Name: Opracowanie biohybrydowej sondy mikroskopowej sił atomowych opartej na żądłach komarów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Poznaj metodę tworzenia biohybrydowych sond AFM z żądeł komarów do badania mechanizmów ugryzień. Protokół umożliwia precyzyjną i powtarzalną analizę zachowań wektorowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe z kanadyjskiego New Frontiers in Research Fund (NFRF), programu Discovery Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) oraz stypendiów magisterskich Fonds de Recherche du Québec Nature et Technologies (FRQNT). Autorzy chcieliby również podziękować grupie prof. Yaoyao Zhao w McGill za wsparcie techniczne w zakresie druku 3D niektórych komponentów.

Gatunek komara użyty w tym protokole to niezainfekowana dorosła samica Aedes aegypti (A. aegypti), która została zamrożona i przechowywana w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Gatunek został dostarczony przez NIH/NIAID Filariosis Research Reagent Resource Center do dystrybucji za pośrednictwem BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. Odczynniki i sprzęt używany do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Odcięcie wargi sromowej od trąbki
<ol>
	<li>Za pomocą pęsety umieść martwego komara na szklanym szkiełku pod mikroskopem i upewnij się, że na końcu trąbki znajduje się zwężająca się końcówka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Trzymając komara na szkiełku, delikatnie przyłóż ostrze skalpela do warg sromowych w pobliżu głowy komara (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Przystąp do wykonania nacięcia w poprzek całej górnej połowy wargi sromowej (cięcie około 80 μm) z płytką głębokością penetracji przez grubość wargi sromowej. Upewnij się, że lekko naciskasz na ostrze, aby przeciąć tylko wargę sromową, ale nie pęczek, który znajduje się pod spodem.</li>
	<li>Za pomocą pęsety mocno przytrzymaj głowę komara, a drugą parą precyzyjnych pęset delikatnie ściśnij wargę sromową w dowolnym miejscu między zwężającą się końcówką a miejscem nacięcia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B).
	<ol>
		<li>Pociągnij pęsetę trzymającą wargę sromową w kierunku zwężającej się końcówki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Kontynuuj ciągnięcie pęsety, aż warga sromowa oderwie się i zostanie całkowicie usunięta z pęczka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść komara pod mikroskopem i sprawdź, czy obecna jest końcówka obrąbka. Można to rozpoznać po obecności zwężającej się końcówki na pęczku (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
</ol>
2. Oddzielenie wierzchołka obrąbka od innych elementów pęczka
<ol>
	<li>Zaciśnij i zamknij końcówki zestawu precyzyjnych pęset i umieść końcówkę pęsety tuż obok obrąbka w pobliżu jego końcówki.</li>
	<li>Użyj końcówki pęsety, aby przyłożyć delikatną siłę do obrąbka w kierunku prostopadłym do długości pęczka (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
	<li>Kontynuuj przesuwanie obrąbka po szkiełku szkiełkowym, aż do oddzielenia obrąbka od innych elementów pęczka.</li>
	<li>Sprawdź próbkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że osiągnięto prawidłową separację między obrąbkiem a innymi elementami pęczka (<silna klasa="xfig">Rysunek 3, po lewej). Jeśli separacja się nie powiedzie, wróć do kroku 2.1.</li>
</ol>
3. Przecinanie końcówki obrąbka
<ol>
	<li>Gdy obrąbek jest nadal na szkiełku podstawowym, umieść ostrze skalpela nad obrąbkiem w odległości około ~200 μm od końcówki obrąbka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A). Delikatnie dociśnij i przetnij końcówkę obrąbka na całej długości. Podczas gdy końcówka obrąbka powinna być jak najkrótsza, ~200 μm to najlepsze, z czym może sobie poradzić obecne podejście.</li>
	<li>Zmierz długość wyciętego obrąbka, aby upewnić się, że nie jest dłuższa niż 300 μm (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 4B) za pomocą dowolnego cyfrowego oprogramowania pomiarowego. W tym protokole użyto ImageJ14.</li>
</ol>
4. Chwytanie czubka obrąbka
<ol>
	<li>Za pomocą pęsety precyzyjnej zlokalizuj i odizoluj końcówkę obrąbka na szklanym szkiełku. Wyrzuć każdą część pozostałą na szkiełku podstawowym inną niż końcówka obrąbka.</li>
	<li>Za pomocą tej samej precyzyjnej pęsety powoli i lekko ściśnij obrąbek, aby odcięty koniec był wolny i nie był zasłonięty pęsetą. Upewnij się również, że orientacja obrąbka jest równoległa do kierunku długości pęsety, a odcięty koniec obrąbka jest skierowany w stronę przeciwną do korpusu pęsety.</li>
	<li>Gdy próbka zostanie mocno ściśnięta, usuń siłę zacisku trzymającą końcówki pęsety razem. Końcówka obrąbka przyklei się do jednej z końcówek pęsety.</li>
	<li>Pod mikroskopem sprawdź końcówki pęsety i upewnij się, że końcówka obrąbka znajduje się na jednej z końcówek pęsety (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). Jeśli końcówka obrąbka nie znajduje się na pęsetie, wróć do kroku 4.2, a jeśli końcówka obrąbka nie znajduje się na pęsetie ani na szkiełku podstawowym, wróć do kroku 1.</li>
</ol>
5. Nakładanie żywicy epoksydowej na belkę wspornikową bez końcówki
<ol>
	<li>Umieść kroplę (~0,05 ml) żywicy epoksydowej na krawędzi nowego szkiełka podstawowego, bezpośrednio odlewając klej z oryginalnej butelki/pojemnika. Umieść szkiełko ze szkła epoksydowego pod stacją sondy i skup się na niej.</li>
	<li>Zamontuj wspornik AFM bez końcówki do zespołu zacisku, zabezpieczając podstawę (tj. większy koniec), pozostawiając koniec wspornika wolny i zawieszony w przestrzeni. Upewnij się, że spód wspornika AFM jest skierowany w dół.</li>
	<li>Zamontuj manipulator na stacji pomiarowej.</li>
	<li>Podnieś oś Z manipulatora do pozycji, w której wspornik bez końcówki znajduje się kilka milimetrów nad szklanym suwakiem zawierającym żywicę epoksydową.</li>
	<li>Ręcznie przesunąć manipulator tak, aby wspornik bez końcówki był widoczny w polu view kamery na stacji pomiarowej.</li>
	<li>Za pomocą manipulatora przesuń wspornik AFM wzdłuż kierunków X i Y, aż końcówka wspornika będzie spoczywać bezpośrednio nad żywicą epoksydową na krawędzi szkiełka podstawowego.</li>
	<li>Używając ponownie manipulatora, powoli opuść wspornik bez końcówki w kierunku Z przez krawędź szklanego suwaka.</li>
	<li>Gdy wspornik jest opuszczany i zbliża się do szklanego zjeżdżalni, opuszczaj wspornik bardzo powoli, aż po raz pierwszy dotknie żywicy epoksydowej. Nie opuszczaj dalej wspornika.</li>
	<li>Ostrożnie włącz manipulator, aby powoli przesuwać wspornik w kierunku X lub Y i wyjmij wspornik z puli żywicy epoksydowej, ciągle przesuwając wspornik w wybranym kierunku, aż wspornik zostanie całkowicie oddzielony od żywicy epoksydowej na szkiełku szkiełkowym. Wspornik bez końcówki powinien mieć na końcu miniaturową bańkę żywicy epoksydowej, widoczną pod stacją sondy.</li>
	<li>Podnieś wspornik w kierunku Z za pomocą manipulatora.</li>
</ol>
6. Łączenie końcówki obrąbka z belką wspornikową bez końcówki
<ol>
	<li>Obróć manipulator wokół długiej osi wspornika o 90 stopni i oprzyj manipulator na stacji pomiarowej na boku urządzenia. W tej konfiguracji grubości na całej długości wspornika AFM są w kierunku pionowym.</li>
	<li>Umieść precyzyjną pęsetę, która zawiera końcówkę obrąbka, pod kamerą stacji sondy tak, aby cała długość końcówki obrąbka była widoczna na monitorze komputera.</li>
	<li>Umieść zespół manipulatora trzymającego zacisk i wspornik bez końcówki pod kamerą stacji pomiarowej tak, aby cała długość wspornika bez końcówki była widoczna na monitorze komputera.</li>
	<li>Ustaw ostrość mikroskop stacji pomiarowej na końcówce obrąbka i wsporniku bez końcówki.</li>
	<li>Ustaw wspornik prostopadle do końcówki obrąbka, ostrożnie i ręcznie obracając manipulator (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6A).</li>
	<li>Korzystając ze stopni swobody manipulatora, powoli przesuwaj wspornik bez końcówki w kierunkach XY, tak aby klej na wsporniku stykał się z odciętym końcem końcówki obrąbka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6B).</li>
	<li>Utwardź żywicę epoksydową, utrwalając skrzyżowanie między wspornikiem a obrąbkiem komara.</li>
	<li>Po utwardzeniu żywicy epoksydowej delikatnie włącz manipulator w kierunkach XY i odsuń wspornik od pęsety, sprawdzając, czy końcówka obrąbka stoi teraz na belce wspornikowej bez końcówki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6C).</li>
</ol>

Bio-Hybrid AFM Probe with Mosquito Labrum for Studying Biting Behaviors

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+vector+control+response+2017%E2%80%932030%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global vector control response 2017–2030.</a> World Health Organization. , (2017).</li>
<li>Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+mosquitoes%E2%80%99+painless+piercing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Lessons from mosquitoes’ painless piercing.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).</li>
<li>Ma, G., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle%2C+bio-microneedle+and+bio-inspired+microneedle%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journ+of+Contr+Relea%22%5BJournal%5D)">Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review.</a> Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).</li>
<li>Kong, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micronano+structure+and+mechanics+behavior+of+mosquito%E2%80%99s+proboscis+biomaterials+with+applications+to+microneedle+design%5BTitle%5D)+AND+%22Advan+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Micronano structure and mechanics behavior of mosquito’s proboscis biomaterials with applications to microneedle design.</a> Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).</li>
<li>Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+proboscis-inspired+needle+insertion+to+reduce+tissue+deformation+and+organ+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement.</a> Sci Rep. 10 (1), 12248(2020).</li>
<li>Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Scanning+Probe+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Probe+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Introduction to Scanning Probe Microscopy.</a> Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).</li>
<li>García, R., Peréz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+atomic+force+microscopy+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Surf+Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamic atomic force microscopy methods.</a> Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).</li>
<li>Thurner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+and+indentation+force+measurement+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Nanomed+and+Nanobio%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone.</a> WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).</li>
<li>Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotech%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).</li>
<li>Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+atomic+force+microscopy+for+-critical+dimension+metrology%5BTitle%5D)+AND+%22Meas+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology.</a> Meas Sci Technol. 28 (1), 012001(2017).</li>
<li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+proboscis%3A+An+elegant+biomicroelectromechanical+system%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E%22%5BJournal%5D)">Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system.</a> Phys Rev E. 82 (1), 011910(2010).</li>
<li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+prediction+of+insertion+force+for+the+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bionic+Eng%22%5BJournal%5D)">Measurement and prediction of insertion force for the mosquito.</a> J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).</li>
<li>Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+a+mosquito+bite+with+applications+to+microneedle+design%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinspir+Biomim%22%5BJournal%5D)">Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design.</a> Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001(2008).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide">http://imagej.nih.gov/ij/docs/guide</a> (2012).</li>
<li>Dai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surface+measurements+at+sidewalls+of+nano-+and+micro-structures%5BTitle%5D)+AND+%22Measur+Sci+and+Technol%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures.</a> Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Krok 1 protokołu ma na celu oczyszczenie próbki biologicznej z niechcianego warg sromowych. Aby to osiągnąć, wykonuje się nacięcie na wargach sromowych, ale nie na pęczku, który spoczywa bezpośrednio pod wargą sromową (ryc. 1). Ponieważ pęczek i warga sromowa nie są ze sobą połączone na ich styku (tj. warga sromowa może swobodnie przesuwać się wzdłuż pęczka i jest utrzymywana na miejscu tylko przez jego przymocowanie do głowy komara), wykonane nacięcie ma na celu oddzielenie części wargi sromowej od głowy komara, ułatwiając w ten sposób usunięcie zewnętrznej osłony. Podczas wyciągania wargi sromowej z próbki technik powinien odczuwać lekki opór spowodowany przez dolną połowę wargi sromowej nadal przyczepioną do komara. Oczekuje się, że ta siła oporu zwolni się stosunkowo łatwo, ponieważ nacięcie będzie sprzyjać propagacji pęknięć materiału biologicznego, indukując w ten sposób nieprzecięty segment wargi sromowej do rozerwania i powodując zsunięcie się całego warga sromowego z pęczka podczas ciągnięcia. Jeśli zostanie wykonane niewystarczające nacięcie, technik może odczuwać nadmierny opór podczas ciągnięcia i jest zachęcany do podjęcia próby kolejnego nacięcia przed kontynuowaniem protokołu.
Ważne jest, aby ćwiczyć miękki dotyk i cierpliwość w kroku 1 i kroku 4 podczas manipulowania obrąbkiem poprzez szczypanie pęsetą. Chociaż obrąbek jest stosunkowo sprężysty, nadal może ulec uszkodzeniu, jeśli zostanie zbyt agresywnie ściśnięty pęsetą. Technik jest prowadzony, aby lekko uszczypnąć wargę sromową/obrąbek, co oznacza, że powinien przyłożyć minimalną siłę potrzebną do przytrzymania wargi sromowej/obrąbka. Ocenę obecności uszkodzeń można przeprowadzić na końcu kroku 1 i kroku 4 podczas badania próbki pod mikroskopem. Zaleca się sprawdzenie trąbki pod kątem wszelkich nieprawidłowości na jej długości (tj. wgniecenia, rozdarcia, separacje w segmentach). Jeśli istnieje podejrzenie, że próbka jest uszkodzona na końcu obrąbka, wyrzuć ją i uruchom ponownie protokół.
Kluczowe etapy procesu protokołu, takie jak krok 3 i krok 6, wymagają szczególnej ostrożności. Aby wykonać krok 3, końcówkę obrąbka należy przyciąć ręcznie skalpelem. Zbyt krótkie cięcie sprawi, że reszta eksperymentu będzie wykładniczo trudniejsza, ponieważ może być zbyt mała, aby nią manipulować. Wręcz przeciwnie, jeśli końcówka przekracza 300 μm długości, staje się zbyt długa, aby można ją było zamontować na wsporniku AFM z powodu nadmiernego prostopadłego przesunięcia, które jest wprowadzane między końcówką obrąbka a wspornikiem AFM. Przesunięcie to jest spowodowane niedoskonałościami w procesie montażu i/lub krzywizną, które mogą występować w próbce, które stają się problematyczne przy większych długościach obrąbka. Również wsporniki z bardzo długimi końcówkami będą bardzo trudne w użyciu pod AFM. Podczas kroku 3 ważne jest, aby pamiętać, że wszystkie stylety pęczkowe (obrąbek, szczęki, żuchwy i gardło dolne) zostaną prawdopodobnie przecięte w tej procedurze. Obrąbek można łatwo zlokalizować i odizolować od pozostałych słupków w kroku 4 dzięki ręcznemu oddzielaniu, które zostało wykonane w kroku 2. W kroku 6, mimo że prawie niemożliwe jest upewnienie się, że końcówka jest idealnie normalna do wspornika pod mikroskopem optycznym, nadal konieczne jest zminimalizowanie kąta nachylenia, aby uniknąć niepożądanych warunków obciążenia w przyszłości.
Ważne jest również, aby wybrać odpowiednią żywicę epoksydową do mocowania żądła do wspornika AFM. Przetestowano różne wolno utwardzalne dwuskładnikowe żywice epoksydowe, które później okazały się nieidealne, ponieważ każde niewielkie drgania podłogi laboratoryjnej podczas procesu utwardzania może spowodować niepowodzenie eksperymentu. W związku z tym ostatecznie zdecydowano się na żywicę epoksydową utwardzaną promieniami UV. Zastosowany klej to szybkoutwardzalna żywica epoksydowa o niskiej lepkości, która jest w stanie utwardzić się w ciągu 5 sekund od ekspozycji na promieniowanie UV. Po zestaleniu klej staje się bardzo sztywny i ma doskonałą wytrzymałość, co powoduje, że wyprodukowana sonda kantylowa obrąbka zachowuje się jak pojedynczy korpus i nie ulega uszkodzeniu ani nie odkształca się w miejscu przylegania. Ta opcja zapewniła wystarczająco dużo czasu przed utwardzeniem, aby skonfigurować konfigurację we właściwej pozycji do przylegania żądła do wspornika AFM (krok 6.3), jednocześnie eliminując wszelkie problemy związane z wibracjami otoczenia ze względu na jego utwardzanie na polecenie.
Pozostałym kluczowym wyposażeniem w tym protokole jest stacja sondy, ostra pęseta i wspornik. Zastosowana stacja sondy wyposażona jest w obiektyw 5x zamontowany do kamery; Jednak dla tego protokołu nie jest konieczne używanie dokładnie tego modelu stacji pomiarowej. Przy wyborze stacji pomiarowej jedynym priorytetem jest zapewnienie wyraźnej i łatwej widoczności wspornika AFM i obrąbka. Używane ostre pęsety miały rozmiar końcówki 0,5 mm na 0,1 mm. Konieczne jest użycie pęsety o tym wymiarze końcówki lub podobnym, ponieważ używanie kleszczy o mniejszej drobności może prowadzić do trudności podczas manipulacji obrąbkiem. Wspornik użyty w tym protokole jest pozyskiwany ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Ten model wspornikowy został wybrany ze względu na jego wysoką sztywność, ponieważ duża siła musi zostać przeniesiona na końcówkę sondy przeciw komarom, aby naśladować rzeczywistą penetrację skóry. Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku wszystkich sond opartych na żądle, wspornik AFM nie może być zbyt miękki, ponieważ brak sztywności doprowadzi do wygięcia wspornika podczas testów AFM, co z kolei doprowadzi do braku rozwoju ciśnienia na końcówce sondy żądło. Spowoduje to, że sonda będzie niedokładnie naśladować proces pieczenia, co sprawi, że bardzo sztywne wsporniki AFM bez końcówek staną się wymogiem dla tego protokołu.
Podsumowując, zastosowanie biohybrydowej sondy AFM na bazie żądła do ilościowych badań penetracji/gryzienia mechanicznego ma wyjątkowe zalety w porównaniu z innymi metodami, które wymagają żywych komarów i ochotników 4,11,12 do przeprowadzenia podobnych badań. Ultrawysoka rozdzielczość wykrywania AFM może umożliwić pomiar z niespotykaną dotąd dokładnością, a sonda biohybrydowa umożliwia niemal realistyczną emulację rzeczywistych scenariuszy gryzienia, obejmując statystycznie istotną liczbę pomiarów bez konieczności angażowania ochotników 4,11,12. Ponadto materiały używane do produkcji mikroigieł są zazwyczaj podatne na pękanie lub wyboczenie 3,4, co nie jest reprezentatywne dla trąbki komara. Używanie samych części komara bardziej przypomina prawdziwy scenariusz gryzienia. Protokół ten może być potencjalnie dalej rozwijany i zautomatyzowany w celu uzyskania wysokiej przepustowości produkcji. Wreszcie, opracowany protokół może być potencjalnie wykorzystany do produkcji innych biohybrydowych sond AFM wykorzystujących żądła różnych zwierząt do badań ilościowych różnych zachowań związanych z gryzieniem/penetracją.

Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) poinformowała, że choroby przenoszone przez wektory (VBD) stanowią ponad 17% wszystkich chorób zakaźnych, które powodują ponad 7 000 000 zgonów rocznie na całym świecie. Na przykład, jako najbardziej śmiercionośne zwierzę na świecie, komary przenoszą liczne patogeny, takie jak denga, malaria i Zika, poprzez żywiące się krwią stawonogi, co powoduje 700 milionów infekcji każdego roku1. Kluczowe znaczenie mają badania nad opracowaniem skutecznych środków zapobiegania VBD, w tym naśladowanie zachowań komarów związanych z penetracją w celu zbadania ich mechanizmów gryzienia oraz badania potencjalnych barier w celu udowodnienia ich skuteczności w zapobieganiu penetracji. Jednym z kluczowych wyzwań jest opracowanie odpowiednich podejść do przeprowadzania takich badań. Podjęto wysiłki w literaturze, w tym nad opracowaniem igieł w skali mikro, które przypominają geometrię żądła komarów; jednak wiele materiałów użytych do produkcji tych mikroigieł (tj. materiały lepkosprężyste<klasa SUP = "xref">2, krzem (Si), szkło, ceramika <klasa SUP = "xref">3, itp.) ma inne właściwości mechaniczne niż materiał biologiczny trąbki komara. Materiały inżynieryjne mogą być kruche i podatne na pękanie i wyboczenie3,4, podczas gdy trąbka komara lepiej znosi złamania lub wyboczenia4. Zaletą posiadania sondy biohybrydowej wykorzystującej obrąbek komara zamiast materiałów inżynieryjnych jest to, że może ona być dokładniejszym odwzorowaniem mechanizmu przekłuwania komarów. Ponadto specjalistyczne narzędzia muszą być zintegrowane z mikroigłami w celu wykonywania badań ilościowych, takich jak dokładny pomiar siły5, co nie jest łatwo osiągalne przy użyciu niestandardowych konfiguracji przy użyciu zaprojektowanych mikroigieł.
Podejście oparte na mikroskopii sił atomowych (AFM) jest obiecujące, ponieważ działa poprzez zastosowanie wspornika z ultracienką końcówką, która jest starannie umieszczona blisko powierzchni próbki. Końcówka może skanować w poprzek lub być dociskana w kierunku/w powierzchnię, doświadczając różnych sił przyciągania lub odpychania ze względu na jej interakcje z próbką6. Interakcje te prowadzą do odchylenia wspornika, które jest śledzone przez odbicie wiązki laserowej od szczytu wspornika do fotodetektora6. Wyjątkowa czułość systemu na ruch umożliwia AFM przeprowadzanie różnorodnych pomiarów, w tym między innymi mapowania morfologicznego z dokładnością pikometru, pomiarów siły w zakresie od pikonewtonów do mikroniutonów oraz kompleksowych badań multifizycznych7. Na przykład wgłębienia AFM można wykonać w celu precyzyjnej oceny reakcji na przyłożoną siłę próbki, a także w celu zmierzenia twardości, elastyczności i innych właściwości mechanicznych próbki poprzez sprzężenie z odpowiednimi modelami analitycznymi8. Sonda AFM jest najczęściej wykonana z krzemu (Si) lub azotku krzemu (Si3N4)8 o długości 20-300 μm9 i promieniu końcówki rzędu kilku do kilkudziesięciu nanometrów10. Promień końcówki w skali nanometrowej może być idealny do zastosowań takich jak obrazowanie w wysokiej rozdzielczości; Nie posiada jednak cech biologicznych żądeł do badań, które próbują naśladować zachowania penetracyjne pod względem sztywności, promienia, kształtu i proporcji. Na przykład struktura mikroigłowa komara to pęczek, który ma proporcje ~6011 (długość ~1,5 mm do 2 mm; średnica ~30 μm)12. Chociaż można założyć, że konwencjonalna sonda AFM przypomina biologiczne żądło, takie jak obrąbek, jej odrębne właściwości materiałowe i wymiary nie będą odzwierciedlać rzeczywistej sytuacji podczas ugryzienia.
Aby umożliwić ilościowe badania zachowań penetracyjnych naśladujących biologiczne ukąszenia owadów lub innych zwierząt za pomocą żądeł, tutaj rozwijany jest proces wytwarzania bio-hybrydowych wsporników AFM z biologicznym żądłem w miarę rozwoju ich końcówki. Jako studium przypadku z powodzeniem zademonstrowano wspornik AFM z przymocowaną końcówką obrąbka komara. Wykorzystując istniejące informacje z literatury na temat typowych sił wprowadzających, których komar używa, aby przebić się przez skórę ofiary12,13, ten biohybrydowy wspornik AFM może potencjalnie umożliwić niemal rzeczywiste naśladowanie ukąszeń komarów pod zwykłym AFM. Protokół wykorzystania mikrobiologicznych żądeł do wytwarzania biohybrydowych wsporników AFM może być również zastosowany do opracowania innych biohybrydowych wsporników AFM opartych na ostrych żądłach do ilościowych badań różnych mechanizmów gryzienia.
Terminologie 
Schemat trąbki i jej elementów zainteresowania jest pokazany w Rysunek 1, a ich definicje są następujące: (1) Trąba: część ciała z pyska komara, która pozwala komarowi się odżywiać, ze strukturą rdzenia-skorupy składającą się z pęczka (rdzenia) i wargi sromowej (muszli), (2) Labium: ciemna i zewnętrzna osłona trąby2, (3) Pęczek: grupa smukłych igieł znajdujących się wewnątrz warg sromowych, w tym dwie szczęki, dwie żuchwy, gardło dolne i obrąbek stawowy2, (4) Gardło dolne: odpowiedzialne za wydzielanie śliny do krwiobiegu gospodarza2, (5) Szczęki: ząbkowany członek wspomagający mechanizm karmienia2, (5) Żuchwy: podobne do szczęki, pomagają komarowi w mechanizmie żerowania i mają ostrą końcówkę2, (6) Obrąbek: główny element do penetracji skóry ofiary, który jest znacznie większy niż szczęki, żuchwy i gardło dolne. Posiada również struktury sensoryczne, które pozwalają mu znaleźć naczynia krwionośne i kanały wewnętrzne pod skórą2, (7) Manipulator: zespół z trzema stopniami swobody i dokładnością w skali mikronowej do pozycjonowania, umożliwiający ruch w kierunkach XYZ, (8) Zespół zaciskowy: wykonany na zamówienie 2-częściowy zacisk montowany na manipulatorze, używany do zaciskania bezkońcówkowego wspornika AFM podczas eksperymentu.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 5-SA-SE Prosta, stożkowa, ultra drobno spiczasta pęseta</td><td>Excelta</td><td>N/A</td><td>Do manipulowania/preparowania trąbki.</td></tr><tr><td>Stacja pomiarowa C-4D</td><td>Everbeing Int' l Korporacja&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td>Używany do montażu AFM.</td></tr><tr><td>Bezkońcówkowy kątownik w trybie gwintowania</td><td>NanoAndMore USA</td><td>Wspornik TL-NCH</td><td>AFM używany do montażu obrąbka. Specyfikacje są pokazane tutaj: <mocny> Kształt< / mocny>: Belka <silna> Stała siły< / mocna>: 42 N / m (10 - 130 N / m): <silny> Częstotliwość rezonansowa< / silny>: 330 kHz (204 - 497 kHz) <silny>długość</mocny>: 125 &mikro; m (115 - 135 &mikro; m) <mocny>Szerokość</mocny>: 30 &mikro; m (22,5 - 37,5 i mikro; m) < mocny> grubość< / mocny>: 4 i mikro; m ( 3 - 5 & mikro; m)</td></tr> <tr><td>UV Expoxy</td><td>Let's żywica</td><td>ALR00146</td><td>Do mocowania żądeł.</td></tr></tbody></table>

opracowanie biohybrydowej sondy mikroskopowej sił atomowych opartej na żądłach komarów

Development of a Bio-Hybrid Mosquito Stinger-Based Atomic Force Microscopy Probe

Komary, znane jako najbardziej śmiercionośne zwierzęta dla ludzi ze względu na ich zdolność do przenoszenia chorób, stanowią stałe wyzwanie dla zdrowia publicznego. Obecnie stosowana strategia profilaktyki pierwotnej obejmuje repelenty chemiczne, które często okazują się nieskuteczne, ponieważ komary szybko rozwijają odporność. W związku z tym kluczowe znaczenie ma wynalezienie nowych metod prewencyjnych. Taki rozwój opiera się na dokładnym zrozumieniu zachowań związanych z gryzieniem komarów, co wymaga eksperymentalnej konfiguracji, która dokładnie odwzorowuje rzeczywiste scenariusze gryzienia z kontrolowanymi parametrami testowymi i pomiarami ilościowymi. Aby wypełnić tę lukę, zaprojektowano biohybrydową sondę mikroskopii sił atomowych (AFM), której końcówką jest żądło biologiczne - a konkretnie obrąbek plamowy komara. Ta biohybrydowa sonda, kompatybilna ze standardowymi systemami AFM, umożliwia niemal autentyczną symulację zachowań związanych z penetracją komarów. Metoda ta stanowi krok naprzód w ilościowych badaniach mechanizmów gryzienia, potencjalnie prowadząc do stworzenia skutecznych barier przeciwko chorobom przenoszonym przez wektory (VBD) i otwierając nowe możliwości w walce z chorobami przenoszonymi przez komary.

Obrazy z pomiarów za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) wykonanej biohybrydowej sondy AFM znajdują się na Rysunku 7. Końcówka labrum została pomyślnie przyklejona do belek wspornika pozbawionego końcówki. Ze względu na naturalną krzywiznę żądeł komarów oraz manualny charakter przedstawionego protokołu, niezwykle trudno jest uzyskać wspornik z końcówką żądła ustawioną idealnie prostopadle do belki. Kąt odchylenia między żądłem a wyimaginowaną linią środkową prostopadłą do wspornika wynosi zazwyczaj ~10 stopni. Choć wydaje się to powszechnym problemem podczas montażu sondy na wsporniku AFM15, niezamierzone nachylenie musi być uwzględnione podczas analizy sił i naprężeń. W przyszłych badaniach interesujące byłoby skupienie się na udoskonaleniu protokołu wykonania oraz przeprowadzenie badań z wykorzystaniem biohybrydowej sondy. Jest to pierwsza próba stworzenia biohybrydowej sondy AFM z wykorzystaniem żądła owada.
<img alt="Anatomia aparatów gębowych owadów, schemat cymby i pęczka z opisanymi strukturami, do celów edukacyjnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat cymby komara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig01large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat sekcji proboscis komara pokazujący strategiczne etapy rozmieszczenia pęsety i ostrza skalpela." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Usunięcie wargi dolnej (labium) proboscis komara. (A) Komar z pełnym proboscis, wykazujący obecność nienaruszonego, zwężającego się wierzchołka. (B) Miejsce nacięcia wargi dolnej oraz rozmieszczenie pęsety na wargi dolnej podczas procesu jej usuwania. (C) Kierunek pociągnięcia pęsetą podczas usuwania wargi dolnej. (D) Finalnie wypreparowany pęczek z nienaruszonym wierzchołkiem po usunięciu wargi dolnej, z wciąż obecnym i nienaruszonym zwężającym się wierzchołkiem wargi górnej (labrum). Paski skali: 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy analizy pęczka owadziego; zaznaczono labrum, elementy pęczka, kierunek ruchu pęsety." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Oddzielenie labrum od niepożądanych elementów pęczka. (A) Miejsce umieszczenia pęsety i kierunek jej nacisku jako technika oddzielania elementów pęczka ssawki. (B) Ssawka po manipulacji w celu oddzielenia labrum od pozostałych elementów pęczka. Paski skali: 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mikroskopowy rozmieszczenia skalpela i przebicia skóry przez wierzchołek wargi w analizie anatomicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Izolacja pożądanego wierzchołka wargi w celu zamocowania go do wspornika AFM. (A) Miejsce nacięcia wargi w celu usunięcia jej wierzchołka. Pasek skali: 200 µm. (B) Wierzchołek wargi po odcięciu od jej trzonu ma długość około 200-300 µm. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz z mikroskopu; wierzchołek labrum trzymany pęsetą; badanie procesu przebijania przez owada; struktura biologiczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Mocowanie wierzchołka labrum do pęsety przed procesem klejenia. Wierzchołek labrum przymocowany do jednego z ramion pęsety, przy czym niecięty koniec labrum pozostaje wolny i jest skierowany w stronę przeciwną do korpusu pęsety. Pasek skali: 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Sekwencja pomiaru wspornika: mikroskopowa analiza kontaktu wspornika; proces interakcji z wargą." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Sekwencja montażu wierzchołka wargi do wspornika bez wierzchołka. (A) Orientacja wspornika bez wierzchołka w pozycji prostopadłej względem wargi. (B) Połączenie wspornika bez wierzchołka z wargą i utwardzanie kleju epoksydowego użytego do utrwalenia połączenia między dwoma komponentami. (C) Gotowa, utwardzona biohybrydowa sonda AFM bez podtrzymywania wargi pęsetą. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat wspornika z detalem wierzchołka labrum; ustawienie mikroskopowe do analizy w nanoskali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66675/66675fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Obrazy SEM biohybrydowej sondy AFM. (A) Widok ogólny wierzchołka labrum i wspornika bez wierzchołka. Pasek skali: 200 µm. (B) Powiększony widok wierzchołka labrum. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66675/66675fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ilościowe i kontrolowane badania zachowań związanych z gryzieniem owadów są kluczowe dla opracowania skutecznych strategii zwalczania chorób przenoszonych przez wektory. W tym kontekście przedstawiono metodę wytwarzania sondy do biohybrydowej mikroskopii sił atomowych (AFM).

Opracowanie biohybrydowej sondy mikroskopowej sił atomowych opartej na żądłach komarów

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The ...

Zamierzamy opracować wspornik AFM, aby potencjalnie ilościowo badać mechanizmy gryzienia komarów. Nasz protokół oferuje nową metodę tworzenia dokładnych, kontrolowanych i niezawodnych sond AFM w celu badania procesów gryzienia lub śpiewania zwierząt. Nasz protokół ma na celu dokładne symulowanie procesu gryzienia zwierząt, co powoduje, że obecne metodologie są albo niekontrolowane, niepowtarzalne w wiarygodny sposób, albo w niektórych przypadkach całkowicie niedokładne.Efekty naszej pracy są dwojakie. Po pierwsze, tworzymy protokół, który umożliwia innym badaczom wytwarzanie własnych, niestandardowych biohybrydowych wsporników AFM. Po drugie, nasza praca toruje drogę do tworzenia innych protokołów, które łączą systemy testowe z materiałem biologicznym w celu tworzenia bardziej realistycznych scenariuszy testowych.Na początek umieść martwego komara na szklanym szkiełku. Następnie delikatnie umieść ostrze skalpela nad wargą sromową, w pobliżu głowy komara. Wykonaj nacięcie w poprzek całej górnej połowy warg sromowych o płytkiej głębokości penetracji.Następnie za pomocą pęsety mocno przytrzymaj głowę komara. I za pomocą kolejnej pary precyzyjnych pęset delikatnie ściśnij wargę sromową między zwężającą się końcówką a nacięciem. Następnie pociągnij pęsetę trzymającą wargę sromową w kierunku zwężającej się końcówki.Umieść komara pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy końcówka obrąbka jest obecna. Teraz zaciśnij i zamknij końcówki zestawu precyzyjnej pęsety i umieść końcówkę pęsety tuż obok końcówki obrąbka. Użyj końcówki pęsety, aby przyłożyć delikatną siłę do obrąbka prostopadłego do długości pęczka.Kontynuuj przesuwanie obrąbka po szkiełku szkiełkowym, aż do oddzielenia się od innych elementów pęczkuł. Na koniec zbadaj próbkę pod mikroskopem, aby zweryfikować separację. Na początek weź szklane szkiełko zawierające obrąbek komarów.Umieść ostrze skalpela w odległości około 200 mikrometrów od końcówki obrąbka. Następnie delikatnie dociśnij, aby przeciąć końcówkę obrąbka na całej długości. Za pomocą precyzyjnej pęsety zlokalizuj i odizoluj końcówkę obrąbka na szklanym szkiełku.Następnie za pomocą tej samej pęsety delikatnie uszczypnij obrąbek. Gdy próbka zostanie mocno ściśnięta, stopniowo zwalniaj siłę zacisku. Pod mikroskopem zbadaj końcówki pęsety, aby potwierdzić obecność końcówki obrąbka na jednej z nich.Zacznij od umieszczenia niewielkiej ilości żywicy epoksydowej na krawędzi nowego szkiełka. Następnie umieść szklany szkiełko pod stacją sondy i skup się na niej. Zamontuj wspornik AFM bez końcówki do zespołu zacisku.Zabezpiecz podstawę wspornika, pozostawiając jego koniec wolny i zawieszony w przestrzeni. Następnie podłącz manipulator do stacji sondy. Wyreguluj oś Z manipulatora, aby podnieść wspornik o kilka milimetrów ponad szklaną prowadnicę zawierającą żywicę epoksydową.Następnie za pomocą manipulatora wyreguluj położenie wspornika AFM wzdłuż kierunku x i y nad żywicą epoksydową na szkiełku szklanym. Ostrożnie wyrównaj końcówkę wspornika bezpośrednio nad żywicą epoksydową. Następnie powoli opuść wspornik bez końcówki w kierunku z w kierunku żywicy epoksydowej na szkiełku szklanym, aż dotknie żywicy epoksydowej.Następnie delikatnie odsuń wspornik w kierunku x i y od żywicy epoksydowej, upewniając się, że jest oddzielony od suwaka. Podnieś wspornik w kierunku z za pomocą manipulatora. Obróć manipulator o 90 stopni wokół długiej osi wspornika i umieść go bokiem na stacji pomiarowej.Następnie umieść precyzyjną pęsetę z końcówką obrąbka pod kamerą stacji sondy tak, aby widoczna była cała jej długość. Następnie umieść zespół manipulatora z zaciskiem i wspornikiem pod kamerą tak, aby widoczna była cała długość wspornika. Obróć manipulator, aby ustawić wspornik prostopadle do końcówki obrąbka.Korzystając ze stopni swobody manipulatora, powoli przesuwaj końcówkę mniej wychylną w kierunkach x-y, tak aby klej na wsporniku stykał się z odciętym końcem końcówki obrąbka. Następnie utwardź żywicę epoksydową, aby zestalić połączenie między wspornikiem a obrąbkiem. Delikatnie odsuń wspornik od pęsety, upewniając się, że końcówka obrąbka jest przymocowana do belki wspornikowej.

development-bio-hybrid-mosquito-stinger-based-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Analizy czasowej i przestrzennej ekspresji genów odgrywają kluczową rolę w genomice funkcjonalnej. Hybrydyzacja in situ całego preparatu jest przydatna do określania lokalizacji transkryptów w obrębie tkanek i przedziałów subkomórkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hybrydyzacji in situ z modyfikacjami dla konkretnych tkanek docelowych u komarów.

Hybrydyzacja in situ gruczołów ślinowych, jajników i embrionów komarów wektorowych

Wśród trzech rodzajów komarów, mianowicie Anopheles, Aedes oraz Culex, techniki fizycznego mapowania genomu opracowano jedynie dla Anopheles, którego przedstawiciele posiadają czytelne chromosomy politeniczne. W przypadku rodzajów Aedes i Culex mapowanie cytogenetyczne pozostaje jednak wyzwaniem ze względu na niską jakość chromosomów politenicznych. Przedstawiamy tutaj uniwersalny protokół otrzymywania wysokiej jakości preparatów chromosomów mitotycznych oraz zoptymalizowany protokół FISH dla...

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ na chromosomach mitotycznych komarów

Prezentujemy zestaw pęsety optycznej sprzężonej z mikroskopem z arkuszem świetlnym oraz jej implementację do badania mechaniki komórkowej bez koralików w zarodku Drosophila.

Sondowanie mechaniki komórkowej za pomocą pęsety optycznej bez koralików w zarodku Drosophila

Biorąc pod uwagę ich prostą anatomię, jądra Anopheles oferują dobry model cytologiczny do badania spermatogenezy. Protokół ten opisuje hybrydyzację in situ z fluorescencją na całej górze, technikę stosowaną do badania tego procesu biologicznego, a także fenotyp szczepów transgenicznych zawierających mutacje w genach zaangażowanych w produkcję plemników.

Hybrydyzacja fluorescencji in situ w całości w celu zbadania spermatogenezy u komara Anopheles

Artykuł opisuje metody i odczynniki niezbędne do przeprowadzenia hybrydyzacji, reakcji łańcuchowej, fluorescencji RNA, hybrydyzacji in situ (HCR, RNA, WM-FISH), aby ujawnić wgląd w przestrzenną i komórkową rozdzielczość genów receptorów chemosensorycznych w czułku komara i palpie szczękowym.

Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów

Tutaj pokazujemy protokół obrazowania do obserwacji oddziaływań biomolekularnych za pomocą fototermicznego odsłuchu off-rezonansowego (PORT), gdzie zoptymalizowaliśmy parametry obrazowania, zidentyfikowaliśmy ograniczenia systemu i zbadaliśmy potencjalne ulepszenia w obrazowaniu montażu motywu DNA gwiazdy trzypunktowej.

Obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy DNA za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych Obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego

Spektroskopia pojemnościowa pojedynczego elektronu z sondą skanującą ułatwia badanie ruchu pojedynczego elektronu w zlokalizowanych obszarach podpowierzchniowych. Czuły obwód wykrywania ładunku jest wbudowany w kriogeniczny mikroskop skanujący w celu zbadania małych układów domieszek atomów pod powierzchnią próbek półprzewodnikowych.

Spektroskopia pojemnościowa jednoelektronowa z sondą skanującą

Metoda badania struktury fotoreceptora białkowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) jest opisana w tym artykule. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) ujawnia nienaruszone dimery białkowe na powierzchni miki.

Mikroskopia sił atomowych fotoreceptorów światła czerwonego przy użyciu ilościowego mapowania właściwości nanomechanicznych PeakForce

Przedstawiono metodologię przeprowadzania eksperymentów z mikroskopią siły tarcia dla szczotek stykowych: Dwie szczotki polimerowe, które są szczepione z (a) substratów i (b) sond koloidalnych, są przesuwane, aby pokazać, że dzięki zastosowaniu dwóch stykających się niemieszających się systemów szczotek, tarcie w stykach ślizgowych jest zmniejszone w porównaniu do mieszalnych systemów szczotek.

Pomiary preparatyki i mikroskopii siły tarcia niemieszających się, przeciwstawnych szczotek polimerowych

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Poznaj metodę tworzenia biohybrydowych sond AFM z żądeł komarów do badania mechanizmów ugryzień. Protokół umożliwia precyzyjną i powtarzalną analizę zachowań wektorowych.

Opracowanie biohybrydowej sondy mikroskopowej sił atomowych opartej na żądłach komarów

Przeglądaj więcej filmów