Barwienie czerwienią Picrosiriusa do półilościowej oceny histopatologicznej odkładania się kolagenu w mysich modelach przewlekłego odrzucenia alloprzeszczepu płuc
21 marca 2025
Czerwone barwienie Picrosiriusa to półilościowa metoda obiektywnej oceny odkładania się kolagenu w mysim zwłóknieniu płuc w sposób przestrzennie rozwiązany. Oprócz oceny całkowitego odkładania kolagenu, barwienie Picrosirius Red pozwala na różnicowanie włókien kolagenowych o różnej grubości.
Nasze badania koncentrują się na analizie rozwoju zwłóknienia w przewlekłym odrzucaniu alloprzeszczepu płuc. Interesują nas zatem metody, które charakteryzują przedział tkanki zwłóknieniowej. Do rozmnażania chorób związanych z przeszczepem wykorzystujemy mysi model przeszczepu pojedynczego płuca, który wprowadziliśmy kilka lat temu.
W tym modelu wykazano, że przeszczepienie płuca między allogenicznymi szczepami myszy powoduje różne poziomy zwłóknienia przeszczepu. Dane histologiczne dotyczące przebudowy tkanki zwłóknieniowej są często prezentowane jakościowo. Nasza metoda wykorzystująca barwienie Picrosirius Red ma tę zaletę, że jest to ocena półilościowa i rozróżnia grube i cienkie włókna kolagenowe.
Na początek uwodnić próbki płuc myszy zatopione w parafinie w zmniejszających się stężeniach etanolu przez dwie minuty każda. Zabarwić szkiełko przez osiem minut w roztworze hemalumu Meyera. Myj szkiełko przez 10 minut pod bieżącą wodą z kranu, a następnie inkubuj szkiełko przez godzinę w roztworze Picrosirius Red.
Zanurz szkiełko od pięciu do 10 razy w 0,5% roztworze kwasu octowego. Delikatnie potrząśnij szkiełkiem, aby usunąć roztwór. Teraz odwodnić szkiełko w zwiększającym się stężeniu etanolu i 100% ksylolu przez pięć minut każdy.
Dodać jedną kroplę podłoża montażowego na próbkę w celu zatopienia i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia pod wyciągiem. Pod mikroskopem świetlnym użyj odpowiedniego oprogramowania do obrazowania, aby ustawić ostrość próbki, aż do uzyskania wyraźnego i ostrego obrazu.
Dostosuj stopień filtra polaryzacyjnego, aż tło stanie się całkowicie ciemne lub czarne. Zeskanuj próbkę w 20-krotnym powiększeniu i wyeksportuj obrazy w formacie TIFF. Przenieś obrazy do oprogramowania Fidżi.
Kliknij przycisk Edytuj i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz. Następnie kliknij Analizuj, a następnie Zmierz, aby zmierzyć całkowitą powierzchnię. Aby zmierzyć całkowitą zawartość kolagenu w próbce, kliknij Obraz, a następnie Dostosuj i Próg koloru.
Ustaw odcień w zakresie od 2 do 130 i jasność w zakresie od 35 do 255. Następnie kliknij przycisk Analizuj i w oknie Analizuj cząstki ustaw rozmiar na 1 minus nieskończoność i zaznacz pola Wyczyść i Sumuj. Dostosuj odcień na czerwony do analizy grubych włókien kolagenowych i żółto-zielony do cienkich włókien kolagenowych i zmierz całkowitą liczbę kolagenu.
Na koniec kliknij Wtyczki, makra i Rekord, aby skonfigurować makro do automatycznego przetwarzania. Trichrom Massona, barwienie czerwienią Heroviciego i Picrosiriusa ilustrowało rozległe odkładanie się kolagenu przyoskrzelowego i przynaczyniowego w modelu niedopasowania głównego kompleksu zgodności tkankowej. Drobny niedopasowany model wykazywał przede wszystkim gęste nacieki limfocytarne z mniej intensywnym odkładaniem się kolagenu.
Barwienie Picrosirius Red z filtrem polaryzacyjnym ujawniło zielony wygląd osadzonych włókien w obu modelach. Kontrole przeszczepu wykazały kolagen ograniczony do granic przyoskrzelowych i przynaczyniowych, podobnie jak w naiwnych mysich płucach. Cyfrowa analiza obrazu wykazała zwiększoną całkowitą ilość kolagenu w głównych niedopasowanych przeszczepach płuc kompleksu zgodności tkankowej w porównaniu z niewielkimi niedopasowanymi przeszczepami, prawostronną naiwną tkanką płucną lub naiwnym lewym płucem BALB/c.
Nie wykazano różnic w grubych włóknach kolagenowych. Analiza cienkich włókien kolagenowych wykazała zwiększoną obecność w głównym niedopasowanym modelu w porównaniu z niewielkim niedopasowanym modelem, naiwną prawostronną tkanką płucną lub naiwnym lewym płucem BALB/c.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje rozwój włóknienia w przebiegu przewlekłego odrzucania allotransplantatu płuc z wykorzystaniem mysiego modelu transplantacji. Kluczowa metodologia opiera się na barwieniu czerwienią Picrosirius, co pozwala na półilościową ocenę odkładania kolagenu oraz rozróżnienie między grubymi a cienkimi włóknami kolagenowymi.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Przewlekłe odrzucanie przeszczepu płuc
- Charakterystyka tkanki włóknistej
- Mysie modele transplantacji
Wstęp
- Jakościowa ocena przebudowy włóknistej jest powszechna, jednak niniejsze badanie oferuje podejście bardziej ilościowe.
- W różnych szczepach myszy allogenicznych obserwuje się różny stopień włóknienia przeszczepu.
- Analiza histologiczna jest niezbędna do zrozumienia żywotności przeszczepu i odpowiedzi tkankowej.
Zastosowane metody
- Barwienie czerwienią pikrosiriusową w celu oceny kolagenu
- Mysi model transplantacji płuc
- Cyfrowa analiza obrazu z wykorzystaniem specjalistycznego oprogramowania
Główne wyniki
- Zwiększona całkowita zawartość kolagenu w przeszczepach z niedopasowaniem głównego kompleksu zgodności histocompatibilnej w porównaniu do przeszczepów z niedopasowaniem drugorzędnym.
- Cienkie włókna kolagenowe występowały częściej w modelach z niedopasowaniem głównym w porównaniu z grupami kontrolnymi.
- Nie stwierdzono istotnych różnic w liczbie grubych włókien kolagenowych pomiędzy badanymi warunkami.
Wnioski
- Niniejsza praca wykazuje skuteczność barwienia czerwienią pikrosiriusową w ocenie zmian włóknistych w przeszczepach płuc.
- Wyniki te mają istotne znaczenie dla zrozumienia odrzucania przeszczepu oraz włóknienia w biologii transplantologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena włóknienia stanowi krytyczne wyzwanie w przedklinicznych modelach przewlekłego odrzucania alloprzeszczepu płuc, co bezpośrednio wpływa na wiarygodność prognostyczną badań translacyjnych. Barwienie Picrosirius Red umożliwia półilościową ocenę odkładania kolagenu, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów w modelach chorób włóknistych. Podejście to usprawnia podejmowanie decyzji w zakresie portfela badawczego, dostarczając powtarzalnych danych o rozdzielczości przestrzennej w kwestii przebudowy tkanek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie szlaków włóknienia oraz kwantyfikację przebudowy kolagenu w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez rozróżnianie grubych i cienkich włókien kolagenowych w tkance allograftu.
- Ułatwia uzyskanie wiarygodnych prognoz w walidacji celów dla strategii antyfibrotycznych.
Przesiewy i rozwój testów
- Przygotowuje zwalidowane punkty końcowe histopatologiczne do późniejszego przesiewu związków w modelach mysich.
- Standaryzuje półilościowy pomiar kolagenu w celu zapewnienia powtarzalności między badaniami.
- Umożliwia skalowalne cyfrowe procesy analizy obrazu dla uzyskania ilościowych wyników analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uspójnia przedkliniczną kwantyfikację włóknienia z opracowaniem biomarkerów translacyjnych w badaniach nad transplantacją płuc.
- Zapewnia ciągłość od mechanistycznych badań na etapie odkryć do przedklinicznej walidacji interwencji przeciwzwłóknieniowych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez kwantyfikację nasilenia przebudowy tkanki.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając wiarygodną kwantyfikację włóknienia w mysich modelach alloprzeszczepów płuc.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących przebudowy włóknistej i udziału szlaków sygnałowych w przewlekłym odrzuceniu przeszczepu.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki pomiaru kolagenu do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza wyniki cyfrowej analizy obrazu do statystycznego porównania grup eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy przedkliniczne punkty końcowe włóknienia z potencjalnymi strategiami biomarkerów klinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia znormalizowany, wielokrotnego użytku schemat postępowania w ocenie włóknienia w wielu modelach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad włóknieniem.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność analiz histopatologicznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych punktów końcowych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów i modeli antyfibrotycznych z uwzględnieniem ryzyka.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie histopatologii i cyfrowej analizy obrazu.
- Wymagany dostęp do mikroskopii, filtrów polaryzacyjnych i oprogramowania do przetwarzania obrazów (np. Fiji).
- Wymagana jest standaryzacja protokołów barwienia i analizy pomiędzy zespołami.
- Możliwa jest konieczność adaptacji metody dla różnych typów tkanek lub modeli zwierzęcych.
- Potencjalne ograniczenia obejmują zmienność intensywności barwienia oraz progowania obrazu.
