Name: Izolacja immunomagnetyczna komórek macierzystych CD34 + rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych od myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Naucz się izolować komórki macierzyste CD34+ z naczyń myszy metodą immunomagnetyczną. Technika ta umożliwia badanie ich funkcji w modelach chorób układu krążenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82070502, 31972909, 32171099), Programu Nauki i Technologii Sichuan prowincji Syczuan (23NSFSC0576, 2022YFS0607). Autorzy pragną podziękować Qingbo Xu z Uniwersytetu Zhejiang za pomoc w hodowli komórkowej, a autorzy dziękują za naukową i techniczną pomoc platformy cytometrii przepływowej na Południowo-Zachodnim Uniwersytecie Medycznym.

To badanie zostało zatwierdzone, a zwierzęta były traktowane zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi zarządzania i użytkowania zwierząt laboratoryjnych w Chinach. Badania ściśle przestrzegały wymogów etycznych eksperymentów na zwierzętach, za zgodą Komisji Etyki Zwierząt (numer zatwierdzenia: SWMU2020664). Do niniejszego badania wykorzystano ośmiotygodniowe, zdrowe myszy C57BL/6 obu płci, ważące od 18 do 20 g. Zwierzęta były trzymane w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Południowo-Zachodniego Uniwersytetu Medycznego (SWMU).
1. Hodowla bloków tkankowych przydanek z aorty i tętnic krezkowych
<ol>
	<li>Izolacja rezydentnych CD34+ VW-SC
	<ol>
		<li>Znieczulić dwie myszy 3% inhalacją izofluranu (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Potwierdź odpowiednie znieczulenie, szczypiąc palec u nogi. Ułóż mysz na wznak taśmą medyczną i spryskaj ją 70% etanolowym środkiem dezynfekującym, aby zdezynfekować sierść myszy. Otwórz jamę piersiową i brzuszną za pomocą sterylnych nożyczek okulistycznych i kleszczy, aby odsłonić serce i jelita. Po wypreparowaniu izolowanej aorty i tętnic krezkowych, przypnij aortę i łożysko krezkowe na szalce Petriego zawierającej elastomer krzemowy i wypełnionej fizjologicznym roztworem soli. Za pomocą innego zestawu wysterylizowanych nożyczek i kleszczy szybko wypreparuj tłuszcz wokół aorty i tętnic krezkowych.</li>
		<li>Wypreparowane tkanki przenieść na 6-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 1% roztwór penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B (patrz tabela materiałów). Po dwukrotnym przepłukaniu przenieś tętnice do okapu do hodowli tkankowej pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
		<li>Przetnij tętnice wzdłużnie i za pomocą cienkich kleszczyków odklej zewnętrzną warstwę aorty i pierwszą odnogę tętnic krezkowych. Przenieść zewnętrzne warstwy na 3,5 cm szalkę Petriego zawierającą 0,1-0,2 ml pożywki hodowlanej (patrz tabela materiałów). Pokrój zewnętrzne warstwy na drobne kawałki (około 1 mm3).</li>
		<li>Przenieść kawałki tkanek do kolby T25 pokrytej żelatyną, zapewniając równomierne rozprowadzenie na dnie kolby. Zachowaj umiarkowaną odległość między fragmentami tkanki, aby ułatwić pełzanie i wzrost komórek. Umieścić kolbę pionowo w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 3 godziny, aby bloki tkanek przylgnęły do dna kolby.</li>
		<li>Po 3 godzinach dodaj 5 ml pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy, aby zanurzyć bloki tkankowe. Ustawić kolbę T25 poziomo. Monitoruj migrację komórek wokół bloków tkankowych pod mikroskopem w odstępach 3-dniowych. 
		UWAGA: Pożywka powinna zawierać 20% płodowej surowicy bydlęcej, 0,2% czynnika hamującego białaczkę (LIF), 0,2 mM β-merkaptoetanolu i 1% penicyliny/streptomycyny (patrz tabela materiałów). Surowica bydlęca płodu wspomaga proliferację komórek, a LIF i β-merkaptoetanol utrudniają różnicowanie komórek7,8.</li>
		<li>Gdy komórki w kolbie T25 osiągną około 80% konfluencji, należy je przepuścić i wyhodować w jednej lub dwóch kolbach T75. Subkulturuj komórki przez pięć pasaży, aby zapewnić prawidłowy wzrost i zdrowie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Separacja magnetyczna rezydujących komórek macierzystych CD34+
	<ol>
		<li>Gdy komórki w jednej lub dwóch kolbach T75 osiągną 80% konfluencji, zdysocjuj komórki trypsyną i ponownie zawieś je w 1 ml buforu sortującego (2 mM EDTA i 0,5% FBS). Oznaczyć liczbę komórek (kolba 107/T75) i odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 5 minut (w temperaturze pokojowej).</li>
		<li>Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 98 μl buforu sortującego na 107 komórek. Dodać 2 μl przeciwciała CD34 (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4°C w ciemności, od czasu do czasu wstrząsając.</li>
		<li>Przemyć komórki, dodając 2 ml buforu sortującego i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie i całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 80 μl buforu sortującego.</li>
		<li>Dodać 20 μl mikrokulek anty-FITC (na 107 komórek, patrz tabela materiałów) do buforu. Dobrze wymieszać przez wielokrotne pipetowanie i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności, z przerywanym wstrząsaniem.</li>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie, dodając 2 ml buforu i odwiruj przy 300 x g przez 5 minut w celu ponownego osadzenia komórek. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu.</li>
		<li>Umieścić jedną kolumnę MS w polu magnetycznym odpowiedniego separatora, upewniając się, że probówka zbiorcza (np. probówka wirówkowa o pojemności 15 ml) jest umieszczona pod kolumną MS w celu zebrania oddzielonych składników. (patrz Tabela materiałów). Przepłukać kolumnę buforem o pojemności 500 μl i poczekać, aż całkowicie się przejrzy.</li>
		<li>Załadować zawiesinę komórek do kolumny i zebrać przepływowy roztwór zawierający nieoznakowane komórki do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją w nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wprowadzić 500 μl buforu do kolumny, a następnie niezwłocznie wypłukać magnetycznie znakowane komórki, wciskając tłok do kolumny.</li>
		<li>Aby zwiększyć czystość komórek CD34+, eluowaną frakcję można poddać wzbogacaniu za pomocą drugiej kolumny MS. Powtórz proces separacji, jak wspomniano powyżej. Ocenić czystość posortowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. 
		UWAGA: Zazwyczaj uzyskuje się 10%-20% komórek CD34+, z około 70%-80% komórek ujemnych i około 10% strat spowodowanych barwieniem i procedurami wirowania.</li>
		<li>Aby dodatkowo potwierdzić czystość komórek macierzystych CD34 + ściany naczyniowej, zidentyfikuj posortowane komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Obecne badanie wykazało czystość ponad 90%.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Identyfikacja komórek za pomocą immunofluorescencji
<ol>
	<li>Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych (średnica 8 mm) wstępnie pokryte 0,04% żelatyną.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną około 60%-70% konfluencji, spłucz dwa razy PBS i utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 10 minut.</li>
	<li>Myć komórki PBS przez 3 minuty (3 razy) i przepuszczać komórki 0,2% Triton X-100 (w PBS) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Płucz komórki PBS przez 3 minuty (3 razy) i blokuj niespecyficzne wiązanie przeciwciał 5% surowicą osła (w PBS) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usuń bufor blokujący, przytrzymując każde szkiełko nakrywkowe na jego krawędzi kleszczami i odsączając je na arkusz niestrzępiącej się chusteczki.</li>
	<li>Inkubować komórki w 100 razy rozcieńczonych przeciwciałach pierwszorzędowych (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, patrz tabela materiałów) w 1% BSA (w PBS) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować roztwór i przemywać komórki PBS przez 3 minuty (3 razy). Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym Alexa Fluor 488 (1:200 w 1% BSA) (patrz Tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Wykonaj barwienie przeciwstawne DAPI, rozcieńczając roztwór podstawowy DAPI do 0,5 μg/ml w PBS i inkubując komórki przez 5 minut.</li>
	<li>Spłukać PBS i uszczelnić szkiełka nakrywkowe odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu. Rejestruj obrazy pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym.</li>
</ol>
3. Indukowane różnicowanie i charakterystyka CD34+ VW-SC
<ol>
	<li>Wysiewać komórki macierzyste CD34+ o odpowiedniej gęstości (40%-50% konfluencji) odpowiednio na szkiełkach nakrywkowych i płytkach 6-dołkowych.</li>
	<li>Indukuj różnicowanie zorientowane na komórki śródbłonka z komórek CD34 + poprzez hodowlę komórek w pożywce do hodowli komórek śródbłonka EBM-2 (patrz tabela materiałów) przez 1 tydzień.</li>
	<li>Indukuj różnicowanie zorientowane na komórki fibroblastów z komórek CD34 + poprzez hodowlę komórek w pożywce do hodowli komórek fibroblastów FM-2 (patrz tabela materiałów) przez 3 dni.</li>
	<li>Poddaj niezróżnicowane i zróżnicowane komórki barwieniu immunofluorescencyjnemu (jak wspomniano w kroku 2) przy wzbudzeniu laserowym 488 nm i obiektywie 40x. Wykryj ekspresję markerów komórek śródbłonka (CD31, VWF) i markerów komórek fibroblastów (PDGFRα, wimentyna) (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Oddzielić komórki za pomocą trypsyny i otrzymać osad komórkowy przez odwirowanie (300 x g, 5 min, temperatura pokojowa). Zawiesić komórki za pomocą 100 μl buforu sortującego. Wstępnie inkubować zawiesinę komórkową z oczyszczonym mAb anty-mysim CD16/CD32 (1 μg) (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 2 μl przeciwciała monoklonalnego PE Rat anty-mysiego CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) APC (2 μL, 1:50) i przeciwciała monoklonalnego FITC CD140a (PDGFRa) (2 μL, 1:50) bezpośrednio do wstępnie inkubowanych komórek w obecności mysiego bloku Fc i dalej inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 min.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie, dodając 2 ml buforu i odwirować przy 300 x g przez 5 minut (temperatura pokojowa) w celu ponownego osadzenia komórek. Supernatant należy całkowicie odrzucić i ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforu. Umieść probówki przepływowe z barwionymi komórkami w zamrażalniku gotowym do cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
4. Wykrywanie wewnątrzkomórkowejsygnalizacji Ca2+ w naczyniowych komórkach macierzystych CD34+
<ol>
	<li>Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych 10 godzin przed eksperymentami w gęstości do 70% konfluencji.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka nakrywkowe i przymocuj je do dna niestandardowej komory z dowolną wazeliną.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe przemyć raz PBS, zastąpić Fura-2/AM (5 μM) w roztworze Tyrode'a (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl2 1,2 mM, glukoza 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2,4 mM) (patrz tabela materiałów) i inkubować komórki przez 30 minut w ciemności.</li>
	<li>Usuń barwnik, traktując go roztworem Tyrode'a przez 10 minut, aby umożliwić deestryfikację fura-2/AM.</li>
	<li>Zamontuj komorę na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w system obrazowania szerokokątnego zawierający monochromator i kamerę CCD (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Otwórz okno główne, przejdź do okna dialogowego Ustawienia chwytania i strony kamery, a następnie naciśnij przycisk na żywo, aby wyświetlić obraz na żywo.</li>
	<li>Wybierz typ obrazu fluorescencyjnego, ustaw czasy powtarzania pętli 340 nm/380 nm, rozmiar obrazu i czas ekspozycji aparatu na 380 nm i 340 nm, aby uzyskać optymalną jasność obrazu.</li>
	<li>Zrób pojedyncze migawki i narysuj kilka odręcznych linii, aby zakreślić komórki różnymi kolorami i wstępnie zdefiniować region zainteresowań (ROI), wskazując tło jako ROI 0.</li>
	<li>Ponownie edytuj już osadzony protokół w widoku obszaru roboczego i utwórz nowy obszar roboczy.</li>
	<li>Wykonaj protokół, a "Fluorescencja 340 nm div Fluorescencja 380 nm (Live Kinetic)" wyświetli wykres kinetyczny online.</li>
	<li>W widoku numerycznym widoczny będzie arkusz kalkulacyjny prezentujący kolumny wartości w skali szarości i odpowiadające im informacje o czasie. Wyeksportuj dane arkusza kalkulacyjnego za pomocą schowka.</li>
	<li>Obliczać F340 nm/F380 nm wskazujące wewnątrzkomórkowe zmiany Ca2+ po odjęciu fluorescencji tła (ROI 0).</li>
</ol>

Isolation and Magnetic Separation of Murine CD34+ Stem Cells from the Vascular Wall

<ol><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+progenitor+cells+in+the+adventitia+contribute+to+atherosclerosis+of+vein+grafts+in+ApoE-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice.</a> J Clin Invest. 113 (9), 1258-1265 (2004).</li>
<li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonbone+marrow+CD34%2B+cells+are+crucial+for+endothelial+repair+of+the+injured+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Nonbone marrow CD34+ cells are crucial for endothelial repair of the injured artery.</a> Circ Res. 129 (8), e146-e165 (2021).</li>
<li>Tamma, R., Ruggieri, S., Annese, T., Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+wall+as+a+source+of+stem+cells+able+to+differentiate+into+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Vascular wall as a source of stem cells able to differentiate into endothelial cells.</a> Adv Exp Med Biol. 1237, 29-36 (2020).</li>
<li>Patel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+definition+of+progenitors+versus+mature+endothelial+cells+reveals+key+soxF-dependent+differentiation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key soxF-dependent differentiation process.</a> Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).</li>
<li>Zhang, L., Issa Bhaloo, S., Chen, T., Zhou, B., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+stem+cells+in+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Roles of stem cells in vascular remodeling.</a> Chin J Cell Biol. 43 (7), 1352-1361 (2021).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+resident+stem+cells+in+vessel+formation+and+arteriosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Role of resident stem cells in vessel formation and arteriosclerosis.</a> Circ Res. 122 (11), 1608-1624 (2018).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+estrogen+on+growth+and+smooth+muscle+differentiation+of+vascular+wall-resident+CD34%2B+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Effects of estrogen on growth and smooth muscle differentiation of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells.</a> Atherosclerosis. 240 (2), 453-461 (2015).</li>
<li>Tang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+vascular+wall-resident+CD34%2B+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol+Plus%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells.</a> Cardiol Plus. 4 (4), 116-120 (2019).</li>
<li>Sukumaran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+regulates+autophagy+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling regulates autophagy and apoptosis.</a> Cells. 10 (8), 2125(2021).</li>
<li>van der Sanden, B., Dhobb, M., Berger, F., Wion, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Optimizing stem cell culture.</a> J Cell Biochem. 111 (4), 801-807 (2010).</li>
<li>Rotmans, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo%2C+cell+seeding+with+anti-CD34+antibodies+successfully+accelerates+endothelialization+but+stimulates+intimal+hyperplasia+in+porcine+arteriovenous+expanded+polytetrafluoroethylene+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo, cell seeding with anti-CD34 antibodies successfully accelerates endothelialization but stimulates intimal hyperplasia in porcine arteriovenous expanded polytetrafluoroethylene grafts.</a> Circulation. 112 (1), 12-18 (2005).</li>
<li>Qu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+amyloid+A1+in+the+adipogenic+differentiation+of+human+adipose-derived+stem+cells+basing+on+single-cell+RNA+sequencing+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">The role of serum amyloid A1 in the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells basing on single-cell RNA sequencing analysis.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 187(2022).</li>
<li>Flynn, J., Gorry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+Analysis+to+Identify+Human+CD8%2B+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry Analysis to Identify Human CD8+ T Cells.</a> Methods Mol Biol. 2048, 1-13 (2019).</li>
<li>Bacon, K., Lavoie, A., Rao, B. M., Daniele, M., Menegatti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Past%2C+present%2C+and+future+of+affinity-based+cell+separation+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Past, present, and future of affinity-based cell separation technologies.</a> Acta Biomater. 112, 29-51 (2020).</li>
<li>Ma, H. G., Liu, H. Q., Liu, S. D., Tang, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+identification+of+rat+glomerular+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Sin%22%5BJournal%5D)">Primary culture and identification of rat glomerular microvascular endothelial cells.</a> Acta Physiol Sin. 73 (6), 926-930 (2021).</li>
<li>Liu, W. H., Wang, P., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+identification+of+rats+hair+follicle+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and identification of rats hair follicle neural crest stem cells.</a> Chin J Neuroanat. 35 (2), 207-211 (2019).</li>
<li>Kumar, P., Garg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+approaches+to+obtain+medulloblastoma+stem+cells+from+bulk+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry approaches to obtain medulloblastoma stem cells from bulk cultures.</a> Methods Mol Biol. 2423, 87-94 (2022).</li>
<li>Haroon, M. M., Vemula, P. K., Palakodeti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+planarian+stem+cells+using+DNA+and+mitochondrial+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of planarian stem cells using DNA and mitochondrial dyes.</a> Bio Protoc. 12 (2), e4299(2022).</li>
<li>Catchpole, T., Nguyen, T. D., Gilfoyle, A., Csaky, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+profile+of+circulating+vascular+progenitor+cells+in+human+neovascular+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">A profile of circulating vascular progenitor cells in human neovascular age-related macular degeneration.</a> PLOS One. 15 (2), e0229504(2020).</li>
<li>Wang, G., Yu, G., Wang, D., Guo, S., Shan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+purity+and+vitality+of+natural+killer+cells+with+different+isolation+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of the purity and vitality of natural killer cells with different isolation kits.</a> Exp Ther Med. 13 (5), 1875-1883 (2017).</li>
<li>Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consortium+SI.+Isolation+of+B-cells+using+Miltenyi+MACS+bead+isolation+kits%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Consortium SI. Isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits.</a> PLOS One. 14 (3), e0213832(2019).</li>
<li>Jiang, L. H., Mousawi, F., Yang, X., Roger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-induced+Ca2%2B-signalling+mechanisms+in+the+regulation+of+mesenchymal+stem+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">ATP-induced Ca2+-signalling mechanisms in the regulation of mesenchymal stem cell migration.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (20), 3697-3710 (2017).</li>
<li>Ong, H. L., Subedi, K. P., Son, G. Y., Liu, X., Ambudkar, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+store-operated+calcium+entry+to+modulate+Ca2%2B-dependent+physiological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Tuning store-operated calcium entry to modulate Ca2+-dependent physiological processes.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1037-1045 (2019).</li>
<li>Garcia-Carlos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II%2C+ATP+and+high+extracellular+potassium+induced+intracellular+calcium+responses+in+primary+rat+brain+endothelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Funct%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II, ATP and high extracellular potassium induced intracellular calcium responses in primary rat brain endothelial cell cultures.</a> Cell Biochem Funct. 39 (5), 688-698 (2021).</li>
<li>Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caffeine+as+a+tool+to+investigate+sarcoplasmic+reticulum+and+intracellular+calcium+dynamics+in+human+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Caffeine as a tool to investigate sarcoplasmic reticulum and intracellular calcium dynamics in human skeletal muscles.</a> J Muscle Res Cell Motil. 42 (2), 281-289 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Badanie to zapewnia szybką i wygodną metodę uzyskiwania funkcjonalnych CD34+ VW-SC z aorty i tętnic krezkowych myszy. CD34+ VW-SC otrzymane tą metodą wykazują aktywność proliferacyjną i wielokierunkowe właściwości różnicujące. Receptory trifosforanowo-inozytolowo-1,4,5-trifosforanowe (IP3Rs), receptory ryanodyny (RyR) i kanały wapniowe obsługiwane przez magazyn pośredniczą w uwalnianiu i wnikaniu Ca2 + do CD34 + VW-SC. Opracowanie tej techniki stworzy podstawy do dal...

Ściana naczyń odgrywa kluczową rolę w rozwoju naczyń krwionośnych, regulacji homeostazy i postępie chorób naczyniowych. W ostatnich latach liczne badania ujawniły obecność różnych linii komórek macierzystych w tętnicach. W 2004 roku grupa profesora Qingbo Xu po raz pierwszy poinformowała o istnieniu naczyniowych komórek macierzystych/progenitorowych na obrzeżach ściany naczyń krwionośnych dorosłych, wyrażających CD34, Sca-1, c-kit i Flk-11. Te naczyniowe komórki macierzyste wykazują wielokierunkowy potencjał różnicowania i proliferacji. W normalnych warunkach pozostają stosunkowo spokojne; Jednak po aktywacji przez określone czynniki mogą różnicować się w komórki mięśni gładkich, komórki śródbłonka i fibroblasty. Alternatywnie, mogą regulować macierz okołonaczyniową i tworzenie mikronaczyń poprzez efekty parakrynne, aby promować naprawę lub przebudowę uszkodzonych naczyń krwionośnych2,3,4,5,6. Ostatnio odkryto, że komórki macierzyste CD34 + rezydujące w ścianie naczyniowej odgrywają rolę w regeneracji komórek śródbłonka po uszkodzeniu przewodu prowadzącego tętnicy udowej2. W związku z tym izolacja i kwantyfikacja VW-SC CD34+ oraz badanie podstawowych cech biologicznych komórek macierzystych CD34+ mają kluczowe znaczenie dla dalszych badań szlaków sygnałowych zaangażowanych w regulację VW-SC CD34+.
Obecnie dostępne są różne metody separacji komórek, w tym techniki oparte na charakterystyce hodowli komórkowej lub właściwościach fizycznych komórek, takie jak wirowanie w gradiacji gęstości, co powoduje, że posortowane komórki zawierają wiele komórek niedocelowych i stosunkowo niską czystość7,8,9,10,11,12. Inną powszechnie stosowaną techniką jest sortowanie komórek wspomagane fluorescencją/magnetycznie. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) to złożony system o wysokich wymaganiach technicznych, stosunkowo kosztowny, czasochłonny i potencjalnie wpływający na aktywność posortowanych komórek13,14. Jednak sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS) jest bardziej wydajne i wygodne, z wysokim współczynnikiem odzysku i aktywności komórek oraz mniejszym wpływem na dalsze zastosowania8. Dlatego w tym protokole zastosowaliśmy MACS do oczyszczania CD34+ VW-SC i dalej identyfikowaliśmy komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Opracowanie metod izolacji opartych na MACS do badania komórek macierzystych ściany naczyniowej byłoby nieocenione. Po pierwsze, pozwala na eksperymentalne badania genetyczne i biologiczne komórki. Po drugie, skuteczna izolacja i hodowla komórek macierzystych rezydujących w ścianie naczyniowej pozwala na systematyczną ocenę i badania przesiewowe czynników sygnalizacyjnych regulujących funkcje komórek macierzystych. Po trzecie, identyfikacja kluczowych fenotypów w komórkach macierzystych zapewnia ważną "kontrolę jakości" w ocenie stanu komórek. W związku z tym zidentyfikowanie metod oczyszczania może być przydatne w podobnych zastosowaniach do analogicznych komórek macierzystych pochodzących z naczyń krwionośnych.
Ten raport dostarcza szczegółowej demonstracji stabilnej i niezawodnej metody hodowli CD34+ VW-SCs, w tym identyfikacji komórek i oceny funkcjonalnej przeprowadzanej za pomocą cytometrii przepływowej, barwienia immunofluorescencyjnego i pomiaru sygnalizacji Ca2+. Badanie to stanowi podstawę do dalszych pogłębionych badań nad funkcją VW-SC CD34+ i ich mechanizmami regulacyjnymi w stanach fizjologicznych i patologicznych.

<table><tbody><tr><td>2% roztwór żelatyny</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD31</td><td>R& D</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD34</td><td>Abcam</td><td>ab81289</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-c-kit</td><td>CST</td><td>77522</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki anty-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-FITC MicroBeads MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Flk-1</td><td>Abcam</td><td>ab24313</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Ki67</td><td>CST</td><td>34330</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PDGFR&alfa</td><td>Abcam</td><td>ab131591</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Sca-1</td><td>Invitrogen</td><td>710952</td><td></td></tr><tr><td>CD140a (PDGFRA) Monoklonalne Przeciwciało (APA5), FITC</td><td>eBioscience &nbsp; Invitrogen</td><td>11-1401-82</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1) Przeciwciało monoklonalne (390), APC</td><td>eBioscience&nbsp; Invitrogen</td><td>17-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>CD34 Przeciwciało, przeciwciało przeciw myszy, FITC, REAfinity Klon REA383</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-775</td><td></td></tr><tr><td>kaptur do hodowli komórkowej</td><td>JIANGSU SUJING GROUP CO., LTD&nbsp;</td><td>Wirówka SW-CJ-2FD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; CENA&nbsp; &nbsp;</td><td>L530</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp; inkubatory&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>4111</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy&nbsp;</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>ZEISS 980&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DMEM o wysokiej zawartości glukozy</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana EBM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>FACSMelody&nbsp; &nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSMelody&handel; System</td><td>&nbsp; </td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Millipore</td><td>ES-009-C</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka hodowlana FM-2</td><td>ScienCell</td><td>2331</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2/AM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>M1292</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 488</td><td>&nbsp; Thermofisher Naukowy&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę</td><td>Millipore</td><td>LIF2010</td><td></td></tr><tr><td>mikroskopie&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS&nbsp; &nbsp; Zestaw startowy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-312</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B</td><td>Beyotime</td><td>C0224</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony szczur Anti-Mouse CD16/CD32 (mysz BD Fc Block)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZX10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Program TILLvisION 4.0&nbsp;</td><td>&nbsp; T.I.L.L.Photonics GmbH</td><td>polichromia V&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne VWF (F8/86)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp; MA5-14029</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja immunomagnetyczna komórek macierzystych cd34 + rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych od myszy

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Rezydentne komórki macierzyste i progenitorowe CD34+ rezydujące w ścianie naczyniowej (VW-SCs) są coraz bardziej rozpoznawane ze względu na ich kluczową rolę w regulacji uszkodzeń naczyniowych i ich naprawie. Ustalenie stabilnej i wydajnej metody hodowli funkcjonalnych mysich CD34+ VW-SC jest niezbędne do dalszego badania mechanizmów zaangażowanych w proliferację, migrację i różnicowanie tych komórek w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. Opisana metoda łączy przesiewowe kulki magnetyczne i cytometrię przepływową w celu oczyszczenia CD34+ VW-SC z hodowli pierwotnej. Oczyszczone komórki są następnie funkcjonalnie identyfikowane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i obrazowania Ca2 +. Krótko mówiąc, komórki naczyniowe z przydanki mysiej aorty i tętnicy krezkowej uzyskuje się poprzez przyczepienie bloku tkankowego, a następnie subkulturację, aż do osiągnięcia liczby komórek co najmniej 1 ×10 7. Następnie CD34+ VW-SC są oczyszczane za pomocą magnetycznego sortowania kulek i cytometrii przepływowej. Identyfikacja CD34+ VW-SC obejmuje barwienie immunofluorescencyjne komórkowe, podczas gdy wielofunkcyjność funkcjonalna jest określana przez wystawienie komórek na działanie określonej pożywki hodowlanej w celu zorientowanego różnicowania. Co więcej, funkcjonalne wewnętrzne uwalnianie Ca2 + i zewnętrzne wejście Ca2 + ocenia się za pomocą dostępnej na rynku stacji roboczej do obrazowania w komórkach obciążonych Fura-2 / AM wystawionych na działanie ATP, kofeiny lub tapsygarginy (TG). Metoda ta oferuje stabilną i wydajną technikę izolacji, hodowli i identyfikacji komórek macierzystych CD34+ rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych, dając możliwość badań in vitro nad mechanizmami regulacyjnymi VW-SC i badań przesiewowych leków celowanych.

Izolacja i oczyszczanie komórek VW-SCs CD34+ 
Wysoką czystość komórek VW-SCs CD34+ uzyskuje się z błony zewnętrznej tętnicy aorty i tętnicy krezkowej myszy poprzez przywieranie tkanki i sortowanie za pomocą magnetycznych mikrokulek. Procent komórek CD34+ w ścianie naczynia wynosi zazwyczaj 10%-30%. Cytometria przepływowa potwierdza, że czystość komórek CD34+ uzyskanych metodą sortowania magnetycznego przekracza 90% (Rycina 1A). ...

To badanie ustaliło stabilną i efektywną metodę izolacji, hodowli i funkcjonalnego określania komórek macierzystych CD34+ rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych (CD34+ VW-SCs). Ta łatwa do naśladowania i efektywna czasowo metoda izolacji może być wykorzystana przez innych badaczy do badania potencjalnych mechanizmów związanych z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Izolacja immunomagnetyczna komórek macierzystych CD34 + rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych od myszy

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...

Mieszkańcy ściany naczyniowej CD34 dodatni wynik w komórkach macierzystych są coraz częściej rozpoznawani ze względu na ich kluczową rolę w regulacji przebudowy naczyń krwionośnych po urazie. Ustanowienie stabilnej i skutecznej metody charakteryzowania funkcjonalnych komórek CD34-dodatnich jest niezbędne do dalszego badania mechanizmów uczestniczących w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. Technika ta łączy magnetyczne badania przesiewowe B i cytometrię płynową w celu oczyszczenia pierwotnych hodowanych rezydentnych komórek macierzystych CD34.Następnie oczyszczone komórki można funkcjonalnie zidentyfikować za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i obrazowania wapniowego. Ze względu na fenotypową i funkcjonalną heterogeniczność rezydujących komórek macierzystych predykcyjnych CD34 w ścianie naczyniowej, spowolnienie nastąpi w celu zidentyfikowania specyficznego subkomórkowego typu odpowiednich mięśniowych komórek proaktywnych CD34. Przedstawiamy udoskonaloną metodologię identyfikacji hodowli i oceny funkcjonalnej komórek macierzystych CD34 rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych.To nowatorskie podejście obejmuje sortowanie magnetyczne, fotocytometrię, immunofluor, sterling i pomiary niestandardowe. Dzięki zastosowaniu tych technik, nasze badanie jest tylko podstawą do przyszłych kompleksowych badań nad funkcją pod regulacją małomównych komórek macierzystych CD34 zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Aby rozpocząć, umieść znieczuloną mysz na stole operacyjnym.Za pomocą sterylnych nożyczek okulistycznych i kleszczy otwórz klatkę piersiową i jamę brzuszną. To odsłoni serce i jelita. Ostrożnie wypreparuj osobno tętnice krezkowe i aortę.Przepłukać tętnice krezkowe i PBS i przenieść je na 10-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 1% roztwór penicyliny, streptomycyny, amfoterycyny B. Podobnie przepłucz aortę i przenieś ją na inną szalkę Petriego zawierającą ten sam roztwór. Szybko usuń cały tłuszcz wokół aorty i tętnic krezkowych.Po dwukrotnym przepłukaniu umieść tętnice pod mikroskopem stereoskopowym w kapturze do hodowli tkankowych. Ostrożnie wykonaj podłużne cięcie wzdłuż tętnic. Następnie za pomocą cienkich kleszczy oderwij zewnętrzną warstwę aorty i pierwszą odnogę tętnic krezkowych.Umieść zewnętrzną warstwę na 3,5-centymetrowej szalce Petriego zawierającej od 0,1 do 0,2 mililitra pożywki hodowlanej i pokrój ją na drobne kawałki o objętości około jednego milimetra sześciennego. Przenieść kawałki tkanki do kolby T25 pokrytej żelatyną. Umieścić kolbę pionowo w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Po trzech godzinach dodaj pięć mililitrów pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy do kolby, aby zanurzyć wszystkie bloki tkankowe. Na początek wyizoluj i pohoduj zewnętrzną warstwę aorty i pierwszą gałąź tętnic krezkowych odizolowanych od znieczulonej myszy. Gdy komórki osiągną 80% zlewu, odwiruj zdysocjowaną zawiesinę komórkową o stężeniu 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 98 mikrolitrach buforu sortującego na 10 milionów wszystkich komórek. Po dodaniu przeciwciała CD34 inkubować komórki w ciemności przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby umyć komórki, dodaj do komórek dwa mililitry buforu sortującego i odwiruj przy 300 G przez 10 minut.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 80 mikrolitrach buforu sortującego. Następnie dodaj 20 mikrolitrów mikrokulek anty-FITC do zawiesiny komórek. Po umyciu i odwirowaniu komórek, jak pokazano wcześniej, ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu sortującego.Następnie umieść kolumnę separacji magnetycznej w polu magnetycznym separatora i umieść rurkę zbiorczą pod kolumną. Po przepłukaniu 500 mikrolitrami buforu, załadować zawiesinę komórek do kolumny i zebrać przepływ przez zawierające nieoznakowane komórki w probówce zbiorczej. Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na świeżej 15-mililitrowej probówce wirówkowej.Wprowadzić 500 mikrolitrów buforu sortującego do kolumny i wcisnąć tłok do kolumny, aby wypłukać magnetycznie znakowane komórki. Aby scharakteryzować CD34-dodatnie komórki macierzyste wyizolowane z mysich tętnic aortalnych i krezkowych, należy przeprowadzić hodowlę blokową tkanek i uzyskać komórki przez separację magnetyczną. Aby wykryć ekspresję markera komórkowego komórki śródbłonka i fibroblastów po różnicowaniu, obserwuj komórki w 40-krotnym powiększeniu ze wzbudzeniami laserowymi o długości 488 nanometrów.Po trypsynizacji komórek, osadzać je przez odwirowanie i ponownie zawieś w 100 mikrolitrach buforu sortującego. Następnie inkubuj je z przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko myszy, CD 16, CD 32 w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodać dwa mikrolitry każdego pożądanego przeciwciała monoklonalnego do barwienia immunofluorescencyjnego i ponownie inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.Umyj komórki dwukrotnie jednym mililitrem buforu. Po odwirowaniu komórek, jak pokazano, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 300 mikrolitrach buforu. Przenieś komórki do rurek przepływowych i umieść je w zamrażalniku.Uruchom cytometrię przepływową, aby sprawdzić procent zróżnicowanych komórek. Ocena metodą cytometrii przepływowej potwierdziła wysoką czystość wyizolowanych komórek macierzystych CD34 z dodatnim wynikiem ściany naczyniowej. Barwienie immunofluorescencyjne komórkowe wykazało, że wyizolowane komórki macierzyste CD34 dodatnie wykazywały głównie ekspresję markerów komórek macierzystych, CD34, c-kit i Flk-1.Cytometria przepływowa potwierdziła również, że wyizolowane komórki macierzyste CD34-dodatnie posiadają zdolność różnicowania się w komórki śródbłonka, a także fibroblasty in vitro. Na początek wyizoluj rezydentne komórki macierzyste CD34 CD34 z modeli mysich. Uzyskaj czyste komórki przez magnetyczne sortowanie komórek aktywowanych i scharakteryzuj je.W celu wykrycia sygnalizacji wapniowej należy zaopatrzyć się w szkiełko nakrywkowe poprzedzone komórkami i przemyć je raz PBS. Następnie inkubować komórki z roztworem Fura-2 AM i Tyrode przez 30 minut w ciemności. Aby usunąć barwnik, inkubuj komórki w roztworze Tyrode przez 10 minut.Następnie zamontuj komorę na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. Otwórz okno główne i przejdź do okna dialogowego ustawień chwytania i strony kamery. Naciśnij przycisk na żywo, aby wyświetlić obraz na żywo.Aby uzyskać obrazy, narysuj kilka odręcznych linii, aby zakreślić komórki różnymi kolorami i wstępnie zdefiniować obszary zainteresowania. Mikroskopia fluorescencyjna wykazała, że podawanie ATP zwiększyło wewnątrzkomórkowy poziom wapnia w izolowanej ścianie naczynia, komórkach macierzystych CD34-dodatnich.

immunomagnetic-isolation-vascular-wall-resident-cd34-stem-cells-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Ten film demonstruje technikę generowania myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS). Krwiotwórcze komórki macierzyste CD34 + (HSC) są izolowane z ludzkich komórek kożucha krwi pępowinowej za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami. HSC CD34+ są namnażane w pożywce wzrostowej wzbogaconej o cytokiny i kriokonserwowane. Na koniec rozmrożone HSC wstrzykuje się do mysiego szczeniaka z niedoborem odporności w celu ustalenia mysiego modelu HIS.

Izolowanie hematopoetycznych komórek macierzystych krwi pępowinowej w celu wytworzenia myszy z ludzkim układem odpornościowym

Tutaj prezentujemy protokół, który generuje duże ilości mysich monocytów z heterogenicznego szpiku kostnego do zastosowań translacyjnych. W porównaniu z innymi, ta nowa metoda pomaga zmniejszyć liczbę uśmierconych zwierząt i obniżyć koszty, unikając kosztownych metod, takich jak magnetyczna separacja komórek o wysokim gradimencie (MACS).

Izolacja i wstrzyknięcie dożylne monocytów pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Zoptymalizowaliśmy protokół izolacji i oczyszczania mysich perycytów serca do podstawowych badań i badania ich potencjału biologicznego i terapeutycznego.

Izolacja i oczyszczanie perycytów serca myszy

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

Ten protokół opisuje generowanie myszy z ludzkim układem odpornościowym (HIS) do badań immunoonkologicznych. Przedstawiono instrukcje i rozważania dotyczące stosowania tego modelu do testowania ludzkich immunoterapeutyków na ludzkich nowotworach wszczepionych w tym modelu z naciskiem na scharakteryzowanie odpowiedzi ludzkiego układu odpornościowego na guz.

Testowanie immunoterapeutyków przeciwnowotworowych w humanizowanym modelu mysim z ludzkimi nowotworami

Zastrzyki doudowe pozwalają na wszczepienie niewielkiej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC), poprzez umieszczenie komórek bezpośrednio w jamie szpiku kostnego. Tutaj opisujemy eksperymentalny protokół wstrzykiwania do kości udowej ludzkich HSPC myszom z niedoborem odporności.

Wstrzyknięcie doudowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych myszom z obniżoną odpornością

Opisujemy protokół izolowania komórek mikrogleju z podwzgórza myszy (lub równoważnych małych struktur mózgu) za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek (MACS), w stosunkowo krótkim czasie. Mikroglej podwzgórza sortowany przez MACS może być używany do analizy ex vivo i może być posiany w celu przeprowadzenia testów in vitro.

Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie

Naucz się izolować komórki macierzyste CD34+ z naczyń myszy metodą immunomagnetyczną. Technika ta umożliwia badanie ich funkcji w modelach chorób układu krążenia.

Izolacja immunomagnetyczna komórek macierzystych CD34 ⁺ rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych od myszy

Przeglądaj więcej filmów