Name: Ponowne wykorzystanie probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w analizach proteomicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 2 min 36 s
Description: Poznaj protokół czyszczenia i ponownego wykorzystania probówek ultrawirówkowych z poliwęglanu do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w analizach proteomicznych. Metoda zmniejsza koszty i odpady laboratoryjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez grant badawczy z grantów National Institutes of Health (NIH) R01HL147095, R01HL141917, and R01HL136431, Kowa Company, Ltd., oraz Programu Badań i Innowacji Unii Europejskiej Horyzont 2020 w ramach umowy grantowej nr 101023041 (R. Cahalane). Rysunek 1 został utworzony za pomocą Biorender.com. Obecny protokół czyszczenia został opracowany poprzez modyfikację zalecanego protokołu czyszczenia rurki przedstawionego podczas Dnia Edukacji Międzynarodowego Towarzystwa Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych 2023 (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI). Serdeczne podziękowania dla dr Kathryn Howe i dr Sneha Raju z University Health Network (University of Toronto, Kanada) za oryginalne próbki EV tkanki szyjnej.

1. Czyszczenie rurki
UWAGA: Procedura izolacji EV wykorzystuje zarówno zaślepione, jak i niezakryte rury UC z poliwęglanu (szczegóły poniżej). Ta sama procedura została zastosowana zarówno dla probówek z nakrętką, jak i bez korka. W przypadku probówek z nakrętką, części wieczka były czyszczone indywidualnie i ponownie montowane po wysuszeniu i wstępnym przechowywaniu.
<ol>
	<li>Po pierwszym użyciu probówek poliwęglanowych i usunięciu próbki, należy natychmiast zanurzyć rurki UC w wodzie z kranu, aby zapobiec wysuszeniu próbki z boku probówki.</li>
	<li>Przenieś i zanurz probówki w 0,1% dodecylosiarczanie sodu (SDS) w wodzie z kranu na 10 minut.</li>
	<li>Jedna tubka na raz, zdekantuj większość, ale nie całość, roztworu SDS z probówki i użyj bawełnianego wacika, aby dokładnie wytrzeć obszar probówki, w którym znajdował się pellet EV. 
	UWAGA: Nie używaj niczego z włosiem. W tym protokole używano normalnych wacików bawełnianych; Jednak do czyszczenia probówek można użyć specjalistycznych, niestrzępiących się wacików bawełnianych.</li>
	<li>Spłukać co najmniej 3x gorącą wodą z kranu (~50 °C). Upewnij się, że tubka została całkowicie napełniona i zdekantowana.</li>
	<li>Spłucz 1x wodą demineralizowaną za pomocą butelki z rozpylaczem lub butelki z wąskim otworem.</li>
	<li>Spłucz 1x 70% etanolem za pomocą butelki z rozpylaczem.</li>
	<li>Pozostaw probówkę do góry nogami do wyschnięcia. 
	UWAGA: Stojaki na probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją dobrze sprawdzają się do suszenia probówek UC.</li>
	<li>Umieść całkowicie wysuszone probówki w czystym słoiku; są gotowe do ponownego użycia. 
	UWAGA: Obecnie protokół jest zatwierdzony do ponownego użycia do 2x.</li>
</ol>
2. Wzbogacenie EV
UWAGA: Następujący protokół izolacji EV i proteomiki został użyty zarówno do oryginalnej izolacji tkanki EV, jak również do "próbnych próbek" użytych do uzyskania pustych (nigdy nie używanych) i oczyszczonych próbek probówek. Oryginalne próbki zostały ponownie zawieszone w uwięzionych tkankach EV z blaszek szyjnych pacjentów, którzy przeszli endarterektomię tętnicy szyjnej. Próbki chirurgiczne zostały pobrane z University Health Network (Toronto, Kanada) i zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną. Wszyscy pacjenci wyrazili świadomą zgodę na pobranie próbki i analizę danych, zgodnie z Deklaracją Helsińską. Próbki próbne były pseudo-granulkami uzyskanymi z traktowania ślepych i oczyszczonych probówek tymi samymi roztworami i etapami przetwarzania, co próbki izolacyjne EV.
<ol>
	<li>Rozmrażanie próbek EV lub próbnych próbek w PBS na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj bufor NTE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,137 M NaCl pH 7,4) i sterylny filtr.</li>
	<li>Wirować próbki w temperaturze 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do otwartej probówki z poliwęglanu o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Odwirować supernatant w temperaturze 100 000× g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 150 μl sterylnie przefiltrowanego buforu NTE z inhibitorem proteazy.</li>
	<li>Przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać bufor NTE, aby uzyskać całkowitą objętość próbki 1,5 ml.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać na lodzie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie gradientów gęstości i separacja gradientów gęstości
UWAGA: Ten protokół izolacji EV został wcześniej opisany przez Blaser et al.9 W skrócie:
<ol>
	<li>Przygotować pięć roztworów pożywki o gradientzie gęstości jodiksanolu (10%, 15%, 20%, 25% i 30%) z buforem NTE jako rozcieńczalnikiem.</li>
	<li>Ułóż kolejno pięć roztworów gęstości w zakręconych probówkach ultrawirówek, tak aby 30% na dole i 10% na górze.</li>
	<li>Zabezpiecz nakrętki na probówce (rurkach) i delikatnie przesuwaj do stabilnej pozycji poziomej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 1 godzinie delikatnie przesuń rurkę (rurki) do pozycji pionowej na lodzie na 30 minut, aby schłodzić gradient.</li>
	<li>Dodać 1,5 ml próbki lub próbki próbnej (buforu NTE) do górnej części przygotowanej probówki (probówek) z gradientem gęstości.</li>
	<li>Probówka(-ki) ultrawirówkowa o masie 250 000 × g przez 40 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć górne frakcje gradientu gęstości (2,4 ml) do niezakorkowanej probówki (probówek) do ultrawirówki. Napełnij do 9 ml sterylnie przefiltrowanym buforem NTE.</li>
	<li>Granulowanie EV przez ultrawirowanie w temperaturze 100 000 × g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Zakreśl markerem położenie widocznej kulki EV lub oczekiwaną lokalizację. Umożliwi to bezpośrednie oczyszczenie obszaru granulki za pomocą wacika.</li>
	<li>Zassać supernatant, przesuwając probówkę do pozycji odwróconej na 3 minuty. Usuń pozostałe kropelki bawełnianym wacikiem przed odwróceniem probówki prawą stroną do góry.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad EV w 12 μl buforu lizy w referencyjnym zestawie.</li>
</ol>
4. Przygotowanie peptydów do proteomiki
UWAGA: Przygotowanie próbki proteomicznej zostało przeprowadzone zgodnie z protokołem zestawu z wewnętrznymi modyfikacjami dla próbek białek o niskiej obfitości. Zmodyfikowany protokół jest następujący:
<ol>
	<li>Próbki należy poddać lizie, denaturacji, redukcji i alkilowaniu przez ogrzewanie w buforze lizy w temperaturze 95 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Próbki roztwarzać przy użyciu roztworu trawiącego Lys-C/trypsyna przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, używając 10 μl roztworu lizy z próbki i 10 μl roztworu trawiącego.</li>
	<li>Oczyszczaj peptydy przez wkład, wypłukując zanieczyszczenia hydrofilowe i hydrofobowe oraz eluując oczyszczone peptydy za pomocą roztworów zestawowych.</li>
	<li>Oczyszczone peptydy suszyć w próżni o wysokiej prędkości w temperaturze 45 °C przez 45 minut lub do wyschnięcia. 
	UWAGA: Unikaj przesuszenia peptydów.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu sekwencjonowania metodą spektrometrii mas.</li>
	<li>Do wysuszonych peptydów dodać 17 μl roztworu z ładunkiem LC.</li>
	<li>Próbki należy pozostawić na lodzie na 1 godzinę.</li>
	<li>Krótko zawirować próbki, a następnie poddać je sonikacji w ultradźwiękowej łaźni wodnej przez 5 minut.</li>
	<li>Odwirować próbki z ładunkiem LC o masie 16 000 × g przez 1 minutę, zassać 15 μl od góry i rozdzielić do nowej probówki.</li>
</ol>
5. Chromatografia cieczowa i sekwencjonowanie tandemowej spektrometrii mas
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 2 μl roztworu peptydu z obciążeniem LC do spektrometru mas</li>.
	<li>Frakcjonuj peptydy przy użyciu konfiguracji dwukolumnowej.</li>
	<li>Ogrzewać kolumnę do stałej temperatury 45 °C.</li>
	<li>Uruchom gradient analityczny przy 300 nL/min od 5% do 21% rozpuszczalnika B (acetonitryl/0,1% kwasu mrówkowego) przez 60 minut, a następnie 10 minut od 21% do 30% rozpuszczalnika B i kolejne 10 minut mycia wyrzynarki w 95%-5%.</li>
	<li>Ustaw rozdzielczość MS1 na 120 K (maksymalny czas wtrysku, 25 ms), poddaj górne jony prekursorowe (w czasie cyklu 3,0 s) szerokości izolacji HCD 1,2 m/z, włączone wykluczenie dynamiczne (60 s) i ustaw rozdzielczość MS2 na 60 K (maksymalny czas wtrysku, auto; znormalizowana energia zderzenia, 24%, 26% i 28%).</li>
	<li>Ustaw zasięg akwizycji MS1 i MS2 odpowiednio na 400 m/z-1,200 m/z i 120 m/z-1,200 m/z.</li>
</ol>
6. Identyfikacja peptydów/białek
<ol>
	<li>Przeszukaj nabyte widma peptydów za pomocą oprogramowania do wyszukiwania proteomicznego przy użyciu komercyjnego algorytmu wyszukiwania w ludzkiej bazie danych uniProto.</li>
	<li>Ustaw enzym trawiący na trypsynę i pozwól na pominięcie do dwóch rozszczepień.</li>
	<li>Ustaw tolerancję prekursora na 10 ppm, a okno tolerancji fragmentu na 0,02 Da.</li>
	<li>Ustaw utlenianie metioniny i N-końcową acetylację jako zmienne modyfikacje, a cysteinę karbamidometylację jako modyfikację ustaloną.</li>
	<li>Przefiltruj peptydy na podstawie progu współczynnika fałszywych wykryć (FDR) wynoszącego 1,0%, zgodnie z obliczeniami algorytmu Percolator.</li>
	<li>Rozważ tylko peptydy przypisane do jednej danej grupy białek i niewykryte w żadnej innej grupie białek jako unikalne i użyj ich do dalszych analiz.</li>
	<li>Należy uwzględnić tylko co najmniej dwa unikalne peptydy dla każdego białka w analizach.</li>
	<li>Maksymalizuj identyfikatory dzięki wykrywaniu jonów prekursorowych.</li>
	<li>Przeprowadzić wyrównanie chromatograficzne z maksymalnym przesunięciem czasu retencji wynoszącym 10 minut, tolerancją masy 10 ppm i minimalnym stosunkiem sygnału do szumu wynoszącym 5.</li>
	<li>Normalizuj obfitość peptydów przez całkowitą ilość peptydu.</li>
</ol>

Efficient Recycling of Polycarbonate Ultracentrifuge Tubes for Proteomics

<ol><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles%3A+general+methodologies+and+latest+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, e854347(2018).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Karimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+the+plasma+extracellular+vesicle+proteome+after+separation+from+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).</li>
<li>Lischnig, A., Bergqvist, M., Ochiya, T., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+proteins+enriched+in+large+and+small+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies proteins enriched in large and small extracellular vesicles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 21 (9), 100273(2022).</li>
<li>van Herwijnen, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+proteomic+analysis+of+human+milk-derived+extracellular+vesicles+unveils+a+novel+functional+proteome+distinct+from+other+milk+components%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive proteomic analysis of human milk-derived extracellular vesicles unveils a novel functional proteome distinct from other milk components.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (11), 3412-3423 (2016).</li>
<li>Blaser, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiomics+of+tissue+extracellular+vesicles+identifies+unique+modulators+of+atherosclerosis+and+calcific+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Multiomics of tissue extracellular vesicles identifies unique modulators of atherosclerosis and calcific aortic valve stenosis.</a> Circulation. 148 (8), 661-678 (2023).</li>
<li>Kristensen, K., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+cationic+peptides+to+solid+surfaces+of+glass+and+plastic%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adsorption of cationic peptides to solid surfaces of glass and plastic.</a> PLOS ONE. 10 (5), e0122419(2015).</li>
<li>Use and care of centrifuge tubes and bottles. Beckman Coulter. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles">https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles</a> (2014).</li>
<li>R&D & Technology Department chemical resistance of polycarbonate products. PALRAM. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ilgbcatalog.org/wp-content/uploads/2015/02/PC-chemical-resistance.pdf">http://ilgbcatalog.org/wp-content/uploads/2015/02/PC-chemical-resistance.pdf</a> (2015).</li>
<li>Wang, L., Zhang, J., Hou, S., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+quantifying+polycarbonate+and+polyethylene+terephthalate+microplastics+in+environmental+samples+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for quantifying polycarbonate and polyethylene terephthalate microplastics in environmental samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (12), 530-534 (2017).</li>
<li>Schittek, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermcidin%3A+a+novel+human+antibiotic+peptide+secreted+by+sweat+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dermcidin: a novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1133-1137 (2001).</li>
<li>Blaydon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+CSTA%2C+encoding+Cystatin+A%2C+underlie+exfoliative+ichthyosis+and+reveal+a+role+for+this+protease+inhibitor+in+cell-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (4), 564-571 (2011).</li>
<li>Henry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hornerin+is+a+component+of+the+epidermal+cornified+cell+envelopes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hornerin is a component of the epidermal cornified cell envelopes.</a> FASEB Journal. 25 (5), 1567-1576 (2011).</li>
<li>Bolling, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+ichthyotic+peeling+skin+syndrome+due+to+FLG2+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Generalized ichthyotic peeling skin syndrome due to FLG2 mutations.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (8), 1881-1884 (2018).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMP+molecules+S100A9+and+S100A8+activated+by+IL-17A+and+house-dust+mites+are+increased+in+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">DAMP molecules S100A9 and S100A8 activated by IL-17A and house-dust mites are increased in atopic dermatitis.</a> Experimental Dermatology. 23 (12), 938-941 (2014).</li>
<li>Gläser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+protein+psoriasin+%28S100A7%29+is+upregulated+in+atopic+dermatitis+and+after+experimental+skin+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial protein psoriasin (S100A7) is upregulated in atopic dermatitis and after experimental skin barrier disruption.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (3), 641-649 (2009).</li>
<li>Molhave, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((House+dust+in+seven+Danish+offices%5BTitle%5D)+AND+%22Atmospheric+Environment%22%5BJournal%5D)">House dust in seven Danish offices.</a> Atmospheric Environment. 34, 4767-4779 (1999).</li>
<li>Buschow, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-associated+proteins+in+B-cell+exosomes+and+potential+functional+implications+for+exosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (8), 851-856 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W tym miejscu opisujemy i zatwierdzamy protokół czyszczenia rurek UC z poliwęglanu do zastosowań wzbogacania EV i proteomicznych. Wykazaliśmy pomyślne usunięcie resztkowego białka z poprzedniej próbki probówki UC w porównaniu z oczyszczoną analizą pseudo-granulek poniżej granicy wykrywalności tego protokołu akwizycji spektrometrii mas i wykazaliśmy proteomiczne podobieństwo ślepej, nigdy nie używanej probówki UC w porównaniu z oczyszczonymi pseudogranulkami rurki UC.
Po pierwsze, aby zapobiec ...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to cząstki rozdzielane dwuwarstwami lipidów uwalniane z komórek, które przenoszą biologicznie aktywny ładunek, taki jak białko, i uczestniczą w różnych procesach biologicznych, w tym w komunikacji między komórkami i tworzeniu mineralizacji biologicznej1. Cząstki te znajdują się we wszystkich płynach ustrojowych i tkankach, a ich aktywność biologiczna i zastosowania są szybko rozwijającą się dziedziną badań naukowych. Izolacja i walidacja tych nanocząstek wiąże się z różnymi wyzwaniami ze względu na ich niewielkie rozmiary i biopodobieństwo do innych cząstek, takich jak liposomy i agregaty białkowe. Najnowsze wytyczne Międzynarodowego Towarzystwa Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych, Minimalne informacje do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych 2018 (MISEV2018), są uznanym standardem dla badań naukowych EV2.
Różne metody, często w tandemie, muszą być używane do izolacji EV, w zależności od źródła poprzedzającego i dalszych zastosowań. Od 2015 r. najpowszechniejszą metodą izolacji pierwotnej dla pojazdów elektrycznych było ultrawirowanie różnicowe (UC)2. Zasadniczo, początkowe wirowanie z niższą prędkością oddziela większe lub gęstsze niepożądane składniki, takie jak komórki i szczątki komórek, pozostawiając EV w supernatancie. Następnie UC wykorzystuje bardzo dużą siłę odśrodkową do granulowania, a tym samym oddzielania i oczyszczania EV z innych cząstek, które są mniejsze lub mniej gęste, ale które mogą również zawierać gęste cząstki inne niż EV. Większość protokołów często używa, na tym czy innym etapie, UC do izolowania EV od płynu3. Ponadto UC jest stosowany w innych metodach izolacji EV, takich jak ultrawirowanie w gradimencie gęstości (DGUC), które wykorzystuje media, takie jak jodiksanol OptiprepTM i siłę odśrodkową do rozdzielania EV zgodnie z ich gęstością wyporu4. Istnieją inne metody izolacji EV3.
Biorąc pod uwagę szybko rozwijające się zrozumienie procesów biologicznych dyktowanych przez EV i ich potencjał jako biomarkerów oraz informacji dotyczących patofizjologii, analizy oparte na odkryciach, takie jak proteomika, zyskały na popularności5,6,7,8. EV są małe i, w zależności od źródła, mają niską wydajność białka (<1 μg) w porównaniu z lizatem z całych tkanek lub komórek. Izolacja EV do analizy proteomicznej wymaga specjalnych względów, takich jak usuwanie zanieczyszczeń białkowych innych niż EV z cieczy lub tkanki znajdującej się przed nimi, uwzględnienie degradacji białka EV podczas procesu izolacji oraz wykorzystanie metod tworzenia roztworów białkowych, które są chemicznie kompatybilne z preparatem peptydowym i analizami spektrometrii mas.
Materiały eksploatacyjne do laboratoriów badawczych są często plastikowe i jednorazowego użytku. Te materiały jednorazowego użytku przyczyniają się do globalnego kryzysu związanego z zanieczyszczeniem tworzywami sztucznymi i kosztami materiałów eksploatacyjnych. Specjalistyczne rurki UC z poliwęglanu i polistyrenu są zaprojektowane tak, aby wytrzymać wysokie siły odśrodkowe wymagane do granulowania pojazdów elektrycznych w zastosowaniach laboratoryjnych. Chociaż możliwa jest sterylizacja i dezynfekcja probówek UC w celu ich ponownego użycia, szczególnej uwagi wymaga analiza proteomiczna, zwłaszcza w przypadku produktów o niskiej wydajności białka, takich jak EV. Najważniejsze jest nie tylko wystarczające usunięcie pozostałości białka z poprzedniego zastosowania, ale także kompatybilność chemiczna ze spektroskopią mas i zanieczyszczenie polimerami pochodzącymi z tworzyw sztucznych.
Tutaj prezentujemy protokół czyszczenia probówek poliwęglanowych za pomocą detergentów odpowiednich do spektrometrii mas i przeprowadzamy eksperymenty, aby potwierdzić skuteczne usuwanie resztek białka poniżej limitów wykrywalności i braku wykrywalnych zanieczyszczeń polimerowych. Aby zwalidować protokół czyszczenia dla zastosowań proteomicznych EV przy użyciu zarówno UC, jak i DGUC, uzyskaliśmy probówki z izolacji EV ludzkich tkanek naczyniowych z połączonym protokołem UC i DGUC. Probówki oczyszczono przy użyciu opisanego protokołu, a proces eksperymentalny powtórzono bez próbek porównujących pustą, nigdy nie używaną probówkę UC i oczyszczoną probówkę UC. Ostatecznie, walidacja protokołu czyszczenia rur UC odpowiedniego do wzbogacania pojazdów elektrycznych zmniejszy ilość odpadów wytwarzanych przez laboratoria pojazdów elektrycznych i obniży koszty związane z takimi eksperymentami.

<table><tbody><tr><td>10 ml grubościenna rurka poliwęglanowa z otwartym dachem Beckman</td><td>Coulter Life Sciences</td><td>355630</td><td>niezakryta probówka (probówki) ultrawirówkowa bez pokrywy&nbsp;</td></tr><tr><td>Butelka z poliwęglanu 10,4 ml z zespołem nakrętki</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>355603</td><td>probówka ultrawirówkowa z nakrętką&nbsp;</td></tr><tr><td>Uznanie PepMap 100 C18 HPLC Kolumny, 75 i mikro; m x 70 mm; oraz kolumnę HPLC EASY-Spray, 75 &mikro; m x 250 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>164946 i ES902</td><td>Konfiguracja dwukolumnowa</td></tr><tr><td>Krytyczny wacik do wacików, bawełniany wacik z głowicą</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Exploris 480 z przodu ze źródłem EASY-Spray, sprzężony z pompą HPLC Easy-nLC1200.</td>Baza danych <td>spektrometru</td> <td>masowego ThermoFisher Scientific</td><td>BRE725533</td></tr><tr><td>Human UniProt (101043 wpisów, zaktualizowana w styczniu 2022 r.)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Baza danych dla ludzi</td></tr><tr><td></td><td>Zestaw</td> PreOmics iST do wody <td></td><td></td></tr><tr><td>wodnej MilliQ &nbsp;</td><td>Komercyjny zestaw do przygotowywania próbek białek</td> <td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td>&nbsp;</tr><tr><td>Odkrywca proteomu &nbsp; pakiet (PD, wersja 2.5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>Oprogramowanie do wyszukiwania proteomicznego</td></tr><tr><td>Algorytm wyszukiwania SEQUEST-HT&nbsp;</td><td>Algorytm</td><td></td><td>wyszukiwania</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (20%)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-230</td><td>detergent</td></tr></tbody></table>

ponowne wykorzystanie probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w analizach proteomicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Polycarbonate Ultracentrifuge Tube Re-Use in Proteomic Analyses of Extracellular Vesicles

Jednorazowe laboratoryjne tworzywa sztuczne pogłębiają kryzys związany z zanieczyszczeniem środowiska i przyczyniają się do wzrostu kosztów materiałów eksploatacyjnych. W izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) stosuje się probówki ultrawirówki z poliwęglanu (UC), które wytrzymują związane z tym duże siły odśrodkowe. Proteomika EV to rozwijająca się dziedzina i brakuje zatwierdzonych protokołów ponownego użycia tych probówek. Ponowne wykorzystanie materiałów eksploatacyjnych do protokołów izolacji białek o niskiej wydajności i dalszej proteomiki wymaga kompatybilności odczynników z akwizycjami spektroskopii mas, takich jak brak zanieczyszczenia syntetycznym polimerem pochodzącym z probówki wirówkowej oraz wystarczające usunięcie resztek białek.
Ten protokół opisuje i zatwierdza metodę czyszczenia rurek UC z poliwęglanu do ponownego wykorzystania w eksperymentach proteomicznych EV. Proces czyszczenia polega na natychmiastowym zanurzeniu rurek UC wH2O, aby zapobiec wysuszeniu białek, umyciu w 0,1% detergentu z dodecylosiarczanu sodu (SDS), spłukaniu w gorącej wodzie z kranu, wodzie demineralizowanej i 70% etanolu. Aby zwalidować protokół ponownego użycia rurki UC na potrzeby dalszej proteomiki EV, zużyte rurki uzyskano po eksperymencie izolującym EV z tkanki sercowo-naczyniowej za pomocą różnicowej separacji UC i gradientu gęstości. Probówki oczyszczono, a proces eksperymentalny powtórzono bez próbek EV, porównując puste, nigdy nie używane probówki UC z oczyszczonymi probówkami UC. Granulki pseudo-EV otrzymane w procedurach izolacji poddano lizie i przygotowano do chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas przy użyciu komercyjnego zestawu do przygotowywania próbek białek z modyfikacjami dla próbek białek o niskiej liczebności.
Po oczyszczeniu, liczba zidentyfikowanych białek została zmniejszona o 98% w pseudo-granulce w porównaniu z poprzednią próbką izolacji EV z tej samej probówki. Porównując oczyszczoną probówkę z pustą probówką, obie próbki zawierały bardzo małą liczbę białek (≤20) z 86% podobieństwem. Potwierdzono brak pików polimerowych w chromatogramach oczyszczonych probówek. Ostatecznie, walidacja protokołu czyszczenia rur UC odpowiedniego do wzbogacania pojazdów elektrycznych zmniejszy ilość odpadów wytwarzanych przez laboratoria pojazdów elektrycznych i obniży koszty eksperymentów.

Aby zwalidować protokół czyszczenia (Rycina 1), przeprowadzono dwa eksperymenty. Po pierwsze, proteom „próbek kontrolnych” (mock samples) z oczyszczonej probówki porównano z proteomem próbek EV z tkanki pobranych podczas pierwszego użycia probówki, aby określić poziom przeniesienia zidentyfikowanych białek. Reprezentatywne chromatogramy wykazują zmniejszenie heterogeniczności pików po oczyszczeniu probówek (Rysunek 2). W pierwotnej izolacji EV zidentyfikowano 80...

Szczegółowy protokół jest dostarczony do czyszczenia i ponownego użycia probówek ultrawirówek z poliwęglanu do przeprowadzenia izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych odpowiednich do eksperymentów proteomicznych.

Ponowne wykorzystanie probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w analizach proteomicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Single-use laboratory plastics exacerbate the pollution crisis and contribute to consumable costs. In extracellular vesicle (EV) isolation, polycarbonate ...

Zajmujemy się chorobami układu krążenia, a konkretnie rolą pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w patologicznym zwapnieniu tkanek sercowo-naczyniowych, takich jak zastawki i naczynia krwionośne. Naukowcy z naszej grupy zdefiniowali niedawno metody ekstrakcji tkanek i uwięzionych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z włóknistej zwapnienia tkanki sercowo-naczyniowej w celu określenia ich profilu proteomicznego. Nasza grupa wykazała, że te pęcherzyki zewnątrzkomórkowe zawierają ważny ładunek białka do inicjowania zwapnienia w chorych tkankach.Specjalistyczne probówki stosowane na etapie ultrawirowania izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych mogą być czyszczone i sterylizowane w celu ponownego użycia. Jednak analiza proteomiczna wymaga szczególnej uwagi, ponieważ każde zanieczyszczenie może znacznie wpłynąć na dalsze wyniki. W tym miejscu weryfikujemy protokół ponownego wykorzystania materiałów eksploatacyjnych, w szczególności ultrawirówek z poliwęglanu do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, które są odpowiednie do dalszych zastosowań proteomicznych o niskim nakładzie pracy.Nasz protokół jest prosty i skuteczny i pozwoli naukowcom zmniejszyć zarówno koszty materiałów eksploatacyjnych, j

polycarbonate-ultracentrifuge-tube-re-use-proteomic-analyses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Ten film opisuje technikę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ze świeżych lub zamrożonych tkanek. Wyizolowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe można wykorzystać do dalszej analizy w celu odkrycia ich znaczącej roli w patogenezie choroby.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek całych tkanek za pomocą wirowania różnicowego

Ten film demonstruje metodę oczyszczania opartą na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wyizolowania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nadających się do badań charakteryzacyjnych.

Oczyszczanie subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika oczyszczania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirowania w gradimencie gęstości

Ten film demonstruje technikę chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) do oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu hodowlanego Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Technika ta wykorzystuje porowatą kolumnę wypełnioną żywicą w celu uzyskania oczyszczonych frakcji EV. Porowate cząsteczki selektywnie pozwalają mniejszym białkom wnikać do porów, co skutkuje wolniejszą elucją. Jednocześnie pojazdy elektryczne są wykluczone z wnikania do porów ze względu na ich większy...

Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Protokół opisuje powtarzalną metodę przeznaczoną do użycia z supernatantami do hodowli komórkowych do wykrywania epitopów powierzchniowych na małych pęcherzykach zewnątrzkomórkowych (EV). Wykorzystuje specyficzną immunoprecypitację EV za pomocą kulek sprzężonych z przeciwciałami, które rozpoznają antygen powierzchniowy CD9, CD63 i CD81. Metoda jest zoptymalizowana pod kątem analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometryczna przepływowa pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z pożywek kondycjonowanych komórkowo

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z całych tkanek, w tym próbek mózgu i nowotworów. Metoda ta oferuje powtarzalną technikę ekstrakcji EV z tkanki stałej w celu dalszych analiz.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Tutaj prezentujemy łatwy do zastosowania protokół do oceny stabilności przechowywania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych, grupy naturalnie występujących nanocząsteczek wytwarzanych przez komórki. Pęcherzyki są obciążone glukuronidazą jako enzymem modelowym i przechowywane w różnych warunkach. Po przechowywaniu oceniane są ich parametry fizykochemiczne oraz aktywność kapsułkowanego enzymu.

Ocena stabilności spichrzeniowej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Ten protokół izoluje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) od wirionów z wysoką wydajnością i wydajnością, włączając wytrącanie EV, ultrawirowanie w gradiencie gęstości i wychwytywanie cząstek, aby umożliwić usprawnienie przepływu pracy i zmniejszenie wymagań dotyczących objętości początkowej, co skutkuje powtarzalnymi przygotowaniami do użycia we wszystkich badaniach nad EV.

Oczyszczanie wysokowydajnych preparatów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z wirusa

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy izolacji, koncentracji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kultur sinic. Omówiono również podejścia do oczyszczania pęcherzyków z kultur w różnych skalach, kompromisy między metodologiami oraz rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

To badanie opisuje metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (BEV) wzbogaconych z ludzkiego kału poprzez wirowanie w gradifikacji gęstości (DGC), identyfikuje fizyczne cechy BEV na podstawie morfologii, wielkości cząstek i stężenia, oraz omawia potencjalne zastosowania podejścia DGC w badaniach klinicznych i naukowych.

Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Poznaj protokół czyszczenia i ponownego wykorzystania probówek ultrawirówkowych z poliwęglanu do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w analizach proteomicznych. Metoda zmniejsza koszty i odpady laboratoryjne.

Ponowne wykorzystanie probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w analizach proteomicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Przeglądaj więcej filmów