Name: Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowej tomografii całego narządu do wykrywania bakterii Salmonella w tkankach zakażonych myszy. Technika ta pozwala na lokalizację pojedynczych komórek bakteryjnych i analizę ich interakcji z komórkami układu odpornościowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki 310030_156818, 310030_182315 oraz NCCR_ 180541 AntiResist (do DB).

Whole&#45;Organ Pathogen Tracking via Fluorescent Reporter Quantification

<ol><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+understanding+the+infectious+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The importance of understanding the infectious microenvironment.</a> Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).</li>
<li>Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogeography+of+infection+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biogeography of infection revisited.</a> Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).</li>
<li>Bumann, D., Cunrath, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Salmonella-host+interactions+in+infected+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues.</a> Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).</li>
<li>Hofmann, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+-+putting+immune+cells+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging - putting immune cells into context.</a> J Cell Sci. 134 (15), jcs258494(2021).</li>
<li>Blain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tridimensional+atlas+of+the+developing+human+head%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tridimensional atlas of the developing human head.</a> Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).</li>
<li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+maps+reveal+stereotyped+cell-type-based+cortical+architecture+and+subcortical+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism.</a> Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).</li>
<li>Matho, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+glutamatergic+neuron+system+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex.</a> Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).</li>
<li>Muñoz-Castañeda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+anatomy+of+the+mouse+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex.</a> Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+compartmentalization+enables+Salmonella+persistence+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118(2021).</li>
<li>Dogga, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+aspartyl+protease+5+in+the+establishment+of+the+intracellular+niche+during+acute+and+chronic+infection+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii.</a> Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).</li>
<li>Claudi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+of+Salmonella+in+host+tissues+delays+eradication+by+antimicrobial+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy.</a> Cell. 158 (4), 722-733 (2014).</li>
<li>Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hue-shifted+monomeric+variants+of+Clavularia+cyan+fluorescent+protein%3A+identification+of+the+molecular+determinants+of+color+and+applications+in+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging.</a> BMC Biol. 6, 13(2008).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Burton, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparate+impact+of+oxidative+host+defenses+determines+the+fate+of+Salmonella+during+systemic+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host%26Microbe%22%5BJournal%5D)">Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice.</a> Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+afferent+connections+of+the+main+and+the+accessory+olfactory+bulb+formations+in+the+rat%3A+an+experimental+HRP-study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study.</a> J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIDRE%3A+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li>
<li>Wendland, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+GFP+levels+for+analyzing+Salmonella+gene+expression+during+an+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection.</a> FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).</li>
<li>Barat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+to+intracellular+Salmonella+depends+on+surface-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens.</a> PLoS Pathog. 8 (10), e1002966(2012).</li>
<li>Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+selection+based+on+expression+levels+during+infection+facilitates+vaccine+development+for+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).</li>
<li>Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27UTR+sequences+influence+protein+levels+in+Escherichia+coli+by+regulating+translation+initiation+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability.</a> Front Microbiol. 13, 1088941(2022).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li>
<li>Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Salmonella+gene+expression+in+an+infected+mammalian+host+using+the+green+fluorescent+protein+and+two-colour+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry.</a> Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).</li>
<li>Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+Asd%2B+expression-cloning+vector%3A+stable+maintenance+and+high+level+expression+of+cloned+genes+in+a+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22vaccine+strain%22%5BJournal%5D)">Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella.</a> vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Lokalny kontekst tkankowy patogenów bakteryjnych ma kluczowe znaczenie dla określenia miejscowych ataków gospodarza, adaptacji bakteryjnych, lokalnego wyniku interakcji patogenów gospodarza i chemioterapii przeciwdrobnoustrojowej oraz indywidualnego wkładu w ogólny wynik choroby. Obrazowanie bakterii wielkości mikrometra w narządach o rozmiarach centymetrów było wyzwaniem. Seryjna tomografia dwufotonowa (STP) zapewnia wystarczającą rozdzielczość przestrzenną do wykrywania pojedynczych komórek bakteryjnych w całych narządach, zautomatyzowane sekcje i obrazowanie oraz wystarczającą przepustowość (~1 narząd dziennie)11. Podczas gdy antygeny gospodarza mogą być barwione in vivo, komórki patogenu powinny wyrażać odpowiednie białka fluorescencyjne, aby zapewnić kompleksowe wykrywanie wewnątrzkomórkowych komórek patogenu. Uzyskane w ten sposób zestawy danych (0,5-1,5 terabajta na narząd) stanowią poważne wyzwanie dla infrastruktury IT w zakresie analizy i przechowywania danych.
W tej metodzie składa się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, wymagany jest szczep patogenu z wykrywalną i jednorodną ekspresją białka fluorescencyjnego GFP lub YFP. Idealnie, kaseta ekspresji chromosomalnej25 jest używana w celu zminimalizowania niejednorodności fluorescencji spowodowanej zmiennością liczby kopii plazmidu. Wymagana jest wystarczająca intensywność fluorescencji, ale należy unikać nadmiernych poziomów białka fluorescencyjnego, aby uniknąć upośledzenia zdolności patogenu23. Odpowiednie poziomy ekspresji można uzyskać poprzez wybór odpowiedniego promotora i precyzyjne dostrojenie miejsca wiązania rybosomów25 lub całego regionu 5' nieulegającego translacji (UTR)26. Po drugie, utrwalenie perfuzji powinno obejmować wstępne przemycie buforem w celu usunięcia jak największej liczby erytrocytów z krążenia krwi. Jest to szczególnie ważne dla śledziony i wątroby (chociaż całkowite usunięcie erytrocytów z tych narządów jest trudne). Pozostałe erytrocyty pochłaniają światło w widzialnej części widma, pogarszając jakość obrazowania27. Po trzecie, przechowywanie utrwalonych tkanek w krioprotektancie ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia autofluorescencji tkanek, która jest szczególnie wysoka w tkankach objętych stanem zapalnym i może przyćmić stosunkowo słabą fluorescencję komórek patogenu11. Po czwarte, skuteczne sieciowanie tkanki z otaczającym blokiem agarozy ma kluczowe znaczenie dla płynnego cięcia wibratomu bez wyskakiwania tkanki z bloku agarozy. Po piąte, sygnały fluorescencyjne i ich identyfikacja jako komórek chorobotwórczych muszą być niezależnie weryfikowane przy użyciu metod ortogonalnych, takich jak barwienie przeciwciałami przeciwko składnikom patogenu (takim jak lipopolisacharyd dla bakterii Gram-ujemnych) i mikroskopia konfokalna skrawków pobranych z tomografu11. Niektóre zakażone tkanki zawierają cząstki autofluorescencyjne o podobnym kształcie i nakładających się na siebie widmach fluorescencji, które można łatwo błędnie zinterpretować jako komórki chorobotwórcze. Po szóste, ilość komórek patogenu w mikrokoloniach powinna być porównana z podejściami ortogonalnymi, takimi jak mikroskopia konfokalna, w celu oceny dokładności. Całkowite obciążenia bakteryjne na podstawie tych obliczeń należy zweryfikować poprzez porównanie z podejściami ortogonalnymi, takimi jak cytometria przepływowa i posiew.
Do ważnych modyfikacji szeroko stosowanego protokołu STP należy umieszczenie filtra wąskoprzepustowego 510/20 nm przed fotopowielaczem 211, w celu zmniejszenia interferencji zielono-żółtej autofluorescencji, która jest szczególnie silna w zakażonej i zapalnej wątrobie, śledzionie i plamach Peyera. Silna autofluorescencja i zwiększone rozpraszanie światła przez takie narządy w porównaniu z mózgiem (co dominuje w innych zastosowaniach STP) generuje również potrzebę skuteczniejszej korekcji nierównomiernego oświetlenia. Kolejną modyfikacją jest to, że protokół ten wykorzystuje w tym celu podejście CIDRE22 (ryc. 3) oraz segmentację bakterii opartą na sztucznej inteligencji. Wreszcie, wstępne przetwarzanie tkanek zostało zmienione poprzez włączenie etapu inkubacji w krioprotektancie w temperaturze -20 °C, co zmniejsza autofluorescencję tkanek, a tym samym ułatwia wykrywanie małych komórek patogennych o stosunkowo słabej fluorescencji11.
Rozwiązywanie problemów może być konieczne, jeśli nie można wykryć żadnych sygnałów patogenu lub segmentacja zapewnia niewystarczającą czułość (zbyt wiele komórek patogenu jest pomijanych) lub niewystarczającą precyzję (zbyt wiele cząstek tła jest segmentowanych jako komórki patogenu). Jeśli autofluorescencja tkanek tła jest wykrywalna, ale sygnałów patogenu jest zbyt mało, patogeny mogą zawierać niewystarczającą ilość białek fluorescencyjnych. Można to sprawdzić za pomocą mikroskopii konfokalnej wycinków tkanek z tej samej zakażonej tkanki lub cytometrii przepływowej homogenatów tkankowych19,28. Podstawowymi przyczynami mogą być niewystarczające poziomy ekspresji lub niestabilność kasety z ekspresją. Strategie łagodzenia mogą obejmować alternatywne promotory do napędzania ekspresji, adaptację kodonów genów kodujących białko fluorescencyjne dla gatunku patogenu, zastosowanie konstruktów episomalnych o wyższej liczbie kopii lub stabilizację kaset ekspresji przez integrację chromosomów lub komplementację zrównoważoną-letalną29. Wybór białka fluorescencyjnego jest również ważny, ale wykrywanie jest możliwe za pomocą GFP.mut2, mWasabi, YPet i TIMERbac. Jeśli segmentacja jest niedokładna, może to być spowodowane zbyt słabą fluorescencją patogenu, którą można rozwiązać w sposób opisany powyżej, lub zbyt wysokim tłem autofluorescencji tkankowej. Rozległa perfuzja roztworu płuczącego lub przedłużona inkubacja w buforze magazynowym bezpośrednio przed osadzeniem w bloku agarozy i tomografia mogą rozwiązać te problemy. Wreszcie, do precyzyjnej klasyfikacji wymagane jest wystarczające wytrenowanie sieci neuronowej, ale nadmierne trenowanie może prowadzić do nadmiernego dopasowania, które pogarsza wydajność nowych próbek.
Obecnie żadna inna metoda nie jest w stanie zobrazować całych narządów w rozdzielczości przestrzennej wystarczającej do wykrycia pojedynczych bakterii. Przyszłe ulepszenia w oczyszczaniu tkanek i mikroskopii arkuszowej mogą osiągnąć podobną rozdzielczość. Może to umożliwić obrazowanie z większą prędkością i większą liczbą kanałów fluorescencyjnych.
Istotnym ograniczeniem STP jest rozdzielczość pikseli w płaszczyźnie wynosząca ~0,5 μm i rozdzielczość pionowa od 5 do 10 μm, co jest niewystarczające do rozdzielenia blisko położonych bakterii, np. w gęsto upakowanej mikrokolonii. Możliwe jest jednak pobranie skrawków tkanek po tomografii w celu wtórnej mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości wybranych części tkanki. Kolejnym ograniczeniem STP jest dostępność tylko trzech kanałów fluorescencyjnych, co ogranicza liczbę fluoroforów, które mogą być obrazowane jednocześnie. Ponownie, wtórna analiza pobranych skrawków tkanek za pomocą metod multipleksowania może ujawnić lokalizację i intensywność znacznie większej liczby markerów dla wybranych części tkanki. Informacje te można zintegrować z ogólną strukturą 3D otaczającej tkanki, jak określono za pomocą STP.
Podsumowując, protokół ten umożliwia szczegółowe badania interakcji gospodarz-patogen na poziomie lokalnym i całego narządu. Protokół powinien być łatwy do dostosowania do innych patogenów (pod warunkiem, że można je uzyskać w postaci szczepów fluorescencyjnych), innych narządów i różnych gatunków gospodarzy.

Infekcje występują w tkankach o skomplikowanej anatomii i fizjologii przedziałowej. Różnorodne mikrośrodowiska, które współistnieją w zakażonej tkance, mogą decydować o losach lokalnych podzbiorów patogenów i ich wpływie na ogólny wynik choroby1,2,3. Jednak kompleksowe mapowanie 3D patogenów mikrobiologicznych w tkankach o rozmiarach cm pozostaje wyzwaniem4. Obrazowanie mózgu i innych narządów jest bardzo aktywną dziedziną badawczą z ciągle ulepszanymi strategiami eksperymentalnymi5, ale wielu metodom nadal brakuje rozdzielczości poniżej μm, która byłaby wymagana do pewnej identyfikacji patogenów bakteryjnych wielkości μm. Z kolei seryjna tomografia dwufotonowa (STP) 6 umożliwia zautomatyzowane, wielokolorowe, wolne od deformacji obrazowanie całych tkanek z rozdzielczością poniżej μm w płaszczyźnie, uzyskując pełne wolumetryczne zestawy danych. Metoda ta łączy wielokrotne fizyczne cięcie tkanki za pomocą wibratomu z przerywanym dwufotonowym obrazowaniem wyłaniających się powierzchni bloków za pomocą światła podczerwonego. Tomografia STP jest szeroko stosowana do mapowania cienkich aksonów w mózgu w celu ustalenia map połączeń7,8,9,10.
Tomografia STP umożliwia również mapowanie 3D pojedynczych komórek patogenów mikrobiologicznych (Salmonella, Toxoplasma) w całych zakażonych tkankach11,12 za pomocą tomografu. Generacja drugiej harmonicznej ujawnia osłonki kolagenowe wokół tętnic i w pasmach włóknistych, takich jak beleczki śledziony, zapewniając w ten sposób kontekst anatomiczny. Przeciwciała fluorescencyjne wstrzykiwane in vivo mogą być używane do barwienia komórek gospodarza w celu ujawnienia interakcji między poszczególnymi komórkami patogenu a infiltrującymi komórkami odpornościowymi, takimi jak neutrofile. W tym miejscu opisano proces obejmujący przetwarzanie tkanki, obrazowanie, zszywanie płytek obrazowania z korekcją oświetlenia, układanie obrazów w trzech wymiarach oraz segmentację za pomocą narzędzi uczenia maszynowego. Rurociąg ten pozwala na uzyskanie pozycji 3D poszczególnych patogenów, komórek i mikrokolonii w kontekście gospodarza. Liczenie liczby pojedynczych komórek w mikrokoloniach pozostaje trudne ze względu na ograniczenia rozdzielczości, ale takie liczby można oszacować na podstawie zintegrowanej jasności mikrokolonii. Rurociąg można łatwo dostosować do innych modeli infekcji, jeśli dostępne są rekombinowane patogeny wykazujące ekspresję GFP lub YFP.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza Low Melt</td><td>Roth</td><td>Art. 6351.5 25g</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Klej błyskawiczny Loctite 435</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5413-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylopirolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP-100G</td><td></td></tr><tr><td>Borowodorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71321-25g</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Merck</td><td>106453</td><td></td></tr><tr><td>Periodynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tetraboran sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732-100g</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>AppliChem</td><td>A4734,1000</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS)</td><td>Merck</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Próżnia filtracja 500</td><td>TPP</td><td>TPP99250</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Campden Instruments Limited&nbsp;</td><td>01-01-4692</td><td></td></tr><tr><td>MAITAI Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odklejanie plastikowej formy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Tomograf TissueCyte 1000</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało/barwniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primary przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-LPS Salmonella, królik</td><td>Sifin</td><td>REF TS 1624</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD169-PE, klon 3D6.112</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td></td><td></td>142403</tr><tr><td>anty-Ly-6G-PE, klon 1A8</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>127608</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kurczak anty-królik Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Company</td><td>Version</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Image J</td><td>1.54g lub nowszy</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2017b/2018b lub nowszy</td><td></td></tr><tr><td>Orchestrator (tomograf)</td><td>Oprogramowanie do wizualizacji TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.9.0 lub nowsze</td><td></td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Większość infekcji ma miejsce w trójwymiarowych tkankach gospodarza o skomplikowanej anatomii i lokalnie różniącej się fizjologii gospodarza. Umiejscowienie komórek patogennych w tym zróżnicowanym środowisku znacząco wpływa na ich poziom stresu, reakcje, los i przyczynia się do ogólnego postępu choroby i niepowodzenia leczenia. Jednak ze względu na trudności techniczne w lokalizowaniu komórek patogenu o rozmiarach μm w narządach gospodarza o rozmiarach cm, ten obszar badań był stosunkowo mało zbadany. Poniżej przedstawiamy metodę radzenia sobie z tym wyzwaniem. Stosujemy seryjną tomografię dwufotonową i analizę obrazu wspomaganą sztuczną inteligencją, aby zlokalizować pojedyncze komórki Salmonelli w całej śledzionie, płatach wątroby i całych węzłach chłonnych zakażonych myszy. Za pomocą reporterów fluorescencyjnych i podawania przeciwciał in vivo można określić szybkość replikacji pojedynczych komórek Salmonelli, ich miejscową interakcję ze specyficznymi komórkami odpornościowymi oraz odpowiedzi bakterii na antybiotyki. Metodologie te otwierają drogę do kompleksowego badania zakażeń, ich zapobiegania i leczenia w trójwymiarowym kontekście tkankowym.

Opisana procedura umożliwia wykrywanie pojedynczych komórek Salmonella w całych organach myszy, takich jak śledziona, wątroba, węzły chłonne krezkowe i kępki Peyera11 (Rysunek 5 i Rysunek 6). Pozwala ona również na wykrycie pasożytów Toxoplasma gondii w mózgu myszy12. Niektóre zakażone tkanki, w tym wątroba, kępki Peyera i śledziona, wykazują znaczną autofluorescencję w zakresie zielono-żółtym. Autofluorescencja jest dodatkowo wzmacniana przez utrwalanie paraformaldehydem, które jest niezbędne do zachowania struktury tkanki. Wykrywanie zielonej fluorescencji z GFP, mWasabi oraz zielonego komponentu TIMERbac na tle tej autofluorescencji jest usprawnione poprzez zastosowanie wąskopasmowego filtra 510/20 nm (przepuszczającego większość emisji GFP, ale blokującego znaczną część widma autofluorescencji) przed fotopowielaczem 2 (zbierającym emisje zielone) oraz poprzez redukcję autofluorescencji tkanek poprzez przechowywanie utrwalonych tkanek przez 3 lub więcej dni w krioprotektancie11. Niemniej jednak bakterie powinny nadal eksponować co najmniej kilka tysięcy kopii GFP lub innych białek fluorescencyjnych na komórkę. Z drugiej strony należy unikać nadmiernego poziomu białek fluorescencyjnych, aby zminimalizować koszty adaptacyjne, które mogłyby prowadzić do osłabienia wirulencji23.
Prawidłowość segmentacji fluorescencyjnych bakterii w tkankach można potwierdzić za pomocą immunohistochemii pobranych przekrojów tkankowych po przeprowadzeniu obrazowania. W szczególności obiekty barwione przeciwciałem przeciwko komponentom powierzchniowym bakterii, takim jak lipopolisacharyd, można zestawić z obrazem fluorescencyjnym uzyskanym za pomocą tomografii STP (Rycina 5). Należy zauważyć, że niektóre zabarwione komórki Salmonella nie posiadają białek fluorescencyjnych, a tym samym nie wykazują wykrywalnej fluorescencji zarówno w mikroskopii konfokalnej, jak i w tomografii STP. Są to komórki Salmonella, które zostały zabite przez układ odpornościowy gospodarza, co wykazano za pomocą sortowania cytometrycznego i hodowli wzrostowych z pojedynczych posortowanych komórek, a także poprzez bliską korelację między liczbą jednostek tworzących kolonie na płytkach z agarem a liczbą fluorescencyjnych komórek Salmonella wyznaczoną metodą cytometrii przepływowej24. Ponadto utrata plazmidu może prowadzić do powstania niefluorescencyjnych komórek żywotnych, co należy sprawdzić poprzez wysiew na pożywki z odpowiednimi antybiotykami i bez nich, zgodnie z markerem selekcyjnym na plazmidzie. W przypadku plazmidów pochodnych pSC101 utrata plazmidu in vivo występuje rzadko19. Dla większości chromosomowo zintegrowanych kaset ekspresyjnych, takich jak sifB::gfp użytych w11, utrata ekspresji jest niewykrywalna in vivo. Jeśli segmentacja jest niespójna z danymi immunohistochemicznymi, należy zmodyfikować potok segmentacji.
Rozdzielczość tomografii STP jest niewystarczająca, aby rozróżnić poszczególne komórki bakteryjne wewnątrz gęsto upakowanych mikrokolonii. Jednak całkowita intensywność fluorescencji mikrokolonii umożliwia oszacowanie liczby komórek Salmonella. Wymaga to zastosowania szczepu fluorescencyjnego o bardzo jednorodnym poziomie fluorescencji, takiego jak Salmonella sifB::gfp11. Sumowanie oszacowanej liczby komórek Salmonella dla wszystkich mikrokolonii i pojedynczych komórek pozwala uzyskać całkowite obciążenie tkanki bakteriami, które jest zgodne z wynikami otrzymanymi alternatywnymi metodami, takimi jak wysiew na podłoża lub cytometria przepływowa homogenizatów tkankowych11. Wysiewu i cytometrii przepływowej nie można przeprowadzić bezpośrednio z tych samych tkanek, ponieważ do tomografii STP muszą one zostać utrwalone poprzez perfuzję. Zamiast tego należy je wykonać na dodatkowych zwierzętach, które nie zostały poddane utrwaleniu. Jeśli mediany obciążenia bakteryjnego określone różnymi podejściami różnią się więcej niż 3-krotnie, żywotność bakterii fluorescencyjnych może być upośledzona (w przypadku niższej liczby jednostek tworzących kolonie) lub niektóre bakterie mogły utracić fluorescencyjną konstrukcję reporterową (w przypadku wyższej liczby jednostek tworzących kolonie). W celu zidentyfikowania źródła takich rozbieżności wymagane będzie przeprowadzenie eksperymentu kontrolnego.
Tomografia STP umożliwia lokalizację komórek bakteryjnych w obrębie struktury 3D zainfekowanych tkanek. Sygnały drugiej harmonicznej kolagenu stanowią punkty orientacyjne anatomiczne, takie jak tętnice i beleczki kostne. Ponadto komórki gospodarza można barwić in vivo poprzez wstrzyknięcie przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym przed perfuzją (Rycina 5 oraz Rycina 6). Barwienie to dostarcza dodatkowych punktów orientacyjnych dla przedziałów tkankowych i specyficznych mikrootoczeń, w tym ognisk zapalnych (markery wewnątrzkomórkowe oraz niektóre przedziały z barierami dyfuzyjnymi, takie jak biała miazga śledziony czy mózg, nie są łatwo dostępne i odpowiednie do takiego barwienia in vivo). Podejście to ujawniło, że biała miazga śledziony jest przedziałem tkankowym umożliwiającym długoterminowe przetrwanie Salmonella podczas chemioterapii przeciwbakteryjnej11.
Wreszcie, Salmonella namnażająca się w tempie umiarkowanym lub wolnym może zostać zidentyfikowana i zlokalizowana w strukturze 3D tkanek przy użyciu szczepów wykazujących ekspresję timerbac, jednokomórkowego reportera szybkości replikacji11,15.
<img alt="Perfuzja przezsercowa, akwizycja obrazów dwufotonowych, segmentacja oparta na ML; schemat tomografii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Procedura obrazowania całego organu z wykorzystaniem seryjnej tomografii dwufotonowej (STP). (A-B) Organ jest pobierany po perfuzji przezsercowej i przechowywany przez noc w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C. (C-E) Organ jest osadzany w utlenionym agarozie i sieciowany, a następnie tkanka jest skanowana i cięta za pomocą tomografii STP. Przekroje są zbierane do późniejszej immunohistochemii. (F-J) Potoki analizy obliczeniowej do kwantyfikacji liczby bakterii, potwierdzenia obecności bakterii fluorescencyjnych oraz rekonstrukcji 3D pozycji bakterii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ spektroskopowy; metoda wzbudzania optycznego; eksperyment pokazujący analizę absorpcji światła." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Układ tomografii seryjnej dwufotonowej (STP). (A) Tomograf, który obejmuje (B) obrazowanie dwufotonowe wraz z (C) zautomatyzowanym seryjnym cięciem tkanek. (D) Zebrane skrawki tkanki do dalszych badań. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu składania obrazów; od surowych danych do korekcji CIDRE; ulepszenie analizy obrazu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Składanie kafelków i korekcja oświetlenia. Kafelki są składane, a nierównomierne oświetlenie jest korygowane przy użyciu metody rozkładów natężenia skorygowanych poprzez regularyzowaną minimalizację energii (CIDRE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza fluorescencyjna z wykorzystaniem segmentacji i klasyfikacji w mikroskopii; wykres rozrzutu danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Segmentacja bakterii Salmonella wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) z użyciem maszyny wektorów nośnych (SVM) oraz konwolucyjnej sieci neuronowej (CNN). (A) Reprezentatywne obrazy obiektów GFP wysegmentowanych przez SVM (lewo) i odpowiadające im obrazy (prawo) z obszarami wysegmentowanymi przez SVM (Pasek skali: 10 µm). (B) Rozkład zgrupowanych wartości czerwonego-zielonego-niebieskiego (RGB) dla wysegmentowanych obszarów. (C) Reprezentatywne obrazy obiektów niebędących GFP, błędnie zidentyfikowanych przez SVM jako bakterie (lewo). CNN prawidłowo klasyfikuje je jako tło (prawo, pasek skali: 10 µm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig04large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Seryjna tomografia dwufotonowa i mikroskopia konfokalna, obrazowanie tkanek, anty-Ly6G, kolagen, GFP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Detekcja Salmonella wykazującej ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) za pomocą tomografii i potwierdzenie metodą immunohistochemiczną. Obrazy tego samego przekroju uzyskane za pomocą tomografii (po lewej) lub mikroskopii konfokalnej po barwieniu przeciwciałem przeciwko lipopolisacharydom Salmonella (po prawej). Neutrofile (czerwone) zabarwiono poprzez wstrzyknięcie in vivo przeciwciała anty-Ly-6G znakowanego PE przed perfuzją. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat histologiczny, wizualizacja markerów CD169 i kolagenu, mikroskopia, analiza struktury tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Rekonstrukcja 3D i lokalizacja Salmonella w zakażonej śledzionie myszy. (A) Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja plasterka śledziony o grubości 5 mm, barwionego in vivo przed perfuzją przeciwciałem anty-CD169 (czerwony). Sygnał niebieski reprezentuje kolagen wykryty za pomocą drugiej harmonicznej. (B) Pojedyncza płaszczyzna optyczna stosu 3D przedstawionego na (A). Pozycje komórek lub mikrokolonii Salmonella zaznaczono gwiazdkami. (C) Rekonstrukcja 3D pozycji Salmonella (gwiazdki) w zakażonej wątrobie. Tętnice są widoczne dzięki ich otoczkom kolagenowym (niebieski). Pasek skali: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig06large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Infekcje bakteryjne są poważnym zagrożeniem dla zdrowia ludzkiego. Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe wzrasta, a szczepionki przeciwko kilku głównym patogenom wciąż są niedostępne. Aby zidentyfikować nowe sposoby strategii kontroli, musimy dowiedzieć się więcej o tym, jak patogeny reagują na układ odpornościowy gospodarza i na antybiotyki in vivo w zakażonych tkankach.Bakterie, które przeżyły, mogą powodować nawroty choroby, jeśli środki przeciwdrobnoustrojowe nie zlikwidują infekcji. Za pomocą tomografii seryjnej wykazujemy, że salmonella wywołująca dur brzuszny może utrzymywać się podczas terapii w określonej części śledziony. Stan zapalny w tym regionie jest słaby, co zakłóca krytyczną synergię między antybiotykami a stanem zapalnym w celu skutecznego usuwania zanieczyszczeń.Bakterie to obiekty o rozmiarach mikrometrów. Trudno jest zlokalizować tak małe obiekty w ich tkankowym kontekście. Seryjna tomografia dwufotonowa może wykryć pojedynczą bakterię w centymetrowych narządach i określić szybkość jej replikacji.Możemy również wykryć komórki odpornościowe, takie jak neutrofile, i określić ich przestrzenne relacje z bakteriami. Badamy działanie antybiotyków bakteriostatycznych. Antybiotyki te mogą leczyć infekcje, chociaż mogą jedynie hamować rozwój bakterii, nie zabijając patogenu.Określamy również rozprzestrzenianie się mutantów bakteryjnych, które nie mają określonych czynników wirulencji oraz wpływ defektów immunologicznych na zakażenie i leczenie. Na początek podnieś rozmrożone próbki tkanek myszy zakażonych salmonellą za pomocą pęsety. Włóż go szybko na dno plastikowej formy zawierającej płynną agarozę.Po zakończeniu polimeryzacji użyj skalpela, aby otworzyć plastikową formę od rogów. Po umieszczeniu ostrza na mikrotomie przenieś próbkę palcami w rękawiczce do pudełka na próbki. Umieścić próbkę pod mikrotomem w taki sposób, aby górna powierzchnia agarozy znajdowała się na tym samym poziomie co ostrze mikrotomu.Przesuń scenę, aby umieścić sześcian agarozy na środku celu. Kliknij przycisk plasterka w oprogramowaniu tomografu, aż uzyskasz cały nienaruszony plaster kostki. Następnie wyśrodkuj soczewkę obiektywu na próbce tkanki w kierunkach X i Y.Uruchom oprogramowanie lasera, dostosuj długość fali do 800 nanometrów, a następnie włącz laser. Zamknij drzwi szafki mikroskopu. Następnie wyłącz wszystkie źródła światła w pomieszczeniu.Włącz PMT i ustaw napięcie na 750 woltów. Teraz ustaw migawkę mikroskopu na automatyczną, a następnie ustaw napięcia V1 i V2 odpowiednio na 20 i 1,71. Wyreguluj oś Z za pomocą urządzenia Z-piezoelektrycznego, aż dotrze do powierzchni tkanki.Pokrój wiele plastrów o grubości 50 mikrometrów. Następnie zdefiniuj krawędzie próbki. Ogranicz obszar obrazowania do tkanki, minimalizując obrazowanie otaczającej agarozy.Po wyłączeniu PMT ustaw długość fali lasera na 800 nanometrów. Użyj plamki lasera, aby znaleźć współrzędne krawędzi tkanki podczas przesuwania stolika. Po potwierdzeniu współrzędnych umieść plamkę lasera po prawej stronie pośrodku.Teraz zmień długość fali na 940 nanometrów. Ustaw migawkę mikroskopu w trybie automatycznym i ustaw napięcie migawki na 20 dla V1 i 1.71 dla V2. Naciśnij opcję ustawień mozaiki 3D, aby rozpocząć skanowanie. Po obrazowaniu należy pobrać skrawki tkanek ze zbiornika na wodę.Aby zszyć obrazy kafelków, najpierw przenieś dane z serwera tomografu na komputer z systemem Linux. Otwórz skrypt MATLAB, StepOneStitchingAndArchive. m i zlokalizuj folder źródłowy.Przejdź do zakładki edytora i kliknij uruchom. Informacje o postępie zostaną wyświetlone w oknie poleceń. Znajdź zszyte obrazy w podfolderze o nazwie stitchedimages_100 w folderze źródłowym.Skompresuj surowe dane za pomocą polecenia tar i zapisz je jako pojedynczy plik o rozszerzeniu nazwy tar.bz2. Aby wytrenować maszynę wektorów nośnych, wyświetl podgląd zszytych obrazów. Otwórz jeden obraz o tej samej nazwie pliku z każdego podfolderu z Fidżi.Połącz trzy kanały w jeden kolorowy obraz i dostosuj jasność każdego kanału, aż zobaczysz wyraźne sygnały z bakterii i autofluorescencji tkanek. Zwróć uwagę na dostosowany maksymalny poziom intensywności każdego kanału. Następnie otwórz skrypt MATLAB StepTwoSegmentationAndAnalysis.m.Zdefiniuj folder źródłowy i nazwy obrazów do trenowania, a następnie przejdź do zakładki edytora i kliknij uruchom. Gdy pojawi się okno dialogowe z prośbą o podanie progów kolorów, wypełnij je wartościami opartymi na wcześniejszym ręcznym sprawdzaniu z Fidżi. Wybierz regiony tła i obszary zainteresowania zgodnie z oknami dialogowymi.Zostaną wyświetlone wykresy pokazujące, jak dobrze model został wytrenowany i pytające, czy należy dodać więcej regionów. Dodaj więcej obszarów zainteresowania i tła, aż bakterie będą mogły być wyraźnie podzielone na segmenty. Proces segmentacji zostanie uruchomiony automatycznie, a postęp będzie można zobaczyć w oknie poleceń.Następnie otwórz obrazy kanału niebieskiego, który zawiera sygnały drugiej harmonicznej kolagenu. Obrazy pierwszego kanału można dziesięciokrotnie zmniejszyć, zarówno na osi X, jak i Y, a zmniejszone obrazy zapisać w nowym folderze. Utwórz trzy repliki obrazów o zmniejszonym rozmiarze w tym samym folderze.Aby uzyskać wizualizację 3D, uruchom pakiet oprogramowania do wizualizacji Imaris w widoku areny. Teraz otwórz plik IMS lub TIF. Dostosuj reprezentacje kolorów różnych kanałów w oknie regulacji wyświetlania.Kliknij właściwości obrazu w menu edycji, aby ręcznie ustawić wartości minimalne lub maksymalne oraz wartość korekcji gamma. Po dostosowaniu wyglądu obrazu wyeksportuj bieżący widok za pomocą narzędzia do robienia zdjęć. Użyj wskaźnika nawigacji, aby znaleźć widok, a następnie użyj dodawania plus, aby dodać klatki kluczowe.Użyj ikony animacji, aby przedstawić dane 3D jako film. Naciśnij czerwony przycisk nagrywania, aby skompilować film, a następnie zapisz go w żądanym folderze docelowym i typie pliku. Pojedyncze komórki salmonelli wykryto w całych narządach myszy, takich jak śledziona, wątroba, krezkowe węzły chłonne i plamy Peyera.Segmentację bakterii fluorescencyjnych potwierdzono metodą immunohistochemiczną. Komórki gospodarza barwiono in vivo poprzez wstrzyknięcie przeciwciała do markerów powierzchniowych przed perfuzją.

high-resolution-three-dimensional-whole-organ-tomography-microbial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do uzyskania jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najefektywniejszą jest mikrotomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi.

Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D Ex-vivo Próbki biologiczne w mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT)

Bezsoczewkowa tomografia optyczna to trójwymiarowa technika mikroskopowa oferująca rozdzielczość przestrzenną &lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, przy dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie użyteczne w integracji z platformami typu lab-on-a-chip.

Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej

Połączone obrazowanie optyczne i μCT w mysim modelu infekcji implantu ortopedycznego, wykorzystujące bioluminescencyjny zmodyfikowany szczep Staphylococcus aureus, zapewniło możliwość nieinwazyjnego i podłużnego monitorowania dynamiki infekcji bakteryjnej, jak również odpowiadającej jej reakcji zapalnej i zmian anatomicznych w kości.

Połączone obrazowanie optyczne in vivo i μCT w celu monitorowania infekcji, stanu zapalnego i anatomii kości w zakażeniu implantu ortopedycznego u myszy

Opracowaliśmy protokoły i zaprojektowaliśmy niestandardowe urządzenie, aby umożliwić osadzanie próbek w skali milimetrowej. Przedstawiamy procedury przygotowania próbek z naciskiem na zatapianie w rurkach z żywicy akrylowej i poliimidu w celu uzyskania sztywnego unieruchomienia i długotrwałego przechowywania próbek w celu zbadania architektury tkanek i morfologii komórek za pomocą mikro-CT.

Sztywne osadzanie utrwalonych i barwionych, całych próbek w skali milimetrowej do bezsekcyjnej histologii 3D za pomocą mikrotomografii komputerowej

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Cała struktura 3D i zawartość komórkowa organoidów, jak również ich fenotypowe podobieństwo do oryginalnej tkanki, mogą być uchwycone za pomocą opisanego tutaj protokołu obrazowania 3D o rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem.

Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Przedstawiamy krok po kroku protokół do wysokorozdzielczego, bezznacznikowego i trójwymiarowego obrazowania organoidów przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję obrazowania i obliczeniową analizę obrazu, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki strukturalnej i reakcji leków w żywych organoidach.

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Poznaj metodę trójwymiarowej tomografii całego narządu do wykrywania bakterii Salmonella w tkankach zakażonych myszy. Technika ta pozwala na lokalizację pojedynczych komórek bakteryjnych i analizę ich interakcji z komórkami układu odpornościowego.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Przeglądaj więcej filmów