Name: AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Poznaj metodę AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA, takich jak mikroRNA i tRNA. Technika ta umożliwia dokładne badanie zmian w puli tRNA podczas hibernacji Mycobacterium bovis BCG.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy niniejszej pracy są wdzięczni autorom oryginalnego artykułu opisującego technologię AQRNA-seq7. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) oraz National Research Foundation of Singapore za pośrednictwem Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Antimicrobial Resistance IRG.

Analyzing tRNA Dynamics Using AQRNA-seq

<ol><li>Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+RNA+sequencing+into+clinical+diagnostics%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gen%22%5BJournal%5D)">Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges.</a> Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).</li>
<li>Grillone, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+cancer%3A+platforms+and+strategies+for+investigating+the+genomic+%26%2334%3Bdark+matter.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic &#34;dark matter.&#34.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117(2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Goh, J. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+multiplexed+RNA+imaging+in+tissues+with+split-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH.</a> Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Cummings, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+diagnosis+in+Mendelian+disease+with+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing.</a> Sci Transl Med. 9 (386), 5209(2017).</li>
<li>Hu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+the+cellular+small+RNA+landscape+with+AQRNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq.</a> Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).</li>
<li>Alon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+bias+in+high-throughput+multiplex+sequencing+of+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA.</a> Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10 (5), e0126049(2015).</li>
<li>Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cell+stresses+induce+unique+patterns+of+tRNA+up-+and+down-regulation%3A+tRNA-seq+for+quantifying+changes+in+tRNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number.</a> Nuc Acids Res. 42 (22), e170(2014).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+impact+of+RNA+secondary+structure+across+the+Arabidopsis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome.</a> Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).</li>
<li>García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+diversity+is+a+systematic+source+of+variation+in+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data.</a> PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939(2022).</li>
<li>FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastp%3A+an+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%3A+a+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22%5BJournal%5D)">R: a language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2022).</li>
<li>Ougland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlkB+restores+the+biological+function+of+mRNA+and+tRNA+inactivated+by+chemical+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation.</a> Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).</li>
<li>Bernhardt, H. S., Tate, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+soup+or+vinaigrette%3A+did+the+RNA+world+evolve+at+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH.</a> Biol Direct. 7, 4(2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.+J%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
</ol>

P.C.D. jest wynalazcą dwóch patentów (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) związanych z opublikowaną pracą.

Przebieg przygotowania biblioteki AQRNA-seq został zaprojektowany tak, aby zmaksymalizować wychwytywanie RNA w próbce i zminimalizować spadek polimerazy podczas odwrotnej transkrypcji7. Poprzez dwuetapową ligację łącznikową, nowe oligonukleotydy DNA (Linker 1 i Linker 2) są ligowane w nadmiarze, aby w pełni uzupełnić RNA w próbce. Nadmiar łączników można skutecznie usunąć za pomocą RecJf, egzonukleazy od 5 'do 3' specyficznej dla jednoniciowych DNA, pozostawiając nienaruszone produkty ligowane. Po...

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), znane również jako sekwencjonowanie masowo równoległe, to technologia sekwencjonowania DNA, która obejmuje fragmentację DNA, ligację oligonukleotydów adaptorowych, amplifikację opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), sekwencjonowanie DNA i ponowne składanie sekwencji fragmentów w genom. Adaptacja NGS do sekwencji RNA (sekwencja RNA) to potężne podejście do identyfikacji i ilościowego określania transkryptów RNA i ich wariantów1. Innowacyjne osiągnięcia w procesach przygotowywania bibliotek RNA i potokach analizy bioinformatycznej, w połączeniu z postępem w oprzyrządowaniu laboratoryjnym, poszerzyły repertuar aplikacji sekwencyjnych RNA, przechodząc poza sekwencjonowanie egzomu do zaawansowanej funkcjonalnej omiki, takiej jak profilowanie RNA bez kodowania2, analiza pojedynczych komórek3, transkryptomika przestrzenna4,5, alternatywne łączenie analysis6, między innymi. Te zaawansowane metody sekwencjonowania RNA ujawniają złożone funkcje RNA poprzez analizę ilościową transkryptomu w normalnych i chorych komórkach i tkankach.
Pomimo tych postępów w sekwencjonowaniu RNA, kilka kluczowych cech technicznych ogranicza ilościową moc tej metody. Podczas gdy większość metod sekwencjonowania RNA pozwala na precyzyjną i dokładną kwantyfikację zmian poziomów RNA między zmiennymi eksperymentalnymi (tj. próbkami biologicznymi i/lub stanami fizjologicznymi), nie mogą one zapewnić ilościowych porównań poziomów cząsteczek RNA w próbce. Na przykład większość metod sekwencjonowania RNA nie może dokładnie określić ilościowo względnej liczby kopii pojedynczych cząsteczek izoakceptora tRNA w puli komórkowej wyrażonych tRNA. Jak podkreślono w publikacji towarzyszącej7, to ograniczenie do sekwencjonowania RNA wynika z kilku cech struktury RNA i biochemii przygotowania biblioteki. Na przykład na aktywność enzymów ligacyjnych używanych do przyłączania łączników sekwencjonowania końca 3' i 5' do cząsteczek RNA duży wpływ ma tożsamość końcowych nukleotydów RNA i łączników sekwencjonowania. Prowadzi to do dużych różnic w wydajności ligacji łączników i głębokiego wzrostu liczby odczytów sekwencjonowania8,9,10.
Drugi zestaw ograniczeń wynika z nieodłącznych właściwości strukturalnych cząsteczek RNA. W szczególności tworzenie drugorzędowej struktury RNA i dynamiczne zmiany w dziesiątkach potranskrypcyjnych modyfikacji RNA epitranskryptomu mogą powodować spadek lub mutację polimerazy podczas odwrotnej transkrypcji. Błędy te skutkują niekompletną lub skróconą syntezą cDNA lub zmienioną sekwencją RNA. Chociaż oba te zjawiska można wykorzystać do mapowania struktur drugorzędowych lub pewnych modyfikacji, pogarszają one ilościową dokładność sekwencji RNA, jeśli kolejne etapy przygotowania biblioteki nie zdołają uchwycić obciętych cDNA lub jeśli przetwarzanie danych wyrzuca zmutowane sekwencje niepasujące do referencyjnego zestawu danych11,12. Co więcej, ogromna różnorodność chemiczna, długotrwała i strukturalna transkryptów RNA, a także brak narzędzi do jednolitej fragmentacji długich RNA, zmniejsza możliwość zastosowania większości metod sekwencjonowania RNA do wszystkich gatunków RNA13.
Metoda AQRNA-seq (sekwencjonowanie RNA w absolutnej kwantyfikacji) została opracowana w celu usunięcia kilku z tych technicznych i biologicznych ograniczeń, które ograniczają dokładność ilościową7. Minimalizując zależne od sekwencji odchylenia w wychwytywaniu, ligacji i amplifikacji podczas przygotowywania biblioteki sekwencjonowania RNA, AQRNA-seq osiąga lepszą liniowość w porównaniu z innymi metodami, dokładnie określając ilościowo 75% biblioteki referencyjnej 963 miRNA z 2-krotną dokładnością. Ta liniowa korelacja sekwencjonowania, liczby odczytów i obfitości RNA jest również obserwowana w analizie puli oligonukleotydów o zmiennej długości oraz w odniesieniu do metod ortogonalnych, takich jak northern blotting. Ustalenie liniowości między sekwencjonowaniem, liczbą odczytów a obfitością RNA umożliwia AQRNA-seq osiągnięcie dokładnej, bezwzględnej kwantyfikacji wszystkich gatunków RNA w próbce.
Oto opis protokołu do przygotowania biblioteki AQRNA-seq i towarzyszącego mu potoku analizy danych. Metodę zastosowano w celu wyjaśnienia dynamiki liczebności tRNA podczas stanu spoczynku wywołanego głodem, a następnie reanimacji w modelu gruźlicy Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG). Wyniki przedstawiono w celu eksploracyjnej wizualizacji danych sekwencjonowania, wraz z późniejszymi analizami grupowania i różnicowej ekspresji, które ujawniły dostrzegalne wzorce obfitości tRNA związane z różnymi fenotypami.

<table><tbody><tr><td>2-ketoglutaran&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75890</td><td>Przygotować roztwór roboczy (1 M) i przechowywać go w temperaturze -20&ordm; C</td></tr><tr><td>2100 Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>5'-trifosforan adenozyny (ATP)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (składnik #: N0437AVIAL)</td><td>NEB M0437M zawiera ligazę T4 RNA 1 (30 U/&mu; L), bufor reakcyjny ligazy RNA T4 (10X), PEG 8000 (1X) i ATP (100 mM); przygotować roztwór roboczy (10 mM) i przechowywać go w temperaturze -20&ordm; C</td></tr><tr><td>AGAROZA GPG/LE</td><td>AmericanBio</td><td>AB00972-00500</td><td>Przechowywać w temperaturze otoczenia</td></tr><tr><td>Sześciowodny siarczan amonu żelaza(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2262</td><td>Przygotować roztwór roboczy (0,25 M) i przechowywać go w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Bioanalyzer Analiza małego RNA</td><td>Agilent</td><td>5067-1548&nbsp;</td><td>Analiza małego RNA służy do sprawdzania jakości wejściowych RNA i wydajności reakcji enzymatycznych (np. ligacja Linker 1)</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA; 10 mg/ml)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000</td><td>Ten produkt został wycofany z produkcji 15.12.2022 r. i został zastąpiony albuminą rekombinowaną, klasy biologii molekularnej (NEB B9200).</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4441-10</td><td></td></tr><tr><td>Demetylaza&nbsp;</td>Demetylaza <td>ArrayStar</td><td>AS-FS-004</td><td>jest dostarczana z obróbką wstępną tRNA rtStar i Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA (AS-FS-004)</td></tr><tr><td>Mieszanina roztworów deoksynukleotydów (dNTP)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L (składnik #: N0447LVIAL)</td><td>Ta mieszanina roztworów dNTP zawiera równomolowe stężenia dATP, dCTP, dGTP i dTTP (po 10 mM)</td></tr><tr><td>Cyfrowy podwójny blok grzewczy</td><td>VWR Scientific Products</td><td>13259-052</td><td>Blok grzewczy jest używany z QIAquick&nbsp; Zestaw do ekstrakcji żelu&nbsp;</td></tr><tr><td>Barwnik Ex&nbsp; Zestaw wirowania 2.0&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>63204&nbsp;</td><td>Skuteczny w usuwaniu krótkich pozostałości (np. oligonukleotydów o długości mniejszej niż 10 pz)</td></tr><tr><td>Zasilanie do elektroforezy</td> Probówki <td>Bio-Rad</td><td>PowerPac 300</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR (0,5 ml)</td><td>Probówki Eppendorf</td><td>0030124537</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock (0,5 ml)</td><td>Probówki Eppendorf</td><td>022363611</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock (1,5 ml)</td><td>Probówki Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock (2 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy (etanol), czysty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023&nbsp;</td><td>Czysty etanol jest używany z zestawem Oligo Clean and Concentrator Kit firmy Zymo Research</td></tr><tr><td>Gel Imaging System</td><td>Alpha Innotech</td><td>FluorChem 8900</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Dye, fioletowy (6X), bez SDS</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (składnik #: B7025SVIAL)</td><td>NEB N0556S zawiera Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder i Gel Loading Dye, fioletowy (6X), bez SDS</td></tr><tr><td>GENESYS 180 Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840-309000</td><td>Spektrofotometr służy do pomiaru stężeń oligonukleotydów przy użyciu prawa Beera</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>Przygotować roztwór roboczy (1 M; pH = 8 z NaOH) i przechowywać go w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)&nbsp;</td><td>Produkty naukowe VWR</td><td>BDH3028&nbsp;</td><td>Przygotować roztwór roboczy (5 M) i przechowywać go w temperaturze otoczenia</td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy (Isopropanol), czysty</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3032-16</td><td>Izopropanol jest używany z QIAquick&nbsp; Zestaw do ekstrakcji żelu&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Przygotować roztwór roboczy (0,5 M) i przechowywać go w temperaturze -20&ordm; C</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2 (10X)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (składnik #: B7002SVIAL)</td><td>NEB M0264L zawiera RecJf (30 U/&mu; L) oraz NEBuffer 2 (10X); Przechowywać w temperaturze -20 & C</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Czysty & Zestaw koncentratora&nbsp;</td><td>Badania Zymo</td><td>D4061&nbsp;</td><td>Przechowywać w temperaturze otoczenia</td></tr><tr><td>PEG 8000 (50% roztwór)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (składnik #: B1004SVIAL)</td><td>NEB M0437M zawiera ligazę T4 RNA 1 (30 U/&mu; L), bufor reakcyjny ligazy RNA T4 (10X), PEG 8000 (1X) i ATP (100 mM); przygotować roztwór roboczy (10 mM) i przechowywać go w temperaturze -20&ordm; C</td></tr><tr><td>Peltier Thermal Cycler</td><td>MJ Research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:choloroform:izoamyl&nbsp; alkohol 25:24:1 pH = 5,2&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J62336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bufor PrimeScript (5X)</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza</td><td>PrimeScript TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAszybki&nbsp; Zestaw do ekstrakcji żelu&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Ten zestaw wymaga bloku grzewczego i izopropanolu do pracy z</td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0551S (składnik #: N0551SVIAL)</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (składnik #: N0556SVIAL)</td><td>NEB N0556S zawiera Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder i Gel Loading Dye, fioletowy (6X), bez SDS</td></tr><tr><td>RecJf&nbsp; (30 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (składnik #: M0264LVIAL)</td><td>NEB M0264L zawiera RecJf (30 U/&mu; L) oraz NEBuffer 2 (10X); Przechowywać w temperaturze -20 & </td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy C (mysi; 40 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>M0314L&nbsp;( składnik #: M0314LVIAL)</td> <td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp; Polimeraza DNA&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 zawiera SeqAMP&nbsp; Polimeraza DNA&nbsp; oraz SeqAMP&nbsp; Bufor PCR (2X)</td></tr><tr><td>SeqAMP&nbsp; Bufor PCR (2X)&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>638509&nbsp;</td><td>TaKaRa 638509 zawiera SeqAMP&nbsp; Polimeraza DNA&nbsp; oraz SeqAMP&nbsp; Bufor PCR (2X)</td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna krewetek (1 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371L&nbsp;( składnik #: M0371LVIAL)</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; S5881</td><td>Przygotować roztwór roboczy (5 M) i przechowywać go w temperaturze otoczenia</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4 (400 U/&mu; L)&nbsp;</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>M0202L&nbsp;( składnik #: M0202LVIAL)NEB</td> <td>M0202L zawiera ligazę DNA T4 (400 U/&mu; L) i bufor reakcyjny ligazy DNA T4 (10X)</td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny ligazy DNA T4 (10X)&nbsp;</td><td>Nowa Anglia Biolabs</td><td>M0202L&nbsp;( składnik #: B0202SVIAL)NEB</td> <td>M0202L zawiera ligazę DNA T4 (400 U/&mu; L) i bufor reakcyjny ligazy DNA T4 (10X)</td></tr><tr><td>Ligaza RNA T4 1 (30 U /&mu; L)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (składnik #: M0437MVIAL)</td><td>NEB M0437M zawiera ligazę RNA T4 1 (30 U/&mu; L), bufor reakcyjny ligazy RNA T4 (10X), PEG 8000 (1X) i ATP (100 mM)</td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny ligazy RNA T4 (10X)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (składnik #: B0216SVIAL)</td><td>NEB M0437M zawiera ligazę T4 RNA 1 (30 U/&mu; L), bufor reakcyjny ligazy RNA T4 (10X), PEG 8000 (1X) i ATP (100 mM)</td></tr></tbody></table>

aqrna-seq do ilościowego oznaczania małych rna

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq zapewnia bezpośrednią liniową zależność między liczbą odczytów sekwencjonowania a małą liczbą kopii RNA w próbce biologicznej, umożliwiając w ten sposób dokładną kwantyfikację puli małych RNA. Opisana tutaj procedura przygotowania biblioteki AQRNA-seq obejmuje użycie specjalnie zaprojektowanych łączników sekwencjonowania i etapu redukcji modyfikacji metylacji RNA, które blokują procesywność odwrotnej transkrypcji, co skutkuje zwiększoną wydajnością cDNA o pełnej długości. Ponadto przedstawiono szczegółową realizację towarzyszącego pipeline'u bioinformatycznego. Ta demonstracja AQRNA-seq została przeprowadzona poprzez analizę ilościową 45 tRNA w Mycobacterium bovis BCG zebranych w ciągu 5 wybranych dni w ciągu 20-dniowego okresu deprywacji składników odżywczych i 6 dni resuscytacji. W tym miejscu omówione zostaną również bieżące wysiłki na rzecz poprawy skuteczności i rygoru AQRNA-seq. Obejmuje to badanie metod zapobiegania oczyszczaniu żelu w celu złagodzenia problemów z dimerami starterów po amplifikacji PCR oraz zwiększenia udziału odczytów o pełnej długości, aby umożliwić dokładniejsze mapowanie odczytu. Przyszłe ulepszenia AQRNA-seq będą skoncentrowane na ułatwieniu automatyzacji i wysokoprzepustowego wdrożenia tej technologii do ilościowego oznaczania wszystkich małych gatunków RNA w próbkach komórkowych i tkankowych pochodzących z różnych organizmów.

Mycobacterium bovis BCG (bacilli de Calmette et Guérin) szczep 1173P2 w fazie wzrostu wykładniczego poddano serii czasowej (0, 4, 10 i 20 dni) głodzenia nutrientowego, po czym przeprowadzono 6-dniową resuscyjację w pożywce bogatej w składniki odżywcze, zgodnie z metodą opisaną wcześniej przez Hu i wsp.7. Małe RNA wyizolowano z hodowli bakteryjnej, w trzech powtórzeniach biologicznych, w każdym z pięciu wyznaczonych punktów czasowych. Biblioteki Illumina przygotowano zgodnie z opisanym pow...

Bezwzględna kwantyfikacja Sekwencjonowanie RNA (AQRNA-seq) to technologia opracowana do ilościowego określania krajobrazu wszystkich małych RNA w mieszaninach biologicznych. W tym miejscu zademonstrowano zarówno etapy przygotowania biblioteki, jak i przetwarzania danych AQRNA-seq, określając ilościowo zmiany w puli transferu RNA (tRNA) w Mycobacterium bovis BCG podczas spoczynku wywołanego głodem.

AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

Sekwencjonowanie AQRA ilościowo mapuje małe RNA, takie jak mikroRNA, tRNA i fragmenty tRNA w praktycznie każdej próbce komórki lub tkanki. Może być używany do mapowania niektórych ze 170 znanych modyfikacji tRNA, ale istnieją inne metody, które są bardziej specyficzne dla mapowania. Za pomocą AQRNA-Seq można odkryć biomarkery choroby w RNO i zbadać mechanizmy translacji białek na poziomie systemów.Większość metod sekwencjonowania RNA nie jest w stanie dokładnie określić ilościowo obfitości pojedynczych cząsteczek RNA w próbce. Jest to spowodowane zarówno właściwościami strukturalnymi RNA, takimi jak struktury drugorzędowe, modyfikacje potranskrypcyjne, jak i biochemią przygotowania biblioteki, takimi jak tysiąckrotne odchylenia ligacji indukowane przez końcowe nukleotydy na RNA. AQRNA-Seq został opracowany w celu przezwyciężenia kilku technicznych i biologicznych wyzwań ograniczających dokładną kwantyfikację obfitości RNA w próbce.W porównaniu z innymi zagadnieniami, a osiąga liniowość między rekonesansem a liczbą kopii cząsteczek RNA, dokładnie określa ilościowo 75% biblioteki referencyjnej kompresującej 963 mikroRNA z podwójną dokładnością. AQRNA-Seq jest unikalny w zapewnianiu a

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

MikroRNA (miRNA) to szeroko konserwatywna klasa cząsteczek regulatorowych. Tutaj opisujemy metodę klonowania miRNA, która opiera się na dwóch silnych etapach ligacji, po których następuje sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Nasza metoda pozwala na dokładną ocenę ilościową miRNA w całym genomie.

Wysoce wydajna ligacja małych cząsteczek RNA do kwantyfikacji mikroRNA za pomocą sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Dostępny jest protokół do ilościowego oznaczania genów bakteryjnych 16S rRNA i transkryptów z osadów przybrzeżnych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Metodologia obejmuje jednoczesną ekstrakcję DNA i RNA; przygotowanie RNA wolnego od DNA; oraz kwantyfikacja genu 16S rRNA i transkryptu za pomocą RT-q-PCR, w tym konstrukcja krzywej standardowej.

Jednoczesna ekstrakcja DNA-RNA z osadów przybrzeżnych i kwantyfikacja genów i transkryptów 16S rRNA metodą Real-time PCR

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Ten protokół opisuje metodę mapowania końcowych miejsc przetwarzania pre-mRNA 3'.

3' Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania końcowego za pomocą A-seq2

Tutaj opisujemy krok po kroku strategię izolowania małych RNA, wzbogacania mikroRNA i przygotowywania próbek do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Następnie opisujemy, jak przetwarzać odczyty sekwencji i dopasowywać je do mikroRNA za pomocą narzędzi open source.

Kompletny potok do izolowania i sekwencjonowania mikroRNA oraz analizowania ich przy użyciu narzędzi open source

Koliste RNA (circRNA) to niekodujące RNA, które mogą odgrywać rolę w regulacji transkrypcji i pośredniczeniu w interakcjach między białkami. Po dokonaniu oceny różnych parametrów budowy bibliotek sekwencjonowania circRNA, opracowano protokół wykorzystujący przygotowanie biblioteki nici całkowitego RNA ze wstępną obróbką RNazy R i przedstawiono go tutaj.

Identyfikacja kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Prezentowany tutaj jest protokół do laserowego mikrodyparowania (LCM) tkanek roślinnych. LCM to mikroskopowa technika izolowania obszarów tkanki w sposób wolny od zanieczyszczeń. Procedura obejmuje utrwalenie tkanek, zatopienie parafiny, cięcie, ekstrakcję LCM i RNA. RNA jest wykorzystywane w dalszej, specyficznej tkankowo, czasowo rozdzielczej analizie transkryptomów.

Sekwencjonowanie RNA z mikrodysekcją laserową do przestrzennej i czasowej analizy ekspresji genów specyficznych dla tkanek u roślin

Ta praca przedstawia metodę szybkiego i precyzyjnego ilościowego określenia pigmentacji brzucha Drosophila melanogaster za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Metoda ta usprawnia procedury między akwizycją fenotypu a analizą danych i obejmuje montowanie próbek, akwizycję obrazu, ekstrakcję wartości pikseli i pomiar cech.

Kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster

Poznaj metodę AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA, takich jak mikroRNA i tRNA. Technika ta umożliwia dokładne badanie zmian w puli tRNA podczas hibernacji Mycobacterium bovis BCG.

AQRNA-seq do ilościowego oznaczania małych RNA

Przeglądaj więcej filmów