Multipleksowane obrazowanie żywych komórek w celu uzyskania odpowiedzi na leki w organoidalnych modelach raka pochodzących od pacjenta
5 stycznia 2024
Organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów są wyrafinowanym systemem modelowym do badań podstawowych i translacyjnych. Ten artykuł dotyczący metod szczegółowo opisuje zastosowanie multipleksowanego obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek do jednoczesnej oceny kinetycznej różnych fenotypów organoidów.
Stosujemy modele organoidowe pochodzące od pacjenta, które są tworzone z rzeczywistych próbek guzów pacjenta, aby zbadać, jak guzy reagują na leki. Możemy również zdefiniować cechy molekularne, które korelują z odpowiedzią. Wyniki te są następnie wykorzystywane do ustalania priorytetów najlepszych nowych terapii, które mają awansować w przyszłych badaniach klinicznych.
Jednym z głównych wyzwań związanych ze stosowaniem modeli organoidów pochodzących od pacjentów jest to, że są one ograniczonym zasobem. Ponadto istnieje bardzo niewiele gotowych zestawów do oceny odpowiedzi leku w modelach organoidowych, które zachowują próbkę w formacie umożliwiającym inne dalsze analizy, takie jak profilowanie transkryptomiczne. Opracowaliśmy multipleksowe podejście do genetycznego monitorowania odpowiedzi terapeutycznej w modelach organoidowych.
Używamy barwników fluorescencyjnych, które są specyficzne dla różnych procesów komórkowych, co zapewnia wgląd w mechanizm działania leku w każdym modelu organoidowym. W pojedynczym eksperymencie zbieramy zarówno funkcjonalne, jak i czasowe dane dotyczące przebiegu w próbkach, które są dostępne dla innych testów. Metoda ta może być stosowana do oceny odpowiedzi na szeroki zakres metod terapeutycznych poza inhibitorami małocząsteczkowymi, w tym wrażliwość na promieniowanie.
Kontynuujemy również wprowadzanie innowacji, opracowując narzędzia dla innych fenotypów komórkowych, które można mierzyć kinetycznie, takich jak starzenie się. Na początek weź probówkę z organoidami pochodzącymi od pacjenta lub zawiesiną PDO, w równej ilości ekstraktów z błony podstawnej lub BME. Za pomocą pipety o pojemności 20 mikrolitrów umieść pięć mikrolitrowych kopułek w środku każdej studzienki wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytki.
Po wysianiu wszystkich dołków umieść pokrywkę na talerzu i delikatnie ją odwróć. Inkubować odwróconą płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych, aby kopuły mogły się zestalić. Odwróć płytkę tak, aby pokrywka była skierowana do góry, a następnie ponownie inkubuj.
Po dodaniu barwników fluorescencyjnych i leków do płytek zawierających PDO, umieść płytkę w cytacie piątym. Uruchom oprogramowanie Gen5 i w oknie menedżera zadań wybierz tryb ręczny Imager i kliknij Przechwyć teraz. W ustawieniach określ cel:Filtr, format mikropłytki i typ naczynia.
Wybierz opcję Użyj pokrywy i Użyj mniejszej prędkości nośnika, a następnie kliknij przycisk OK. Następnie wybierz studnię, która Cię interesuje. Wybierz kanał Bright Field, kliknij automatyczne naświetlanie i dostosuj ustawienia zgodnie z wymaganiami. Następnie, aby skonfigurować Z-Stack, rozwiń kartę trybu obrazowania, wybierz Z-Stack i dostosuj ostrość za pomocą strzałek regulacji kursu, aż wszystkie PDO znikną nieostre.
Ustal ten punkt jako dolną część stosu Z i powtórz w odwrotnej kolejności, aby ustawić górę. Następnie skonfiguruj kanały fluorescencyjne, otwierając krok Edytuj obrazowanie. W sekcji Kanały wybierz żądaną liczbę kanałów, wyznacz jeden kanał dla jasnego pola i dodatkowe kanały dla każdego kanału fluorescencyjnego.
Zamknij okno, klikając przycisk OK. Zmień menu rozwijane na GFP. Aby ustawić ekspozycję dla pierwszego kanału fluorescencyjnego, kliknij opcję Automatyczna ekspozycja i dostosuj ustawienia ekspozycji na karcie ekspozycji, aby zredukować sygnał tła. Aby skopiować ustawienia ekspozycji na kartę trybu obrazu, kliknij ikonę Kopiuj, a następnie kliknij przycisk Edytuj krok obrazowania, aby otworzyć nowe okno.
W kanale GFP kliknij ikonę schowka w linii ekspozycji, aby dodać ustawienia oświetlenia, czasu integracji i wzmocnienia kamery do kanału. Teraz kliknij ikonę Aparat fotograficzny i wybierz wstępne przetwarzanie obrazu w obszarze, Dodaj krok przetwarzania. Na karcie Jasne pole usuń zaznaczenie opcji Zastosuj wstępne przetwarzanie obrazu.
Dla każdej zakładki kanału fluorescencyjnego upewnij się, że zaznaczona jest opcja Zastosuj wstępne przetwarzanie obrazu. Usuń zaznaczenie opcji Użyj tych samych opcji, co kanał pierwszy, a następnie kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno. Teraz kliknij projekcję Z w kroku Dodaj przetwarzanie.
W razie potrzeby dostosuj zakres plasterków i zamknij okno, klikając OK.To skonfiguruj protokół obrazowania kinetycznego, na pasku narzędzi kliknij Zestaw obrazów i z menu rozwijanego wybierz Utwórz eksperyment z tego zestawu obrazów. Kliknij Opcje pod drugim nagłówkiem i zaznacz pole nieciągłej procedury kinetycznej. W obszarze Szacowany łączny czas wprowadź środowisko uruchomieniowe eksperymentu.
Zamknij okno, klikając przycisk OK. Dodatkowo ustaw w tym momencie układ płyt i gradient temperatury. Zatwierdź kroki redukcji danych, klikając okna. Następnie przejdź do pliku i kliknij Zapisz protokół jako na pasku narzędzi.
Wybierz lokalizację zapisu. Wprowadź nazwę pliku i kliknij przycisk Zapisz. Aby rozpocząć obrazowanie kinetyczne, załaduj protokół do bio spa, oprogramowania do planowania na żądanie i wybierz dostępne miejsce.
Na karcie informacji o procedurze wybierz z menu opcję Użytkownik. Obok miejsca na protokół kliknij Wybierz i wybierz Dodaj nowy wpis. Teraz kliknij Wybierz obok miejsca protokołu.
Kliknij przycisk Otwórz, aby nawigować i zaimportować protokół do oprogramowania do planowania. Wprowadź wymagany czas obrazowania dla płyty i kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno. W polu Interwał wprowadź żądaną częstotliwość obrazowania.
Wybierz płytę harmonogramu lub statek. Aby zainicjować sekwencję sprawdzania poprawności blachy, kliknij przycisk Tak, aby zaakceptować ten harmonogram. Na początek zobrazuj fluorescencyjnie znakowane PDO za pomocą systemu obrazowania żywych komórek cytowanych pięciu.
Następnie uruchom oprogramowanie Gen5, przejdź do eksperymentów i kliknij Otwórz w Menedżerze zadań. Otwórz żądany eksperyment i wybierz Płyta, a następnie Widok na pasku narzędzi. Następnie przełącz menu rozwijane danych na projekcję Z.
Kliknij dwukrotnie wybraną studnię, wybierz Analizuj, kliknij, Chcę skonfigurować nowy krok redukcji danych analizy obrazu, a następnie kliknij OK.In ustawienia analizy, ustaw typ na Komórkowy kanał analizy i detekcji na Z przekształcone jasne pole TSF. Kliknij przycisk Opcje, aby otworzyć stronę maski podstawowej i zliczania. Zaznacz opcję Auto w polu progu i kliknij przycisk OK, aby zamknąć wyskakujące okienko.
W obszarze Wybór obiektów określ minimalne i maksymalne rozmiary obiektów, aby odfiltrować zanieczyszczenia komórkowe lub pojedyncze komórki, a następnie wybierz inne obiekty zgodnie z potrzebami. Następnie kliknij Zastosuj, a zamaskowane obiekty zostaną podświetlone. Aby skonfigurować analizę subpopulacji na pasku narzędzi analizy komórkowej, kliknij Obliczone metryki.
Następnie kliknij Wybierz lub Utwórz interesujące dane na poziomie obiektu w prawym dolnym rogu. Z dostępnych metryk obiektów wybierz Żądane metryki, takie jak Obiegowość, i kliknij przycisk Wstaw. Kliknij przycisk OK, aby potwierdzić.
Następnie wybierz opcję Analiza subpopulacji na pasku narzędzi analizy komórkowej i kliknij przycisk Dodaj, aby utworzyć nową subpopulację. Wprowadź nazwę subpopulacji. W metrykach obiektu kliknij Dodaj warunek, aby dodać wybraną metrykę.
Wprowadź żądane parametry w oknie edycji warunku i kliknij przycisk OK. Wybierz żądane wyniki w tabeli u dołu okna i kliknij OK, a następnie Zastosuj. W obszarze Szczegóły obiektu wybierz wyznaczoną subpopulację, aby wyświetlić maskowanie. Jeśli wszystko jest w porządku, kliknij przycisk OK w oknie analizy komórkowej i kliknij przycisk Dodaj krok, aby zastosować analizę do wszystkich studzienek.
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia zastosowanie organoidów nowotworowych pochodzących od pacjentów jako systemu modelowego do oceny odpowiedzi na leki. Przedstawiono w nim podejście oparte na multipleksowym fluorescencyjnym obrazowaniu żywych komórek w celu oceny fenotypów organoidów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- onkologia
- badania translacyjne
Wprowadzenie
- Organoidy pochodzenia pacjenta są tworzone z rzeczywistych próbek guzów pobranych od pacjentów.
- Służą one do badania odpowiedzi nowotworów na różne terapie.
- Wyzwania obejmują ograniczone zasoby oraz potrzebę stosowania kompatybilnych zestawów do oceny odpowiedzi na leki.
- Analizy końcowe, takie jak profilowanie transkrypcyjne, są niezbędne dla kompleksowych badań.
Cel badania
- Ocena odpowiedzi guzów na leki z wykorzystaniem modeli organoidowych.
- Określenie charakterystyki molekularnej korelującej z odpowiedziami terapeutycznymi.
- Priorytetyzacja nowych terapii do badań klinicznych na podstawie odpowiedzi organoidów.
Zastosowane metody
- Multipleksowe obrazowanie żywych komórek z wykorzystaniem fluorescencji.
- Genetyczny monitoring odpowiedzi terapeutycznej w modelach organoidowych.
- Równoczesna ocena różnych fenotypów organoidów.
- Integracja danych o odpowiedzi na leki z profilowaniem molekularnym.
Główne wyniki
- Skuteczne zastosowanie obrazowania multipleksowego do oceny odpowiedzi organoidów.
- Identyfikacja cech molekularnych powiązanych ze skutecznością leku.
- Opracowanie ram priorytetyzacji terapii do badań klinicznych.
- Wykazanie potencjału modeli organoidowych w badaniach translacyjnych.
Wnioski
- Organoidy pochodzące od pacjentów są cenne dla zrozumienia odpowiedzi na leki.
- Podejście multipleksowe usprawnia ocenę fenotypów organoidów.
- Wyniki mogą pomóc w planowaniu przyszłych badań klinicznych i strategii terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Multipleksowe obrazowanie żywych komórek w modelach nowotworowych organoidów pochodzenia pacjenta (PDO) umożliwia wysokotreściową, ilościową ocenę odpowiedzi na leki w systemach, które ściśle naśladują ludzkie schorzenia. Podejście to niweluje lukę translacyjną między tradycyjnymi liniami komórkowymi a wynikami klinicznymi, dostarczając danych mechanistycznych i fenotypowych z ograniczonej ilości materiału pacjenta. Integracja obrazowania kinetycznego z multipleksowymi odczytami zwiększa pewność prognostyczną i pomaga w selekcji projektów w krytycznych punktach odkrywania leków i etapie przedklinicznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w systemach pochodzących od pacjentów, istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ilościowe określanie stanu zdrowia komórek oraz apoptozy w odpowiedzi na testowane substancje.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów poprzez multipleksowe wyniki fenotypowe.
- Dostarcza danych do priorytetyzacji celów i związków do dalszego rozwoju.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia standaryzowane, powtarzalne przepływy pracy dla wysokoprzepustowego screeningu leków w 3D modelach organoidów.
- Generuje ilościowe, multipleksowane wyniki, takie jak liczba PDO, powierzchnia oraz intensywność fluorescencji.
- Umożliwia kinetyczne monitorowanie efektów działania leków, wspierając rzetelne opracowywanie i optymalizację testów.
- Przygotowuje zwalidowane systemy do dalszych analiz molekularnych i fenotypowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Usprawnia dopasowanie testów przedklinicznych do biologii chorób u ludzi, wykorzystując PDO jako modele translacyjne.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez umożliwienie wieloparametrycznego profilowania odpowiedzi na leki.
- Dostarcza informacji o mechanizmach działania, które pomagają w podejmowaniu decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka.
- Pozwala na rozszerzenie zakresu o dodatkowe odczyty fenotypowe, zwiększając istotność translacyjną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta platforma obrazowania multipleksowego integruje procesy od wczesnego etapu odkryć, poprzez identyfikację wiodących kandydatów, aż po walidację przedkliniczną, wykorzystując PDO dla zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w modelach istotnych dla pacjentów.
- Przesiewy: Dostarcza gotowych do analizy, powtarzalnych i ilościowych wyników do oceny związków.
- Analityka: Zapewnia pomiary o wysokiej zawartości informacji oraz wyniki statystyczne do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkrywcza z fazą przedkliniczną za pomocą danych istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, wielokrotnego użytku platformę dla różnych modalności terapeutycznych i fenotypów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w ocenie odpowiedzi na lek.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i automatyzuje obrazowanie oraz analizę w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne pod względem kapitałowym zarządzanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój kandydatów posiadających dowody translacyjne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie trójwymiarowej (3D) hodowli komórek, obrazowania żywych komórek oraz analizy obrazu.
- Niezbędny jest dostęp do zautomatyzowanych platform obrazowania oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Wymagana jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przygotowania testów i interpretacji danych.
- Protokoły muszą zostać dostosowane do różnych źródeł PDO oraz punktów końcowych fenotypowych.
- Ograniczenia ilości próbek oraz kompatybilność odczynników mogą ograniczać przepustowość i analizy poniżej głównego etapu (downstream).
Najczęściej zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:24
Plating Intact Patient‐Derived Organoids and Setting Up Imaging Parameters for Multiplexed Live‐Cell Imaging
6:34
Image Analysis in Gen5 Software to Analyze Drug Response in Patient‐Derived Organoids Using Multiplexed Live‐Cell Imaging
