AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Sekwencjonowanie AQRA ilościowo mapuje małe RNA, takie jak mikroRNA, tRNA i fragmenty tRNA w praktycznie każdej próbce komórki lub tkanki. Może być używany do mapowania niektórych ze 170 znanych modyfikacji tRNA, ale istnieją inne metody, które są bardziej specyficzne dla mapowania. Za pomocą AQRNA-Seq można odkryć biomarkery choroby w RNO i zbadać mechanizmy translacji białek na poziomie systemów.

Większość metod sekwencjonowania RNA nie jest w stanie dokładnie określić ilościowo obfitości pojedynczych cząsteczek RNA w próbce. Jest to spowodowane zarówno właściwościami strukturalnymi RNA, takimi jak struktury drugorzędowe, modyfikacje potranskrypcyjne, jak i biochemią przygotowania biblioteki, takimi jak tysiąckrotne odchylenia ligacji indukowane przez końcowe nukleotydy na RNA. AQRNA-Seq został opracowany w celu przezwyciężenia kilku technicznych i biologicznych wyzwań ograniczających dokładną kwantyfikację obfitości RNA w próbce.

W porównaniu z innymi zagadnieniami, a osiąga liniowość między rekonesansem a liczbą kopii cząsteczek RNA, dokładnie określa ilościowo 75% biblioteki referencyjnej kompresującej 963 mikroRNA z podwójną dokładnością. AQRNA-Seq jest unikalny w zapewnianiu absolutnej kwantyfikacji małych RNA. Łączy to przeliczanie sekwencjonowania bezpośrednio z liczbą kopii cząsteczki RNA w próbce.

Ten poziom dokładności ma kluczowe znaczenie dla porównywania dziesiątek do setek tRNA w próbce i różni się od zwykłego małego sekwencjonowania RNA, które pozwala tylko na względną kwantyfikację w różnych warunkach i próbkach. Zaprojektowaliśmy AQRNA-Seq z myślą o niezaspokojonej potrzebie i zrozumieniu translacji białek. Odkryliśmy, że komórki przeprogramowują dziesiątki modyfikacji tRNA i liczbę kopii zmodyfikowanych tRNA, aby umożliwić selektywną translację informacyjnych RNA, które są wzbogacone o kodony pasujące do tych tRNA.

AQRNA-Seq pozwala nam określić ilościowo zmiany w puli tRNA w ramach tego mechanizmu. Używaliśmy go intensywnie do walidacji tego nowego modelu translacji białek. Na początek przygotuj 10 mililitrów buforu reakcyjnego 2X AlkB i wysterylizuj przez filtr strzykawkowy o wielkości 0,2 mikrona.

W sterylnej probówce do PCR dodać 20 mikrolitrów łącznika jeden zligowany RNA, 50 mikrolitrów buforu reakcyjnego 2X AlkB, dwa mikrolitry demetylazy AlkB, jeden mikrolitr inhibitora RNazy i 27 mikrolitrów wody wolnej od RNaz w celu przygotowania reakcji trawienia AlkB. Inkubować mieszaninę do wytrawiania AlkB w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby usunąć metylację potranskrypcyjną z RNazy. W celu separacji czystych faz dodaj 50 mikrolitrów wody wolnej od RNaz do reakcji AlkB, a następnie dodaj 100 mikrolitrów mieszaniny fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego.

Potrząsaj probówką przez 10 sekund. Odwirować mieszaninę AlkB o stężeniu 16 000 G przez 10 minut. Przenieś około 140 mikrolitrów górnej wody zawierającej RNA później do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Aby usunąć resztki fenolu, dodaj 100 mikrolitrów chloroformu do wyekstrahowanej RNazy i wstrząśnij probówką. Odwirować mieszaninę przy 16 000 G przez 10 minut i przenieść około 120 mikrolitrów górnej warstwy wodnej do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Po reakcji odwrotnej transkrypcji dodaj jeden mikrolitr pięciu molowych wodorotlenków sodu do hybrydy cDNA RNA.

Inkubuj w temperaturze 93 stopni Celsjusza przez trzy minuty, aby hydrolizować nić RNA hybrydy cDNA RNA. Następnie dodaj 0,77 mikrolitra pięciu molowych kwasów solnych, aby zneutralizować reakcję. Przygotuj 3% żel agarozowy w buforze TAE.

Wymieszaj jeden mikrolitr barwnika 6X ładującego z pięcioma mikrolitrami produktu PCR i załaduj żel mieszaniną. Załaduj pięć mikrolitrów drabinek DNA o długości 50 lub 100 par zasad do studzienki przed pierwszą próbką i studzienki po ostatniej próbce. Uruchom elektroforezę żelową przy napięciu 120 woltów i 400 miliamperach przez 75 minut, aby zlokalizować produkty PCR.

Po elektroforezie umieść żel w pudełku i napełnij go wodą dejonizowaną, aż żel zostanie całkowicie zanurzony. Dodaj 10 mikrolitrów bromku etydyny do wody, owiń pudełko folią i bejcuj przez 30 minut na shakerze. Wylać bromek etydyny zawierający wodę do butelki na odpady umieszczonej w dygestorium.

Raz spłucz żel wodą dejonizowaną i wylej wodę do butelki na odpady. Po umyciu żelu wodą dejonizowaną przez 10 minut, użyj imagera do żelu, aby uwidocznić opaski i uzyskać obraz żelu w wysokiej rozdzielczości.