Ponowne wykorzystanie probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w analizach proteomicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych
8 marca 2024
Szczegółowy protokół jest dostarczony do czyszczenia i ponownego użycia probówek ultrawirówek z poliwęglanu do przeprowadzenia izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych odpowiednich do eksperymentów proteomicznych.
Zajmujemy się chorobami układu krążenia, a konkretnie rolą pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w patologicznym zwapnieniu tkanek sercowo-naczyniowych, takich jak zastawki i naczynia krwionośne. Naukowcy z naszej grupy zdefiniowali niedawno metody ekstrakcji tkanek i uwięzionych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z włóknistej zwapnienia tkanki sercowo-naczyniowej w celu określenia ich profilu proteomicznego. Nasza grupa wykazała, że te pęcherzyki zewnątrzkomórkowe zawierają ważny ładunek białka do inicjowania zwapnienia w chorych tkankach.
Specjalistyczne probówki stosowane na etapie ultrawirowania izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mogą być czyszczone i sterylizowane w celu ponownego użycia. Jednak analiza proteomiczna wymaga szczególnej uwagi, ponieważ każde zanieczyszczenie może znacznie wpłynąć na dalsze wyniki. W tym miejscu weryfikujemy protokół ponownego wykorzystania materiałów eksploatacyjnych, w szczególności ultrawirówek z poliwęglanu do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, które są odpowiednie do dalszych zastosowań proteomicznych o niskim nakładzie pracy.
Nasz protokół jest prosty i skuteczny i pozwoli naukowcom zmniejszyć zarówno koszty materiałów eksploatacyjnych, jak i odpady zwykle związane z tymi protokołami izolacji. Na początek zbierz zużyte rurki poliwęglanowe i dokładnie wyrzuć poprzednią próbkę. Aby zapobiec wysuszeniu próbki na bok probówki, należy natychmiast zanurzyć probówki ultrawirówki w wodzie z kranu.
Następnie inkubować probówkę w 0,1% dodecylosiarczanie sodu lub SDS przez 10 minut. Zdekantować większość, ale nie całość roztworu SDS z tuby. Za pomocą bawełnianego wacika dokładnie wytrzyj obszar probówki, w której znajdował się granulat pęcherzyka zewnątrzkomórkowego.
Aby spłukać, napełnij rurkę gorącą wodą z kranu i całkowicie zdekantuj. Po trzech płukaniach za pomocą butelki z rozpylaczem, spryskaj rurkę wodą demineralizowaną, a następnie 70% etanolem. Umieść probówkę do góry nogami do całkowitego wyschnięcia i przenieś ją do czystego słoika w celu ponownego użycia.
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na roli pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w chorobach układu sercowo-naczyniowego, w szczególności na ich udziale w zwapnieniu tkanek sercowo-naczyniowych. Badacze prezentują skuteczny protokół czyszczenia i ponownego wykorzystywania poliwęglanowych probówek do ultrawirówki służących do izolacji tych pęcherzyków, co zapewnia ich przydatność w proteomice przy jednoczesnym ograniczeniu ilości odpadów i kosztów.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Choroby układu sercowo-naczyniowego
- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe
- Proteomika
Wstęp
- Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe odgrywają kluczową rolę w zwapnieniu tkanek sercowo-naczyniowych.
- Prawidłowa izolacja jest niezbędna do dokładnej analizy proteomicznej.
- Zanieczyszczenia podczas izolacji mogą znacząco wpłynąć na wyniki.
Zastosowane metody
- Czyszczenie i sterylizacja poliwęglanowych probówek do ultrawirówki
- Wykorzystanie tkanek z włóknisto-zwapniałych układów sercowo-naczyniowych
- Walidacja protokołu dla zastosowań proteomicznych przy niskiej ilości materiału wejściowego
Główne wyniki
- Zwalidowano prostą i skuteczną metodę ponownego wykorzystania probówek do ultrawirówki.
- Zapewniono integralność i wiarygodność analiz proteomicznych.
- Ograniczono koszty i ilość odpadów związanych z materiałami eksploatacyjnymi w procesie.
Wnioski
- Badanie przedstawia wykonalną metodę ponownego wykorzystania probówek do ultrawirówki, co ma istotne znaczenie dla proteomiki w badaniach sercowo-naczyniowych.
- Podejście to przyczynia się do bardziej zrównoważonych praktyk laboratoryjnych w badaniach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zwalidowane ponowne wykorzystanie poliwęglanowych probówek do ultrawirówki w proteomice pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) rozwiązuje problemy związane zarówno z zrównoważonym rozwojem, jak i efektywnością kosztową w przepływach pracy na etapie odkrywczym. Zapewnienie minimalnego zanieczyszczenia i kompatybilności ze spektrometrią mas umożliwia wiarygodną identyfikację białek z próbek EV o niskiej wydajności. Niniejszy protokół wspiera badania i rozwój w przedsiębiorstwach poprzez redukcję odpadów z materiałów eksploatacyjnych bez ograniczania rygoru analitycznego lub jakości danych końcowych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną weryfikację hipotez poprzez minimalizację zanieczyszczeń białkami tła w proteomice EV.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dzięki wiarygodnej analizie zawartości białkowej EV pochodzących z tkanek sercowo-naczyniowych.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez zapewnienie integralności próbek w powtarzanych izolacjach.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych probówek o niskim stopniu zanieczyszczeń, zapewniając powtarzalność izolacji EV oraz przebiegu analiz proteomicznych.
- Standaryzuje przygotowanie próbek, redukując zmienność w późniejszych analizach z wykorzystaniem spektrometrii mas.
- Umożliwia skalowalny i kosztowo efektywny screening zawartości białek EV w wielu eksperymentach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera odkrywanie biomarkerów translacyjnych poprzez zapewnienie czystego i powtarzalnego profilowania proteomu EV.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną dzięki minimalizacji przenoszenia syntetycznych polimerów i białek.
- Zmniejsza ryzyko wyników fałszywie dodatnich w identyfikacji biomarkerów spowodowanych zanieczyszczeniami pochodzącymi z probówek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół oczyszczania integruje się z procesem izolacji EV i analizą proteomiczną, od wczesnej fazy odkrywczej po badania przedkliniczne, zapewniając czystość próbek i kompatybilność analityczną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera rzetelne testowanie hipotez i analizę szlaków poprzez redukcję zakłócających sygnałów białkowych.
- Screening: Dostarcza probówki gotowe do analizy z minimalnym tłem, co umożliwia wiarygodne badania porównawcze.
- Analityka: Zapewnia ilościowe wyniki spektrometrii mas z potwierdzonym brakiem pików polimerowych.
- Badania translacyjne: Ułatwia powtarzalne profilowanie białek EV w celu dopasowania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zwalidowany, powtarzalny przepływ pracy z wykorzystaniem materiałów eksploatacyjnych dla ciągłych badań proteomicznych EV.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w proteomice EV poprzez minimalizację ryzyka kontaminacji.
- Wartość operacyjna: Redukuje koszty materiałów eksploatacyjnych i odpady laboratoryjne dzięki walidowanemu ponownemu wykorzystaniu probówek.
- Wartość strategiczna: Umożliwia przeprowadzenie większej liczby eksperymentów w ramach tego samego budżetu, wspierając efektywność kapitałową prac B+R.
- Wpływ na portfolio: Poprawia decyzje dotyczące rozwoju skorygowane o ryzyko poprzez zapewnienie integralności danych w wielu badaniach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie proteomiki oraz kontroli zanieczyszczeń.
- Wymaga dostępu do spektrometrii mas oraz zwalidowanych odczynników czyszczących.
- Wymaga standaryzacji etapów czyszczenia i walidacji pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych źródeł EV lub platform proteomicznych.
- Ograniczone do protokołów, w których można analitycznie potwierdzić, że przeniesienie polimerów i białek jest pomijalne.
