Name: Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 2 min 32 s
Description: Poznaj nową metodę iniekcji dootrzewnowej u dorosłych Danio rerio, która zmniejsza uszkodzenia ciała i śmiertelność ryb. Ta technika ułatwia badania kardiotoksyczności doksorubicyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez NIH (HL107304 i HL081753) oraz Fundację Mayo (Centrum Odkryć Biomedycznych i Badań Sercowo-Naczyniowych) do X.X. J.L. jest finansowane przez Fundusze Badań Podstawowych dla Centralnych Uniwersytetów Central South University, nr 56021702. Specjalne podziękowania dla Beninio Gore'a i Quentina Stevensa za zarządzanie obiektem dla danio pręgowanego.

Wszystkie przeprowadzone procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Mayo Clinic, zgodnie ze standardami określonymi w „Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” (National Academies Press, 2011). Wszystkie danio pręgowane wykorzystane w badaniu należą do szczepu Wild Indian Karyotype (WIK). Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie i przechowywanie roztworu zapasowego doksorubicyny
<ol>
	<li>Należy pozyskać doxorubicinę z komercyjnego źródła. 
	UWAGA: Doxorubicyna jest światłoczuła, dlatego należy ją nabyć w formie proszku i przechowywać w nieprzezroczystych pojemnikach, aby chronić ją przed ekspozycją na światło. Wszystkie etapy przygotowania proszku Dox należy przeprowadzać w dygestorium chemicznym.</li>
	<li>Całkowicie rozpuścić proszek Dox w wodzie destylowanej i przygotować roztwór zapasowy o końcowym stężeniu 5 mg/mL.</li>
	<li>Przygotować alikwoty roztworu zapasowego, rozdzielając go do probówek o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Owiniąć probówki folią aluminiową, aby chronić je przed ekspozycją na światło.</li>
	<li>Przechowywać alikwoty roztworu Dox w temperaturze 4 °C w przypadku przechowywania krótkoterminowego (&lt;1 miesiąca) lub w -20 °C w przypadku przechowywania długoterminowego10.</li>
</ol>
2. Grupowanie ryb według masy ciała
<ol>
	<li>Pogrupuj ryby o różnicy BW wynoszącej mniej niż 10% przed kolejnym etapem wstrzykiwania. 
	UWAGA: Aby usprawnić ten etap, ryby z odchyleniem BW poniżej 10% są klasyfikowane jako ryby o tym samym rozmiarze.</li>
	<li>Pozostaw ryby na 24-godzinną głodówkę przed wstrzyknięciem.</li>
	<li>Znieczul ryby, używając wody dla embrionów zawierającej 0,16 mg/mL trikainy przez 1 min.</li>
	<li>Wyjmij ryby z wody z trikainą i osusz obie strony ciała ryby czystym papierem filtrowanym, aby usunąć nadmiar wody.</li>
	<li>Zmierz i zapisz BW każdej ryby, a następnie niezwłocznie przenieś ryby do zbiornika regeneracyjnego wypełnionego świeżą wodą systemową. 
	UWAGA: Wstrzyknięcie Dox wykonano u ryb po osiągnięciu 3 miesięcy wieku. W niniejszym badaniu naukowcy wykorzystali ryby w wieku od 3 do 10 miesięcy. BW dojrzałych zebrafish szczepu WIK może wynosić od 0,2 g do 0,5 g. Przedłużona anestezja trwająca ponad 5 min, po której nastąpiło wstrzyknięcie Dox, prowadziła do wysokiej śmiertelności ryb.</li>
</ol>
3. Przygotowanie igły i stanowiska do iniekcji
<ol>
	<li>Wyznaczyć objętość iniekcji roztworu zapasu Dox (np. 5 mg/mL) potrzebną dla każdej ryby na podstawie średniej masy ciała, aby osiągnąć docelową dawkę 20 µg/g.</li>
	<li>Użyć następującego wzoru do obliczenia objętości iniekcji: 
	<img alt="Wzór na objętość iniekcji: równanie obliczania dawkowania dla ryb; schemat eksperymentu biologicznego." src="/files/ftp_upload/66500/66500eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"></li>
	<li>Dodać 1x zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS), aby rozcieńczyć roztwór Dox obliczony w kroku 1 do iniekcji, osiągając objętość całkowitą 5 µL. 
	UWAGA: Przygotować roztwór zbiorczy dla każdej grupy ryb na podstawie ich BW i uwzględnić dodatkowe 3 ryby w każdej grupie, aby zapewnić brak niedoboru roztworu do iniekcji w trakcie eksperymentu.</li>
	<li>Delikatnie opukać probówkę, a następnie krótko wirować w mikrowirówce z maksymalną prędkością, aby zebrać roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 s.</li>
	<li>Umieścić przygotowany roztwór na lodzie i chronić go przed ekspozycją na światło.</li>
	<li>Umieścić czystą szalkę Petriego o średnicy 100 mm z gąbką pod spodem pod mikroskopem stereoskopowym, a następnie ustawić ostrość. 
	UWAGA: Gąbka posiada rowek o długości 4 cm. Elastyczne cofanie się gąbki zapewni rybie podparcie i utrzyma jej ciało w odpowiedniej pozycji. Gąbkę można wykorzystać ponownie.</li>
	<li>Wyposażyć mikrostrzykawkę 10 µL w igłę skośną 34 G.</li>
	<li>Przepłukać igłę buforem 1x HBSS, aby usunąć pęcherzyki powietrza i udrożnić potencjalne zatory w strzykawce.</li>
	<li>Odmierzyć 5 µL roztworu przygotowanego w kroku 4 do iniekcji.</li>
</ol>
4. Procedura wstrzykiwania Dox do jamy otrzewnej (IP)
<ol>
	<li>Umieścić dorosłe ryby w wodzie z dodatkiem 0,16 mg/mL tricainy na 1 min, aby wywołać stan utraty przytomności.</li>
	<li>Ułożyć rybę w rowku osadzonej gąbki brzuchem do góry (Rysunek 1A).</li>
	<li>Wprowadzić igłę pod kątem bliskim 0°, zaczynając od środka płetwy piersiowej w kierunku tylnej części jamy serca (Rysunek 1B). 
	UWAGA: Należy unikać jakiegokolwiek kontaktu z sercem podczas procedury.</li>
	<li>Kierować igłę w stronę ogona, prowadząc ją pod skórą srebrzystą. 
	UWAGA: Należy umieścić igłę w bliskim sąsiedztwie skóry srebrzystej, dbając o to, aby jej nie zadrapać ani nie przebić.</li>
	<li>Monitorować położenie końcówki igły w jamie brzusznej przez cały czas trwania operacji (Rysunek 1C). 
	UWAGA: Należy unikać uszkodzenia wątroby, jelit, pęcherza pławnego i innych narządów. Należy upewnić się, że igła dotarła do końca jelita, w pobliżu otworu kloaki.</li>
	<li>Stopniowo i równomiernie podać 5 µL roztworu Dox, a następnie powoli wycofać igłę wzdłuż pierwotnej ścieżki, aby zapobiec wyciekowi (Rysunek 1D).</li>
	<li>Monitorować jamę brzuszną pod kątem obecności Dox, obserwując czerwone zabarwienie roztworu Dox (Rysunek 1E).</li>
	<li>Szybko przenieść wstrzyknięte ryby do czystego zbiornika przelewnego wypełnionego świeżą wodą systemową, aby pomóc rybom w rekonwalescencji. 
	UWAGA: Pomiędzy wstrzyknięciami należy jednokrotnie przepłukać igłę buforem 1x HBSS.</li>
</ol>
5. Opieka nad rybami po iniekcji
<ol>
	<li>Po wstrzyknięciu zwróć ryby do systemu z cyrkulacją.</li>
	<li>Poddaj wszystkie wstrzyknięte ryby dodatkowemu 24-godzinnemu postowi, aby ułatwić ich rekonwalescencję.</li>
	<li>W ciągu pierwszego tygodnia uważnie obserwuj ryby. Usuwaj martwe osobniki tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zainfekowania pozostałych ryb. 
	UWAGA: Śmiertelność ryb w ciągu pierwszych 24 h prawdopodobnie wynika z obrażeń fizycznych powstałych podczas wstrzykiwania lub przedłużonej anestezji. Odnotuj liczbę ryb w celu wygenerowania krzywej przeżywalności.</li>
	<li>Wykonaj echokardiografię w celu fenotypowania ryb po wstrzyknięciu Dox w 56. dniu po zabiegu11. 
	UWAGA: Zapewnij jednolitość warunków i procedur dla odpowiadającej im grupy kontrolnej, której wstrzyknięto roztwór HBSS.</li>
</ol>

Optimized Intraperitoneal Injection for Compound Delivery in Adult Zebrafish

<ol><li>Tavares, B., Lopes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Zebrafish+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Medica+Portuguesa%22%5BJournal%5D)">The importance of Zebrafish in biomedical research.</a> Acta Medica Portuguesa. 26 (5), 583-592 (2013).</li>
<li>Dang, M., Henderson, R. E., Garraway, L. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+drug+administration+in+the+adult+zebrafish+using+oral+gavage+for+cancer+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Long-term drug administration in the adult zebrafish using oral gavage for cancer preclinical studies.</a> Disease Model Mech. 9 (7), 811-820 (2016).</li>
<li>Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gelatin-based+diet+for+oral+dosing+juvenile+to+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+Sci+Prof%22%5BJournal%5D)">A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish (Danio rerio).</a> Lab Animal Sci Prof. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:85611302 32-35 (2014).</li>
<li>Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+into+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection into adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (42), e2126(2010).</li>
<li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (34), e1645(2009).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneally+delivered+mesenchymal+stem+cells+alleviate+experimental+colitis+through+THBS1-mediated+induction+of+IL-10-competent+regulatory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneally delivered mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis through THBS1-mediated induction of IL-10-competent regulatory B cells.</a> Front Immunol. 13, 853894(2022).</li>
<li>De Smet, L., Ceelen, W., Remon, J. P., Vervaet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+drug+delivery+systems+for+intraperitoneal+therapy+to+extend+the+residence+time+of+the+chemotherapeutic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of drug delivery systems for intraperitoneal therapy to extend the residence time of the chemotherapeutic agent.</a> The Scientific World Journal. 2013, 720858(2013).</li>
<li>Dakwar, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine-based+intraperitoneal+therapy+for+the+treatment+of+peritoneal+carcinomatosis-Mission+possible%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine-based intraperitoneal therapy for the treatment of peritoneal carcinomatosis-Mission possible.</a> Adv Drug Deliv Rev. 108, 13-24 (2017).</li>
<li>Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+route+of+drug+administration%3A+should+it+be+used+in+experimental+animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Res%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal route of drug administration: should it be used in experimental animal studies.</a> Pharmaceutical Res. 37, 1-17 (2020).</li>
<li>Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+doxorubicin-induced+cardiomyopathy+model+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (136), e57567(2018).</li>
<li>Wang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+echocardiographic+assessment+of+cardiac+function+in+normal+adult+zebrafish+and+heart+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models.</a> Disease Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).</li>
<li>Christidi, E., Brunham, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell+death+pathways+in+doxorubicin-induced+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulated cell death pathways in doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Cell Death Dis. 12 (4), 339(2021).</li>
<li>Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+juvenile+doxorubicin-induced+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction.</a> Pediatric Res. 64 (5), 488-494 (2008).</li>
<li>Podyacheva, E. Y., Kushnareva, E. A., Karpov, A. A., Toropova, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+models+of+doxorubicin-induced+cardiomyopathy+in+rats+and+mice.+A+modern+view+from+the+perspective+of+the+pathophysiologist+and+the+clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Analysis of models of doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats and mice. A modern view from the perspective of the pathophysiologist and the clinician.</a> Frontiers Pharmacol. 12, 670479(2021).</li>
<li>Chaoul, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+drug+administration+techniques+in+zebrafish+models+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Assessing drug administration techniques in zebrafish models of neurological disease.</a> Int J Mol Sci. 24 (19), 14898(2023).</li>
<li>Lu, X., Lu, L., Gao, L., Wang, Y., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calycosin+attenuates+doxorubicin-induced+cardiotoxicity+via+autophagy+regulation+in+zebrafish+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Calycosin attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity via autophagy regulation in zebrafish models.</a> Biomed Pharmacother. 137, 111375(2021).</li>
</ol>

W odróżnieniu od dwóch istniejących metod wstrzykiwania IP 4,10, nowa metoda wstrzykiwania IP charakteryzuje się następującymi odrębnymi cechami. Po pierwsze, stosowany jest unikalny kąt penetracji igły (bliski zeru); po drugie, igła wnika w rybę przez unikalne miejsce, tj. naturalny otwór na brzusznej powierzchni ryby, który ułatwiłby wstrzyknięcie; I wreszcie ruch igły odbywa się od przodu do tyłu. Regulacje te skutecznie zmniejszają uszkodzenia narządów, które wynikają ze zminimalizowanego wycieku Dox podczas procesu penetracji. Ścieżka igły znajduje się tuż pod srebrną skórą, która może być stale monitorowana przez badacza. W związku z tym można skutecznie uniknąć bezpośredniego kontaktu końcówki igły z narządami wewnętrznymi. Po wstrzyknięciu cały wstrzyknięty Dox pozostaje w jamie brzusznej, a jedyne wyjście (punkt nakłucia) może zostać zamknięte, gdy ryba jest obudzona i zaczyna płynąć do przodu.
W porównaniu z dwiema istniejącymi metodami wstrzykiwania IP 4,10, nowa metoda wstrzykiwania IP konsekwentnie skutkuje zminimalizowaniem uszkodzeń ciała i zwiększeniem wskaźników przeżycia. Stwierdzenie to zostało dodatkowo podkreślone przez wykonalność wielokrotnych wstrzyknięć tej samej ryby w celu wygenerowania chronicznego modelu DIC danio pręgowanego. Co ważne, w porównaniu z poprzednimi dwiema metodami wstrzykiwania IP 4,10, nowa metoda może być szybko opanowana przez badaczy, którzy nie mają wcześniejszego doświadczenia w pracy z dorosłymi danio pręgowanymi. Wydaje się, że wiarygodne modele DIC zostały pomyślnie uzyskane za pierwszym lub drugim podejściem w rękach co najmniej 4 różnych badaczy. Powodzenie wstrzyknięcia można łatwo stwierdzić w ciągu pierwszego tygodnia po wstrzyknięciu: >80%, najlepiej 100%, ryby powinny być w stanie przeżyć po wstrzyknięciu. Wszystkie ryby przetrwają do 56 dpi, kiedy to większość ryb (>80%) powinna być wolna od oczywistych uszkodzeń ciała. Jest to znacząca poprawa, ponieważ niezawodny model DIC wykorzystujący dwie pierwsze metody IP może być ustabilizowany w ręku badacza dopiero po więcej niż 3 rundach ćwiczeń z co najmniej 10 rybami w każdej rundzie. Proces ten może być czasochłonny, ponieważ każda praktyka wymagała około 2 miesięcy, aby stwierdzić sukces jego/jej wstrzyknięcia. Zmniejszenie urazów tkanek nie tylko poprawia samopoczucie ryb, ale także minimalizuje czynniki zakłócające, które mogą wpłynąć na wyniki badania.
Jednym z kluczowych kroków zapewniających powodzenie nowej metody jest kąt penetracji. Jak pokazano na rysunku 2, gdy kąt penetracji zmienił się z 0° na 45°, odnotowano znaczną śmierć ryb, prawdopodobnie z powodu zwiększonego ryzyka kontaktu końcówki igły z narządami wewnętrznymi.
Podstawowym ograniczeniem metody jest to, że metoda ta nie może być stosowana do dostarczania leków rybom w wieku poniżej 3 miesięcy. Ze względu na niewielkie rozmiary ciała młode ryby nie mogą przetrwać po fizycznych uszkodzeniach związanych z penetracją igły. Metodę można jednak stosować u dorosłych ryb, gdy ich masa ciała jest większa niż 0,15 g, w tym tych w wieku od 3 miesięcy do 4 lat.
Ta nowa metoda będzie szeroko stosowana do dostarczania leków dorosłym danio pręgowanym, zwłaszcza gdy mamy do czynienia z potencjalnie toksycznymi związkami, takimi jak Dox15,16. Jeśli chodzi o związki nietoksyczne, powinny mieć zastosowanie wszystkie trzy metody.

Danio rerio) zyskał uwagę jako eksperymentalny model do badania chorób ludzkich, ponieważ zwierzę to charakteryzuje się wysoką homologią genów i narządów do ludzi, zewnętrznym zapłodnieniem, łatwością manipulacji genetycznej i przezroczystością ciała do wczesnej dojrzałości, co ułatwia niezliczone zastosowania obrazowania1. W przeciwieństwie do prostego procesu dostarczania leków bezpośrednio do wody dla zarodków i larw danio pręgowanego, podawanie leków dorosłym danio pręgowanym stanowi bardziej skomplikowane i wymagające przedsięwzięcie2.
U dorosłych ryb związki mogą być dostarczane za pomocą technik pasywnego dostarczania leków, takich jak bezpośrednie podawanie do wody, lub za pomocą doustnych metod dostarczania leków, takich jak gavaging2. Inne podejścia obejmują powlekanie pokarmu dla ryb związkami, a następnie karmienie ryb3 oraz bezpośrednie podawanie leków nierozpuszczalnych w wodzie w określonym stężeniu, w tym wstrzyknięcia zaoczodołowe lub dootrzewnowe4,5. Podawanie dootrzewnowe jest preferowane w badaniach in vivo modeli choroby ze względu na jego wyraźne zalety farmakokinetyczne6. Metoda ta zapewnia wysokie stężenie leku i wydłużony okres półtrwania w jamie otrzewnej, oferując skuteczną drogę dostarczania leku7,8. Podejście to jest powszechnie stosowane w warunkach badawczych w celu zapewnienia optymalnego wchłaniania i dystrybucji leków 9. Podczas gdy metody oparte na iniekcjach okazują się skuteczne w przypadku pojedynczego podania, długotrwałe i powtarzające się wstrzyknięcia często prowadzą do uszkodzenia organizmu i przewlekłej infekcji2.
Obecnie istnieją dwie metody wstrzykiwania IP u dorosłych zerbafish4,10. Jednak obie metody mają ograniczenia w dostarczaniu toksycznych związków, takich jak doksorubicyna, co prowadzi do poważnych uszkodzeń kształtu ciała i śmiertelności ryb. Skutki uboczne mogą znacznie skomplikować interpretację danych. Chociaż te wyzwania mogą być rozwiązane za pomocą szeroko zakrojonego szkolenia10, istnieje wyraźna potrzeba nowej metody wstrzykiwania IP, która minimalizuje skutki uboczne.
Tutaj naszym celem jest opracowanie nowej metody wstrzykiwania IP, zoptymalizowanej pod kątem skutecznego dostarczania doksorubicyny do dorosłego danio pręgowanego, ułatwiając generowanie niezawodnych modeli kardiomiopatii wywołanej doksorubicyną (DIC) przy zminimalizowaniu uszkodzeń ciała i związanej z tym śmiertelności.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; L Strzykawka NanoFil</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>Narzędzie do iniekcji</td><td>NANOFIL</td></tr><tr><td>34 G igła</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>NI34BV-2</td><td>narzędzie do wkłuwania</td></tr><tr><td>60 mm szalka Petriego</td><td>fisher scientific/fisherbrand</td><td>FB0875713A</td><td>umieszczania gąbki&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Injceting Dox Dox</td></tr>, <tr><td>chlorowodorek doksorubicyny</td>, <td>lek Sigma</td><td>D1515-10MG</td><td>do tworzenia modelu DIC&nbsp;</td></tr><tr><td>Echokardiografia</td><td>VISUAL SONICS</td><td>Vevo 3100</td><td>pomiar czynności serca</td></tr><tr><td>Gąbka piankowa</td><td>Jaece Industries</td><td>L800-D Umieszczanie</td><td>ryb</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14025076</td><td>Pojazd do</td></tr><tr><td>mikrowirówki Dox&nbsp;</td><td>southernlabware</td><td>MyFuge/C1012</td><td>zbiera rozwiązanie Dox&nbsp;</td></tr><tr><td>Waga precyzyjna</td><td>Torbal</td><td>AD60</td><td>Waga cyfrowa</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Argent</td><td>MS-222</td> Rurka <td>znieczulająca do ryb</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>1,5 ml</td><td>przechowywanie&nbsp;</td></tr><tr><td>vevo LAB&nbsp; oprogramowanie</td><td>FUJIFILM VISUAL SONICS&nbsp;</td><td>5.6.0</td><td>Kwantyfikacja serca</td></tr></tbody></table>

technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność

An Intraperitoneal Injection Technique in Adult Zebrafish that Minimizes Body Damage and Associated Mortality

Dorosły danio pręgowany (Danio rerio), który jest genetycznie dostępny, jest wykorzystywany jako cenny model kręgowców do badania ludzkich zaburzeń, takich jak kardiomiopatia. Wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) jest ważną metodą, która dostarcza związki do organizmu w celu testowania efektów terapeutycznych lub generowania modeli chorobowych, takich jak kardiomiopatia wywołana doksorubicyną (DIC). Obecnie istnieją dwie metody wstrzykiwania adresu IP. Obie metody mają ograniczenia w obchodzeniu się ze związkami toksycznymi, takimi jak doksorubicyna, które powodują skutki uboczne objawiające się poważnym uszkodzeniem kształtu ciała i śmiercią ryb. Chociaż te niedociągnięcia można przezwyciężyć poprzez szeroko zakrojone szkolenie badaczy, pożądana jest nowa metoda wstrzykiwania IP, która ma minimalne skutki uboczne. W tym miejscu opisano unikalną metodę wstrzykiwania IP, która jest w stanie poradzić sobie z toksycznymi związkami. Konsekwentne obniżanie czynności serca może skutkować bez ponoszenia znacznej śmierci ryb. Technika ta może być łatwo opanowana przez badaczy, którzy mają minimalne doświadczenie z dorosłymi danio pręgowanymi.

Wcześniej w celu podania doksorubicyny u dorosłych rybek danio-zebrafish stosowano dwie metody doszpikowe (IP)4,10. W metodzie I, znanej również jako klasyczna metoda iniekcji IP opisana przez Kinkela i współpracowników4, igłę wprowadzano pod kątem 45° względem linii środkowej między płetwami brzusznymi, z brzuchem skierowanym do góry. W metodzie II, czyli alternatywnej metodzie iniekcji IP opisanej przez Ma i współpracowników10, igłę wprowadzano przez stronę grzbietową ryby (Ryc. 2A(i,ii)). W przeciwieństwie do nich, nasza metoda III wprowadza dwie główne zmiany. Po pierwsze, zmieniono miejsce iniekcji: brzuch jest skierowany do góry, a igłę kieruje się od punktu środkowego płetwy piersiowej w stronę brzucha. Miejsce penetracji wyznaczany jest przez naturalny otwór w tym obszarze. Po drugie, zmniejszono kąt nachylenia igły, który powinien wynosić niemal 0° (Ryc. 2A(iii), Ryc. 1).
Porównanie trzech metod iniekcji doszprownej 
W celu porównania trzech metod iniekcji IP przedstawiono dane uzyskane przez Badacza I, który nie posiadał wcześniejszego doświadczenia w pracy z danio przebraniem. Zastosowanie metod I i II do iniekcji IP spowodowało znaczną śmiertelność ryb w ciągu pierwszych dwóch tygodni po zabiegu. W metodzie I śmierć zaobserwowano trzy dni po iniekcji, natomiast w metodzie II nastąpiła ona po dwóch dniach. 70% wstrzykniętych ryb wykazywało widoczne uszkodzenia ciała, zwłaszcza wokół miejsca iniekcji, objawiające się drastycznym zmniejszeniem rozmiaru ciała i jego zakrzywieniem od jednego do dwóch miesięcy po iniekcji IP (Rysunek 2A (iv,v)). Przyjęto, że śmiertelność i zaobserwowane uszkodzenia można przypisać toksyczności doxorubicyny12, która mogła wyciekać z wylotu igły podczas procesu wstrzykiwania, uszkadzając narządy wewnętrzne wzdłuż drogi iniekcji. W metodzie I końcówka igły mogła dotykać jelit (Rysunek 2A(i)), natomiast w metodzie II mogła dotykać pęcherza pławnego (Rysunek 2A(ii)). Postulowano, że stosując metodę III (Rysunek 2A(iii)), można zapobiec dotykaniu końcówką igły jakichkolwiek narządów wewnętrznych. Rzeczywiście odnotowano znaczną poprawę przeżywalności – 80% ryb przeżyło miesiąc po iniekcji (Rysunek 2B). Stanowi to znaczną poprawę w porównaniu z przeżywalnością dla metod I i II, która wynosiła odpowiednio 53,33% i 33,33%. Co ważne, 80% ryb, które przeżyły, wykazywało prawidłowy kształt ciała, w przeciwieństwie do ryb z grup metod I i II (Rysunek 2A(vi)). Aby potwierdzić pomyślne utworzenie modelu DIC, oceniono funkcję serca poprzez pomiar procentowej frakcji wyrzutowej (EF%). Rzeczywiście, w grupie z zastosowaniem metody III zaobserwowano znaczną redukcję EF% w 56 dniu po iniekcji (Rysunek 2C).
Powtarzalność metody III w wykonaniu różnych badaczy 
Aby udowodnić, że metoda III może zostać łatwo opanowana przez różnych badaczy, do badania zrekrutowano 3 osoby, które wcześniej nie pracowały z danio przebranie. Po kilku pierwszych próbach z zastosowaniem metody III, wszyscy badacze uzyskali przeżywalność na poziomie odpowiednio 85,71%, 95% i 83,33% 56 dni po iniekcji oraz wyraźnie obniżoną EF (Rysunek 3A,B). Należy zaznaczyć, że trzej badacze powtórzyli swoje eksperymenty odpowiednio 3, 3 i 2 razy, za każdym razem uzyskując pomyślne wyniki. Dane te potwierdziły powtarzalność metody III, umożliwiając badaczom bez wcześniejszego doświadczenia w pracy z rybami generowanie wiarygodnych modeli DIC.
W jednej z pierwszych prób z zastosowaniem metody III, badacz II przetestował odstępstwo od tej metody: zamiast kąta 0°, podczas wprowadzania igły przez skórę zastosowano kąt 45° (Rycina 2A(iii), przerywana strzałka). Tylko 15% ryb przeżyło dwa miesiące po wstrzyknięciu (Rycina 3A), przy czym u 80% przeżyłych ryb stwierdzono znaczne uszkodzenia ciała. Dane te wykazały, że kąt nakłucia jest krytycznym etapem dla sukcesu metody III.
Metoda III umożliwia stworzenie modelu chronicznego DIC 
Postawiono hipotezę, że znacząco zredukowane uszkodzenia organizmu mogą umożliwić wielokrotne iniekcje do jam brzusznych (IP) u tej samej ryby, co naśladowałoby model chronicznego DIC u myszy13,14. W związku z tym w metodzie III zastosowano serię iniekcji przez 4 kolejne tygodnie, z dawką 5 µg/g Dox tygodniowo (Rysunek 4A). W tym eksperymencie przeżyło 100% iniekowanych ryb, a 80% z nich nie wykazywało oznak uszkodzeń organizmu. Co istotne, w 56. dniu po iniekcji (dpi) odnotowano znacząco obniżoną frakcję wyrzutową, co wskazuje na pomyślne stworzenie modelu chronicznego DIC u dorosłych danio przebrzuchłych (Rysunek 4B).
<img alt="Proces wstrzykiwania igłą u ryb; schemat przedstawiający kąty i lokalizacje w jamie ciała dla badania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Lokalizacja i kąt wprowadzenia igły w nowej metodzie wstrzykiwania do jamy ciała (IP). (A) Miejsce wprowadzenia igły. Ryba znajduje się w pozycji odwróconej, eksponując stronę brzuszną. Głowa skierowana jest w prawo. Naturalny otwór znajdujący się między płetwami piersiowymi ułatwia przebicie skóry. (B) Kąt wprowadzenia igły. Wynosi on niemal 0 stopni względem powierzchni ciała ryby. (C) Tor prowadzenia igły pod skórą. Po dostaniu się do jamy brzusznej końcówka igły jest stale monitorowana. Punkt wlotowy wygląda inaczej niż na Rysunku 1A ze względu na odkształcenie skóry podczas procesu przebijania. (D) Ryba po uwolnieniu Dox. Jama brzuszna staje się czerwona po uwolnieniu Dox. (E) Ryba po wstrzyknięciu IP. Po wyjęciu igły nie stwierdzono wycieku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig01large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Porównanie metod iniekcji u danio przebrzosławionego; wykres przeżywalności; wykres efektywności; wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Porównanie trzech metod iniekcji doprzewnowej (IP) u dorosłych ryb danio przebrzosławionych. (A) Schematy trzech metod iniekcji IP. (i-iii) Przedstawiono schematy klasycznej iniekcji IP (metoda I), alternatywnej iniekcji IP (metoda II) oraz nowej metody (metoda III). Strzałki wskazują miejsca penetracji i kąt wprowadzenia igły dla trzech metod iniekcji. Przerywana strzałka oznacza nieprawidłowy kąt penetracji igły. Pasek skali: 5 mm. (iv-vi) Zmniejszona wielkość ciała i zakrzywiony kształt ciała w modelach DIC. Przedstawiono reprezentatywne ryby z grupy DIC w 56 dpi. (B) Porównanie krzywych przeżywalności dla trzech metod iniekcji IP. Liczbę przeżyłych ryb odnotowywano co tydzień. (Eksperyment rozpoczęto z całkowitą liczbą n = 15). (C) Ocena funkcji serca ryb w 56 dpi po stresie wywołanym Dox. Grupa kontrolna 1x HBSS obejmowała n = 6 ryb, a eksperyment rozpoczęto z całkowitą liczbą n = 15 ryb w każdej z 3 partii poddanych iniekcji Dox. Wartości przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig02large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres analizy przeżywalności i wykres słupkowy EF% po wstrzyknięciu w różnych warunkach eksperymentalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Metoda III umożliwia spójne ustanowienie modelu DIC u zebrafish przez 3 różnych badaczy. (A) Krzywe przeżywalności ryb z DIC przy zastosowaniu Metody III przez trzech różnych badaczy. Wysoki wskaźnik przeżywalności odnotowano u wszystkich trzech badaczy. Liczbę żywych ryb rejestrowano co tydzień. Niski wskaźnik przeżywalności odnotowano u badacza II w przypadku zastosowania nieudanej Metody III (kąt penetracji igły 45°, wskazany przerywaną strzałką na Rysunku 2A). (B) Ocena funkcji serca ryb z DIC przy zastosowaniu Metody III przez trzech różnych badaczy. Łącznie Badacz II, dla kąta penetracji igły 45°, wykorzystał 3 partie (9, 12, 14) ryb do wstrzyknięcia Dox. Dla kąta penetracji igły 0° zastosowano n = 6 ryb w 1x HBSS jako wspólną grupę kontrolną. Eksperyment rozpoczęto od całkowitej liczby n = 85 ryb z RII (9, 12, 14), RIII (8, 6, 6) i RIV (12, 18) wykorzystanych w każdej z 8 partii wstrzykniętych Dox przez trzech badaczy (II, III, IV), odpowiednio. Wartości przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Harmonogram wstrzykiwań DOX i wyniki echokardiografii; wykres słupkowy przedstawia różnice w EF% w grupie WT(HBSS) w porównaniu z grupą Dox." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Metoda III umożliwia wielokrotne wstrzyknięcia Dox u dorosłego danio pręgowanego, odtwarzając przewlekłe modele DIC u gryzoni. (A) Schematy modelu wielokrotnych wstrzykiwań. 5 µg/g Dox (5 µL) wstrzykiwano w czterech kolejnych tygodniach. (B) Przewlekły model DIC objawia się obniżoną wartością EF% w 56 dpi. Wartości przedstawiono jako średnia ± błąd standardowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Opisano nową metodę iniekcji dootrzewnowej (IP) u dorosłych ryb pręgowanych. W przypadku stosowania związków toksycznych, takich jak doksorubicyna, procedura ta jest bardziej skuteczna niż dwie wcześniej opisane metody IP. Technika ta została zaprojektowana tak, aby mogła być łatwo zaadoptowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w modelowaniu danio pręgowanego.

Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność

The adult zebrafish (Danio rerio), which is genetically accessible, is being employed as a valuable vertebrate model to study human disorders such as ...

Naszym celem jest wygenerowanie modeli kardiotoksyczności indukowanej antracyklinami u dorosłych danio pręgowanego, abyśmy mogli odkryć nowe geny i związki terapeutyczne. Niezawodna metoda wstrzykiwania IP jest niezbędna, aby zapewnić sukces tego projektu. Dotychczas opracowane metody iniekcji IP to techniki klasyczne i alternatywne.Podczas gdy metoda klasyczna penetruje rybę od strony brzusznej przez linię środkową między płetwami brzusznymi, metoda alternatywna penetruje rybę od strony grzbietowej znajdującej się między płetwami brzusznymi a odbytowymi. Ze względu na toksyczność doksorubicyny stwierdzono znaczne uszkodzenia ciała i śmiertelność ryb przy użyciu obecnych dwóch metod IP. Badacze muszą zostać gruntownie przeszkoleni, zanim modele chorób będą mogły być wiarygodnie osadzone w ich rękach.Zaprojektowaliśmy nową metodę iniekcji IP, dostosowując miejsce penetracji igły i kąt penetracji igły. Wstrzykujemy przez naturalny otwór znajdujący się w okolicy brzusznej między płetwami piersiowymi i penetrujemy przez unikalny kierunek od przodu do tyłu. Na początek rozpuść pięć miligramów doksorubicyny w proszku w jednym mililitrze wody destylowanej.Podnieś bulion do 1,5 mililitrowej tuby. Następnie należy łowić ryby w grupach, w których różnica masy ciała wynosi mniej niż 10%. Po znieczuleniu ryb w wodzie zarodkowej za pomocą tricainy, wyjmij rybę z wody, przetrzyj obie strony ciała ryby czystą bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar wody.Następnie umieść znieczuloną rybę w rowku osadzonej gąbki z brzuchem skierowanym do góry. Napełnij strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów wyposażoną w igłę o rozmiarze 34 pięcioma mikrolitrami roztworu roboczego doksorubicyny. Wbić igłę pod kątem prawie zerowym od środka płetwy piersiowej w kierunku tylnej strony jamy serca.Skieruj igłę w stronę ogona i wejdź pod srebrną skórę. Powoli dozuj roztwór dokujący, a następnie wyjmij igłę wzdłuż pierwotnej ścieżki, aby zapobiec wyciekowi. Roztwór dokujący pokoloruje brzuch na czerwono.

an-intraperitoneal-injection-technique-adult-zebrafish-that-minimizes

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszym materiale przedstawiamy sposób wykonywania iniekcji do zatoki nadoczodołowej u dorosłych rybek zebrafish.

Iniekcja zaoczna u dorosłych danio pręgowanych

Prezentujemy technikę wstrzykiwania dosytniewnego u dorosłych rybek danio-ostrobramkowych. Używamy mikrosyringi NanoFil o pojemności 10 μl, sterowanej za pomocą kontrolera Micro4 oraz pompy UltraMicroPump III. Demonstracja obejmuje wykorzystanie zimnej wody jako środka znieczulającego.

Wtryskiwanie doszpikowe u dorosłych danio prążkowanych

Ten film opisuje technikę wstrzykiwania domięśniowego w celu dostarczania związków do mięśni grzbietowych dorosłego danio pręgowanego.

Wstrzyknięcie domięśniowe (IM): Podanie związku do mięśnia grzbietowego dorosłego danio pręgowanego

Ten film opisuje technikę iniekcji dootrzewnowej, metodę dostarczania roztworów do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego.

Wstrzyknięcie dootrzewnowe: metoda dostarczania roztworu do jamy brzusznej dorosłego danio pręgowanego

Ten film opisuje technikę dostarczania związków do serca dorosłego danio pręgowanego za pomocą iniekcji dopiersiowej.

Wstrzyknięcie do klatki piersiowej: podanie związku do serca dorosłego danio pręgowanego

Ta metoda polega na wstrzyknięciu 0,5−3 μL roztworu do klatki piersiowej dorosłego danio pręgowanego. Procedura skutecznie dostarcza białka i związki chemiczne w pobliże serca danio pręgowanego, nie uszkadzając przy tym narządu. Podejście to nadaje się do badania wpływu czynników egzogennych na różne tkanki serca.

Wstrzyknięcie do klatki piersiowej w celu zbadania serca dorosłego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany i skuteczny protokół dożylnego wstrzykiwania komórek lub środków farmakologicznych dorosłemu danio pręgowanemu, co skutkuje zwiększonym wszczepieniem komórek i zwiększonymi wskaźnikami przeżycia leczonego danio pręgowanego.

Zoptymalizowane wstrzyknięcie dożylne dorosłym danio pręgowanym

Zebrafish stanowią cenny model do badania mechanizmów regeneracji serca u kręgowców. W niniejszym protokole przedstawiamy metodę indukcji zawału serca u dorosłych osobników tego gatunku z wykorzystaniem kriourazu. Metoda ta prowadzi do masowej śmierci komórek w obrębie 20% ściany komory, co przypomina zmiany obserwowane w zawałach u ssaków.

Indukcja zawału mięśnia sercowego u dorosłych rybek danio-osterskich z wykorzystaniem kriourazu

Przedstawiono szybki sposób na badanie modyfikatorów czerniaka za pomocą autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego. Wykorzystuje wektor miniCoopR, który pozwala na ekspresję genów kandydujących na czerniaka w melanocytach. Opisano metodę uzyskiwania krzywych przeżycia wolnych od czerniaka, test inwazji, protokół barwienia przeciwciałami melanocytów łuskowych oraz test przeszczepiania czerniaka.

Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego

Określenie wszczepienia komórek dawcy stanowi wyzwanie w modelach przeszczepu szpiku kostnego u myszy, które nie mają dobrze zdefiniowanych markerów fenotypowych. Opisaliśmy metodologię ilościowego oznaczania wszczepienia męskich komórek dawcy u samic myszy biorców przeszczepu. Metoda ta może być stosowana u wszystkich szczepów myszy do badania funkcji HSC.

Wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym do określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego

Poznaj nową metodę iniekcji dootrzewnowej u dorosłych Danio rerio, która zmniejsza uszkodzenia ciała i śmiertelność ryb. Ta technika ułatwia badania kardiotoksyczności doksorubicyny.

Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność (Wideo) | JoVE Journal

Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność

Przeglądaj więcej filmów