Opracowanie biohybrydowej sondy mikroskopowej sił atomowych opartej na żądłach komarów
26 kwietnia 2024
Ilościowe i kontrolowane badania zachowań związanych z gryzieniem owadów są kluczowe dla opracowania skutecznych strategii zwalczania chorób przenoszonych przez wektory. W tym kontekście przedstawiono metodę wytwarzania sondy do biohybrydowej mikroskopii sił atomowych (AFM).
Zamierzamy opracować wspornik AFM, aby potencjalnie ilościowo badać mechanizmy gryzienia komarów. Nasz protokół oferuje nową metodę tworzenia dokładnych, kontrolowanych i niezawodnych sond AFM w celu badania procesów gryzienia lub śpiewania zwierząt. Nasz protokół ma na celu dokładne symulowanie procesu gryzienia zwierząt, co powoduje, że obecne metodologie są albo niekontrolowane, niepowtarzalne w wiarygodny sposób, albo w niektórych przypadkach całkowicie niedokładne.
Efekty naszej pracy są dwojakie. Po pierwsze, tworzymy protokół, który umożliwia innym badaczom wytwarzanie własnych, niestandardowych biohybrydowych wsporników AFM. Po drugie, nasza praca toruje drogę do tworzenia innych protokołów, które łączą systemy testowe z materiałem biologicznym w celu tworzenia bardziej realistycznych scenariuszy testowych.
Na początek umieść martwego komara na szklanym szkiełku. Następnie delikatnie umieść ostrze skalpela nad wargą sromową, w pobliżu głowy komara. Wykonaj nacięcie w poprzek całej górnej połowy warg sromowych o płytkiej głębokości penetracji.
Następnie za pomocą pęsety mocno przytrzymaj głowę komara. I za pomocą kolejnej pary precyzyjnych pęset delikatnie ściśnij wargę sromową między zwężającą się końcówką a nacięciem. Następnie pociągnij pęsetę trzymającą wargę sromową w kierunku zwężającej się końcówki.
Umieść komara pod mikroskopem, aby sprawdzić, czy końcówka obrąbka jest obecna. Teraz zaciśnij i zamknij końcówki zestawu precyzyjnej pęsety i umieść końcówkę pęsety tuż obok końcówki obrąbka. Użyj końcówki pęsety, aby przyłożyć delikatną siłę do obrąbka prostopadłego do długości pęczka.
Kontynuuj przesuwanie obrąbka po szkiełku szkiełkowym, aż do oddzielenia się od innych elementów pęczkuł. Na koniec zbadaj próbkę pod mikroskopem, aby zweryfikować separację. Na początek weź szklane szkiełko zawierające obrąbek komarów.
Umieść ostrze skalpela w odległości około 200 mikrometrów od końcówki obrąbka. Następnie delikatnie dociśnij, aby przeciąć końcówkę obrąbka na całej długości. Za pomocą precyzyjnej pęsety zlokalizuj i odizoluj końcówkę obrąbka na szklanym szkiełku.
Następnie za pomocą tej samej pęsety delikatnie uszczypnij obrąbek. Gdy próbka zostanie mocno ściśnięta, stopniowo zwalniaj siłę zacisku. Pod mikroskopem zbadaj końcówki pęsety, aby potwierdzić obecność końcówki obrąbka na jednej z nich.
Zacznij od umieszczenia niewielkiej ilości żywicy epoksydowej na krawędzi nowego szkiełka. Następnie umieść szklany szkiełko pod stacją sondy i skup się na niej. Zamontuj wspornik AFM bez końcówki do zespołu zacisku.
Zabezpiecz podstawę wspornika, pozostawiając jego koniec wolny i zawieszony w przestrzeni. Następnie podłącz manipulator do stacji sondy. Wyreguluj oś Z manipulatora, aby podnieść wspornik o kilka milimetrów ponad szklaną prowadnicę zawierającą żywicę epoksydową.
Następnie za pomocą manipulatora wyreguluj położenie wspornika AFM wzdłuż kierunku x i y nad żywicą epoksydową na szkiełku szklanym. Ostrożnie wyrównaj końcówkę wspornika bezpośrednio nad żywicą epoksydową. Następnie powoli opuść wspornik bez końcówki w kierunku z w kierunku żywicy epoksydowej na szkiełku szklanym, aż dotknie żywicy epoksydowej.
Następnie delikatnie odsuń wspornik w kierunku x i y od żywicy epoksydowej, upewniając się, że jest oddzielony od suwaka. Podnieś wspornik w kierunku z za pomocą manipulatora. Obróć manipulator o 90 stopni wokół długiej osi wspornika i umieść go bokiem na stacji pomiarowej.
Następnie umieść precyzyjną pęsetę z końcówką obrąbka pod kamerą stacji sondy tak, aby widoczna była cała jej długość. Następnie umieść zespół manipulatora z zaciskiem i wspornikiem pod kamerą tak, aby widoczna była cała długość wspornika. Obróć manipulator, aby ustawić wspornik prostopadle do końcówki obrąbka.
Korzystając ze stopni swobody manipulatora, powoli przesuwaj końcówkę mniej wychylną w kierunkach x-y, tak aby klej na wsporniku stykał się z odciętym końcem końcówki obrąbka. Następnie utwardź żywicę epoksydową, aby zestalić połączenie między wspornikiem a obrąbkiem. Delikatnie odsuń wspornik od pęsety, upewniając się, że końcówka obrąbka jest przymocowana do belki wspornikowej.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nową metodę wytwarzania biohybrydowych sond do mikroskopii sił atomowych (AFM) w celu ilościowego badania zachowań kleszczowych i gryzących u owadów, w szczególności u komarów. Celem protokołu jest zwiększenie dokładności i wiarygodności badań procesów kąsania u zwierząt, co pozwala na wyeliminowanie ograniczeń obecnych metodologii.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biofizyka
- Badania nad chorobami przenoszonymi przez wektory
Wstęp
- Zachowania żerowania owadów są kluczowe dla zrozumienia chorób przenoszonych przez wektory.
- Obecne metodologie badania tych zachowań są często niewiarygodne.
- Technologia AFM może dostarczyć informacji na temat mechaniki kąsania.
- Istnieje potrzeba opracowania ulepszonych metod wytwarzania sond AFM.
Cel badania
- Opracowanie protokołu tworzenia niestandardowych biohybrydowych wsporników AFM.
- Umożliwienie dokładnej symulacji procesów gryzienia u zwierząt.
- Ułatwienie tworzenia powtarzalnych i kontrolowalnych układów eksperymentalnych.
Zastosowane metody
- Opracowanie nowego protokołu wytwarzania wsporników AFM.
- Testowanie niezawodności i dokładności sond.
- Symulowanie procesów kąsania przez zwierzęta w kontrolowanych środowiskach.
- Przedstawienie wytycznych dla innych badaczy w celu replikacji metody.
Główne wyniki
- Nowy protokół umożliwia wytwarzanie precyzyjnych sond AFM.
- Sondy wykazały poprawioną kontrolę i powtarzalność w eksperymentach.
- Umożliwiono realizację realistycznych scenariuszy testowych do badania mechanizmów kąsania.
- Stworzono podstawy do dalszego rozwoju protokołów łączących materiały biologiczne z systemami testowymi.
Wnioski
- Badanie przedstawia znaczący postęp w technologii AFM w badaniach biologicznych.
- Dostosowane biohybrydowe wsporniki AFM mogą usprawnić badanie zachowań owadów.
- Niniejsza praca kładzie fundamenty pod przyszłe badania nad mechanizmami chorób przenoszonych przez wektory.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe zrozumienie mechaniki ukąszeń komarów jest kluczowe dla opracowywania barier i interwencji nowej generacji przeciwko chorobom przenoszonym przez wektory. Biohybrydowa sonda AFM umożliwia kontrolowaną i powtarzalną symulację penetracji przez komara, co zwiększa pewność prognostyczną na wczesnych etapach odkrywania i walidacji celów. Możliwość ta wzmacnia pomost translacyjny między wglądem w mechanizmy a zastosowanymi rozwiązaniami w zakresie kontroli wektorów w portfelach badawczo-rozwojowych biofarmaceutyki.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę mechanizmów kąsania komarów w celu walidacji celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez odtwarzanie autentycznych scenariuszy penetracji.
- Ułatwia uzyskanie wiarygodnych wyników prognostycznych przy ocenie kandydackich repelentów lub barier.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do ilościowej oceny skuteczności interwencji.
- Standaryzuje warunki analizy w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności między badaniami.
- Umożliwia wiarygodny pomiar sił penetracji i wydajności bariery.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzgadnia wyniki eksperymentalne z zachowaniami wektorów istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po walidację przedkliniczną strategii antywektorowych.
- Dostarcza ilościowych punktów końcowych dla decyzji o dalszym rozwoju projektu, skorygowanych o ryzyko.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda z wykorzystaniem biohybrydowej sondy AFM integruje etapy wczesnego odkrywania i oceny przedklinicznej, umożliwiając redukcję ryzyka mechanistycznego oraz ilościowy screening potencjalnych interwencji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących penetracji przez komary oraz mechanizmów naruszania barier.
- Przesiew: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny związków lub materiałów.
- Analityka: Zapewnia pomiary siły i profile penetracji do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z przedklinicznym opracowywaniem produktów przeciwwektorowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Tworzy platformę wielokrotnego użytku dla różnorodnych badań nad wektorami i barierami.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad kontrolą wektorów.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów przenikania.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz optymalizuje alokację zasobów w portfelach wczesnej fazy.
- Wpływ na portfel: Wspiera priorytetyzację kandydatów i technologii przeciwwektorowych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obsłudze AFM oraz w przygotowywaniu próbek biologicznych.
- Wymaga dostępu do precyzyjnej aparatury i infrastruktury mikroskopowej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności wytwarzania sond.
- Możliwość adaptacji do innych wektorów lub modeli zwierzęcych poprzez modyfikację protokołu.
- Spójność wyników zależy od jakości materiału biologicznego oraz umiejętności operatora.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:59
Dissection of the Labium and Separation of the Labrum's Tip for Fabricating an Atomic Force Microscopy Probe
2:02
Isolation of the Desired Labrum Tip for Preparing the Atomic Force Microscopy Probe
2:40
Mounting and Bonding the Labrum's Tip to the Atomic Force Microscopy (AFM) Tipless Cantilever Beam
