Name: Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj obrazowanie wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników. Ta metoda pozwala badać zakłócenia sygnałowania w nabłonku jelitowym i interakcje wirus-gospodarz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty R01DK115507 i R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) z National Institutes of Health (NIH). Wsparcie stażystów zapewnili F30DK131828 grantów NIH (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) i F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Chcielibyśmy podziękować Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core za dostarczenie pożywki do konserwacji organoidów.

Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers

<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Danese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+as+a+result+of+calcium+signaling+modulation%3A+A+cancer-centric+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061(2021).</li>
<li>Harr, M. W., Distelhorst, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+autophagy%3A+Decoding+calcium+signals+that+mediate+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579(2010).</li>
<li>Barak, P., Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Ca2%2B+microdomains+from+store-operated+CRAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097(2020).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP%2C+a+family+of+single-fluorophore+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Evol+Biochem+Phys%22%5BJournal%5D)">GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators.</a> J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).</li>
<li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li>
<li>Nászai, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells%3A+Got+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells: Got calcium.</a> Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).</li>
<li>Barrett, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+chloride+secretion+in+the+intestinal+epithelium%3A+Significance+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation.</a> Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensing+receptor+regulates+intestinal+dipeptide+absorption+via+Ca2%2B+signaling+and+IKCa+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation.</a> Physiol Rep. 8 (1), e14337(2020).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CRISPR%E2%80%93Cas9-mediated+genetic+knockout+human+intestinal+tissue%E2%80%93derived+enteroid+lines+by+lentivirus+transduction+and+single-cell+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).</li>
<li>Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+dissect+gastrointestinal+virus-host+interactions%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned.</a> Viruses. 13 (6), 999(2021).</li>
<li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FPbase%3A+a+community-editable+fluorescent+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li>
<li>Lai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-triggered+secretion+by+hydrocarbon-stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides.</a> Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+induces+intercellular+calcium+waves+through+ADP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling.</a> Science. 370 (6519), eabc3621(2020).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoctamin+1%2FTMEM16A+controls+intestinal+Cl%E2%88%92+secretion+induced+by+carbachol+and+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin.</a> Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+TMEM16A+control+luminal+chloride+secretion+in+a+NHERF1+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100912(2021).</li>
<li>Mroz, M. S., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+chronically+upregulates+Ca2%2B-dependent+Cl%E2%88%92+conductance+and+TMEM16A+expression+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells.</a> J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).</li>
<li>Sui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+Ca2%2B-activated+Cl%E2%88%92+channel+transmembrane+member+16A+in+lipopolysaccharide-induced+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 404(2020).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).</li>
<li>Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+as+a+key+for+pathogens+invasion+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (5), 2506(2021).</li>
<li>Samak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2FAsk1%2FMKK7%2FJNK2%2Fc-Src+signalling+cascade+mediates+disruption+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+by+dextran+sulfate+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium.</a> Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+Ca2%2B+regulates+intestinal+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity.</a> Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).</li>
<li>Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+host+cell+calcium+signaling+during+viral+infections%3A+Emerging+paradigm+with+high+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance.</a> Mol Aspects Med. 81, 101004(2021).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+calcium+dysregulation+manifests+as+dynamic+calcium+signaling+in+the+cytoplasm+and+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum.</a> Sci Rep. 9 (1), 10822(2019).</li>
<li>Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+disrupts+calcium+homeostasis+by+NSP4+viroporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity.</a> mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).</li>
<li>Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rotavirus+NSP4+viroporin+domain+is+a+calcium-conducting+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel.</a> Sci Rep. 7, 43487(2017).</li>
<li>Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+hijacked+through+viroporin-activated+calcium%2Fcalmodulin-dependent+kinase+kinase-%CE%B2+signaling+is+required+for+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).</li>
<li>Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPII+vesicle+transport+is+required+for+Rotavirus+NSP4+interaction+with+the+autophagy+protein+LC3+II+and+trafficking+to+viroplasms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms.</a> J Virol. 94 (1), e01341(2019).</li>
<li>Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+calcium+on+the+early+steps+of+Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection.</a> Virology. 295 (1), 190-200 (2002).</li>
<li>Hyser, J. M., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+consequences+of+calcium-conducting+viroporins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins.</a> Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).</li>
<li>Strtak, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovirus+NS1-2+has+viroporin+activity+that+induces+aberrant+cellular+calcium+signaling+to+facilitate+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication.</a> mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> J Vis Exp. (146), 59357(2019).</li>
<li>Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+intestinal+organoid+technology+and+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling.</a> Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).</li>
<li>Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+rotavirus+entry+and+release+from+differentiated+small+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells.</a> Virology. 499, 65-71 (2016).</li>
<li>Mirabelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Norovirus+efficiently+replicates+in+differentiated+3D-human+intestinal+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids.</a> J Virol. 96 (22), e0085522(2022).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), 28749075(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+NEMO+as+calcium+indicators+with+large+dynamics+and+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity.</a> Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Zmiany poziomu cytozolowego Ca2+ mogą być zarówno przyczyną, jak i skutkiem patologii w obrębie nabłonka 10,16,17. Wzrost cytozolowego wapnia może bezpośrednio napędzać wydzielanie poprzez aktywację zależnego od wapnia kanału chlorkowego TMEM16A 18,19. Aktywacja TMEM16A w odpowiedzi na Ca2+ pozwala na wierzchołkowy wypływ chlorku, ustanawiając gradient osmotyczny, który sprzyja wydzielaniu płynów20,21. Co więcej, wzrost Ca2 + w komórkach enteroendokrynnych wyzwala uwalnianie serotoniny, która stymuluje doprowadzające neurony czuciowe, które mogą modulować aktywność w jelitowym układzie nerwowym22. Sygnały Ca2 + mogą również modulować ścisłe połączenia, aby wpływać na funkcję bariery23,24 i regulować proliferację w jelitowych komórkach macierzystych25. Tak więc rozregulowanieCa2+ może mieć szerokie i dalekosiężne skutki.
Wiele wirusów manipuluje cytozolowym Ca2+, aby stworzyć środowisko komórkowe sprzyjające replikacji26. Rotawirus jest tego doskonałym przykładem w obrębie nabłonka jelitowego27. Białko niestrukturalne 4 rotawirusa (NSP4) jest kanałem przewodzącym Ca2 +, który umożliwia wypływ Ca2 + z retikulum endoplazmatycznego do cytozolu28,29. Stymuluje to autofagię i wspomaga montaż zewnętrznego kapsydu 30,31,32. Zakażenie rotawirusem indukuje również uwalnianie ADP, wyzwalając międzykomórkowe fale Ca2+, które przyczyniają się do patogenezy17. Inne wirusy jelitowe, w tym zarówno kaliciwirusy, jak i enterowirusy, kodują wiroporyny przewodzące Ca2 +, które wywołują podobną dysregulację Ca2 + w zakażonych komórkach33,34.
Obrazowanie żywych komórek Ca2+ ludzkich organoidów jelitowych stanowi wszechstronną platformę do badania sygnalizacji indukowanej przez wirusa w nabłonku. Jednak siła wniosków wyciągniętych z danych obrazowych zależy nierozerwalnie od stanu zdrowia i jakości HIO, odpowiednich parametrów obrazowania i solidnego podejścia analitycznego.
Wydajna transdukcja lentiwirusowa jest często krokiem ograniczającym przy tworzeniu nowych linii HIO, ale lentiwirus o wysokim mianie i transdukcje wielokrotne pomagają zapewnić wystarczającą ekspresję transgenu. Co ważne, będzie to musiało zostać zrównoważone z możliwością wystąpienia znacznego stresu komórkowego podczas transdukcji. Jest to najczęściej tymczasowe i ustępuje po selekcji i wielokrotnych przejściach. Niemniej jednak bardzo ważne jest, aby HIO zaprojektowane do ekspresji GECI wykazywały normalny wzrost i proliferację przed rozpoczęciem eksperymentów. Podobnie, rozpraszanie trójwymiarowych HIO i przekształcanie ich w monowarstwy indukuje stres komórkowy. Najlepszą praktyką jest pozostawienie trzech lub więcej dni na adaptację monowarstw po poszyciu. Powlekanie płytek kolagenem IV ma kluczowe znaczenie dla integralności monowarstwy35,36. Podawanie kolagenu dożylnie i przechowywanie w temperaturze -80 °C między użyciami pomaga zapewnić przyleganie jednej warstwy. Określenie optymalnej gęstości wysiewu dla każdej linii HIO może również pomóc w poprawie spójności. Wreszcie, włączenie odpowiednich kontroli i porównanie ich w różnych eksperymentach jest niezbędne, aby zapewnić, że każda obserwacja reprezentuje reakcję na daną zmienną, a nie techniczny czynnik zakłócający.
Podczas gdy nacinanie monowarstwy może powodować niepożądane uszkodzenia komórek, znacznie zwiększa infekcję RV 2D HIO. Ilustruje to rysunek 2 , ponieważ prawie wszystkie zainfekowane komórki przylegają bezpośrednio do rysy. Dowody eksperymentalne sugerują, że RV infekuje najskuteczniej na podstawno-bocznej powierzchni komórek nabłonka jelitowego37. W związku z tym przewiduje się, że nacinanie monowarstwy zwiększa zakaźność poprzez odsłonięcie powierzchni podstawno-bocznej. Skuteczną infekcję jednowarstwową można również osiągnąć poprzez posiewanie HIO na membranach poliwęglanowych zawieszonych w studzienkach zawierających pożywkę hodowlaną, które umożliwiają dostęp do powierzchni podstawno-bocznej. Jednak stosunkowo duża odległość między płytą a membraną poliwęglanową, sama membrana poliwęglanowa oraz plastikowa powierzchnia u podstawy studni sprawiają, że nie nadają się one do obrazowania epifluorescencyjnego. W związku z tym metoda punktacji opisana w tym protokole pozostaje preferowanym podejściem. Biorąc pod uwagę, że punktacja sama w sobie może prowadzić do perturbacji sygnalizacyjnych, włączenie niezainfekowanych, punktowanych kontroli ma kluczowe znaczenie dla interpretacji. W przypadku wirusów, takich jak norowirus ludzki, które skutecznie infekują przez błonę wierzchołkową, punktacja monowarstwy nie jest wymagana38.
Podobnie jak w przypadku każdego systemu obrazowania na żywo, fototoksyczność może łatwo zmylić eksperymenty z wykorzystaniem monowarstw HIO. W trakcie eksperymentu obrazowego ważne jest, aby monitorować nieoczekiwaną wakuolizację, pęcherzenie błony lub inne morfologiczne wskaźniki stresu39. Jeśli którykolwiek z tych objawów zostanie wykryty, czas trwania, częstotliwość lub moc wzbudzenia muszą zostać zmniejszone. Zwiększenie stosunku sygnału do szumu często odbywa się kosztem długoterminowego zdrowia komórek, dlatego empiryczna optymalizacja parametrów ma kluczowe znaczenie. Fotowybielanie, na co wskazuje spadek wyjściowej intensywności fluorescencji w czasie, jest zwiastunem stresu komórkowego i należy go unikać.
Wizualność danych obrazowych może skłonić badaczy do preferowania analiz jakościowych, a nie ilościowych. Jednak, jak w przypadku każdej innej modalności, powtarzalne wnioski wymagają oceny ilościowej. Ilościowa analiza obrazu jest znacznie bardziej złożona niż ta, którą można omówić w jednym manuskrypcie, ale warto zwrócić uwagę na kilka kluczowych punktów. Po pierwsze, konsekwentna kwantyfikacja wymaga konsekwentnego nabywania. Potok analizy opracowany dla danego zestawu parametrów akwizycji może nie być skuteczny w przypadku obrazów uzyskanych przy różnych częstotliwościach, czasach naświetlania, mocach lasera lub długościach fal. Po drugie, mnogość infekcji ma ogromny wpływ na częstotliwość indukowanych przez wirusa sygnałów wapniowych. W związku z tym ważne jest, aby ocenić liczbę zakażonych komórek w polu widzenia i zapewnić spójność we wszystkich warunkach leczenia. Alternatywnie, normalizacja częstotliwości sygnału do liczby zainfekowanych komórek na pole widzenia może pomóc w zmniejszeniu błędów. Wreszcie, podczas gdy niedawno opracowany wskaźnik wapnia oparty na mNG (NEMO) oferuje obiecujące podejście do określania bezwzględnych stężeń Ca2+ w komórkach40, większość bioczujników przekazuje tylko względne informacje o systemach biologicznych. W związku z tym odejmowanie tła, normalizacja i porównanie z kontrolą mają kluczowe znaczenie.
Chociaż protokół ten koncentruje się na obrazowaniu wapnia podczas infekcji wirusowej, ogólne podejście można łatwo dostosować. Infekcja wirusowa może być łatwo zastąpiona alternatywnym stanem leczenia, a istnieje stale rosnąca litania bioczujników do monitorowania wielu różnych szlaków i procesów komórkowych. Przy każdej adaptacji protokołu badacze muszą mieć na uwadze analizę, projektując eksperymenty z jasnymi, wymiernymi wynikami.
Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie na żywo zapewnia niezrównaną rozdzielczość czasową, poprawiając charakterystykę wysoce dynamicznych procesów. Włączenie organoidów do eksperymentów obrazowania na żywo pozwala na obserwację tych procesów w prawdziwie tkankowym, fizjologicznie istotnym modelu. Mamy nadzieję, że opisany tutaj protokół ułatwi projektowanie i optymalizację eksperymentów, umożliwiając naukowcom odkrycie nowych aspektów sygnalizacji komórkowej i tkankowej.

Wapń jest powszechnie konserwowanym drugim przekaźnikiem, który odgrywa kluczową rolę w regulacji fizjologii komórkowej1. Ze względu na silny ładunek, niewielkie rozmiary i wysoką rozpuszczalność w warunkach fizjologicznych, wapń jest idealnym manipulatorem konformacji białek. To sprawia, że wapń jest potężnym środkiem do przekształcania sygnałów elektrochemicznych w zmiany enzymatyczne, transkrypcyjne lub potranskrypcyjne. Ścisłe gradienty stężenia wapnia w siateczce endoplazmatycznej (ER) i błonach plazmatycznych tworzą dużą siłę napędową, która pozwala na szybkie zmiany stężenia wapnia w cytozolu. Wiele mechanizmów, w tym zarówno buforowanie, jak i transport aktywny, ściśle utrzymuje ten gradient. Chociaż jest to konieczne dla normalnych funkcji komórkowych, to utrzymanie jest energetycznie kosztowne, co czyni je szczególnie podatnym w stanach stresu 2.
W związku z tym, rozregulowanie wapnia w cytozolu jest niemal uniwersalnym sygnałem wielu rodzajów stresu komórkowego. Zaburzenia metaboliczne, toksyny, patogeny, uszkodzenia mechaniczne i zaburzenia genetyczne mogą zakłócać sygnalizację wapniową. Niezależnie od bodźca, na poziomie całej komórki, utrzymujący się, niekontrolowany wzrost cytozolowego wapnia może sprzyjać apoptozie i ostatecznie martwicy3,4. Zmiany poziomu wapnia cytozolowego o mniejszej amplitudzie lub wyższej częstotliwości mają jednak różne skutki2. Podobnie, wyniki wahań wapnia mogą się różnić w zależności od mikrodomeny przestrzennej, w której występują5. Monitorowanie poziomu wapnia może zatem zapewnić wgląd w dynamiczne procesy sygnalizacyjne, ale wymaga to pobierania próbek ze stosunkowo wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.
Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) są potężnymi narzędziami do ciągłego pobierania próbek w systemach żywych komórek6. Niektóre z najczęściej stosowanych GECI to reagujące na wapń białka fluorescencyjne na bazie GFP, znane jako GCaMPs7. Kanoniczny GCaMP to fuzja trzech odrębnych domen białkowych: kołowo permutowanego GFP (cpGFP), kalmoduliny i M136. Domena kalmoduliny ulega zmianie konformacji po związaniu wapnia, co umożliwia jej interakcję z M13. Interakcja kalmodulina-M13 indukuje zmianę konformacyjną w cpGFP, która zwiększa jego emisję fluorescencyjną po wzbudzeniu. W związku z tym wzrost stężenia wapnia koreluje ze wzrostem intensywności fluorescencji GCaMP. Czujniki te mogą być cytozolowe lub ukierunkowane na określone organelle8.
Podobnie jak w większości tkanek, wapń reguluje różne funkcje w obrębie nabłonka przewodu pokarmowego. Nabłonek jelitowy jest integralną częścią wchłaniania składników odżywczych i płynów, ale musi również tworzyć ścisłą barierę i interfejs immunologiczny, aby uniknąć inwazji patogenów lub toksycznych urazów. Szlaki zależne od wapnia wpływają na prawie wszystkie te funkcje życiowe9,10,11. Jednak sygnalizacja wapniowa w nabłonku jelitowym pozostaje niedostatecznie zbadaną granicą z obiecującym potencjałem jako cel terapeutyczny. Podczas gdy monitorowanie dynamiki wapnia w nabłonku jelitowym in vivo nadal stanowi wyzwanie, ludzkie organoidy jelitowe (HIO) oferują adaptowalny system ex vivo do eksperymentów12. HIO są trójwymiarowymi (3D) sferoidami pochodzącymi z ludzkich jelitowych komórek macierzystych i, po różnicowaniu, podsumowują dużą część różnorodności komórkowej natywnego nabłonka jelitowego12.
Ten protokół opisuje kompleksowe metody inżynierii HIO, które wyrażają GECI, a następnie przygotowują zmodyfikowane HIO jako monowarstwy do obrazowania wapnia w żywych komórkach. Oferuje infekcję wirusową jako przykład patologicznej manipulacji, która zakłóca sygnalizację wapnia i zapewnia analityczne podejście do ilościowego określenia tych zmian.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowany DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>0,05% Trypsyna EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25300054</tr><tr><td>Probówki mikrowirówkowe 1,5 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>5408137</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0553859A</td> 16% formaldehydu <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Igła o rozmiarze 25</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1482113D</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-antyprątkowy&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP1600100</tr><tr><td>Szkiełko do hodowli komórkowych CellView, PS, 75/25 MM, szklane dno, 10 przegródek</td><td>Greiner</td><td>543979</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodowa&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobryt</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>35050079</tr><tr><td>Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu</td><td>ProteinTech</td><td>HZ-1326</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>VectorBuilder</td> <td>(zmienna)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosceicen</td><td>356231/CB40230C</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki poddane hodowli komórek nunc</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>Enzym TrypLE Express, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Worthington Biochemical</td><td>NC9811754</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Sygnalizacja wapniowa jest integralnym regulatorem prawie każdej tkanki. W nabłonku jelitowym wapń bierze udział w regulacji aktywności wydzielniczej, dynamice aktyny, reakcjach zapalnych, proliferacji komórek macierzystych i wielu innych niescharakteryzowanych funkcjach komórkowych. W związku z tym mapowanie dynamiki sygnalizacji wapniowej w nabłonku jelitowym może zapewnić wgląd w homeostatyczne procesy komórkowe i ujawnić unikalne reakcje na różne bodźce. Ludzkie organoidy jelitowe (HIO) są wysokoprzepustowym, pochodzącym od człowieka modelem do badania nabłonka jelitowego, a tym samym stanowią użyteczny system do badania dynamiki wapnia. W tym artykule opisano protokół stabilnej transdukcji HIO z genetycznie kodowanymi wskaźnikami wapnia (GECI), wykonywania mikroskopii fluorescencyjnej na żywo i analizy danych obrazowych w celu sensownego scharakteryzowania sygnałów wapniowych. Jako reprezentatywny przykład, trójwymiarowe HIO zostały transdukowane lentiwirusem w celu stabilnej ekspresji GCaMP6s, cytozolowego GECI opartego na zielonym fluorescencyjnym białku. Zmodyfikowane HIO zostały następnie rozproszone w jednokomórkowej zawiesinie i wysiane jako monowarstwy. Po różnicowaniu monowarstwy HIO zostały zakażone rotawirusem i/lub potraktowane lekami, o których wiadomo, że stymulują odpowiedź wapniową. Mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w nawilżoną komorę do obrazowania na żywo o kontrolowanej temperaturze pozwolił na długotrwałe obrazowanie zakażonych lub leczonych lekami monowarstw. Po zobrazowaniu uzyskane obrazy zostały przeanalizowane za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania analitycznego ImageJ. Ogólnie rzecz biorąc, prace te ustanawiają elastyczny potok do charakteryzowania sygnalizacji komórkowej w HIO.

Rysunek 1A przedstawia kopułę BMM zawierającą trójwymiarowe ludzkie organoidy jelita, które zostały przetransdukowane w celu stabilnej ekspresji GCaMP6s. Rysunek 1B przedstawia tę samą linię organoidów wysianą jako monowarstwa w 24, 48 i 72 h po wysianiu. Aby zweryfikować funkcję GCaMP6s, monowarstwę obrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej co 2 s przez 4 min, a po około 20 s do medium dodano 100 nM ADP. ADP wywołuje uwalnianie wapnia z retikulum endoplazmatycznego, zwiększając stężenie wapnia w cytozolu. Intensywność fluorescencji wykryta w kanale 488 nm przy każdej ekspozycji została przedstawiona na Rysunku 1C. Krzywa wykazuje stabilną podstawową intensywność fluorescencji, po której następuje gwałtowny wzrost po dodaniu ADP, a następnie stopniowy powrót do poziomu bazowego. Uwzględniono kontrolę z nośnikiem, aby potwierdzić, że odpowiedź jest rzeczywistym zdarzeniem sygnałowym, a nie jedynie zmianą intensywności fluorescencji, która mogłaby wynikać z dodania medium.
Nacinanie monowarstwy HIO zwiększa wydajność infekcji rotawirusem. Chociaż techniki nacinania są zróżnicowane, najłatwiej jest uzyskać spójną infekcję, wykonując pojedyncze nacięcie wzdłuż długości monowarstwy, jak pokazano na Rysunku 2A. Przy użyciu rekombinowanych szczepów rotawirusa wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych, infekcję można zweryfikować podczas obrazowania na żywo (Rysunek 2B). W przypadku stosowania szczepu, który nie wykazuje ekspresji markera, infekcję można wykryć za pomocą immunofluorescencji po obrazowaniu. Ze względu na ruchliwość komórek w monowarstwach HIO często trudno jest śledzić pojedynczą zainfekowaną komórkę w czasie. Zamiast tego należy zastosować barwienie końcowe jako metodę weryfikacji infekcji i potwierdzenia, że wielokrotność infekcji jest jednakowa w różnych polach widzenia (Rysunek 2C).
Międzykomórkowe fale wapnia w HIO można obserwować jakościowo, jak przedstawiono na Ryc. 3A. Jednak określenie częstotliwości fal wapnia w danym polu widzenia wymaga analizy ilościowej. Etapy prawidłowej segmentacji, opisane w kroku 6 powyższego protokołu, zilustrowano na Ryc. 3A. Rysunek przedstawia obraz surowy (Ryc. 3Ai), obraz po odjęciu intensywności pikseli z poprzedniej klatki (Ryc. 3Aii), a następnie zsegmentowaną falę wapnia (Ryc. 3Aiii).
Po segmentacji i ilościowym określeniu fal wapniowych dla każdego pola widzenia w trakcie całego procesu obrazowania, często pomocne jest porównanie częstotliwości fal w monowarstwach poddanych różnym warunkom. Wykres słupkowy na Rysunku 3B przedstawia całkowitą liczbę fal wapniowych na pole widzenia w monowarstwach kontrolnych (mock) oraz zaszczepionych rotawirusami. Ten przykład obejmuje dwa szczepy RV: szczep ludzkiego rotawirusa (Ito HRV) oraz rekombinowany szczep małpiego rotawirusa SA11 wykazujący ekspresję mRuby (SA11-mRuby). Kontrolę mock przyjmuje się jako bazową częstotliwość fal wapniowych, nieleczone monowarstwy zainfekowane rotawirusami służą jako kontrole pozytywne, natomiast zainfekowane rotawirusami i leczone monowarstwy stanowią warunki eksperymentalne. Monowarstwy kontrolne oraz zainfekowane RV, leczone lekami, w tym inhibitorem receptora ADP – BPTU, mogą następnie zostać porównane z obiema grupami kontrolnymi za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (one-way ANOVA). Dane sugerują, że BPTU skutecznie zmniejsza częstotliwość międzykomórkowych fal wapniowych.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, porównanie sferoidów komórkowych, wykres fluorescencji GCaMP6s, analiza odpowiedzi na ADP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig01.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Walidacja ekspresji GCaMP6s w ludzkich organoidach jelita cienkiego (HIO) pochodzących z jelita czczego. (A) Po transdukcji lentiwirusowej HIO wykazujące ekspresję GCaMP poddano selekcji i wielokrotnym pasażom; przedstawiono je tutaj w 7. dniu od ostatniego pasażu. Po stymulacji laserem 488 nm ekspresja GCaMP6s jest widoczna w transdukowanych HIO wysianych w 15 μL matrycy błony podstawnej jako sferoidy trójwymiarowe (Ai). Obrazy z czasem ekspozycji 50 ms uzyskano przy 50% mocy lasera za pomocą obiektywu 20x, a następnie zszyto je w celu wizualizacji całej kopuły matrycy błony podstawnej. Analogiczny proces przeprowadzono, stosując 4 ms ekspozycji w jasnym polu (Aii). Na obrazie w jasnym polu ciemne HIO w centrum kopuły są wskazaniem, że kultury są gotowe do pasażowania. (B) HIO poddano trawieniu enzymatycznemu do zawiesiny pojedynczych komórek, a następnie wysiano ponownie z gęstością 150 000 komórek na studzienkę (o średnicy 5 mm) płytki do obrazowania z odpowiednim dnem, uprzednio pokrytego kolagenem IV. Po 72 h od wysiania monowarstwa była złączona i gotowa do dalszych zastosowań. Aby zwalidować funkcję GCaMP, obrazy pozyskano przy użyciu zestawu filtrów 488 nm z czasem ekspozycji 50 ms i 50% mocy lasera co 2 s przez 4 min. (C) Przedstawione tutaj ślady reprezentują intensywność fluorescencji całego pola znormalizowaną do pierwszej akwizycji w czasie trwania obrazowania. Około 20 s (strzałka), po dziesiątej ekspozycji, dodano 100 nM difosforanu adenozyny (ADP), aby wywołać skok poziomu wapnia cytozolowego (czerwony). Dodanie równiej objętości 1x PBS nie wywołało istotnej odpowiedzi (niebieski). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat równowagi statycznej z igłą; mikroskopia fluorescencyjna; obrazowanie i analiza komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig02.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Nacinanie monowarstwy HIO w celu ułatwienia infekcji RV. (A) Rysunek przedstawia odpowiednią technikę nacinania monowarstwy przy użyciu igły 25G. (B) Monowarstwa HIO została zainfekowana rekombinowanym szczepem RV wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego mRuby (magenta, strzałka), co umożliwia identyfikację zainfekowanych komórek. Alternatywnie, w przypadku użycia naturalnie występującego szczepu RV, komórki zainfekowane można zidentyfikować za pomocą immunofluorescencji. (C) Przedstawione obrazy pochodzą z 4 różnych monowarstw HIO po fiksacji, barwieniu DAPI (niebieski) i znakowaniu przeciwciałami antygenu rotawirusa (magenta). Obie techniki ilustrują preferencyjną infekcję RV w pobliżu naciętej części monowarstwy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna i wykres słupkowy; analiza fal Ca²⁺ w badaniu HRV/BPTU; porównanie statystyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig03.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Segmentacja i kwantyfikacja indukowanych przez RV międzykomórkowych fal wapnia. Ekspozycje przy 488 nm zakażonych RV HIO wykazujących ekspresję GCaMP6s były rejestrowane co 1 min przez 16 h zgodnie z protokołem. (A) Rycina ilustruje proces segmentacji międzykomórkowych fal wapnia. Najpierw wartości pikseli z poprzedniego pomiaru (t-1) są odejmowane od każdego surowego obrazu (Ai), aby określić zmianę natężenia fluorescencji (Aii). Następnie stosowany jest próg oparty na eksperymentalnie zoptymalizowanym minimalnym wzroście natężenia w stosunku do poprzedniej klatki. Obrazy są następnie filtrowane pod kątem minimalnego ciągłego obszaru sygnału, aby wyselekcjonować międzykomórkowe fale wapnia (Aiii) i wykluczyć sygnały wapniowe pojedynczych komórek. Przetwarzanie to umożliwia kwantyfikację fal wapnia w każdym polu widzenia. W tym eksperymencie monowarstwy były albo zakażone pozornie, albo zakażone szczepem ITO ludzkiego rotawirusa (HRV), albo zakażone rekombinowanym szczepem rotawirusa małpiego kodującym mRuby w segmencie genu 7, w regionie downstream od białka niestrukturalnego 3 (SA11-mRuby). Zakażone monowarstwy były leczone inhibitorem receptorów ADP BPTU lub pozostawione bez leczenia. Następnie wykonano obrazowanie monowarstw w 8 różnych pozycjach, a fale wapnia w każdym polu widzenia skwantyfikowano przy użyciu procedury opisanej w tym protokole. Punkty na wykresie liniowym wskazują liczbę fal wapnia wykrytych w każdej pozycji, nałożone na wykres słupkowy oznaczający średnią i SD. Jednoczynnikowa analiza ANOVA, a następnie testy Dunnetta, wykazują, że choć oba szczepy RV zwiększają częstotliwość międzykomórkowych fal wapnia powyżej poziomu grupy niezakażonej, leczenie BPTU zapobiega indukowanemu przez RV wzrostowi częstotliwości fal wapnia. **p&lt;0.01, ***p&lt;0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Transdukcja</td>
			<td>Kontrola</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (stężenie zapasu 1 mM) </td>
			<td>4 μL</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (1 mg/μL roztwór zapasowy)</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentiwirus</td>
			<td>zmienna</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HighWnt-WRNE *patrz uwagi</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. 400 μL</td>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. 400 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Pożywka do transdukcji lentiwirusowej. Przygotować pożywki do transdukcji oraz pożywki kontrolne, łącząc odczynniki w objętościach wskazanych odpowiednio w drugiej i trzeciej kolumnie. Dążyć do uzyskania wielokrotności infekcji (MOI) na poziomie 10 jednostek transdukcyjnych lentiwirusa na komórkę. W przypadku LV pakowanych wewnętrznie zazwyczaj wymaga to ~25-50 μL skoncentrowanego LV. Miano większości komercyjnie pakowanych LV zostanie podane w Certyfikacie Analizy.
Uzupełniający plik z kodem 1: Skrypt makra ImageJ umożliwiający ilościowe określanie fal wapniowych poprzez przetwarzanie wsadowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/Wave_counter.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje podejście do wykonywania obrazowania wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych i oferuje podejście do analizy.

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

W ramach naszych badań dążymy do zrozumienia, w jaki sposób wirusy zaburzają sygnalizację w obrębie nabłonka jelitowego. Szczególnie interesuje nas poznanie mechanizmów, dzięki którym komórki zainfekowane wirusem dysregulują sąsiednie komórki niezainfekowane, co przyczynia się do patogenezy. Niedawno odkryliśmy, że komórki zainfekowane rotawirusem uwalniają impulsy ADP, co prowadzi do dysregulacji sąsiednich komórek niezainfekowanych, ułatwia rozprzestrzenianie się wirusa i zaostrza przebieg choroby. Choć obrazowanie wapnia jest bardzo popularne w dziedzinach takich jak neuronauka, nie było ono szeroko stosowane w badaniach nad biologią nabłonków czy wirusologią. Niniejszy protokół przedstawia podejście pozwalające na adaptację istniejących technologii i systemów modelowych do badania sygnalizacji wapniowej w żywej, zainfekowanej wirusem tkance nabłonkowej.Dzięki modyfikacji organoidów w celu ekspresji genetycznie kodowanych wskaźników wapnia, nasze podejście umożliwia spójne, powtarzalne i długoterminowe obrazowanie w systemie modelowym, który odzwierciedla różnorodność komórkową ludzkiego nabłonka jelitowego.Naszym celem jest zrozumienie wpływu indukowanego przez wirusy parakrynnego sygnalizowania purinergicznego zarówno dla gospodarza, jak i dla wirusa. Nasze przyszłe prace pozwolą również ustalić, czy ten typ sygnalizowania jest szeroko zakonserwowany u innych wirusów oraz czy efekty są podobne.Na początku należy przygotować roztwór kolagenu IV w wodzie o stężeniu 1 mg/mL i dodać 95 µL tego roztworu do każdej studni 10-studnieniowej szkiełka z komorami o szklanym dnie do obrazowania. Szkiełko należy inkubować w temperaturze 37 °C przez od 30 minut do 2 godzin w celu pokrycia studni. Z hodowanych trójwymiarowych ludzkich organoidów jelitowych należy usunąć podłoże utrzymujące WRNE z studni od pięciu do siedmiu dni po ostatnim pasażu. Następnie do każdej studni należy dodać 500 µL 1X PBS zawierającego 0,5 mM EDTA.Używając wcześniej powleczonego końcówki o pojemności 1 ml, ostrożnie pipetuj, aby odłączyć BMM od płytki. Przenieś zawiesinę do wcześniej powleczonej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przepłucz każdą studzienkę dodatkowymi 500 µl roztworu PBS/EDTA.Odwirować zawiesinę, a następnie usunąć nadsącz oraz pozostałe BMM. Następnie, używając końcówki z filtrem, zawiesić osad w 3 mL PBS zawierającego 5 mM EDTA. Ponownie odwirować i zawiesić w 2 mL buforu do dysocjacji enzymatycznej. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Następnie dodać 3 mL CMGF minus z 10% FBS i delikatnie wymieszać. Odwirować i dodać 1 mL CMGF minus do osadu. Energicznie pipetować mieszaninę od 80 do 100 razy, aby rozbić organoidy do pojedynczych komórek. Odwirować i zawiesić osad w 1 mL pożywki WRNE. Wykonać pomiar liczby komórek i rozcieńczyć zawiesinę komórkową, aby uzyskać 1,25 × 10⁵ komórek w 100 µL.Następnie należy usunąć roztwór kolagenu z wcześniej przygotowanej płytki, unikając dotykania dna dołka. Potem do każdego dołka dodać 100 µL przygotowanej zawiesiny komórek. Inkubować przez 24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C. Co 24 godziny wymieniać pożywkę na 100 mL pożywki różnicującej na dołek, aż do osiągnięcia konfluencji. Po tym etapie monowarstwy są gotowe do dalszych zastosowań.Rozpocznij od przygotowania inokulum wirusa. Aktywuj zapas rotawirusa, dodając 10 µg/µL trypsyny Worthington i inkubując w temperaturze 37°C przez jedną godzinę. Następnie rozcieńcz 50 µL aktywnego zapasu wirusa w 50 µL pożywki CMGF minus. Dalej, zastąp pożywkę z monowarstw HIO 100 µL inokulum wirusa, aby zainfekować monowarstwy. W przypadku infekcji rotawirusem wykonaj pojedyncze nacięcie wzdłuż monowarstwy za pomocą igły 25G. Inkubuj płytki w temperaturze 37°C przez dwie godziny. Po inkubacji usuń inokulum i przemyj monowarstwy raz roztworem 1X PBS. Następnie dodaj 100 µL pożywki różnicującej bez czerwieni fenolowej. Umieść preparat w inkubatorze w temperaturze 37°C do momentu rozpoczęcia obrazowania.W celu rozpoczęcia przygotuj mikroskop epifluorescencyjny. Przed obrazowaniem rozgrzej inkubator nad stolikiem do 37 °C i wprowadź do komory nawilżony dwutlenek węgla z przepływem 0,02 l/min. Następnie umieść szkiełko z zainfekowanymi monowarstwami w komorze inkubatora i szczelnie zamknij pokrywę. Korzystając z obiektywu 20X przy oświetleniu w polu jasnym, wybierz współrzędne X i Y pól widzenia w obrębie monowarstwy. Zoptymalizuj parametry obrazowania i wykonaj zdjęcie, stosując długość fali wzbudzenia 488 nm.Aby zminimalizować fototoksyczność, ustaw źródło światła na 50% mocy z czasem ekspozycji 50 ms. Upewnij się, że żadne piksele nie są nasycone i dostosuj ustawienia tak, aby wykryć cały zakres dynamiczny fluorescencyjnego sensora wapnia. Skonfiguruj pętlę obrazowania i wykonaj zdjęcie dla każdej wybranej współrzędnej X i Y w jednej minutowej pętli, a następnie obrazuj tę pętlę w sposób ciągły.W przypadku wirusów znakowanych fluorescencyjnie należy rejestrować obraz na odpowiednim kanale co 10. cykl. W przypadku stosowania wirusów niefluorescencyjnych należy przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne po zakończeniu obrazowania.W pierwszej kolejności utrwal warstwy monowarstw za pomocą 100 µL formaldehydu. Po inkubacji usuń utrwalacz i przeprowadź gaszenie, stosując 100 µL 50 mM chlorku amonu przez 10 minut. Po usunięciu chlorku amonu przeprowadź permeabilizację monowarstw, stosując 100 µL 0,1% Triton X-100 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń ten roztwór, dodaj 100 µL roztworu blokującego i inkubuj przez jedną godzinę. Następnie usuń roztwór blokujący i dodaj 100 µL przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w 1X PBS. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C przy łagodnym kołysaniu. Po inkubacji usuń przeciwciała pierwszorzędowe i przemyj próbki trzykrotnie roztworem 1X PBS.Na koniec należy dodać 100 µL przeciwciał wtórnych sprzężonych z fluoresceincją, rozcieńczonych w 1X PBS. Aby zapobiec fotoblaknięciu, płytkę należy chronić przed światłem i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji należy usunąć przeciwciała wtórne i zabarwić próbki roztworem DAPI.Następnie utrwalone monowarstwy umieść w 100 µL 1X PBS w celu przeprowadzenia obrazowania. Umieść preparat z powrotem na stoliku mikroskopu. Wczytaj ponownie współrzędne X i Y z sesji obrazowania na żywo i wykonaj zdjęcia każdego punktu pomiarowego na kanale odpowiadającym przeciwciału wtórnemu użytemu do barwienia.Należy odnieść się do obrazów z sesji obrazowania na żywo, aby zapewnić uchwycenie tych samych punktów.Zastosowano tę technikę do obrazowania infekcji rotawirusem w monowarstwie HIO po dokonaniu nacięć tej monowarstwy. W przypadku rekombinowanych szczepów rotawirusa wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych, takich jak m-Ruby, infekcję potwierdzono podczas obrazowania na żywo. Natomiast w przypadku użycia szczepu niewykazującego ekspresji markera, infekcję wykryto za pomocą immunofluorescencji po przeprowadzeniu obrazowania.

live-calcium-imaging-virus-infected-human-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie wapnia in vivo wirusowo zakażonych ludzkich pojedynczych warstw organoidów jelitowych z wykorzystaniem genetycznie zakodowanych wskaźników wapnia

Siatkowka śródplazmatyczna odgrywa kluczową rolę w biogenezie białek oraz w homeostazie wapnia. Opracowaliśmy system eksperymentalny, który pozwala nam zbadać rolę kanałów przecieku Ca2+ oraz scharakteryzować ich domniemane mechanizmy regulacyjne. System ten obejmuje wyciszanie genów za pomocą siRNA oraz obrazowanie Ca2+ w żywych komórkach.

Obrazowanie poziomu wapnia w żywych komórkach połączone z wyciszaniem genów za pomocą siRNA identyfikuje kanały przecieku Ca2+ w błonie ER i ich mechanizmy regulacyjne

Ten film przedstawia koncepcje związane z obrazowaniem wapnia i zawiera przykładowy protokół obrazowania poklatkowego robaków znajdujących się w formowanych studzienkach agarozowych.

Obrazowanie wapnia: metoda wizualizacji aktywności neuronalnej u żywych C. elegans

Źródło: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Ten film pokazuje wapń obrazowanie w celu wizualizacji i analizy aktywności neuronów jelitowych i gleju w preparatach splotu mięśniowo-mięśniowego okrężnicy myszy.

Obrazowanie wapnia aktywności neuronów jelitowych i gleju w splocie mięśniowym okrężnicy myszy

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Ten protokół wyjaśnia pierwotną hodowlę organoidów z dodatnim Lgr5 i późniejszą transdukcję retrowirusową. Umożliwia to indukowaną przez Cre nadekspresję lub knockdown dostarczonego transgenu i umożliwia prowadzenie badań funkcjonalnych w nowym systemie modeli organotypowych in vitro.

Protokół wideo infekcji retrowirusowej w pierwotnej hodowli organoidów jelitowych

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Ta metoda umożliwia połączenie optogenetyki i genetycznie kodowanych czujników wapnia do obrazowania wyjściowego poziomu cytozolowego wapnia i zmian w wywołanych przejściowych stanach wapnia w mięśniach ściany ciała organizmu modelowego C. elegans.

Obrazowanie wapnia in vivo w mięśniach ściany ciała C. elegans

Tutaj prezentujemy protokół, w którym pojedyncze komórki są monitorowane pod kątem ostrych zdarzeń i produktywnego zakażenia HIV-1 na urządzeniu nanofluidycznym. Dane obrazowe definiują interakcje wirus-receptor gospodarza i dynamikę szlaku sygnałowego. Jest to pierwsza metoda nanofluidycznej, wysokoprzepustowej, podłużnej hodowli pojedynczej komórki i obrazowania w celu zbadania kinetyki sygnalizacji i interakcji molekularnych.

Jednokomórkowa charakterystyka napływu wapnia i zakażenia HIV-1 przy użyciu wieloparametrowej platformy optofluidycznej

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Obrazowanie żywymi komórkami sygnalizacji wapnia jest szeroko wykorzystywane do badania mobilizacji wapnia w stabilnych liniach komórkowych hodowanych w monowarstwach. Protokół ten opisuje obrazowanie fluorescencji żywych komórek sygnalizacji wapnia z użyciem barwników komórek żywych na złożonych, pierwotnych tkankach, a także wykorzystuje oprogramowanie uczenia maszynowego do ilościowego określania intensywności fluorescencji tysięcy pojedynczych komórek jednocześnie, co usprawnia analizy.

Obrazowanie wapnia oparte na fluorescencji w pierwotnych hodowlach nabłonka dróg oddechowych z wykorzystaniem zautomatyzowanej segmentacji komórek

Poznaj obrazowanie wapnia w zakażonych wirusem ludzkich organoidach jelitowych przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników. Ta metoda pozwala badać zakłócenia sygnałowania w nabłonku jelitowym i interakcje wirus-gospodarz.

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie na żywo wapnia zakażonych wirusem monowarstw organoidów jelitowych ludzkich przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Przeglądaj więcej filmów