Name: Barwienie czerwienią Picrosiriusa do półilościowej oceny histopatologicznej odkładania się kolagenu w mysich modelach przewlekłego odrzucenia alloprzeszczepu płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T12:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 42 s
Description: Poznaj metodę barwienia czerwienią Picrosiriusa do półilościowej oceny odkładania się kolagenu w modelu przeszczepu płuc u myszy. Technika ta pozwala rozróżnić grube i cienkie włókna kolagenowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Birte Ohm jest wspierana przez-Ottenstein-Program for Clinician Scientists, Faculty of Medicine, University of Freiburg. Steffen U Eisenhardt jest profesorem Uniwersytetu Heisenberga w Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) i wspierał tę pracę osobistymi grantami. Ponadto chcielibyśmy podziękować Sheenie Kreuzaler za jej pomoc techniczną. Rysunek 1 został stworzony z pomocą Biorender.com. Obrazowanie wykonano w Lighthouse Core Facility, który jest częściowo finansowany przez Wydział Medyczny Uniwersytetu we Fryburgu (numery projektów 2023/A2-FOL; 2021/B3-FOL), DKTK i DFG (numer projektu 450392965).

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt są zgodne z zasadami etycznymi 3R w zakresie humanitarnego prowadzenia badań na zwierzętach i zostały zatwierdzone przez lokalną weterynaryjną komisję etyczną (Veterinäramt Kanton Zürich, Szwajcaria, numer badania 45/2014). Podobnie, czytelnicy powinni uzyskać zgodę odpowiednich instytucji przed przeprowadzeniem jakichkolwiek procedur na zwierzętach laboratoryjnych.
1. Pozyskiwanie próbek
<ol>
	<li>Przeprowadzić doświadczenia na zwierzętach zgodnie z indywidualnymi potrzebami i odpowiednią zgodą komisji etycznej. Wszystkie operacje wykonuje jeden mikrochirurg, aby uniknąć dodatkowego wydłużenia czasu niedokrwienia. 
	UWAGA: Aby powtórzyć nasze reprezentatywne wyniki, należy pozyskać od Charles River Laboratories dorosłe samce myszy C57BL/6J, C57BL/10J i BALB/c wolne od specyficznych patogenów o wadze 27-30 g. W przypadku izograftów należy użyć zwierząt C57BL/6J zarówno jako dawców, jak i biorców. W modelu z niewielką niezgodnością (minor mismatch) należy przeszczepić płuca dawcy C57BL/10J biorcom C57BL/6J. W modelu z dużą niezgodnością (major mismatch) należy przeszczepić płuca dawcy BALB/c biorcom C57BL/6J, a po operacji codziennie wstrzykiwać podskórnie cyklosporynę (10 mg/kg/day) i metyloprednizolon (1.6 mg/kg/day)5. Do perfuzji należy użyć roztworu soli fizjologicznej, a płuca pobrać po 8 tygodniach (56 dniach).</li>
	<li>W celu eutanazji zwierzę należy zaintubować cewnikiem 20G i wentylować O2 z dodatkiem 2%-3% izofluranu. Odpowiednią głębokość znieczulenia należy potwierdzić brakiem reakcji na uciśnięcie łapy.</li>
	<li>Wykonać medianową laparosternotomię poprzez nacięcie ściany brzusznej nożyczkami chirurgicznymi i przecięcie wzdłuż mostka w celu odsłonięcia serca. Zidentyfikować żyłę główną dolną oraz uszko lewego przedsionka na podstawie ich lokalizacji anatomicznej.</li>
	<li>W szybkim następstwie przeciąć żyłę główną dolną i uszko lewego przedsionka nożyczkami chirurgicznymi, a następnie przeprowadzić perfuzję zwierzęcia 3-5 mL 0.9% NaCl poprzez pierścień tętnicy płucnej za pomocą strzykawki, aby usunąć całą krew z krążenia płucnego. 
	UWAGA: Eutanazję należy przeprowadzić zgodnie z odpowiednią zgodą etyczną. Można zastosować również inne metody. Zaleca się dokładne usunięcie krwi z krążenia płucnego, co można również osiągnąć poprzez perfuzję po zatrzymaniu krążenia.</li>
	<li>Usunąć perfundowane płuca za pomocą nożyczek.</li>
	<li>W celu konserwacji próbki inkubować w 4% formalinie. Roztwór formaliny wstrzyknąć bezpośrednio do oskrzela i naczyń płucnych. Zanurzyć próbki w formalinie i inkubować przez co najmniej 6 h. 
	UWAGA: W celu napowietrzenia płuca formaliną należy zastosować znormalizowaną procedurę, aby uzyskać porównywalne wyniki. Przykładowe protokoły takich procedur są opublikowane w innych źródłach10,11.</li>
	<li>Przyciąć narząd zgodnie z potrzebami eksperymentalnymi. Przeciąć płuca poprzecznie na pół, aby w jednym przekroju uchwycić wszystkie części drzewa oskrzelowego.</li>
	<li>Przenieść próbki do automatycznego procesora tkanek w celu odwodnienia w serii alkoholi, przejrzystania w ksylolu i zatapiania w parafinie według następującego schematu: 70% etanol, 70% etanol, 80% etanol, 96% etanol, 100% etanol (po 1 h każdy), 100% etanol, 100% etanol, ksylol (po 2 h każdy), ksylol (1 h) oraz parafina 3x przez 2 h.</li>
	<li>Roztopić parafinę i zorientować próbki prawidłowo w kasetkach do zatapiania z polioksymetylenu. Należy zadbać o to, aby próbki były zatopione powierzchnią cięcia skierowaną w dół. Użyć mikrotomu obrotowego do seryjnego wycinania skrawków o grubości 5 µm. Pozostawić preparaty do wyschnięcia na 24 h w temperaturze 37 °C przed dalszą obróbką.</li>
</ol>
2. Deparafinizacja i rehydratacja preparatów woskowych
<ol>
	<li>Usunąć parafinę, inkubując próbki dwukrotnie w 100% ksylolu przez 5 min w każdym cyklu. 
	UWAGA: Ksylol jest łatwopalny i szkodliwy dla zdrowia. Należy go używać wyłącznie pod dygestorium.</li>
	<li>Odwodnij próbki w 100% etanolu, 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i 50% etanolu przez 2 minuty w każdym roztworze. Następnie płucz przez 2 minuty w wodzie destylowanej.</li>
</ol>
3. Barwienie czerwoną picrosyryną
<ol>
	<li>Barwić preparaty przez 8 min w roztworze hemalum Meyera. Płukać preparaty przez 10 min pod bieżącą wodą z kranu.</li>
	<li>Inkubować preparaty przez 1 h w roztworze Picrosirius Red. Jako roztwór Picrosirius Red można zastosować gotowy roztwór barwiący lub 0.1% Direct Red 80 lub Sirius Red F 3B (CI 35780) rozpuszczony w nasyconym kwasie pikrykowym. 
	OSTROŻNIE: Kwas pikrykowy jest łatwopalny i silnie wybuchowy, należy z nim obchodzić się ostrożnie. 
	UWAGA: Dostępnych jest wielu różnych dostawców zestawów do barwienia Picrosirius Red, jak wymieniono w Tabeli Materiałów. Należy zwrócić uwagę na różnice w cenach i metodach barwienia oraz zawsze przestrzegać instrukcji dostawcy. Zaleca się stosowanie wyłącznie zestawów barwiących z konkretnym indeksem koloru dla Sirius Red F 3B (CI 35780).</li>
	<li>Zanurzyć preparaty 5–10 razy w roztworze kwasu octowego (0.5%). Delikatnie potrząsnąć preparatami, aby fizycznie usunąć roztwór.</li>
	<li>Odwodnić preparaty w 95% etanolu, 100% etanolu, 100% etanolu, 100% ksylolu i 100% ksylolu przez 5 min w każdym kroku.</li>
	<li>Zamontować, nakładając jedną kroplę medium montażowego na każdą próbkę i przykrywając szkiełkiem nakrywką. Pozostawić preparaty do wyschnięcia pod dygestorium.</li>
</ol>
4. Digitalizacja i przetwarzanie obrazów
<ol>
	<li>Ustaw próbki pod mikroskopem świetlnym z odpowiednim oprogramowaniem do obrazowania, aż obraz stanie się wyraźny i ostry. Dodaj filtr polaryzacyjny i dostosuj stopień polaryzacji, aż tło stanie się całkowicie ciemne lub czarne. Prawidłową polaryzację osiągnięto, gdy tło jest tak ciemne, jak to tylko możliwe. 
	UWAGA: Barwienie Picrosirius Red można wizualizować również przy użyciu konwencjonalnego światła przechodzącego, bez filtra polaryzacyjnego. W tym celu zaleca się stosowanie Sirius Red z Fast Green, ponieważ wykazano, że jest on bardziej czuły niż sam Sirius Red12,13. Jednakże mikroskopia polaryzacyjna jest niezbędna do rozróżnienia grubych i cienkich włókien kolagenowych.</li>
	<li>Przeskanuj wszystkie próbki w całości przy powiększeniu 20x i wyeksportuj do formatu .tiff. Przenieś pliki do oprogramowania Fiji14. Należy upewnić się, że szkiełka zostały odpowiednio oczyszczone wcześniej, a ustawienia czasu ekspozycji i intensywności źródła światła są zestandaryzowane.</li>
	<li>Obrysuj próbkę ręcznie i wytnij ją w oprogramowaniu, korzystając z opcji Edit &gt; Clear Outside. Zmierz całkowitą powierzchnię, klikając Analyze &gt; Measure. 
	UWAGA: Wybór obszaru do pomiaru jest krytycznym krokiem w uzyskaniu wiarygodnych i porównywalnych wyników. Dzięki cyfryzacji i wybraniu całej próbki wyświetlany jest reprezentatywny przekrój, a tkanki niejednorodne są rozpatrywane jako całość. Można jednak ograniczyć się do konkretnych obszarów w obrębie próbek, takich jak opłucna lub poszczególne oskrzela. Należy pamiętać, aby obszary porównawcze zawsze wybierać w sposób zestandaryzowany. Jeśli próbki wykazują dużą zmienność w wentylacji, zaleca się wykluczenie powierzchni przestrzeni powietrznych z analizowanego obszaru15.</li>
	<li>Zmierz całkowitą zawartość kolagenu na próbkę, korzystając z progowania kolorystycznego poprzez kliknięcie Image &gt; Adjust &gt; Color Threshold, a następnie dostosuj ustawienia, klikając Analyze &gt; Analyze Particles. Ustaw Size = 1 - Infinity, Clear, Summarize. Brightness = 35 - 255. Hue = 2 - 130 
	UWAGA: Odpowiednie ustawienie progów kolorystycznych jest kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników.</li>
	<li>Powtórz procedurę dla grubych i cienkich włókien kolagenowych, dostosowując parametr Hue dla koloru czerwonego <img alt="Symbol w przybliżeniu równe, notacja matematyczna." src="/files/ftp_upload/66395/66395eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> grube włókna kolagenowe (Hue 2-30) oraz żółto-zielonego <img alt="Symbol w przybliżeniu równe, notacja matematyczna." src="/files/ftp_upload/66395/66395eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> cienkie włókna kolagenowe (Hue 31-130). Wynikiem będzie powierzchnia zabarwionych pikseli.</li>
	<li>Skonfiguruj makro do zautomatyzowanego przetwarzania, klikając Plugins &gt; Macros &gt; Record, i powtórz czynność dla wszystkich próbek.</li>
	<li>Aby otrzymać końcowe wartości zestandaryzowane do powierzchni przekroju, podziel powierzchnię zabarwionych pikseli dla wszystkich parametrów przez całkowitą powierzchnię zmierzoną odpowiednio w krokach 4.3 i 4.5 dla każdej próbki.</li>
</ol>

Collagen Assessment in Murine Pulmonary Fibrosis Using Picrosirius Red Staining

<ol><li>Weigt, S., DerHovanessian, A., Wallace, W., Lynch, J., Belperio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchiolitis+Obliterans+Syndrome%3A+The+Achilles%27+heel+of+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bronchiolitis Obliterans Syndrome: The Achilles' heel of lung transplantation.</a> Semin Respir Crit Care Med. 34 (3), 336-351 (2013).</li>
<li>Verleden, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lung+allograft+dysfunction%3A+Definition%2C+diagnostic+criteria%2C+and+approaches+to+treatment-A+consensus+report+from+the+Pulmonary+Council+of+the+ISHLT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Chronic lung allograft dysfunction: Definition, diagnostic criteria, and approaches to treatment-A consensus report from the Pulmonary Council of the ISHLT.</a> J Heart Lung Transplant. 38 (5), 493-503 (2019).</li>
<li>Lama, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+lung+transplant+research%3A+A+consensus+statement+from+the+National+Heart%2C+Lung%2C+and+Blood+Institute+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Models of lung transplant research: A consensus statement from the National Heart, Lung, and Blood Institute workshop.</a> JCI Insight. 2 (9), e93121(2017).</li>
<li>Martinu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+of+chronic+lung+allograft+pathology+in+a+mouse+minor-mismatched+orthotopic+lung+transplant+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Spectrum of chronic lung allograft pathology in a mouse minor-mismatched orthotopic lung transplant model.</a> Am J Transplant. 19 (1), 247-258 (2019).</li>
<li>de Vleeschauwer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+rejection+pathology+after+orthotopic+lung+transplantation+in+mice%3A+The+development+of+a+murine+BOS+model+and+its+drawbacks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chronic rejection pathology after orthotopic lung transplantation in mice: The development of a murine BOS model and its drawbacks.</a> PLoS One. 7 (1), e29802(2012).</li>
<li>Yamada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+airway+fibrosis+in+orthotopic+mouse+lung+transplantation+models-An+experimental+reappraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Chronic airway fibrosis in orthotopic mouse lung transplantation models-An experimental reappraisal.</a> Transplantation. 102 (2), e49-e58 (2018).</li>
<li>Whittaker, P., Kloner, R. A., Boughner, D. R., Pickering, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+myocardial+collagen+with+picrosirius+red+staining+and+circularly+polarized+light%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of myocardial collagen with picrosirius red staining and circularly polarized light.</a> Basic Res Cardiol. 89 (5), 397-410 (1994).</li>
<li>Puchtler, H., Waldrop, F. S., Valentine, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+microscopic+studies+of+connective+tissue+stained+with+picro-sirius+red+FBA%5BTitle%5D)+AND+%22Beitr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Polarization microscopic studies of connective tissue stained with picro-sirius red FBA.</a> Beitr Pathol. 150 (2), 174-187 (1973).</li>
<li>Junqueira, L. C. U., Cossermelli, W., Brentani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+staining+of+collagens+type+I%2C+II+and+III+by+Sirius+Red+and+polarization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Jpn%22%5BJournal%5D)">Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy.</a> Arch Histol Jpn. 41 (3), 267-274 (1978).</li>
<li>Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+and+inflation+of+the+mouse+lung+for+tumor+histology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology.</a> J Vis Exp. (162), e60605(2020).</li>
<li>Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instillation+and+fixation+methods+useful+in+mouse+lung+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Instillation and fixation methods useful in mouse lung cancer research.</a> J Vis Exp. (102), e52964(2015).</li>
<li>Segnani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+detection+of+collagen+fibers+by+Sirius+Red%2FFast+Green+is+more+sensitive+than+van+Gieson+or+Sirius+Red+alone+in+normal+and+inflamed+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Histochemical detection of collagen fibers by Sirius Red/Fast Green is more sensitive than van Gieson or Sirius Red alone in normal and inflamed rat colon.</a> PLoS One. 10 (12), e0144630(2015).</li>
<li>Courtoy, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+analysis+of+Picrosirius+Red+staining%3A+A+robust+method+for+multi-organ+fibrosis+quantification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Digital image analysis of Picrosirius Red staining: A robust method for multi-organ fibrosis quantification and characterization.</a> Biomolecules. 10 (11), 1585(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ségard, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+fibrosis+extend+and+airspace+availability+in+lung%3A+A+semi-automativ+ImageJ%2FFiji+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22PloS%22%5BJournal%5D)">Quantification of fibrosis extend and airspace availability in lung: A semi-automativ ImageJ/Fiji toolbox.</a> PloS. 2 (2), e0298015(2024).</li>
<li>Zhou, X., Moore, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+section+staining+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Lung section staining and microscopy.</a> Bio Protoc. 7 (10), e2286(2017).</li>
<li>Herovici, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picropolychrome%3A+histological+staining+technic+intended+for+the+study+of+normal+and+pathological+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Fr+Etud+Clin+Biol%22%5BJournal%5D)">Picropolychrome: histological staining technic intended for the study of normal and pathological connective tissue.</a> Rev Fr Etud Clin Biol. 8, 88-89 (1963).</li>
<li>Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirius+Red+F3BA+as+a+stain+for+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol%22%5BJournal%5D)">Sirius Red F3BA as a stain for connective tissue.</a> Arch Pathol. 78, 69-72 (1964).</li>
<li>Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+hematoxylin+and+eosin+staining+of+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (6), 655-658 (2014).</li>
<li>Montes, G. S., Junqueira, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+Picrosirius-polarization+method+for+the+study+of+the+biopathology+of+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">The use of the Picrosirius-polarization method for the study of the biopathology of collagen.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 86, Suppl 3 1-11 (1991).</li>
<li>Rittié, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Picrosirius+Red-polarization+detection+of+collagen+fibers+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Method for Picrosirius Red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections.</a> Methods Mol Biol. 1627, 395-407 (2017).</li>
<li>Diehm, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-enriched+hybrid+breast+reconstruction+reduces+risk+for+capsular+contracture+in+a+hybrid+breast+model%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Stem cell-enriched hybrid breast reconstruction reduces risk for capsular contracture in a hybrid breast model.</a> Plast Reconstr Surg. 152 (3), 572-580 (2023).</li>
<li>Rich, L., Whittaker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+and+Picrosirius+Red+staining%3A+A+polarized+light+assessment+of+fibrillar+hue+and+spatial+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Morphol+Sci%22%5BJournal%5D)">Collagen and Picrosirius Red staining: A polarized light assessment of fibrillar hue and spatial distribution.</a> Braz J Morphol Sci. 22 (2), 97-104 (2005).</li>
<li>Datar, U. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathologic+study+of+a+series+of+giant+cell+fibroma+using+picrosirius+red+polarizing+microscopy+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Iran+Med%22%5BJournal%5D)">Clinicopathologic study of a series of giant cell fibroma using picrosirius red polarizing microscopy technique.</a> Arch Iran Med. 17 (11), 746-749 (2014).</li>
<li>Nishat, R., Kumar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fibers+in+oral+submucous+fibrosis+-+A+polarizing+microscopy+study+using+two+special+stains%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Pathol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Collagen fibers in oral submucous fibrosis - A polarizing microscopy study using two special stains.</a> Indian J Pathol Microbiol. 62 (4), 537-543 (2019).</li>
<li>Lattouf, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picrosirius+red+staining%3A+a+useful+tool+to+appraise+collagen+networks+in+normal+and+pathological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues.</a> J Histochem Cytochem. 62 (10), 751-758 (2014).</li>
<li>López De Padilla, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picrosirius+Red+staining%3A+Revisiting+its+application+to+the+qualitative+and+quantitative+assessment+of+collagen+type+I+and+type+III+in+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Picrosirius Red staining: Revisiting its application to the qualitative and quantitative assessment of collagen type I and type III in tendon.</a> J Histochem Cytochem. 69 (10), 633-643 (2021).</li>
<li>Junqueira, L. C. U., Bignolas, G., Brentani, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picrosirius+staining+plus+polarization+microscopy%2C+a+specific+method+for+collagen+detection+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections.</a> Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scar+collagen+deposition+in+the+airways+of+allografts+of+lung+transplant+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Scar collagen deposition in the airways of allografts of lung transplant recipients.</a> Am J Respir Crit Care Med. 155 (6), 2072-2077 (1997).</li>
<li>Astbury, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+computational+quantification+of+liver+fibrosis+is+compromised+by+inherent+staining+variation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Clin+Res%22%5BJournal%5D)">Reliable computational quantification of liver fibrosis is compromised by inherent staining variation.</a> J Pathol Clin Res. 7 (5), 471-481 (2021).</li>
<li>Feingold, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+myocardial+fibrosis+among+healthy+pediatric+heart+transplant+recipients%3A+Correlation+of+histology%2C+cardiovascular+magnetic+resonance%2C+and+clinical+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Transplant%22%5BJournal%5D)">Diffuse myocardial fibrosis among healthy pediatric heart transplant recipients: Correlation of histology, cardiovascular magnetic resonance, and clinical phenotype.</a> Pediatr Transplant. 21 (5), 12986(2017).</li>
<li>vander Ploeg, E. A., Melgert, B. N., Burgess, J. K., Gan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+biomarkers+of+fibrosis+in+chronic+lung+allograft+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Rev+%28Orlando%29%22%5BJournal%5D)">The potential of biomarkers of fibrosis in chronic lung allograft dysfunction.</a> Transplant Rev (Orlando). 35 (3), 100626(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Standardowe metody histologiczne, takie jak hematoksylina i eozyna oraz barwienie trichromowe Massona, są szeroko stosowane do wykrywania zmian zwłóknieniowych w płucach myszy w sposób przestrzennie rozdzielczy 16,19. Jednak często konieczne są dodatkowe metody, aby określić ilościowo te zmiany i ocenić skład kolagenu w tkance.
Barwienie Picrosirius Red zostało po raz pierwszy opisane w 1964 roku w celu identyfikacji kolagenu: pod mikr...

Przeszczep płuc to zdecydowana opcja terapeutyczna dla pacjentów cierpiących na schyłkową chorobę płuc. Jednak długoterminowe przeżycie jest utrudnione przez przewlekłe odrzucenie, które dotyka 50% biorców w ciągu pierwszych pięciu lat po operacji1. Zwłóknienie małych dróg oddechowych i miąższu płuc jest histologiczną cechą charakterystyczną leżącą u podstaw postępującej utraty funkcji płuc w przewlekłym odrzucaniu alloprzeszczepu płuc2. Eksperymentalnie, przewlekłe odrzucenie alloprzeszczepu płuc można modelować za pomocą ortotopowego przeszczepu płuc u myszy między niedopasowanymi szczepami myszy MHC. Zaproponowano różne kombinacje szczepów w celu osiągnięcia fenotypu przewlekłego odrzucenia3. Wśród nich często stosuje się kombinację przeszczepu niewielkiego niedopasowanego dawcy C57BL/10 MHC i biorcy C57BL/64. Alternatywnie, płuca dawcy BALB/c mogą być przeszczepione biorcom C57BL/6 otrzymującym codzienne leczenie immunosupresyjne5. Modele te skutkują histologicznie różnymi stopniami zmian zwłóknieniowych6. Zmiany te są często zgłaszane jakościowo przy użyciu standardowej Hematoksyliny i Eozyny oraz barwienia Trichromem Massona.
Standardowe barwienie histologiczne za pomocą Hematoxyliny i Eozyny pozwala na przegląd próbki, ponieważ zabarwia ona jądra na niebiesko, podczas gdy cytoplazma i włókna kolagenowe wydają się czerwone. W przypadku barwienia trichromem Massona jądra są barwione na czarno, włókna kolagenowe są barwione na zielono do niebieskich, a tło, w tym cytoplazma, fibryna i mięśnie, jest czerwone. Ponieważ bejca Trichrome Massona może prowadzić do zaniżonych wartości, użycie czerwonej plamy Picrosirius jest uważane za korzystne7. Picrosirius Red to liniowy barwnik anionowy, który wiąże się z długimi kationowymi włóknami kolagenowymi i zapewnia bogate w kontrast czerwone zabarwienie. Co więcej, barwienie Picrosirius Red wzmacnia naturalną dwójłomność włókien kolagenowych w świetle spolaryzowanym krzyżowo8. W ten sposób można ocenić grubość włókien kolagenowych i upakowanie. Za pomocą filtra polaryzacyjnego tło ciemnieje i możliwe staje się rozróżnienie grubości osadzonego kolagenu. Podczas gdy grube włókna kolagenowe wydają się czerwone, cienkie włókna kolagenowe stają się zielone pod wpływem polaryzacji. Bezpośredni związek między dwójłomnością a podtypem kolagenu jest często opisywany w literaturze, przy czym dwójłomność czerwona jest przypisana do kolagenu I, a dwójłomność zielona do kolagenu III9.
Ten protokół opisuje użycie barwienia Picrosirius Red do oceny zwłóknienia w alloprzeszczepach płuc u myszy. Oprócz konwencjonalnego barwienia histologicznego pozwala na półilościową ocenę zmian zwłóknieniowych w mysich modelach przewlekłego odrzucenia, zapewnia sposób rozróżnienia grubych i cienkich włókien kolagenowych tylko w jednym barwieniu, jest opłacalny i łatwy do wykonania. Metoda ta może być równie dobrze zastosowana do innych mysich modeli eksperymentalnych charakteryzujących się zwłóknieniową przebudową miąższu płuca.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Honeywell, Charlotte, USA</td><td>33209</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td>4633000956 (numer seryjny)</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 1.5</td><td>Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>KCY5.1</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37%</td><td>Fisher Scientific, Leicestershire, Wielka Brytania</td><td>F/1501/PB15</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hemalumu Meyera</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Solution</td><td>Morphisto, Offenbach am Main, Niemcy</td><td>13422</td><td>alternatywy, które można zastosować: ab150681, abcam, Cambridge, Wielka Brytania; SRS250 ScyTek Laboratories, Logan City US</td></tr><tr><td>Filtr polaryzacyjny</td><td>Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td>0000000-1121-813</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom obrotowy, HistoCore AUTOCUT</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td>149AUTO00C1, 14051956472</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe ROTI Histokitt</td><td>Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Plast Paraffin</td><td>Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>6642.5</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do zatapiania Rotilabo, POM</td><td>Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>K113.1</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Adhesion Microscope Slide</td><td>epredia, Portsmouth, Wielka Brytania</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Procesor tkanek&nbsp;</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td>TP 1020</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji wersja oprogramowania 2.14.0/1.54f</td><td>Oprogramowanie do obrazowania Open Source</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN 3.4.91</td><td>Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

barwienie czerwienią picrosiriusa do półilościowej oceny histopatologicznej odkładania się kolagenu w mysich modelach przewlekłego odrzucenia alloprzeszczepu płuc

Picrosirius Red Staining for Semiquantitative Histopathologic Evaluation of Collagen Deposition in Murine Models of Chronic Lung Allograft Rejection

Zwłóknienie jest patofizjologiczną cechą przewlekłego odrzucenia po przeszczepie płuc i główną przeszkodą na drodze do długoterminowego przeżycia biorcy. Dostępnych jest kilka mysich modeli przeszczepu płuc do badania przewlekłego odrzucenia. Wykazują jednak niejednorodne wyniki dotyczące zmian zwłóknieniowych przeszczepu, a zakres histologiczny zwłóknienia jest w większości podawany jakościowo. Dlatego podejście rozdzielcze przestrzenne, które pozwala na analizę statystyczną, może pomóc w ocenie zwłóknienia w tych modelach. W niniejszym badaniu przedstawiono barwienie Picrosirius Red w celu półilościowej oceny organizacji kolagenu w mysich alloprzeszczepach płuc i porównano je ze standardowymi barwnikami Hematoxyliny i Eozyny, Trichromem Massona i Herovici. Barwienie przeprowadzono na wycinkach z dwóch różnych modeli przeszczepu myszy w oparciu o drobne i duże niezgodności kompleksu zgodności tkankowej (MHC). Metodę opracowano dla półilościowej analizy organizacji kolagenu w całych odcinkach płuc. W związku z tym może służyć jako narzędzie do mysich modeli eksperymentalnych zwłóknieniowych chorób płuc.

Opisany powyżej protokół umożliwia obiektywną, półilościową ocenę odkładania kolagenu w tkance płuc myszy. Remodeling włóknisty jest patofizjologiczną cechą charakterystyczną dla przewlekłego odrzucania przeszczepu płuc. W związku z tym barwienie Picrosirius Red zostało zastosowane w modelach przewlekłego odrzucania allograftu płuc z wykorzystaniem lewostronnego ortotopowego przeszczepienia płuc u myszy. Przeszczepienie płuc z główną niezgodnością MHC od dawcy BALB/c do biorcy C57BL/6 przy łagodnej immunosupresji prowadz...

Czerwone barwienie Picrosiriusa to półilościowa metoda obiektywnej oceny odkładania się kolagenu w mysim zwłóknieniu płuc w sposób przestrzennie rozwiązany. Oprócz oceny całkowitego odkładania kolagenu, barwienie Picrosirius Red pozwala na różnicowanie włókien kolagenowych o różnej grubości.

Barwienie czerwienią Picrosiriusa do półilościowej oceny histopatologicznej odkładania się kolagenu w mysich modelach przewlekłego odrzucenia alloprzeszczepu płuc

Fibrosis is the pathophysiologic hallmark of chronic rejection after lung transplantation and the foremost hurdle to long-term recipient survival. Several ...

Nasze badania koncentrują się na analizie rozwoju zwłóknienia w przewlekłym odrzucaniu alloprzeszczepu płuc. Interesują nas zatem metody, które charakteryzują przedział tkanki zwłóknieniowej. Do rozmnażania chorób związanych z przeszczepem wykorzystujemy mysi model przeszczepu pojedynczego płuca, który wprowadziliśmy kilka lat temu.W tym modelu wykazano, że przeszczepienie płuca między allogenicznymi szczepami myszy powoduje różne poziomy zwłóknienia przeszczepu. Dane histologiczne dotyczące przebudowy tkanki zwłóknieniowej są często prezentowane jakościowo. Nasza metoda wykorzystująca barwienie Picrosirius Red ma tę zaletę, że jest to ocena półilościowa i rozróżnia grube i cienkie włókna kolagenowe.Na początek uwodnić próbki płuc myszy zatopione w parafinie w zmniejszających się stężeniach etanolu przez dwie minuty każda. Zabarwić szkiełko przez osiem minut w roztworze hemalumu Meyera. Myj szkiełko przez 10 minut pod bieżącą wodą z kranu, a następnie inkubuj szkiełko przez godzinę w roztworze Picrosirius Red.Zanurz szkiełko od pięciu do 10 razy w 0,5% roztworze kwasu octowego. Delikatnie potrząśnij szkiełkiem, aby usunąć roztwór. Teraz odwodnić szkiełko w zwiększającym się stężeniu etanolu i 100% ksylolu przez pięć minut każdy.Dodać jedną kroplę podłoża montażowego na próbkę w celu zatopienia i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia pod wyciągiem. Pod mikroskopem świetlnym użyj odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, aby ustawić ostrość próbki, aż do uzyskania wyraźnego i ostrego obrazu.Dostosuj stopień filtra polaryzacyjnego, aż tło stanie się całkowicie ciemne lub czarne. Zeskanuj próbkę w 20-krotnym powiększeniu i wyeksportuj obrazy w formacie TIFF. Przenieś obrazy do oprogramowania Fidżi.Kliknij przycisk Edytuj i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz. Następnie kliknij Analizuj, a następnie Zmierz, aby zmierzyć całkowitą powierzchnię. Aby zmierzyć całkowitą zawartość kolagenu w próbce, kliknij Obraz, a następnie Dostosuj i Próg koloru.Ustaw odcień w zakresie od 2 do 130 i jasność w zakresie od 35 do 255. Następnie kliknij przycisk Analizuj i w oknie Analizuj cząstki ustaw rozmiar na 1 minus nieskończoność i zaznacz pola Wyczyść i Sumuj. Dostosuj odcień na czerwony do analizy grubych włókien kolagenowych i żółto-zielony do cienkich włókien kolagenowych i zmierz całkowitą liczbę kolagenu.Na koniec kliknij Wtyczki, makra i Rekord, aby skonfigurować makro do automatycznego przetwarzania. Trichrom Massona, barwienie czerwienią Heroviciego i Picrosiriusa ilustrowało rozległe odkładanie się kolagenu przyoskrzelowego i przynaczyniowego w modelu niedopasowania głównego kompleksu zgodności tkankowej. Drobny niedopasowany model wykazywał przede wszystkim gęste nacieki limfocytarne z mniej intensywnym odkładaniem się kolagenu.Barwienie Picrosirius Red z filtrem polaryzacyjnym ujawniło zielony wygląd osadzonych włókien w obu modelach. Kontrole przeszczepu wykazały kolagen ograniczony do granic przyoskrzelowych i przynaczyniowych, podobnie jak w naiwnych mysich płucach. Cyfrowa analiza obrazu wykazała zwiększoną całkowitą ilość kolagenu w głównych niedopasowanych przeszczepach płuc kompleksu zgodności tkankowej w porównaniu z niewielkimi niedopasowanymi przeszczepami, prawostronną naiwną tkanką płucną lub naiwnym lewym płucem BALB/c.Nie wykazano różnic w grubych włóknach kolagenowych. Analiza cienkich włókien kolagenowych wykazała zwiększoną obecność w głównym niedopasowanym modelu w porównaniu z niewielkim niedopasowanym modelem, naiwną prawostronną tkanką płucną lub naiwnym lewym płucem BALB/c.

picrosirius-red-staining-for-semiquantitative-histopathologic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje czerwone zabarwienie tkanek zwłóknieniowych metodą picrosiriusa w celu wykrycia nadmiernego odkładania się kolagenu w skrawkach tkanki zwłóknistej . Technika barwienia pomaga ocenić ekspresję kolagenu w chorobach tkanki łącznej.

Barwienie czerwoną polaryzacją Picrosiriusa: technika wykrywania zwłóknienia w skrawkach tkanki serca za pomocą mikroskopii jasnego pola

Tutaj prezentujemy protokół do badania immunologii odrzucenia. Przedstawiony model chirurgiczny informuje o krótkim czasie operacji i zwięzłej technice. W zależności od kombinacji szczepu dawca-biorca, w przeszczepionej nerce może rozwinąć się ostre odrzucenie komórkowe lub przewlekłe uszkodzenie przeszczepu allogenicznego, zdefiniowane przez zwłóknienie śródmiąższowe i zanik kanalików słuchowych.

Przeszczep nerki u myszy: modele odrzucenia przeszczepu allogenicznego

Streptococcus pneumoniae tworzy dyskretne, nieropne, mikroskopijne zmiany w sercu. Przedstawiono protokół mysiego modelu powstawania mikrouszkodzeń serca. Prowadzone są szkolenia dotyczące wizualizacji mikrozmian za pomocą mikroskopii, rozróżniania wczesnych i późnych mikrouszkodzeń oraz metod wykrywania przebudowy serca w sercach rekonwalescentów.

Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w obrębie mikrouszkodzeń serca i późniejsza przebudowa serca

Celem tego badania było opracowanie mysiego modelu gojenia się ran po oparzeniach. Oparzenie termiczne wywołano na skórze grzbietowej myszy za pomocą podgrzanego mosiężnego szablonu. Spaloną tkankę oczyszczono i pokryto przeszczepem skóry pobranym z ogona genetycznie podobnej myszy dawcy.

Mysi model rany oparzeniowej zrekonstruowany za pomocą allogenicznego przeszczepu skóry

Ten protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu krzemicy poprzez wielokrotne wystawienie na działanie zawiesin krzemionki za pomocą kroplówki z nosa. Model ten może wydajnie, wygodnie i elastycznie naśladować patologiczny proces krzemicy u ludzi z wysoką powtarzalnością i oszczędnością.

Mysi model krzemicy utworzony przez wielokrotne wdychanie krystalicznego pyłu krzemionkowego

Stworzyliśmy mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby, który dostarcza odpowiedniego modelu zwierzęcego do mechanistycznego badania atrezji dróg żółciowych (BA) wywołanego przez wirusa i platformy dla przyszłych terapii BA.

Mysi model przewlekłego zwłóknienia wątroby do badania atrezji dróg żółciowych

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Model myszy choroby wątroby związanej z zaburzeniami metabolicznymi (MASLD) z zaburzeniami metabolicznymi, zmianami ekspresji genów wątroby oraz zmianami histologicznymi przypominającymi ludzkie MASLD, w tym zwłóknieniem przechodzącym do zaawansowanego stadium 3. Model ten może być wykorzystywany w badaniach patofizjologii MASLD oraz w przedklinicznych badaniach nowych terapii.

Model myszy dotyczący zaburzenia metabolicznego związane ze steatotyczną chorobą wątroby z włóknieniem

Protokół ten określa metodę wywoływania zwłóknienia płuc u myszy poprzez wielokrotne podawanie bleomycyny do jamy ustnej i gardła, uzyskując cechy patologiczne bardzo podobne do idiopatycznego zwłóknienia płuc.

Wyrafinowany mysi model idiopatycznego włóknienia płuc

Przed przystąpieniem do operacji nowy chirurg powinien przejść szkolenie z zakresu podstawowych technik i koncepcji chirurgicznych. Niniejszy artykuł przedstawi podstawowe zagadnienia chirurgiczne ze szczególnym uwzględnieniem gryzoni.

Zasady chirurgii gryzoni dla początkującego chirurga

Poznaj metodę barwienia czerwienią Picrosiriusa do półilościowej oceny odkładania się kolagenu w modelu przeszczepu płuc u myszy. Technika ta pozwala rozróżnić grube i cienkie włókna kolagenowe.

Barwienie czerwienią Picrosiriusa do półilościowej oceny histopatologicznej odkładania się kolagenu w mysich modelach przewlekłego odrzucenia alloprzeszczepu płuc (Wideo) | JoVE Journal

Barwienie czerwienią Picrosiriusa do półilościowej oceny histopatologicznej odkładania się kolagenu w mysich modelach przewlekłego odrzucenia alloprzeszczepu płuc

Przeglądaj więcej filmów