Name: Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj obrazowanie wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników. Ta metoda pozwala badać zakłócenia sygnałowania w nabłonku jelitowym i interakcje wirus-gospodarz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty R01DK115507 i R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) z National Institutes of Health (NIH). Wsparcie stażystów zapewnili F30DK131828 grantów NIH (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) i F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Chcielibyśmy podziękować Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core za dostarczenie pożywki do konserwacji organoidów.

Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers

<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Danese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+as+a+result+of+calcium+signaling+modulation%3A+A+cancer-centric+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061(2021).</li>
<li>Harr, M. W., Distelhorst, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+autophagy%3A+Decoding+calcium+signals+that+mediate+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579(2010).</li>
<li>Barak, P., Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Ca2%2B+microdomains+from+store-operated+CRAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097(2020).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP%2C+a+family+of+single-fluorophore+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Evol+Biochem+Phys%22%5BJournal%5D)">GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators.</a> J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).</li>
<li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li>
<li>Nászai, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells%3A+Got+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells: Got calcium.</a> Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).</li>
<li>Barrett, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+chloride+secretion+in+the+intestinal+epithelium%3A+Significance+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation.</a> Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensing+receptor+regulates+intestinal+dipeptide+absorption+via+Ca2%2B+signaling+and+IKCa+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation.</a> Physiol Rep. 8 (1), e14337(2020).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CRISPR%E2%80%93Cas9-mediated+genetic+knockout+human+intestinal+tissue%E2%80%93derived+enteroid+lines+by+lentivirus+transduction+and+single-cell+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).</li>
<li>Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+dissect+gastrointestinal+virus-host+interactions%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned.</a> Viruses. 13 (6), 999(2021).</li>
<li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FPbase%3A+a+community-editable+fluorescent+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li>
<li>Lai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-triggered+secretion+by+hydrocarbon-stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides.</a> Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+induces+intercellular+calcium+waves+through+ADP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling.</a> Science. 370 (6519), eabc3621(2020).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoctamin+1%2FTMEM16A+controls+intestinal+Cl%E2%88%92+secretion+induced+by+carbachol+and+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin.</a> Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+TMEM16A+control+luminal+chloride+secretion+in+a+NHERF1+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100912(2021).</li>
<li>Mroz, M. S., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+chronically+upregulates+Ca2%2B-dependent+Cl%E2%88%92+conductance+and+TMEM16A+expression+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells.</a> J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).</li>
<li>Sui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+Ca2%2B-activated+Cl%E2%88%92+channel+transmembrane+member+16A+in+lipopolysaccharide-induced+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 404(2020).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).</li>
<li>Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+as+a+key+for+pathogens+invasion+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (5), 2506(2021).</li>
<li>Samak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2FAsk1%2FMKK7%2FJNK2%2Fc-Src+signalling+cascade+mediates+disruption+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+by+dextran+sulfate+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium.</a> Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+Ca2%2B+regulates+intestinal+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity.</a> Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).</li>
<li>Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+host+cell+calcium+signaling+during+viral+infections%3A+Emerging+paradigm+with+high+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance.</a> Mol Aspects Med. 81, 101004(2021).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+calcium+dysregulation+manifests+as+dynamic+calcium+signaling+in+the+cytoplasm+and+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum.</a> Sci Rep. 9 (1), 10822(2019).</li>
<li>Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+disrupts+calcium+homeostasis+by+NSP4+viroporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity.</a> mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).</li>
<li>Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rotavirus+NSP4+viroporin+domain+is+a+calcium-conducting+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel.</a> Sci Rep. 7, 43487(2017).</li>
<li>Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+hijacked+through+viroporin-activated+calcium%2Fcalmodulin-dependent+kinase+kinase-%CE%B2+signaling+is+required+for+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).</li>
<li>Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPII+vesicle+transport+is+required+for+Rotavirus+NSP4+interaction+with+the+autophagy+protein+LC3+II+and+trafficking+to+viroplasms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms.</a> J Virol. 94 (1), e01341(2019).</li>
<li>Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+calcium+on+the+early+steps+of+Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection.</a> Virology. 295 (1), 190-200 (2002).</li>
<li>Hyser, J. M., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+consequences+of+calcium-conducting+viroporins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins.</a> Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).</li>
<li>Strtak, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovirus+NS1-2+has+viroporin+activity+that+induces+aberrant+cellular+calcium+signaling+to+facilitate+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication.</a> mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> J Vis Exp. (146), 59357(2019).</li>
<li>Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+intestinal+organoid+technology+and+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling.</a> Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).</li>
<li>Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+rotavirus+entry+and+release+from+differentiated+small+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells.</a> Virology. 499, 65-71 (2016).</li>
<li>Mirabelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Norovirus+efficiently+replicates+in+differentiated+3D-human+intestinal+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids.</a> J Virol. 96 (22), e0085522(2022).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), 28749075(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+NEMO+as+calcium+indicators+with+large+dynamics+and+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity.</a> Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Zmiany poziomu cytozolowego Ca2+ mogą być zarówno przyczyną, jak i skutkiem patologii w obrębie nabłonka 10,16,17. Wzrost cytozolowego wapnia może bezpośrednio napędzać wydzielanie poprzez aktywację zależnego od wapnia kanału chlorkowego TMEM16A 18,19. Aktywacja TMEM16A w odpowiedzi na Ca2+ pozwala na wierzchołkowy wypływ chlorku, ustanawiając gradi...

Wapń jest powszechnie konserwowanym drugim przekaźnikiem, który odgrywa kluczową rolę w regulacji fizjologii komórkowej1. Ze względu na silny ładunek, niewielkie rozmiary i wysoką rozpuszczalność w warunkach fizjologicznych, wapń jest idealnym manipulatorem konformacji białek. To sprawia, że wapń jest potężnym środkiem do przekształcania sygnałów elektrochemicznych w zmiany enzymatyczne, transkrypcyjne lub potranskrypcyjne. Ścisłe gradienty stężenia wapnia w siateczce endoplazmatycznej (ER) i błonach plazmatycznych tworzą dużą siłę napędową, która pozwala na szybkie zmiany stężenia wapnia w cytozolu. Wiele mechanizmów, w tym zarówno buforowanie, jak i transport aktywny, ściśle utrzymuje ten gradient. Chociaż jest to konieczne dla normalnych funkcji komórkowych, to utrzymanie jest energetycznie kosztowne, co czyni je szczególnie podatnym w stanach stresu 2.
W związku z tym, rozregulowanie wapnia w cytozolu jest niemal uniwersalnym sygnałem wielu rodzajów stresu komórkowego. Zaburzenia metaboliczne, toksyny, patogeny, uszkodzenia mechaniczne i zaburzenia genetyczne mogą zakłócać sygnalizację wapniową. Niezależnie od bodźca, na poziomie całej komórki, utrzymujący się, niekontrolowany wzrost cytozolowego wapnia może sprzyjać apoptozie i ostatecznie martwicy3,4. Zmiany poziomu wapnia cytozolowego o mniejszej amplitudzie lub wyższej częstotliwości mają jednak różne skutki2. Podobnie, wyniki wahań wapnia mogą się różnić w zależności od mikrodomeny przestrzennej, w której występują5. Monitorowanie poziomu wapnia może zatem zapewnić wgląd w dynamiczne procesy sygnalizacyjne, ale wymaga to pobierania próbek ze stosunkowo wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.
Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) są potężnymi narzędziami do ciągłego pobierania próbek w systemach żywych komórek6. Niektóre z najczęściej stosowanych GECI to reagujące na wapń białka fluorescencyjne na bazie GFP, znane jako GCaMPs7. Kanoniczny GCaMP to fuzja trzech odrębnych domen białkowych: kołowo permutowanego GFP (cpGFP), kalmoduliny i M136. Domena kalmoduliny ulega zmianie konformacji po związaniu wapnia, co umożliwia jej interakcję z M13. Interakcja kalmodulina-M13 indukuje zmianę konformacyjną w cpGFP, która zwiększa jego emisję fluorescencyjną po wzbudzeniu. W związku z tym wzrost stężenia wapnia koreluje ze wzrostem intensywności fluorescencji GCaMP. Czujniki te mogą być cytozolowe lub ukierunkowane na określone organelle8.
Podobnie jak w większości tkanek, wapń reguluje różne funkcje w obrębie nabłonka przewodu pokarmowego. Nabłonek jelitowy jest integralną częścią wchłaniania składników odżywczych i płynów, ale musi również tworzyć ścisłą barierę i interfejs immunologiczny, aby uniknąć inwazji patogenów lub toksycznych urazów. Szlaki zależne od wapnia wpływają na prawie wszystkie te funkcje życiowe9,10,11. Jednak sygnalizacja wapniowa w nabłonku jelitowym pozostaje niedostatecznie zbadaną granicą z obiecującym potencjałem jako cel terapeutyczny. Podczas gdy monitorowanie dynamiki wapnia w nabłonku jelitowym in vivo nadal stanowi wyzwanie, ludzkie organoidy jelitowe (HIO) oferują adaptowalny system ex vivo do eksperymentów12. HIO są trójwymiarowymi (3D) sferoidami pochodzącymi z ludzkich jelitowych komórek macierzystych i, po różnicowaniu, podsumowują dużą część różnorodności komórkowej natywnego nabłonka jelitowego12.
Ten protokół opisuje kompleksowe metody inżynierii HIO, które wyrażają GECI, a następnie przygotowują zmodyfikowane HIO jako monowarstwy do obrazowania wapnia w żywych komórkach. Oferuje infekcję wirusową jako przykład patologicznej manipulacji, która zakłóca sygnalizację wapnia i zapewnia analityczne podejście do ilościowego określenia tych zmian.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowany DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>0,05% Trypsyna EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>Probówki mikrowirówkowe 1,5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>5408137</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0553859A</td> 16% formaldehydu <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 25</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1482113D</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-antyprątkowy&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP1600100</tr><tr><td>Szkiełko do hodowli komórkowych CellView, PS, 75/25 MM, szklane dno, 10 przegródek</td><td>Greiner</td><td>543979</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodowa&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobryt</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>ProteinTech</td><td>HZ-1326</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>VectorBuilder</td> <td>(zmienna)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosceicen</td><td>356231/CB40230C</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki poddane hodowli komórek nunc</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>Enzym TrypLE Express, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Worthington Biochemical</td><td>NC9811754</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Sygnalizacja wapniowa jest integralnym regulatorem prawie każdej tkanki. W nabłonku jelitowym wapń bierze udział w regulacji aktywności wydzielniczej, dynamice aktyny, reakcjach zapalnych, proliferacji komórek macierzystych i wielu innych niescharakteryzowanych funkcjach komórkowych. W związku z tym mapowanie dynamiki sygnalizacji wapniowej w nabłonku jelitowym może zapewnić wgląd w homeostatyczne procesy komórkowe i ujawnić unikalne reakcje na różne bodźce. Ludzkie organoidy jelitowe (HIO) są wysokoprzepustowym, pochodzącym od człowieka modelem do badania nabłonka jelitowego, a tym samym stanowią użyteczny system do badania dynamiki wapnia. W tym artykule opisano protokół stabilnej transdukcji HIO z genetycznie kodowanymi wskaźnikami wapnia (GECI), wykonywania mikroskopii fluorescencyjnej na żywo i analizy danych obrazowych w celu sensownego scharakteryzowania sygnałów wapniowych. Jako reprezentatywny przykład, trójwymiarowe HIO zostały transdukowane lentiwirusem w celu stabilnej ekspresji GCaMP6s, cytozolowego GECI opartego na zielonym fluorescencyjnym białku. Zmodyfikowane HIO zostały następnie rozproszone w jednokomórkowej zawiesinie i wysiane jako monowarstwy. Po różnicowaniu monowarstwy HIO zostały zakażone rotawirusem i/lub potraktowane lekami, o których wiadomo, że stymulują odpowiedź wapniową. Mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w nawilżoną komorę do obrazowania na żywo o kontrolowanej temperaturze pozwolił na długotrwałe obrazowanie zakażonych lub leczonych lekami monowarstw. Po zobrazowaniu uzyskane obrazy zostały przeanalizowane za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania analitycznego ImageJ. Ogólnie rzecz biorąc, prace te ustanawiają elastyczny potok do charakteryzowania sygnalizacji komórkowej w HIO.

Rysunek 1A przedstawia kopułę BMM zawierającą trójwymiarowe ludzkie organoidy jelita, które zostały przetransdukowane w celu stabilnej ekspresji GCaMP6s. Rysunek 1B przedstawia tę samą linię organoidów wysianą jako monowarstwa w 24, 48 i 72 h po wysianiu. Aby zweryfikować funkcję GCaMP6s, monowarstwę obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej co 2 s przez 4 min, a po około 20 s do medium dodano 100 nM ADP. ADP wywołuje uwalnianie wapnia z retikulum endopl...

Ten protokół opisuje podejście do wykonywania obrazowania wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych i oferuje podejście do analizy.

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

W ramach naszych badań dążymy do zrozumienia, w jaki sposób wirusy zaburzają sygnalizację w obrębie nabłonka jelitowego. Szczególnie interesuje nas poznanie mechanizmów, dzięki którym komórki zainfekowane wirusem dysregulują sąsiednie komórki niezainfekowane, co przyczynia się do patogenezy. Niedawno odkryliśmy, że komórki zainfekowane rotawirusem uwalniają impulsy ADP, co prowadzi do dysregulacji sąsiednich komórek niezainfekowanych, ułatwia rozprzestrzenianie się wirusa i zaostrza przebieg choroby. Choć obrazowanie wapnia jest bardzo popularne w dziedzinach takich jak neuronauka, nie było ono szeroko stosowane w badaniach nad biologią nabłonków czy wirusologią. Niniejszy protokół przedstawia podejście pozwalające na adaptację istniejących technologii i systemów modelowych do badania sygnalizacji wapniowej w żywej, zainfekowanej wirusem tkance nabłonkowej.Dzięki modyfikacji organoidów w celu ekspresji genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, nasze podejście umożliwia spójne, powtarzalne i długoterminowe obrazowanie w systemie modelowym, który odzwierciedla różnorodność komórkową ludzkiego nabłonka jelitowego.Naszym celem jest zrozumienie wpływu indukowanego przez wirusy parakrynn

live-calcium-imaging-virus-infected-human-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie wapnia in vivo wirusowo zakażonych ludzkich pojedynczych warstw organoidów jelitowych z wykorzystaniem genetycznie zakodowanych wskaźników wapnia

Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Źródło: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Ten film pokazuje wapń obrazowanie w celu wizualizacji i analizy aktywności neuronów jelitowych i gleju w preparatach splotu mięśniowo-mięśniowego okrężnicy myszy.

Obrazowanie wapnia aktywności neuronów jelitowych i gleju w splocie mięśniowym okrężnicy myszy

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Ten protokół wyjaśnia pierwotną hodowlę organoidów z dodatnim Lgr5 i późniejszą transdukcję retrowirusową. Umożliwia to indukowaną przez Cre nadekspresję lub knockdown dostarczonego transgenu i umożliwia prowadzenie badań funkcjonalnych w nowym systemie modeli organotypowych in vitro.

Protokół wideo infekcji retrowirusowej w pierwotnej hodowli organoidów jelitowych

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół, w którym pojedyncze komórki są monitorowane pod kątem ostrych zdarzeń i produktywnego zakażenia HIV-1 na urządzeniu nanofluidycznym. Dane obrazowe definiują interakcje wirus-receptor gospodarza i dynamikę szlaku sygnałowego. Jest to pierwsza metoda nanofluidycznej, wysokoprzepustowej, podłużnej hodowli pojedynczej komórki i obrazowania w celu zbadania kinetyki sygnalizacji i interakcji molekularnych.

Jednokomórkowa charakterystyka napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu wieloparametrowej platformy optofluidycznej

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Obrazowanie żywymi komórkami sygnalizacji wapnia jest szeroko wykorzystywane do badania mobilizacji wapnia w stabilnych liniach komórkowych hodowanych w monowarstwach. Protokół ten opisuje obrazowanie fluorescencji żywych komórek sygnalizacji wapnia z użyciem barwników komórek żywych na złożonych, pierwotnych tkankach, a także wykorzystuje oprogramowanie uczenia maszynowego do ilościowego określania intensywności fluorescencji tysięcy pojedynczych komórek jednocześnie, co usprawnia analizy.

Obrazowanie wapnia oparte na fluorescencji w pierwotnych hodowlach nabłonka dróg oddechowych z wykorzystaniem zautomatyzowanej segmentacji komórek

Poznaj obrazowanie wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników. Ta metoda pozwala badać zakłócenia sygnałowania w nabłonku jelitowym i interakcje wirus-gospodarz.

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Przeglądaj więcej filmów