Name: Generowanie siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Poznaj zoptymalizowaną metodę indukcji siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Technika zmniejsza adhezję i fuzję organoidów, zwiększając powtarzalność produkcji modeli do badań chorób siatkówki i terapii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z założeniami Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Chińskiego Szpitala Ogólnego ChALW. Linia ESC WA09 (H9) została pozyskana z Instytutu Badawczego WiCell.
1. Pożywki hodowlane i przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Pożywka hodowlana u ludzi z ESC i roztwór do pasażu
	<ol>
		<li>Pożywka konserwacyjna (MM): Przygotować 500 ml kompletnego MM (podłoże podstawowe + 5 razy suplement; patrz tabela materiałów) w sposób aseptyczny. Rozmrozić 5x suplement w temperaturze pokojowej (RT) lub przez noc w temperaturze 2-8 °C. Podgrzej do RT. Dobrze wymieszaj przed użyciem, aż suplement będzie wolny od zmętnienia.</li>
		<li>1% macierz zewnątrzkomórkowa (ECM): Użyj wstępnie schłodzonej końcówki pipety i sterylnych probówek, aby dozować 200 μl ECM (patrz Tabela materiałów) na probówkę z lodem. Probówki należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Rozpuść ECM na lodzie i rozcieńcz wstępnie schłodzonym DMEM/F12 w stosunku 1:100.</li>
		<li>0,5 mM pH = 8,0 EDTA: Aby przygotować 500 ml 0,5 mM EDTA, dodaj 500 μl 0,5 M EDTA i 0,9 g NaCl do 500 ml 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS) (patrz Tabela materiałów). Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 2-8 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ośrodek różnicujący siatkówkę
	<ol>
		<li>Pożywka zdefiniowana chemicznie bez czynnika wzrostu (gfCDM): Przygotuj gfCDM, łącząc 45% zmodyfikowanego Dulbecco's medium-GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX) firmy Iscove, 45% Ham's F12-GlutaMAX (F12-Glutamax), 10% zamiennika surowicy nokautującej (KSR), 1% koncentratu lipidów cholesterolu i 450 μM tioglicerolu (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Związki małocząsteczkowe
	<ol>
		<li>Y-27632 2HCl: Dodaj 50 mg proszku Y-27632 do 3,122 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Dozować i przechowywać Y-27632 (patrz tabela materiałów) w stężeniu 50 mM w temperaturze -80 °C przez 2 lata, z dala od światła. Rozcieńczyć zapas 2,500 razy (20 μM) przed użyciem, co odpowiada 0,4 μl Y-27632 na ml gfCDM.</li>
		<li>IWR1-endo: Dodać 2,4424 ml DMSO, aby rozpuścić 10 mg IWR1-endo (patrz Tabela materiałów), aby otrzymać 10 mM roztwór podstawowy. Dozować porcje i przechowywać je w temperaturze -80 °C przez okres do 2 lat. Dodać 0,3 μl 10 mM IWR1-endo na ml gfCDM dla stężenia 3 μM do indukcji.</li>
		<li>SB431542: Aby przygotować 50 mM SB431542, dodaj 10 mg SB431542 (patrz Tabela Materiałów) do 0,5203 ml DMSO i dokładnie wymieszaj. Przechowywać w temperaturze -80 °C w rozpuszczalniku maksymalnie 2 lata. W celu przygotowania SB431542 o stężeniu roboczym 10 μM, dodać 2 μl 50 mM roztworu podstawowego do 10 ml gfCDM.</li>
		<li>LDN-193189 2HCl: Rozpuścić 5 mg LDN-193189 2HCl (patrz tabela materiałów) w 10,4297 ml DMSO, aby uzyskać 1 mM roztworu podstawowego. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C (zgodnie z zaleceniami producenta). Dodaj 0,1 μl zapasu do każdych 10 ml gfCDM, co daje 100 nM LDN-193189 do indukcji.</li>
		<li>Rekombinowane białko morfogenetyczne ludzkiej kości 4 (BMP4): Rozpuścić w 50-200 μg/ml w 4 mM HCl (patrz tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze od 2 °C do 8 °C przez 1 miesiąc lub w temperaturze -20 °C przez 1 rok po rozpuszczeniu. Przeprowadzić indukcję NR za pomocą 1,5 nM BMP4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Długotrwała pożywka hodowlana NR
	<ol>
		<li>Kwas retinowy (RA): Odmierz 6 mg proszku RZS (patrz tabela materiałów) i dodaj do 3,9941 ml DMSO. Przechowywać w porcjach 5 mM w temperaturze -80 °C i zużyć w ciągu 3 miesięcy. Aby osiągnąć stężenie robocze 0,5 μM, dodaj 10 μl mieszanki wzorcowej do 100 ml pożywki do różnicowania siatkówki nerwowej (NRDM). Dodaj tuż przed użyciem. 
		UWAGA: Przechowywać z dala od światła podczas przygotowywania i przechowywania.</li>
		<li>Tauryna: Dodać taurynę w proszku (patrz tabela materiałów) o wadze 200 mg do 7,9904 ml DMSO, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 200 mM. Dozować i przechowywać w temperaturze 2-8 °C. Stężenie robocze 0,1 mM tauryny uzyskuje się przez dodanie 50 μl roztworu podstawowego na 100 ml NRDM.</li>
		<li>NRDM: Skomponować NRDM z pożywką DMEM/F12-GlutaMAX, 1% suplementem N2, 10% płodową surowicą bydlęcą, 0,5 mM RZS i 0,1 mM tauryną (patrz tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 2 tygodni lub 6 miesięcy w temperaturze -20 °C, aby zapewnić aktywność składników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor blokujący: Rozcieńczyć w stosunku 1:9 DPBS w celu uzyskania 10% roztworu roboczego do użycia (patrz Tabela Materiałów). Przechowywać w temperaturze -20 °C do 5 lat. 
	UWAGA: Wszystkie inne procedury należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby zapewnić sterylność, z wyjątkiem ważenia. Jeśli konieczne jest dodanie zważonych odczynników podczas procesu przygotowania, do filtracji należy użyć filtrów 0,22 μm.</li>
</ol>
2. Hodowla H9-ESC
<ol>
	<li>Rozmrażanie H9-ESC
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml 1% ECM do każdego dołka na płytce 6-dołkowej. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2. 
		UWAGA: Unikaj dodawania ECM wzdłuż ścianek studni, ponieważ może on przykleić się do powierzchni.</li>
		<li>Weź wywar kriogeniczny H9-ESC ze zbiornika z ciekłym azotem i szybko wstrząśnij nim w wodzie o temperaturze 37 °C przez 30 s. 
		UWAGA: Nie dopuścić do całkowitego rozmrożenia fiolki.</li>
		<li>Wyjąć fiolkę i ostrożnie wysterylizować ją za pomocą 75% środka dezynfekującego w sprayu. Dodać rozmrożony H9-ESC z kriowialu do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml MM z 10 μM Y-27632.</li>
		<li>Odwirować probówkę o stężeniu 190 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć większość supernatantu za pomocą pipety o pojemności 1 ml, pozostawiając około 50 μl supernatantu, aby uniknąć utraty komórek.</li>
		<li>Dodać 1 ml MM zawierającego 10 μM Y27632 do osadu komórkowego i delikatnie zawiesić osad komórkowy za pomocą pipety o pojemności 1 ml, pipetując w górę iw dół 5-10 razy.</li>
		<li>Usunąć powłokę ECM po 1 godzinie inkubacji. Do każdej studzienki dodać 2 ml wstępnie podgrzanego MM zawierającego 10 μM Y-27632.</li>
		<li>Dozować 0,5 ml zawiesiny komórek na dołek. Delikatnie potrząśnij płytką na boki, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez co najmniej 24 godziny, nie dotykając jej.</li>
		<li>Zmieniaj medium codziennie. Gdy gęstość klonowania osiągnie 70% i więcej, wymagane jest pasażowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pasażowanie H9-ESC
	<ol>
		<li>Przygotować płytkę pokrytą ECM, jak opisano powyżej (krok 2.1.1) i dodać 2 ml MM do dołka.</li>
		<li>Usuń zużyte podłoże z płytek 6-dołkowych. Umyj każdą studzienkę dwukrotnie 1 ml DPBS.</li>
		<li>Przemyj każdą studzienkę dwukrotnie, powoli dodając 1 ml EDTA i inkubując z 1 ml EDTA przez 4-7 minut w temperaturze RT. 
		UWAGA: Podczas inkubacji badać płytkę 6-dołkową przez 3 minuty pod mikroskopem. Przejdź natychmiast do następnego kroku, jeśli większość komórek jest bliska odłączenia od naczynia. Unikaj długotrwałej inkubacji, aby zmniejszyć negatywny wpływ na komórki.</li>
		<li>Odrzuć EDTA i dodaj 1 ml MM, aby przerwać trawienie.</li>
		<li>Delikatnie postukaj w płytkę studzienki, aż większość komórek zostanie odłączona.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Delikatnie zawieś kolonie H9-ESC w górę i w dół 3-5 razy, aby wymieszać je z pitette Pasteura. Przenieś 20-100 μl zawiesiny komórek do nowego 6-dołkowego naczynia hodowlanego pokrytego ECM i potrząśnij nim w przód iw tył.</li>
		<li>Gdy gęstość komórek zostanie zaobserwowana pod mikroskopem jako wystarczająca, inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 przez co najmniej 24 godziny, nie dotykając jej.</li>
		<li>Zmieniaj nośniki codziennie. Przy gęstości klonów 70% i wyższej wymagane jest przejście.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Generacja ludzkich NR
UWAGA: Gdy kolonie osiągną około 70% konfluencji, mogą być skierowane w kierunku różnicowania w organoidy siatkówki (RO), korzystając z kroków proceduralnych opisanych w Rysunek 1.
<ol>
	<li>Dzień 0 - Tworzenie się ciała zarodka (EB)
	<ol>
		<li>Po umyciu komórek 2 ml DPBS dodać 0,5 ml CDS (patrz tabela materiałów) zawierającej 20 μM Y27632 do studzienki. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2. 
		UWAGA: Sprawdź pod mikroskopem. Skróć czas inkubacji tak bardzo, jak to możliwe, aby uniknąć szkodliwego wpływu na komórki.</li>
		<li>Przerwać trawienie, dodając 3 ml MM zawierającego 20 μM Y27632. Odwirować przy 190 × g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml gfCDM zawierającym 20 μM Y27632 i policzyć komórki. Dodaj odpowiednią objętość dla 1,2 × 106 komórek (1,2 × 104 komórek na studzienkę) do 10 ml gfCDM, który jest wstępnie włączony do 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 i 100 nM LDN-193189 (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka z 96 studzienkami stożkowymi z dnem w kształcie litery V. Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 do dnia 6. 
		UWAGA: Nie przesuwaj naczyń przez co najmniej 24 godziny, aby zwiększyć przyczepność EB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 6 - Indukcja siatkówki
	<ol>
		<li>W dniu 6 dodaj 10 ml gfCDM zawierającego 55 ng/ml BMP4, aby umożliwić całkowitą zmianę pożywki hodowlanej na EB. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. 
		UWAGA: Pipetę należy kierować w stronę ścianek studzienki stożkowej o średnicy 96 V z dnem w kształcie litery V, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Unikaj pobierania jakichkolwiek organoidów podczas zmiany podłoża.</li>
		<li>Przeprowadzić połowę średniej zmiany w dniu 9, dniu 12 i dniu 15. Zastąp połowę pożywki świeżym gfCDM, aby stopniowo rozcieńczać BMP4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień 18 - Długotrwała hodowla NR
	<ol>
		<li>W 18 dniu ostrożnie przenieś uformowane EB do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml za pomocą pipet Pasteura o pojemności 5 ml i delikatnie spłucz ponownie NRDM. Przenieś EB na płytki 6- lub 24-dołkowe o niskiej adsorpcji (patrz tabela materiałów). Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.</li>
		<li>Co 3 dni wymieniaj pożywkę na świeży NRDM. 
		UWAGA: Wyłącz światło podczas wymiany medium, ponieważ RA jest wrażliwy na światło. Usuń źle zróżnicowane organoidy i oddziel przylegające organoidy pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza ludzkich NR
<ol>
	<li>Montaż RO
	<ol>
		<li>Wybierz różne generacje H9-ESC, aby wywołać trzy partie RO. 
		UWAGA: Trzy tabliczki z liczbą tworzących NR dla każdej z trzech ocenianych metod (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 oraz zmodyfikowana metoda w niniejszym badaniu) są obliczane w celu oceny wskaźnika powodzenia indukcji. Indukcja jest uważana za udaną, jeśli mikroskopia świetlna ujawni tworzenie się struktur przypominających nabłonek nerwowy w 30 dniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne RO
	<ol>
		<li>Przenieś 3-5 RO do probówek o pojemności 1,5 ml. Odpipetować nadmiar pożywki i raz umyć RO 1 ml DPBS w temperaturze pokojowej. Pozwól RO zatonąć i ostrożnie wyjmij DPBS. Dodać 1 ml 4% paraformaldehydu (patrz tabela materiałów) na probówkę o pojemności 1,5 ml i utrwalić w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: RO w dniu 6 i dniu 18, fix 2 h. Poprawka na 12 godzin w dniu 30 i 14 godzin w dniu 60.</li>
		<li>Po utrwaleniu odwodnić za pomocą alkoholu gradientowego. Pozostaw RO na 15 minut w 50%, 60% i 70% alkoholu, a następnie na 10 minut w 80%, 90%, 95%, 100% i 100% alkoholu. Następnie dodaj mieszaninę 1:1 100% alkoholu i ksylenu przez 10 minut, a następnie ksylen dwa razy po 10 minut.</li>
		<li>Umieść RO w metalowych foremkach wypełnionych stopionym paraplastem (patrz Tabela Materiałów) na 40 minut, a następnie schładzaj formy na lodzie, aby utrwalić RO. Umieść pudełka do zatapiania w foremkach i zamroź je w temperaturze -20 °C przez noc. Następnie ostrożnie odłącz pudełka do osadzania. Na koniec przechowuj je w RT.</li>
		<li>Twórz ciągłe sekcje (o grubości 5 μm) za pomocą krajalnicy do parafiny. Przymocuj plastry do szkiełek mikroskopu adhezyjnego, wysusz i przechowuj w temperaturze RT.</li>
		<li>Wykonaj deparafinację i ponowne nawodnienie przed naprawą antygenu12,27.</li>
		<li>Dodać 10 ml 20x roztworu do odzyskiwania antygenu cytrynianowego o pH 6,0 (patrz tabela materiałów) do 190 ml ddH2O (podwójnie destylowanegoH2O). Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej w trybie wysokim przez 4 minuty, aż się zagotuje. Po dodaniu skrawków parafiny podgrzewaj sekcje w trybie niskim przez 20 minut, aby zakończyć naprawę antygenu.</li>
		<li>Pozwól sekcjom parafiny naturalnie ostygnąć w wentylowanym miejscu, a następnie umieść je w wilgotnej komorze.</li>
		<li>Użyj pisaka (patrz Spis materiałów), aby obrysować sekcje. Inkubować z 0,2% Tritonem X-100 w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby rozbić membrany, a następnie trzykrotnie umyć szkiełka TPBS, po 5 minut każde.</li>
		<li>Blok z 10% surowicą osła rozcieńczoną w DPBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w wilgotnej komorze o objętości 10 μl na obszar barwienia.</li>
		<li>Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w 10% surowicy osła. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w komorze wilgotnościowej. Przemyć próbki trzykrotnie TPBS przez 10 minut każda, aby usunąć niezwiązane przeciwciało. 
		UWAGA: Przeciwciała pierwszorzędowe są następujące: anty-PAX6 (1: 250), anty-SOX2 (1: 200), anty-KI67 (1: 200), anty-CHX10 (1: 200), anty-β tubulina III (1: 250) i anty-NESTIN (1: 200) (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w DPBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Powtórz krok prania z TPBS trzy razy po 10 minut każdy. 
		UWAGA: Przechowywać w ciemności, aby zapobiec wygaszeniu fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego. Przeciwciała drugorzędowe to Alexa Fluor 488 sprzężona z anty-mysią IgG osła i Alexa Fluor 568 skoniugowana z anty-króliczą IgG osła w rozcieńczeniu 1:400 (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Inkubować z DPBS zawierającym DAPI (1:500; patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj trzy razy TPBS po 10 minut.</li>
		<li>Upuść odpowiednią ilość uszczelniacza antyfluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów) na szkiełko i przykryj szkiełkami nakrywkowymi.</li>
		<li>Wizualizacja za pomocą przepływowego analizatora ilościowego komórek tkankowych (patrz tabela materiałów) lub podobnego.</li>
		<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności po analizie mikroskopowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Enhanced 3D Neural Retina Differentiation from Human Embryonic Stem Cells

<ol><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+retina%3A+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the retina: development and disease.</a> Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).</li>
<li>Steinmetz, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+blindness+and+vision+impairment+in+2020+and+trends+over+30+years%2C+and+prevalence+of+avoidable+blindness+in+relation+to+VISION+2020%3A+the+Right+to+Sight%3A+an+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Glob+Health%22%5BJournal%5D)">Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).</li>
<li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%3A+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li>
<li>Singh, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+proliferation+and+retinoblastoma+genesis+in+RB-deficient+human+but+not+mouse+cone+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).</li>
<li>Slijkerman, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+vertebrate+animal+models+for+functional+and+therapeutic+research+on+inherited+retinal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies.</a> Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).</li>
<li>Peng, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+classification+and+comparative+taxonomics+of+foveal+and+peripheral+cells+in+primate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina.</a> Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).</li>
<li>Ribeiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+visual+function+in+advanced+disease+after+transplantation+of+purified+human+pluripotent+stem+cell-derived+cone+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors.</a> Cell Rep. 35 (3), 109022(2021).</li>
<li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li>
<li>Manafi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+and+organ+chips+in+ophthalmology%5BTitle%5D)+AND+%22Ocul+Surf%22%5BJournal%5D)">Organoids and organ chips in ophthalmology.</a> Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%60of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nat Commun. 6, 6286(2015).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nat Commun. 5, 4047(2014).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+a+window+into+human+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: a window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), (2020).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+resveratrol+on+the+ethanol-induced+disruption+of+retinogenesis+in+pluripotent+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids.</a> FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).</li>
<li>Zou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid-derived+C-Kit%28%2B%29%2FSSEA4%28-%29+human+retinal+progenitor+cells+promote+a+protective+retinal+microenvironment+during+transplantation+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents.</a> Nat Commun. 10 (1), 1205(2019).</li>
<li>Mandai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+Retinal+organoid%2Fcells+for+retinal+regeneration+therapies%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review.</a> Regen Ther. 22, 59-67 (2023).</li>
<li>Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+and+organoid+culture+in+research%3A+physiology%2C+hereditary+genetic+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer.</a> Cell Biosci. 12 (1), 39(2022).</li>
<li>Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurological+disorders+in+3D+organoids+using+human-derived+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 640212(2021).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+Retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), 171686(2019).</li>
<li>Sanjurjo-Soriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RA+delays+initial+photoreceptor+differentiation+and+results+in+a+highly+structured+mature+Retinal+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478(2022).</li>
<li>Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+cultivation%2C+differentiation%2C+and+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation.</a> Front Cell Neurosci. 15, 638439(2021).</li>
<li>Zerti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+simple+method+to+enhance+the+generation+of+cone+and+rod+photoreceptors+in+pluripotent+stem+cell-derived+Retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids.</a> Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+Retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Yamasaki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+Chk1+inhibitor+and+BMP4+cooperatively+promotes+retinal+tissue+formation+in+self-organizing+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture.</a> Regen Ther. 19, 24-34 (2022).</li>
<li>Döpper, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+protocol+for+3D+Retinal+organoids%2C+immunostaining+and+signal+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120(2020).</li>
<li>Norrie, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+from+human+stem+cell-derived+Retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids.</a> Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Ludzkie RO mogą przestrzennie i czasowo odtworzyć rozwój siatkówki płodu, a wczesne RO wykazują wysoki stopień podobieństwa do siatkówki płodu na równoważnych etapach rozwoju15. Pod względem morfologii tkanek i ekspresji molekularnej, ludzka RO ściśle odzwierciedla rzeczywisty stan wzrostu tkanki siatkówki, zapewniając ogromne i niespotykane możliwości w dziedzinie modelowania chorób, badań przesiewowych leków i medycyny regeneracyjnej. Obecnie ustalono kilka różnych metod generowania RO z ludzkic...

Oko służy jako główne źródło informacji między ludzkimi narządami zmysłów, a siatkówka jest główną tkanką czuciową w oczach ssaków1. Retinopatia jest jedną z głównych globalnych przyczyn chorób oczu, prowadzącą do ślepoty2. Około 2,85 miliona ludzi na całym świecie cierpi na różnego stopnia upośledzenie wzroku z powodu retinopatii3. W związku z tym badanie jego patogenezy ma kluczowe znaczenie dla wczesnej diagnozy i szybkiego leczenia. Większość badań nad ludzką retinopatią koncentrowała się przede wszystkim na modelach zwierzęcych4,5,6. Jednak ludzka siatkówka jest złożoną, wielowarstwową tkanką składającą się z różnych typów komórek. Tradycyjne dwuwymiarowe (2D) hodowle komórkowe i systemy modeli zwierzęcych zazwyczaj nie są w stanie wiernie odtworzyć normalnego rozwoju czasoprzestrzennego i metabolizmu leków rodzimej ludzkiej siatkówki7,8.
Ostatnio, techniki hodowli 3D rozwinęły się do generowania tkanek podobnych do organów z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC)9,10. Organoidy siatkówki (RO) generowane z ludzkich PSC w systemie hodowli zawiesinowej 3D nie tylko zawierają siedem typów komórek siatkówki, ale także wykazują wyraźną strukturę warstwową podobną do ludzkiej siatkówki in vivo11,12,13. Ludzkie RO pochodzące z PSC zyskały popularność i powszechną dostępność i są obecnie najlepszymi modelami in vitro do badania rozwoju i choroby ludzkiej siatkówki14,15. W ciągu ostatnich kilku dekad wielu badaczy wykazało, że ludzkie PSC, w tym embrionalne komórki macierzyste (ESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), mogą różnicować się w RO przy użyciu różnych protokołów indukcji. Postępy te mają ogromny potencjał w retinopatii w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i terapiach opartych na komórkach macierzystych16,17,18.
Jednak generowanie siatkówki nerwowej (NR) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) jest skomplikowanym, kłopotliwym i czasochłonnym procesem. Co więcej, różnice w organoidach tkankowych między partiami mogą prowadzić do mniejszej odtwarzalności wyników19,20. Liczne czynniki wewnętrzne i zewnętrzne mogą wpływać na wydajność organoidów siatkówki (RO), takich jak liczba lub gatunek komórek wyjściowych oraz wykorzystanie czynników transkrypcyjnych i związków małocząsteczkowych21,22,23. Odkąd pierwsza ludzka RO została wygenerowana przez laboratorium Sasai11, na przestrzeni lat zaproponowano wiele modyfikacji w celu zwiększenia łatwości i skuteczności procesu indukcji13,21,24,25. Niestety, do tej pory nie ustanowiono złotego standardu dla generowania RO we wszystkich laboratoriach. Rzeczywiście, istnieje pewien stopień rozbieżności w RO wynikający z różnych metod indukcji, a także duże zróżnicowanie w ekspresji markerów siatkówki i odporności ich struktury22,26. Kwestie te mogą poważnie skomplikować pobieranie próbek i interpretację wyników badania. W związku z tym potrzebny jest bardziej skonsolidowany i solidny protokół różnicowania, aby zmaksymalizować wydajność przy minimalnej heterogeniczności wytwarzania RO.
To badanie opisuje zoptymalizowany protokół indukcji oparty na kombinacji Kuwahara et al.12 i Döpper et al.27 ze szczegółowymi instrukcjami. Nowa metoda znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo pęcherzyków organoidowych i fuzji, zwiększając wskaźnik powodzenia generowania NR. Odkrycie to jest bardzo obiecujące dla modelowania chorób, badań przesiewowych leków i terapii komórkowej w zaburzeniach siatkówki.

<table><tbody><tr><td>0,01 M TPBS</td><td>Servicebio</td><td>G0002</td><td>Plastry do prania</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td>Servicebio</td><td>G1101-500ML</td><td>Napraw organoidy siatkówki</td></tr><tr><td>5 ml Pipeta Pasteura</td><td>NEST</td><td>Biotechnology 318516</td><td>Organoidy siatkówki</td></tr><tr><td>96 studzienek stożkowych z dnem w kształcie litery V</td><td>Sumitomo Bakelit</td><td>MS-9096VZ</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe adhezyjne</td><td>CITOTEST</td><td>188105</td><td>Plastry Fix</td></tr><tr><td>AggreWell medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5893</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Etanol bezwodny</td><td>SINOPHARM</td><td>10009218</td><td>Odwodnienie&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-CHX10</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365519</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Roztwór przeciw blaknięciu</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9556</td><td></td></tr><tr><td>Anty-KI67</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>anty-NESTIN</td><td>Sigma</td><td>N5413</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Antyneuronalna klasa III &beta;-tubulina (TUJ1)</td><td>Beyotime</td><td>AT809</td><td>Przeciwciało</td></tr> <tr>pierwszorzędowe<td>Anty-PAX6</td><td>Abcam</td><td>ab195045</td><td>Pierwotne przeciwciało</td></tr><tr><td>Roztwór dysocjacji komórek (CDS)</td> <td>STEMCELL Technologie</td><td>7922</td><td>Dysocjacja komórek</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleckchem</td><td>S2924</td><td>Inhibitor GSK-3 i alfa;/&beta;</td></tr><tr><td>Koncentrat lipidowy cholesterolu</td><td>Gibco</td><td>12531018</td><td>250 razy;</td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania antygenu cytrynianowego</td><td>Servicebio</td><td>G1202-250ML</td><td>20&razy;, pH 6,0</td></tr><tr><td>CS10</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>1001061</td><td>Medium do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>Jądrowy przeciwbarwnik</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td> <td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>Medium</td></tr><tr><td>DMEM/F12-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32766</td><td>Przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Osioł anty-Rabbit Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Biosharp</td><td>BL518A</td><td>0,5 M, pH 8,0, dysocjacja komórek</td></tr><tr><td>Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Płytki powlekające</td></tr><tr><td>F12-Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31765035</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>Przepływowy analizator ilościowy komórek tkankowych</td><td>TissueGnostics</td><td>TissueFAXS Plus</td><td>Sekcje skanowania</td></tr><tr><td>IMDM-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31980030</td><td>Medium</td></tr><tr><td>IWR1-endo</td><td>Selleckchem</td><td>S7086</td><td>Inhibitor Wnt</td></tr><tr><td>KnockOut Wymiana surowicy</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189 2HCl</td><td>Selleckchem</td><td>S7507</td><td>BMP-inhibitor</td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe o niskiej przyczepności</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe o niskiej przyczepności</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże konserwacyjne (MM)</td><td>STEMCELL Technologie</td><td>85850</td><td>Średni</td></tr><tr><td>suplement N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Solarbio</td><td>SL050</td><td>Bufor blokujący</td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td>Tkanka zatapiająca</td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 podstawowa (1x)</td> <td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td>Bez Ca+,Mg+</td></tr><tr><td>Rekonstanant białka morfogenetycznego ludzkiej kości-4 (rhBMP4)</td> <td>R& D</td><td>314-BP</td><td>Kluczowy czynnik białkowy</td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Proszek, przechowywać z dala od światła</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td>Inhibitor ALK5</td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Selleckchem</td><td>S7667</td><td>Inhibitor kinazy tyrozynowej</td></tr><tr><td>Super PAP Pen</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9305</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma</td><td>T0625-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tioglycerol</td><td>Sigma</td><td>M1753</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Permeabilizacja</td></tr><tr><td>WA09 linia embrionalnych komórek macierzystych</td> Instytut <td></td><td>Badawczy WiCell</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>SINOPHARM</td><td>10023418</td><td>Deparafiing</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCL</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td>ROCK-inhibitor</td></tr></tbody></table>

generowanie siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopatia jest jedną z głównych przyczyn ślepoty na całym świecie. Badanie jego patogenezy jest niezbędne do wczesnej diagnozy i szybkiego leczenia retinopatii. Niestety, bariery etyczne utrudniają zbieranie dowodów od ludzi. Ostatnio liczne badania wykazały, że ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) mogą być różnicowane w organoidy siatkówki (RO) przy użyciu różnych protokołów indukcji, które mają ogromny potencjał w retinopatii w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i terapiach opartych na komórkach macierzystych. W badaniu tym opisano zoptymalizowany protokół indukcji w celu wygenerowania siatkówki nerwowej (NR), który znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo pęcherzyków i fuzji, zwiększając wskaźnik sukcesu produkcji do 60 dnia. Opierając się na zdolności PSC do samoreorganizacji po dysocjacji, w połączeniu z pewnymi czynnikami uzupełniającymi, ta nowa metoda może w szczególności napędzać różnicowanie NR. Co więcej, podejście to jest nieskomplikowane, opłacalne, wykazuje znaczną powtarzalność i wydajność, przedstawia zachęcające perspektywy dla spersonalizowanych modeli chorób siatkówki i zapewnia obfity rezerwuar komórek do zastosowań takich jak terapia komórkowa, badania przesiewowe leków i testowanie terapii genowej.

Graficzny przegląd zmodyfikowanego protokołu przedstawiono na Rysunku 1. H9-ESC zostały wykorzystane do generowania RO, gdy komórki osiągnęły gęstość 70%-80%. Zawiesiny pojedynczych komórek H9-ESC w 96-dołkowych stożkowych studzienkach o dnie w kształcie litery V uległy agregacji w 1. dniu i do 6. dnia utworzyły wyraźnie odgraniczone, okrągłe EB. Wraz z wydłużeniem czasu hodowli objętość EB stopniowo wzrastała. W 30. dniu, podczas długotrwałej różnicowania NR, wyraźnie uformowały się i pogru...

Obecny protokół opisuje zoptymalizowany system 3D do indukcji siatkówki neuronalnej, który zmniejsza adhezję i fuzję organoidów siatkówki z wysoką powtarzalnością i wydajnością.

Generowanie siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

Nasza grupa koncentruje się na zrozumieniu patogenezy i leczenia chorób siatkówki u ludzi. Nasz protokół opisuje zoptymalizowaną technikę indukcji w celu wygenerowania siatkówki nerwowej, która znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo eskalacji i fuzji w celu zwiększenia wskaźnika sukcesu produkcji siatkówki aż do śmierci 60. Zmodyfikowana metoda jest prostsza i bardziej wydajna w generowaniu siatkówki nerwowej, która może okazać się lepszym modelem choroby do badań przesiewowych leków i terapii komórkowej.W przyszłości zamierzamy zbadać wpływ fizycznych czynników chemicznych na rozwój siatkówki i mechanizmy leżące u jej podstaw przy użyciu naszego modelu organoidów siatkówki. Na początek dodaj jeden mililitr 1% macierzy zewnątrzkomórkowej do każdej studzienki 6-dołkowej płytki. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla.Po godzinie dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanej pożywki konserwacyjnej zawierającej 0,4 mikromola Y-27632 do każdej studzienki. Aby rozmrozić embrionalne komórki macierzyste H9, potrząsaj bulionem kriowialnym w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 sekund. Ostrożnie wysterylizuj kriowial za pomocą 75% dezynfekującego alkoholu w sprayu.Następnie przenieś rozmrożone komórki do 15-mililitrowej probówki zawierającej pożywkę konserwacyjną i Y-27632. Odwirować probówkę o sile 190 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie usuń większość supernatantu i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze pożywki konserwacyjnej zawierającej Y-27632.Dozować 0,5 mililitra zawiesiny komórkowej do każdej studzienki płytki pokrytej matrycą zewnątrzkomórkową zawierającej pożywkę konserwacyjną. Potrząśnij płytką bokiem i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez co najmniej 24 godziny. Zmieniaj podłoże codziennie.Gdy gęstość klonu osiągnie 70%, usuń zużyte podłoże. Po dwóch płukaniach DPBS inkubować komórki z jednym mililitrem EDTA przez cztery do siedmiu minut w temperaturze pokojowej i całkowicie odrzucić EDTA. Dodaj jeden mililitr pożywki konserwacyjnej do komórek i delikatnie postukaj w płytkę.Następnie przenieś usunięte komórki do 15-mililitrowej probówki i wymieszaj je trzy do pięciu razy. Dodaj od 20 do 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka wcześniej przygotowanego naczynia pokrytego ECM i dobrze wymieszaj. Za pomocą mikroskopu potwierdź gęstość komórek i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod 5% dwutlenkiem węgla.Na początek rozmrozić i wyhodować H9-embrionalne komórki macierzyste w pożywce podtrzymującej zawierającej Y-27632. W dniu zero, gdy kolonie osiągną 70% zlewania się, umyj je dwoma mililitrami DPBS. Następnie inkubuj komórki z 0,5 mililitra roztworu dysocjacji komórek, zawierającego 20 mikromoli na litr Y-27632.Aby przerwać trawienie, dodaj trzy mililitry pożywki podtrzymującej zawierającej 20 mikromoli na litr Y-27632. Aby rozwinąć komórki, odwirować probówkę o stężeniu 190 G przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze chemicznie zdefiniowanego podłoża wolnego od czynnika wzrostu z Y-27632.Po policzeniu komórek dodaj 1,2 miliona komórek do 10 mililitrów chemicznie zdefiniowanego podłoża bez czynnika wzrostu i dobrze wymieszaj. Następnie dozować 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki 96-dołkowej stożkowej płytki dolnej. Inkubować w wilgotnej atmosferze 5% dwutlenku węgla.Aby wywołać tworzenie się siatkówki w szóstym dniu, dodaj BMP4 zawierającą pożywkę do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i ponownie inkubuj w 9, 12 i 15 dniu. Zastąp połowę zużytego podłoża świeżym podłożem bez BMP4. W dniu 18 ostrożnie przenieś uformowane ciała zarodkowe do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.Po naturalnym wytrąceniu się ciał zarodkowych należy delikatnie usunąć supernatant i przepłukać je pożywką do różnicowania siatkówki nerwowej. Następnie umieść ciała zarodków na 6-dołkowej płytce o niskiej absorpcji i ponownie inkubuj płytkę. W 21 dniu obrazy w jasnym polu wykazały ciągłą strukturę nabłonka nerwowego w siatkówce nerwowej wygenerowaną tą metodą.Wskaźnik powodzenia indukcji siatkówki był znacznie wyższy, a organoidy siatkówki wygenerowane przy użyciu tego protokołu były podobne pod względem wielkości i morfologii w porównaniu z innymi metodami.

generating-neural-retina-from-human-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda wykorzystuje kombinację czynników wzrostu i małych cząsteczek do skierowania różnicowania komórek macierzystych w niedojrzałe RPE w ciągu czternastu dni i dojrzałe, funkcjonalne RPE po trzech miesiącach.

Szybkie, ukierunkowane różnicowanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z ludzkich embrionalnych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Produkcja wyspecjalizowanych komórek siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych jest punktem zwrotnym w rozwoju terapii chorób siatkówki opartej na komórkach macierzystych. W niniejszej pracy opisano prostą metodę wydajnego generowania organoidów siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki do badań podstawowych, translacyjnych i klinicznych.

Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC

Opisujemy metodę inżynierii tkanki siatkówki składającej się z komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych hodowanych na ludzkich błonach owodniowych i jej przygotowania do szczepienia na modelach zwierzęcych.

Inżynieria Odpowiednia do przeszczepu tkanka nabłonka barwnikowego siatkówki pochodząca z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Korzystając z metody samoorganizacji, opracowujemy protokół z dodatkiem COCO, który może znacznie zwiększyć generowanie fotoreceptorów.

Ukierunkowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy zoptymalizowany system indukcji organoidów siatkówki, który jest odpowiedni dla różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do generowania tkanek siatkówki o wysokiej powtarzalności i wydajności.

System indukcji organoidów siatkówki do wyprowadzania tkanek siatkówki 3D z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje efektywną metodę różnicowania hiPSC w klastry pola gałkowego i generowania organoidów neuro-siatkówkowych przy użyciu uproszczonych warunków hodowli obejmujących zarówno systemy hodowli adherentnych, jak i zawiesinowych. Inne typy komórek oka, takie jak RPE i nabłonek rogówki, można również wyizolować z dojrzałych pól ocznych w hodowlach siatkówki.

Wytwarzanie organoidów siatkówki ze zdrowych i specyficznych dla choroby siatkówki pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Poznaj zoptymalizowaną metodę indukcji siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Technika zmniejsza adhezję i fuzję organoidów, zwiększając powtarzalność produkcji modeli do badań chorób siatkówki i terapii komórkowej.

Generowanie siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów