zrozumienie dynamicznej struktury białek, pozwala uniknąć konformacji aminokwasów lub zamrożenia pętli w funkcjonalnie nieistotnych stanach5, a także umożliwia badanie wiązania ligandów w warunkach znacznie bliższych warunkom występującym w naturalnym środowisku białka w komórce i organizmie6.
Alternatywne podejście, wdrożone na linii badawczej Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) w synchrotronie Diamond Light Source, UK, polega na pomiarze danych dyfrakcyjnych bezpośrednio z kryształów w środowisku, w którym rosły (tj. w obrębie płyty krystalizacyjnej), w warunkach otoczenia i bez zakłóceń7,8. Umożliwia to bardzo szybkie informacje zwrotne z ekranów krystalizacji i optymalizacje, aby poprowadzić użytkownika do optymalnej formy kryształu dla jego wymagań. Umożliwia również zautomatyzowane wytwarzanie wysokiej jakości struktur o temperaturze pokojowej9.
Ten protokół zakłada, że użytkownik ma próbkę białka o wysokiej czystości gotową do krystalizacji. Opisujemy doświadczenia użytkownika korzystającego z dostępu do zakładu krystalizacji w Harwell w celu wytworzenia kryształów białka, a następnie wykorzystania linii badawczej VMXi do zbierania danych (rysunek 1).
Zakład krystalizacji w Harwell
Ośrodek Krystalizacji w Harwell (CF) znajduje się w Kompleksie Badawczym w Harwell (RCaH) przylegającym do Diamentowego Źródła Światła. Zakład oferuje użytkownikom zautomatyzowane laboratorium o wysokiej przepustowości do krystalizacji makromolekularnej, wykorzystujące robotykę do badań przesiewowych krystalizacji, optymalizacji kryształów, obrazowania kryształów i charakteryzacji. Dzięki ścisłej integracji z wysoce zautomatyzowaną linią badawczą VMXi, tempo określania struktur temperatury pokojowej znacznie przyspieszyło i umożliwia charakteryzację nowych struktur białkowych, kompleksów białko-ligand i DNA-ligand, a także automatyczne badania przesiewowe fragmentów (Rysunek 1), a wszystko to w warunkach niekriogenicznych.
Rurociąg CF to zestaw oprzyrządowania obejmujący nanolitrowe roboty krystalizacyjne9 do krystalizacji białek rozpuszczalnych i błonowych, roboty do obsługi cieczy do przygotowania komercyjnych ekranów krystalizacji i złożonych niestandardowych ekranów optymalizacyjnych oraz cztery instrumenty do obrazowania (jeden w temperaturze 4 °C i trzy w temperaturze 20 °C do obrazowania płytek krystalizacyjnych (zobacz Tabelę Materiałów). Jeden imager jest w stanie obrazować szklane płytki lipidowe w fazie sześciennej (LCP), a jeden imager jest wyposażony w optykę multifluorescencyjną (obie w temperaturze 20 °C).
Obiekt jest obecnie szeroko wykorzystywany przez szerokie spektrum użytkowników akademickich i przemysłowych, w tym przez Laboratorium Białek Błonowych (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), ośrodek przesiewowy fragmentów XChem 10, linie badawcze MX, XFEL-hub, a także Rosalind Franklin Institute (RFI). Ten dobrze ugruntowany i zoptymalizowany proces produkcyjny umożliwił przeprowadzanie eksperymentów krystalizacji w szerokim spektrum projektów z zakresu biologii strukturalnej. W tym artykule opisano potok dla kryształów przeznaczonych do zbierania danych w VMXi, chociaż kryształy mogą być również zbierane i kriochłodzone lub kierowane do rurociągu XChem.
Dostęp użytkowników jest przydzielany przez system propozycji Diamond MX (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html), a użytkownicy przemysłowi są wspierani przez grupę Diamond Industry Liaison. Wszyscy użytkownicy mogą przyjść na stronę ze swoimi próbkami lub tabliczkami, które można transportować ręcznie. Nie zaleca się wysyłania płytek kurierem, ponieważ z naszego doświadczenia wynika, że krople mogą oddalić się od miejsca, w którym zostały dozowane, lub krople mogą zostać uszkodzone przez zbiornik krystalizacji. Alternatywnie, po uzgodnieniu, użytkownicy mogą wysłać swoje próbki białek do CF, gdzie pracownicy przeprowadzają eksperymenty krystalizacji w ich imieniu. Eksperymenty mogą być monitorowane zdalnie przez użytkownika, logując się do Rock Maker Web w przypadku CF lub przez ISPyB w przypadku VMXi. Dostęp do mukowiscydozy może odbywać się w sposób iteracyjny w oparciu o wyniki dyfrakcji rentgenowskiej zebrane w Diamond.
Linia badawcza VMXi przy diamentowym źródle światła
Linia badawcza VMXi (zwana dalej "linią") to unikalny i niedawno opracowany instrument w pełni dedykowany do wysoce zautomatyzowanej krystalografii rentgenowskiej w temperaturze pokojowej, z naciskiem na pomiar danych z kryształów w odpowiednich płytkach krystalizacyjnych. Linia oferuje mikroogniskową (10 x 10 μm), różową wiązkę (pasmo przepustowe <5 × 10-2ΔE/E) o wysokim strumieniu ~2 × 1013 fotonów/s (przy 16 KeV)7. Ta wiązka o wysokim strumieniu, w połączeniu z szybkim detektorem, umożliwia bardzo wysoką przepustowość próbek i zbieranie danych z próbek o wielkości do 10 μm.
Płytki krystalizacji wchodzą na linię badawczą poprzez przechowywanie w systemie przechowywania próbek i obrazowanie na podstawie harmonogramu dostarczonego przez użytkownika podczas rejestracji płytek za pomocą ISPyB11 interfejs SynchWeb12. Zazwyczaj zaleca się użytkownikom wybór ciągu Fibonacciego punktów czasowych do obrazowania (0, 12, 24, 36, 60...7,320 h od płytki wprowadzanej do systemu). Użytkownik jest informowany e-mailem o zobrazowaniu tablicy. Zarówno obrazowanie w świetle widzialnym, jak i w świetle UV jest dostępne dla użytkowników na żądanie. Obrazy wykonane przez system przechowywania próbek są analizowane przez algorytm uczenia maszynowego; Automatycznie lokalizuje i definiuje punkty zainteresowania obiektów, które przypominają kryształy i rejestruje interesujące miejsca gotowe do dodania przez użytkownika do kolejki zbierania danych. Użytkownicy mogą również ręcznie kliknąć obrazy w świetle widzialnym, aby zarejestrować interesujące miejsca, lub mogą kliknąć i przeciągnąć region, który ma być analizowany za pomocą skanowania rastrowego. Punkty te są dostępne dla użytkowników, którzy mogą dodać je do kolejki wraz z automatycznie zlokalizowanymi punktami.
Gdy wszystkie próbki mają odpowiednie parametry do zbierania danych, płyta trafia do kolejki. Gdy płytka dotrze na szczyt kolejki, jest automatycznie dozowana do linii badawczej. Płytki krystalizacyjne są automatycznie ładowane z hoteli kryształowych do linii badawczej przez ramię robota, a po dopasowaniu obrazu, z każdego wybranego kryształu mierzone są zestawy danych krystalograficznych o rotacji do 60° zgodnie z instrukcjami zdefiniowanymi przez użytkownika. Wszystkie krople znajdujące się na płytce mogą być użyte do tych eksperymentów na linii badawczej. Dane są łączone z wielu kryształów w celu wytworzenia izomorficznych, optymalnie połączonych zestawów danych w sposób zautomatyzowany7,9. Po zebraniu wszystkich zestawów danych w kolejce użytkownik otrzymuje wiadomość e-mail z linkiem, który należy kliknąć, aby wyświetlić zestawy danych w ISPyB11, podobnie jak w innych liniach badawczych Diamond MX. Użytkownicy są również przekierowywani na stronę internetową linii badawczej (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).

<table><tbody><tr><td>Formulator</td><td>Formulatrix</td><td>na zamówienie</td><td>Robot do obsługi cieczy</td></tr><tr><td>Imager Formulatrix</td><td>na</td><td>zamówienie</td><td>Imager do płytek krystalizacyjnych</td></tr><tr><td>Greiner CrystalQuick X&nbsp;</td><td>Greiner</td><td>Z617644</td><td>Płytka krystalizacyjna</td></tr><tr><td>Gryphon&nbsp;</td><td>Instrumenty Art Robbins</td><td>620-1000-10&nbsp;</td><td>Robot krystalizacyjny</td></tr><tr><td>MiTeGen Insitu-1</td><td>Mitegen</td><td>InSitu-01CL-40</td><td>Płytka krystalizacyjna</td></tr><tr><td>Mosquito LCP&nbsp;</td><td>(SPT Labtech)</td><td>na żądanie</td><td>Robot krystalizacyjny</td></tr><tr><td>Rock Imager & Maker</td><td>Formualtrix</td><td>na życzenie</td><td> Oprogramowanie do Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/ </td></tr><tr><td>Scorpion</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>640-1000-10&nbsp;</td><td> Robot do obsługi cieczy https://www.artrobbins.com/scorpion </td></tr></tbody></table>

gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w harwell i linii badawczej vmxi, diamentowego źródła światła

Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source

Opisano protokoły zrobotyzowanej krystalizacji białek za pomocą Zakładu Krystalizacji w Harwell oraz zbierania danych o temperaturze pokojowej in situ z płytek krystalizacyjnych na linii badawczej VMXi Diamond Light Source. Takie podejście umożliwia proste określenie wysokiej jakości struktur krystalicznych w temperaturze pokojowej na podstawie wielu kryształów i zapewnia bardzo szybką informację zwrotną na temat wyników prób krystalizacji, a także umożliwia krystalografię szeregową. Wartość struktur w temperaturze pokojowej w zrozumieniu struktury białek, wiązania ligandów i dynamiki staje się coraz bardziej doceniana w społeczności biologii strukturalnej. Ten potok jest dostępny dla użytkowników z całego świata z kilkoma dostępnymi trybami dostępu. Eksperymenty krystalizacji, które są skonfigurowane, mogą być obrazowane i przeglądane zdalnie, a kryształy są automatycznie identyfikowane za pomocą narzędzia uczenia maszynowego. Dane są mierzone w systemie kolejkowym z zestawami danych o rotacji do 60° z wybranych przez użytkownika kryształów na płytce. Dane ze wszystkich kryształów w danej studni lub grupie próbek są automatycznie łączone za pomocą xia2.multiplex, a wyniki są bezpośrednio dostępne za pośrednictwem interfejsu przeglądarki internetowej.

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Protocols for robotic protein crystallization using the Crystallization Facility at Harwell and in situ room temperature data collection from ...

Zrozumienie trójwymiarowych struktur białek stanowi podstawę biotechnologii projektowania leków i naszego zrozumienia wielu różnych chorób. VMXi określa struktury białek bez kriochłodzenia, a więc znacznie bliżej ich naturalnych temperatur. VMXi mierzy również dane dyfrakcyjne z kryształów białek, gdy są jeszcze w ich płytkach krystalizacyjnych, unikając uszkodzeń spowodowanych mechaniczną obsługą.W przyszłości naprawdę chcemy wykorzystać niesamowitą przepustowość VMXi do badania dużych populacji kryształów w celu zidentyfikowania wielu różnych stanów strukturalnych, a nie pojedynczej struktury, którą ludzie często uzyskują teraz. Chcemy również dążyć do rozwoju leków oraz przeprowadzania badań przesiewowych i optymalizacji fragmentów na płytkach krystalizacyjnych, co jest nowym podejściem, które jest niezwykle obiecujące. Na początek wyprodukuj kryształy w płytkach NC2.Następnie zaloguj się do systemu ISPyB za pomocą podanego identyfikatora Diamond Fed ID i wybierz Propozycje. Przewiń listę lub wpisz numer oferty w pasku wyszukiwania, aby zlokalizować żądaną propozycję. Po znalezieniu oferty wybierz opcję Wysyłka z menu rozwijanego pod numerem oferty.Otworzy się okno przesyłki, w którym wyświetlone zostaną wszystkie przesyłki związane z ofertą. Aby utworzyć nową przesyłkę, kliknij przycisk Dodaj przesyłkę znajdujący się w prawym górnym rogu ekranu i podaj nazwę przesyłki. Następnie wybierz opcję Automated/Imager i kliknij przycisk Dodaj przesyłkę w lewym dolnym rogu ekranu, aby potwierdzić przesyłkę.Przejdź do okna przesyłki i kliknij Dodaj kontener, co spowoduje wyświetlenie strony dodawania kontenera. Teraz wybierz odpowiedni typ płyty z menu rozwijanego typu kontenera. Wprowadź kod kreskowy i nazwę pojemnika zgodnie z instrukcjami personelu linii badawczej dla płytek eksperymentalnych.Wybierz imager VMXi 20 stopni Celsjusza z menu rozwijanego Requested Imager, a następnie wybierz harmonogram obrazowania Fibonacciego z menu rozwijanego Imaging Schedule. Z menu rozwijanego Ekran krystalizacji wybierz ekran krystalizacji, a następnie wybierz poprawną nazwę użytkownika z menu rozwijanego Właściciel. Kliknij Widok i wprowadź dokładny adres kontaktowy w polu e-mail.Wprowadź szczegółowe informacje o tablicy w polu komentarzy. Należy wybrać odpowiednią próbkę z menu rozwijanego Białko i użyć akronimu zarejestrowanego w UAS i zatwierdzonego przez Diamond w ramach propozycji eksperymentalnej. Wprowadź tę samą nazwę w polu nazwy próbki, a pozostałe pola pozostaw puste.Kliknij ikonę Tabliczka, aby powtórzyć próbkę na całej płytce i wypełnić cały pojemnik zielonymi kwadratami. Kliknij przycisk Dodaj kontener u dołu strony, aby zarejestrować tabliczkę. Przenieś płytkę do odpowiedniego imagera, gdzie będzie przechowywana i obrazowana.Wizyta zostanie wygenerowana, gdy kontener zostanie zapisany w imagerze, a użytkownik otrzyma wiadomość e-mail z linkiem do płyty i jej obrazów. Aby wyświetlić wyniki obrazowania, przejdź do interesującej Cię propozycji, wybierz Kontenery z menu rozwijanego pod numerem propozycji i wyświetl listę dostępnych kontenerów. Wybierz płytki filtra, jeśli dostępne są inne typy uchwytów na próbki.Aby zawęzić wyszukiwanie, użyj opcji Moje kontenery, aby wyświetlić tylko odpowiednie kontenery powiązane z bieżącym identyfikatorem użytkownika.Umieść kursor nad linią i kliknij lewym przyciskiem myszy, aby wybrać żądany kontener. Następnie pojawi się nowe okno pokazujące przegląd płyty. Wybierz upuszczenie po lewej stronie reprezentacji płyty, aby wyświetlić jej ostatni obraz.Poruszaj się między kroplami za pomocą strzałek lub wybieraj je pojedynczo za pomocą myszy lub kursora. Aby ręcznie dodać punkty do zbierania danych, naciśnij przycisk Oznacz punkt. Umieść kursor nad żądanym punktem zainteresowania.Dokonaj wyboru i poczekaj, aż pojawi się czerwony krzyżyk. Po zaznaczeniu wszystkich punktów kliknij przycisk Zakończ. Kliknij przycisk Oznacz region, aby dodać regiony do zbierania danych za pomocą skanowania siatki.Kliknij lewy górny punkt, przeciągnij go w dół i w prawo, aby utworzyć region, który zostanie zeskanowany na linii badawczej. Kliknij przycisk Zakończ po ustaleniu wszystkich żądanych regionów. Szukaj niebieskich krzyżyków na obrazach upuszczania, które reprezentują krystaliczne obiekty zlokalizowane automatycznie przez CHiMP.Aby wyświetlić ocenę CHiMP dla spadków krystalizacji, zaznacz opcję Pokaż automatyczne wyniki i wybierz kryształ z listy rozwijanej klasy. Gdy wszystkie punkty i regiony zostaną zaznaczone w odpowiednich dropach, kliknij przycisk Przygotuj do zbierania danych u dołu strony. Przejrzyj listę wstępnie wybranych lub automatycznie zidentyfikowanych próbek.Aby dodać pojedyncze punkty lub regiony, naciśnij przycisk lub kliknij przycisk Dodaj bieżącą stronę do kolejki, aby dodać wszystkie wyświetlane próbki. Następnie kliknij filtr punktowy i zaznacz pole wyboru Zaznacz wszystko, aby zastosować te same parametry do wszystkich próbek na bieżącej liście próbek w kolejce. Użyj filtrów punktowych, regionalnych, ręcznych i automatycznych.W przypadku regionów wybierz Grid Scan DMM 10 mikronów kroki 100% transmisja. W przypadku innych eksperymentów punktowych wybierz odpowiednie opcje z menu rozwijanego. Aby zbierać dane dotyczące oscylacji, wybierz Omega Scan DMM 10 degrees 10% transmission, aby zmaksymalizować zbieranie danych.Po wybraniu prawidłowych parametrów eksperymentalnych dla wszystkich próbek kliknij przycisk Kontener kolejki. Gdy płytka dotrze na szczyt kolejki, zostanie przedstawiona na linii badawczej w celu zebrania danych, a następnie zwrócona do magazynu próbki. Następnie poszukaj wiadomości e-mail z linkiem umożliwiającym dostęp do odpowiednich danych.Wybierz opcję Zarządzanie przykładowymi grupami z menu rozwijanego pod numerem propozycji i poszukaj listy grup, jeśli inni użytkownicy już je utworzyli. Aby wygenerować nową grupę, kliknij przycisk Utwórz przykładową grupę. Kliknij przesyłkę w menu rozwijanym na stronie Utwórz przykładową grupę, aby wyświetlić przeglądarkę próbek.Po kliknięciu kontenera poszukaj grafiki przedstawiającej przegląd płyty. Kliknij pojedynczy drop lub odpowiednią literę lub numer kolumny wiersza. Po wybraniu wszystkich studni skojarzonych z pojedynczą grupą wprowadź nazwę grupy w polu Nazwa grupy próbnej i kliknij przycisk Zapisz grupę próbek.Kliknij przycisk Wyświetl przykładową grupę na tej stronie, aby powrócić do listy już wygenerowanych przykładowych grup powiązanych z propozycją i kontynuować przetwarzanie danych.

crystallization-situ-room-temperature-data-collection-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.

W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

Prezentujemy obszerny przewodnik po przygotowywaniu próbek do stałego celu, zbieraniu danych i przetwarzaniu danych dla szeregowej krystalografii synchrotronowej na linii badawczej Diamond I24.

Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source

Ten protokół pokazuje, jak obrazować biologiczne próbki kriokonserwowane za pomocą kriostrukturalnej mikroskopii świetlnej. Demonstrujemy metodologię, obrazując cytoszkielet komórek U2OS.

Mikroskopijne gromadzenie danych z komórek zakonserwowanych kriogenicznie

Stosunek sygnału do szumu danych jest jednym z najważniejszych czynników przy wykonywaniu pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej z mikrokryształów. Linia badawcza VMXm zapewnia środowisko o niskim poziomie hałasu i mikrowiązkę do takich eksperymentów. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbek do montażu i chłodzenia mikrokryształów dla VMXm i innych linii badawczych do krystalografii makromolekularnej mikrofokusowej.

Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Tutaj opisujemy, jak korzystać z automatycznych procesów krystalografii makromolekularnej do analizy białko-struktura, szybkiej analizy kompleksu ligand-białko i badań przesiewowych fragmentów na dużą skalę w oparciu o technologię CrystalDirect w laboratorium HTX w EMBL Grenoble.

Zautomatyzowane rurociągi krystalograficzne w zakładzie EMBL HTX w Grenoble

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem mutacji termostabilizujących, oczyścić ludzki transporter serotoniny, wygenerować przeciwciała o wysokim powinowactwie i skrystalizować kompleks transporter-przeciwciało serotoniny związany z lekiem przeciwdepresyjnym S-citalopram. Protokół ten można dostosować do badania innych trudnych transporterów błonowych, receptorów i kanałów.

Termostabilizacja, ekspresja, oczyszczanie i krystalizacja ludzkiego transportera serotoniny związanego z S-citalopramem

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Poznaj metodę krystalizacji białek i zbierania danych dyfrakcyjnych in situ przy użyciu linii badawczej VMXi w temperaturze pokojowej. Protokół umożliwia analizę struktur białek bez konieczności kriochłodzenia.

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła (Wideo) | JoVE Journal

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Przeglądaj więcej filmów