Izolacja immunomagnetyczna komórek macierzystych CD34 ⁺ rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych od myszy

Mieszkańcy ściany naczyniowej CD34 dodatni wynik w komórkach macierzystych są coraz częściej rozpoznawani ze względu na ich kluczową rolę w regulacji przebudowy naczyń krwionośnych po urazie. Ustanowienie stabilnej i skutecznej metody charakteryzowania funkcjonalnych komórek CD34-dodatnich jest niezbędne do dalszego badania mechanizmów uczestniczących w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. Technika ta łączy magnetyczne badania przesiewowe B i cytometrię płynową w celu oczyszczenia pierwotnych hodowanych rezydentnych komórek macierzystych CD34

Następnie oczyszczone komórki można funkcjonalnie zidentyfikować za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i obrazowania wapniowego. Ze względu na fenotypową i funkcjonalną heterogeniczność rezydujących komórek macierzystych predykcyjnych CD34 w ścianie naczyniowej, spowolnienie nastąpi w celu zidentyfikowania specyficznego subkomórkowego typu odpowiednich mięśniowych komórek proaktywnych CD34. Przedstawiamy udoskonaloną metodologię identyfikacji hodowli i oceny funkcjonalnej komórek macierzystych CD34 rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych.

To nowatorskie podejście obejmuje sortowanie magnetyczne, fotocytometrię, immunofluor, sterling i pomiary niestandardowe. Dzięki zastosowaniu tych technik, nasze badanie jest tylko podstawą do przyszłych kompleksowych badań nad funkcją pod regulacją małomównych komórek macierzystych CD34 zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Aby rozpocząć, umieść znieczuloną mysz na stole operacyjnym.

Za pomocą sterylnych nożyczek okulistycznych i kleszczy otwórz klatkę piersiową i jamę brzuszną. To odsłoni serce i jelita. Ostrożnie wypreparuj osobno tętnice krezkowe i aortę.

Przepłukać tętnice krezkowe i PBS i przenieść je na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 1% roztwór penicyliny, streptomycyny, amfoterycyny B. Podobnie przepłucz aortę i przenieś ją na inną szalkę Petriego zawierającą ten sam roztwór. Szybko usuń cały tłuszcz wokół aorty i tętnic krezkowych.

Po dwukrotnym przepłukaniu umieść tętnice pod mikroskopem stereoskopowym w kapturze do hodowli tkankowych. Ostrożnie wykonaj podłużne cięcie wzdłuż tętnic. Następnie za pomocą cienkich kleszczy oderwij zewnętrzną warstwę aorty i pierwszą odnogę tętnic krezkowych.

Umieść zewnętrzną warstwę na 3,5-centymetrowej szalce Petriego zawierającej od 0,1 do 0,2 mililitra pożywki hodowlanej i pokrój ją na drobne kawałki o objętości około jednego milimetra sześciennego. Przenieść kawałki tkanki do kolby T25 pokrytej żelatyną. Umieścić kolbę pionowo w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Po trzech godzinach dodaj pięć mililitrów pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy do kolby, aby zanurzyć wszystkie bloki tkankowe. Na początek wyizoluj i pohoduj zewnętrzną warstwę aorty i pierwszą gałąź tętnic krezkowych odizolowanych od znieczulonej myszy. Gdy komórki osiągną 80% zlewu, odwiruj zdysocjowaną zawiesinę komórkową o stężeniu 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 98 mikrolitrach buforu sortującego na 10 milionów wszystkich komórek. Po dodaniu przeciwciała CD34 inkubować komórki w ciemności przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby umyć komórki, dodaj do komórek dwa mililitry buforu sortującego i odwiruj przy 300 G przez 10 minut.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 80 mikrolitrach buforu sortującego. Następnie dodaj 20 mikrolitrów mikrokulek anty-FITC do zawiesiny komórek. Po umyciu i odwirowaniu komórek, jak pokazano wcześniej, ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu sortującego.

Następnie umieść kolumnę separacji magnetycznej w polu magnetycznym separatora i umieść rurkę zbiorczą pod kolumną. Po przepłukaniu 500 mikrolitrami buforu, załadować zawiesinę komórek do kolumny i zebrać przepływ przez zawierające nieoznakowane komórki w probówce zbiorczej. Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na świeżej 15-mililitrowej probówce wirówkowej.

Wprowadzić 500 mikrolitrów buforu sortującego do kolumny i wcisnąć tłok do kolumny, aby wypłukać magnetycznie znakowane komórki. Aby scharakteryzować CD34-dodatnie komórki macierzyste wyizolowane z mysich tętnic aortalnych i krezkowych, należy przeprowadzić hodowlę blokową tkanek i uzyskać komórki przez separację magnetyczną. Aby wykryć ekspresję markera komórkowego komórki śródbłonka i fibroblastów po różnicowaniu, obserwuj komórki w 40-krotnym powiększeniu ze wzbudzeniami laserowymi o długości 488 nanometrów.

Po trypsynizacji komórek, osadzać je przez odwirowanie i ponownie zawieś w 100 mikrolitrach buforu sortującego. Następnie inkubuj je z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko myszy, CD 16, CD 32 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodać dwa mikrolitry każdego pożądanego przeciwciała monoklonalnego do barwienia immunofluorescencyjnego i ponownie inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem buforu. Po odwirowaniu komórek, jak pokazano, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 300 mikrolitrach buforu. Przenieś komórki do rurek przepływowych i umieść je w zamrażalniku.

Uruchom cytometrię przepływową, aby sprawdzić procent zróżnicowanych komórek. Ocena metodą cytometrii przepływowej potwierdziła wysoką czystość wyizolowanych komórek macierzystych CD34 z dodatnim wynikiem ściany naczyniowej. Barwienie immunofluorescencyjne komórkowe wykazało, że wyizolowane komórki macierzyste CD34 dodatnie wykazywały głównie ekspresję markerów komórek macierzystych, CD34, c-kit i Flk-1.

Cytometria przepływowa potwierdziła również, że wyizolowane komórki macierzyste CD34-dodatnie posiadają zdolność różnicowania się w komórki śródbłonka, a także fibroblasty in vitro. Na początek wyizoluj rezydentne komórki macierzyste CD34 CD34 z modeli mysich. Uzyskaj czyste komórki przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych i scharakteryzuj je.

W celu wykrycia sygnalizacji wapniowej należy zaopatrzyć się w szkiełko nakrywkowe poprzedzone komórkami i przemyć je raz PBS. Następnie inkubować komórki z roztworem Fura-2 AM i Tyrode przez 30 minut w ciemności. Aby usunąć barwnik, inkubuj komórki w roztworze Tyrode przez 10 minut.

Następnie zamontuj komorę na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Otwórz okno główne i przejdź do okna dialogowego ustawień chwytania i strony kamery. Naciśnij przycisk na żywo, aby wyświetlić obraz na żywo.

Aby uzyskać obrazy, narysuj kilka odręcznych linii, aby zakreślić komórki różnymi kolorami i wstępnie zdefiniować obszary zainteresowania. Mikroskopia fluorescencyjna wykazała, że podawanie ATP zwiększyło wewnątrzkomórkowy poziom wapnia w izolowanej ścianie naczynia, komórkach macierzystych CD34-dodatnich.