Name: Wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę biodruku 3D do tworzenia modeli naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych. Ta technologia poprawia powtarzalność i umożliwia analizę w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowane przez rząd Korei (Ministerstwo Nauki i ICT, MSIT) [Nie. NRF-2019R1C1C1009606; Nr 2020R1A5A8018367; i Nie. RS-2024-00423107]. Badania te były wspierane przez Program Rozwoju Bio i Technologii Medycznych grantów NRF finansowanych przez MSIT [No. NRF-2022M3A9E4017151 i nr NRF-2022M3A9E4082654]. Prace te były wspierane przez Program Innowacji Technologicznych [nr 20015148] oraz Projekt Alchemik [nr 20012378] finansowany przez Ministerstwo Handlu, Przemysłu i Energii (MOTIE, Korea). Prace te były również wspierane przez Koreański Instytut Planowania i Oceny Technologii w Żywności, Rolnictwie i Leśnictwie (IPET) w ramach Programu Technologii Konwergencji Rolnictwa i Żywności na rzecz Rozwoju Siły Roboczej, finansowanego przez Ministerstwo Rolnictwa, Żywności i Spraw Wsi (MAFRA) [No. RS-2024-00397026].

1. Generowanie G-kodu dla biodrukarki
<ol>
	<li>Aby wygenerować i zwizualizować ścieżkę druku, należy skorzystać z internetowego narzędzia do symulacji G-kodu (np. NCviewer).</li>
	<li>Kliknij ikonę New File w interfejsie, aby utworzyć nowy plik G-kodu.</li>
	<li>Wygeneruj ścieżkę druku, ręcznie wpisując polecenia G-kodu dla kanału poświęcalnego oraz komory krzemowej. Jako punkt odniesienia przy tworzeniu geometrii należy przyjąć wymiary standardowej płytki 6-dołkowej. 
	UWAGA: G-kod użyty w tej procedurze opiera się na kodzie sterowania numerycznego (CNC). Funkcje poszczególnych poleceń przedstawiono w Supplemental Table S1. Format płytki 6-dołkowej wybrano ze względu na kompatybilność z komercyjnymi czytnikami mikro płytek i układami mikroskopowymi oraz możliwość pomieszczenia odpowiednich objętości pożywki niezbędnych do dojrzewania śródbłonka, co minimalizuje konieczność częstych wymian medium. Ten protokół wykonania można również dostosować do innych standardowych płytek wielodołkowych.</li>
	<li>Po zakończeniu pisania G-kodu kliknij ikonę Save File w interfejsie, aby pobrać plik z rozszerzeniem .nc. 
	UWAGA: Do generowania ścieżek druku można użyć każdego innego dostępnego algorytmu generowania G-kodu. Geometrię kanału naczyniowego można modyfikować w tym G-kodzie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tuszy do komór krzemowych i warstw poświęcalnych
UWAGA: Źródła wszystkich materiałów użytych w tym protokole są wymienione w Tabeli materiałów.
<ol>
	<li>Połącz dwa rodzaje polimerów silikonowych, SE1700 i polidimetylosiloksan (PDMS), w stosunku 10:2. Dodaj czynnik sieciujący dla każdego polimeru w stosunku 10:1 (polimer do czynnika sieciującego).</li>
	<li>Użyj mieszadła planetarnego, aby dokładnie wymieszać i odgazować mieszaninę polimerową przy 2 000 rpm.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki przenieś wymieszany polimer silikonowy do jednorazowej strzykawki o pojemności 10 mL. Odwiruj napełnioną strzykawkę przy 400 × g przez 3 min w temperaturze 5 °C, aby zapewnić jednorodną konsystencję i uniknąć pęcherzyków powietrza podczas drukowania. 
	UWAGA: Atrament do komory należy zużyć w ciągu 2 h od dodania czynników sieciujących, aby zapewnić optymalną jakość druku. Przechowuj strzykawkę w temperaturze 5 °C podczas przygotowań do drukowania. Proces ten pomaga spowolnić sieciowanie atramentu, co w przeciwnym razie mogłoby zmienić parametry drukowania.</li>
	<li>Odważ Pluronic F-127 (PF127), aby przygotować 40% (w/v) roztwór zapasu PF127 w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Mieszaj roztwór PF127 w mieszadle planetarnym przez 3 min przy 400 × g w celu uzyskania homogeniczności. Przechowuj zhomogenizowaną mieszaninę w temperaturze 4 °C do całkowitego rozpuszczenia PF127.</li>
	<li>Przygotuj roztwór zapasu trombiny o stężeniu 1 000 units/mL w buforze fosforanowym Dulbecco (DPBS). 
	UWAGA: Przechowuj roztwór zapasu trombiny w aliquotach po 100 µL, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Alikwoty powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C nie dłużej niż przez 6 miesięcy.</li>
	<li>Przed drukowaniem przygotuj atrament poświęcalny, mieszając trombinę w rozcieńczeniu 1:10 z PF127 do końcowego stężenia roboczego 36% (w/v) dla PF127 i 100 units/mL dla trombiny. Aby przygotować 1 mL atramentu poświęcalnego, zmieszaj 100 µL roztworu zapasu trombiny z 900 µL roztworu zapasu PF127. 
	UWAGA: Przy przygotowywaniu atramentu poświęcalnego do wydrukowania pojedynczej płytki objętość całkowita 1 mL jest w zupełności wystarczająca.</li>
</ol>
3. Proces wytwarzania
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem procesu wytwarzania, poddaj płytkę sześciodołkową działaniu plazmy tlenowej (O2) o mocy 100 watów przez 1 min.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w sekcji 2, aby przygotować zarówno tusze poświęcalne, jak i silikonowe, upewniając się, że tusze są wolne od pęcherzyków powietrza i homogenicznie wymieszane w celu zapewnienia spójności drukowania. Ostrożnie wprowadź tusze do głowicy biodrukarki. Ustaw temperaturę głowicy biodrukarki na 37 °C dla tuszu poświęcalnego i 5 °C dla tuszu silikonowego.</li>
	<li>Zamocuj stożkową dyszę z podwójnym gwintem 22 G do strzykawki z silikonem. W przypadku tuszu poświęcalnego dobierz rozmiar dyszy zgodnie z pożądaną średnicą kanału. 
	UWAGA: W tym przypadku zademonstrowano trzy rozmiary dysz: 18 G, 20 G i 22 G. Optymalne parametry drukowania, w tym ciśnienie drukowania i prędkość głowicy, zostały przedstawione w Tabeli 1.</li>
	<li>Wgraj odpowiedni G-kod i naciśnij funkcję servo ready w interfejsie oprogramowania biodrukarki przez 3 s. Umieść płytkę na stole w punkcie startowym G-kodu i kliknij start, aby rozpocząć proces drukowania. 
	UWAGA: Zazwyczaj wytwarzanie jednej płytki zawierającej sześć komór zajmuje około 1 h i 10 min. Krok 3.4, obejmujący wgranie i wykonanie G-kodu, może się różnić w zależności od użytej biodrukarki. Upewnij się, że podczas korzystania z biodrukarki zachowane są warunki sterylne, aby uniknąć kontaminacji.</li>
	<li>Przykryj płytkę pokrywką i przenieś ją do nawilżonego inkubatora CO2 w temperaturze 37 °C na 72 h, aby utwardzić silikonowe komory. 
	UWAGA: Chociaż utwardzanie silikonu może przebiegać wolniej wewnątrz inkubatora, płytki nie wolno umieszczać w suchej suszarce.</li>
</ol>
4. Przygotowanie hydrożelu i osadzanie kanałów
<ol>
	<li>Przygotować probówkę stożkową o pojemności 50 mL zawierającą 20 mL 1x PBS. Do probówki dodać 0,01 g fenylo-2,4,6-trimetylbenzoylofosfinianu litu (LAP), aby przygotować 0,05% (w/v) roztwór LAP. Mieszać na wstrząsarze Vortex do całkowitego rozpuszczenia proszku. 
	UWAGA: Probówkę stożkową należy owinąć folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło. Roztwór zapasowy LAP przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Do 20 mL roztworu LAP dodać 3 g żelatyny metakrylowej (GelMA) i 0,2 g fibrynogenu, aby uzyskać końcowe stężenie 15% GelMA i 1% fibrynogenu (oznaczane jako GelFib). Umieścić mieszaninę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i okresowo mieszać na wstrząsarzu Vortex, aż roztwór zostanie całkowicie rozpuszczony.</li>
	<li>Po wykonaniu etapu opisanego w Sekcji 3, dodać 300 µL uprzednio ogrzanego GelFib do każdej komory hydrożelowej, aby zatopić wzór poświęcalny. Szybko sieciować GelMA światłem ultrafioletowym (UV) o długości fali 405 nm i natężeniu 85 mW/cm2 przez 120 s. Powtórzyć tę procedurę dla wszystkich pozostałych studni. 
	UWAGA: Fibrynogen sieciuje szybko w kontakcie ze wzorem poświęcalnym zawierającym trombinę. Zaleca się dodawanie hydrożelu i przeprowadzanie sieciowania UV oddzielnie dla każdej studni, aby uniknąć niepożądanego żelowania GelMA w temperaturze pokojowej. Ponadto należy zachować warunki sterylne, aby zapobiec kontaminacji podczas procesu utwardzania UV.</li>
	<li>Dodać 1 mL DPBS po każdej stronie kanału naczyniowego w każdej studni i przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przez 15 min, aby upłynnić PF127.</li>
	<li>Po 15 min odessać DPBS i powtórzyć krok 4.5 trzykrotnie, aby całkowicie wypłukać PF127.</li>
	<li>Przed wprowadzeniem komórek do kanałów, perfundować kanały medium DMEM F12 zawierającym 1% Matrigel przez 30 min, aby zwiększyć adhezję komórek.</li>
</ol>
5. Hodowla HUVEC
<ol>
	<li>Podgrzej medium do wzrostu komórek śródbłonka (ECGM) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
	<li>W tym czasie wyjmij fiolkę z kriokonserwowanymi komórkami HUVEC ze zbiornika z azotem, delikatnie poluzuj zakrętkę fiolki, a następnie ponownie ją dokręć, aby usunąć azot z gwintów. Natychmiast rozmroź komórki, zanurzając fiolkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 min, dbając o to, aby wewnątrz fiolki pozostała niewielka ilość lodu. Przepłucz fiolkę 70% etanolem, aby zapobiec kontaminacji. 
	UWAGA: Podczas wyjmowania komórek ze zbiornika z azotem należy nosić okulary ochronne. Zakrętka fiolki musi znajdować się powyżej poziomu wody podczas tego procesu.</li>
	<li>Przygotuj probówkę stożkową 15 mL zawierającą 5 mL podgrzanego medium ECGM. Za pomocą mikropipety ostrożnie przenieś rozmrożone komórki z fiolki do probówki stożkowej. Aby upewnić się, że żadne komórki nie pozostały w fiolce, dodaj 1 mL świeżego podgrzanego medium do kriofiolki, przepłucz jej wnętrze i przenieś pozostałe komórki do probówki stożkowej.</li>
	<li>Wirowaj probówkę stożkową przy 200 × g przez 3 min, aby uzyskać osad komórkowy. Odlej nadsącz, resuspenduj komórki w 10 mL świeżego medium, przenieś komórki do kolby T75 i umieść kolbę w inkubatorze CO2 z wilgotną atmosferą w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Ten krok jest istotny, aby poprzez wirowanie usunąć dimetylosulfotlenek obecny w medium do mrożenia w kriofiolce.</li>
	<li>Wymieniaj medium co drugi dzień, aż komórki osiągną 80-90% konfluencji.</li>
</ol>
6. Endoteliacja kanałów
<ol>
	<li>Podgrzej wstępnie ECGM, DPBS, roztwór neutralizujący trypsynę oraz trypsynę z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (TE) w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
	<li>Przy 90% konfluencji wypłucz komórki w kolbie T75 za pomocą 10 mL DPBS, dodaj do kolby 1 mL 0,25% TE i inkubuj przez 3 min.</li>
	<li>Delikatnie opukaj ścianki kolby i dodaj 5 mL roztworu neutralizującego trypsynę, aby zneutralizować TE. Przenieś komórki do stożkowej probówki 15 mL. Użyj 5 mL świeżego ECGM do zebrania pozostałych komórek i dodaj je do probówki stożkowej.</li>
	<li>Wiruj probówkę stożkową przy 250 × g przez 3 min, aby uzyskać osad komórkowy.</li>
	<li>Odlej nadosad i resuspenduj osad komórkowy w 1 mL świeżego ECGM. Policz komórki za pomocą hemocytometru i powtórz krok 6.4, aby uzyskać osad komórkowy. Resuspenduj 3 miliony komórek w 90 µL świeżego ECGM.</li>
	<li>Przed wprowadzeniem zawiesiny komórkowej do kanału krótko odessaj zawartość kanału za pomocą odkurzacza, aby oczyścić jego światło. 
	UWAGA: Unikaj przedłużonego odsysania z kanału, aby nie naruszyć jego integralności.</li>
	<li>Delikatnie załaduj kanał zawiesiną komórkową przy gęstości zasiewu 0,5 miliona komórek na studzienkę. Użyj mikropipety, aby dodać ~15 µL tej zawiesiny w celu wypełnienia kanału. 
	UWAGA: Gęstość zasiewu może się różnić w zależności od rozmiaru kanału. Gęstość ta jest zoptymalizowana dla kanału wydrukowanego dyszą 20 G o średnicy wewnętrznej około 900 µm.</li>
	<li>Umieść płytkę płasko w inkubatorze na 2 h. Następnie odwróć płytkę o 180°, utrzymując ją w pozycji płaskiej przez kolejne 2 h.</li>
	<li>Po 4 h przemyj kanał DPBS, aby usunąć nieprzylegające i martwe komórki. Dodaj 2 mL świeżego ECGM do każdej studzienki (1 mL po każdej stronie kanału). Rozpocznij kulturę dynamiczną na wytrząsarce przy kącie nachylenia 10° i prędkości 5 rpm, ustawiając płytkę na wytrząsarce tak, aby kanały były równoległe do kierunku kołysania. Wymieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień. 
	UWAGA: Kultura dynamiczna usprawnia wymianę pożywki między zbiornikami a kanałami i wspomaga proliferację komórek w nocy.</li>
</ol>
7. Ocena dojrzewania śródbłonka
<ol>
	<li>Podgrzej ECGM i DPBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 min, a odczynik Cell Counting Kit-8 (CCK8) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy CCK8, mieszając 100 µL odczynnika CCK8 z 1 mL świeżego ECGM na każdą studzienkę. Przy pracy z płytką 6-kanałową przygotuj 600 µL odczynnika CCK8, łącząc go z 6 mL świeżego ECGM.</li>
	<li>Usuń pożywkę wzrostową za pomocą odsysacza i przepłucz kanały DPBS. Do każdej studzienki dodaj 1 mL roztworu roboczego CCK8 i pozostaw płytkę w pozycji poziomej w inkubatorze na 30 min. Następnie rozpocznij hodowlę dynamiczną na wytrząsarce, zgodnie z opisem w kroku 6.9, i kontynuuj ten proces przez kolejne 3 h.</li>
	<li>Po 3 h usuń zawartość każdej studzienki, przechylając płytkę na jedną stronę, i przenieś ją do nowej płytki sześciodołkowej. Przepłucz kanały DPBS i dodaj świeżą pożywkę. 
	UWAGA: Przykryj płytkę folią aluminiową do momentu pomiaru absorbancji. Zachowaj taką samą objętość odczynnika we wszystkich studzienkach, aby zapewnić jednolitość odczytów. Podczas pipetowania unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza, które mogą zaburzyć dokładność pomiarów gęstości optycznej.</li>
	<li>Po delikatnym potrząśnięciu płytką przez 15 s w celu zapewnienia równomiernego wymieszania barwnika, zmierz absorbancję przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę w określonych odstępach czasu. Oblicz średnią gęstość optyczną dla każdego punktu czasowego i wykreśl krzywą wzrostu w oprogramowaniu graficznym. Krzywa ta wskazuje względną maturację śródbłonka w czasie.</li>
</ol>
8. Analiza przepuszczalności
<ol>
	<li>Usunąć medium z jednego wybranego dołka. 
	UWAGA: W przypadku testu przepuszczalności zaleca się przetwarzanie każdego dołka oddzielnie, aby zapobiec wysychaniu pozostałych kanałów, co mogłoby zmienić ich przepuszczalność naczyniową.</li>
	<li>Przygotować 6 mL roztworu dekstranu sprzężonego z FITC o stężeniu 0.1 mg/mL poprzez rozpuszczenie dekstranu FITC 70 kDa w DPBS. 
	UWAGA: Przygotować roztwór zapasowy dekstranu FITC o stężeniu 20 mg/mL, rozpuszczając 100 mg dekstranu FITC w 5 mL DPBS. Po delikatnym wymieszaniu roztworu na wirówce typu vortex, rozdzielić go na alikwoty po 500 µL do probótek 1.5 mL, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Alikwoty te można przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy. Przed przeprowadzeniem testu rozcieńczyć roztwór zapasowy do stężenia roboczego 0.1 mg/mL.</li>
	<li>Mocno ustawić płytkę na stoliku mikroskopu i dostosować powiększenie obiektywu w trybie kontrastu fazowego, aby zapewnić wyraczną widoczność ścianki kanału w obszarze zainteresowania oraz znajdującego się w pobliżu żelu w polu widzenia. 
	UWAGA: Aby skutecznie ocenić przepuszczalność, należy dążyć do maksymalizacji powierzchni żelu otaczającego obszar zainteresowania w polu widzenia; aspekt ten jest kluczowy dla dokładnego monitorowania transportu dekstranu.</li>
	<li>Po ustawieniu ostrości na pożądanym obszarze przełączyć tryb z kontrastu fazowego na fluorescencję. W zakładce image acquisition dodać FITC do widefield channel i wykonać zdjęcie przed dodaniem roztworu dekstranu, aby obliczyć intensywność fluorescencji tła. Następnie dodać 1 mL roboczego roztworu dekstranu FITC po jednej stronie kanału i pozwolić roztworowi przepłynąć w stronę drugiej strony dołka, napędzanemu różnicą ciśnień hydrostatycznych.</li>
	<li>Wykonuje zdjęcia w określonych odstępach czasu – częściej w przypadku kanałów o wysokiej przepuszczalności i rzadziej w przypadku kanałów o niższej przepuszczalności.</li>
</ol>
9. Pomiar intensywności fluorescencji w programie ImageJ
<ol>
	<li>W oprogramowaniu do analizy obrazów ImageJ zmierz intensywność w początkowym punkcie czasowym (IProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.), średnia intensywność zaobserwowana w późniejszym punkcie czasowym (It2), a także intensywność szumu tła (Ib), zgodnie z poniższym opisem. Należy użyć równania (1) w celu obliczenia współczynnika przenikalności (Pd). t1 oraz t2 odnieś się do początkowego i późniejszych punktów czasowych akwizycji obrazów. 
	<img alt="Równanie Pd dla analizy przekazywania ciepła; formuła matematyczna związana z badaniami przewodności cieplnej." src="/files/ftp_upload/66676/66676eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">        (1)
	<ol>
		<li>Uruchom program ImageJ i otwórz obraz pozyskany w początkowym punkcie czasowym.</li>
		<li>Ustaw skalę w programie ImageJ. Przejdź do Analiza | Ustawienie skaliWprowadź znaną skalę i jednostkę pomiaru.</li>
		<li>Wybierz narzędzie prostokąta następnie narysuj prostokąt na obszarze żelu, w którym wymagany jest pomiar intensywności fluorescencji.</li>
		<li>Przejdź do Analiza | Ustawienia pomiarów i upewnij się, że Średnia wartość szarości zostało sprawdzone. 
		UWAGA: Ta opcja mierzy średnią intensywność w obrębie wybranego obszaru. W zależności od potrzeb danej analizy można wybrać inne parametry.</li>
		<li>Przy zachowaniu zaznaczonego obszaru przejdź do Analizuj | Mierz lub po prostu naciśnij MOdczekać do Wyniki otwarte okno, wyświetlające średnią intensywność fluorescencji oraz wszelkie inne wybrane parametry.</li>
		<li>Wykonaj trzy pomiary i oblicz średnią wartość intensywności fluorescencji w arkuszu kalkulacyjnym.</li>
		<li>Powtórz tę procedurę dla obrazów zarejestrowanych w kolejnym punkcie czasowym t2oraz zdjęcia wykonane przed dodaniem roztworu dekstranu w celu obliczenia natężenia fluorescencji w późniejszym punkcie czasowym, aby określić fluorescencję tła.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

3D Bioprinting for Rapid Vascular Network Fabrication Using Vessels-on-a-Plate

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Wykorzystując precyzję, automatyzację i sterowany komputerowo charakter technologii biodruku 3D, opracowaliśmy uproszczoną metodę wytwarzania kanałów naczyniowych w standardowych płytkach sześciodołkowych, które zostały wybrane ze względu na ich kompatybilność z komercyjnymi czytnikami mikropłytek i zestawami do obrazowania mikroskopowego. Konstrukcja płyty może pomieścić kanały o wielu rozmiarach i wystarczającą objętość mediów do wzrostu większych kanałów przy jednoczesnym zmniejszeniu niezbędnej częstotliwości zmian mediów. Przyszłe adaptacje tej konstrukcji mogą zostać dostosowane do innych dostępnych na rynku standardowych płytek studziennych, zwiększając w ten sposób przepustowość eksperymentalną i zmniejszając zużycie materiałów.
Platformy mikroprzepływowe często wykorzystują polimer silikonowy o nazwie PDMS ze względu na jego nietoksyczność, przepuszczalność gazów i wysoką przezroczystość28. Jednak niska wierność kształtu PDMS ogranicza jego zastosowanie w biodruku opartym na mikrowytłaczaniu do wytwarzania chipów z wysoką wiernością kształtu. SE170029, inny polimer silikonowy, oferuje większą precyzję w konstruowaniu komór do produkcji tkanek, ale jego wysoka lepkość wymaga większych dysz i znacznego ciśnienia pneumatycznego. Opracowaliśmy mieszankę SE1700 i PDMS, która może być używana z mniejszymi dyszami, umożliwiając w ten sposób produkcję w ograniczonych przestrzeniach z wysoką precyzją i wiernością kształtu. Inne rodzaje polimerów, takie jak polikaprolakton (PCL) lub polietylen octan winylu (PEVA), mogą być również stosowane do drukowania w komorze ze względu na ich wysoką wierność kształtu30.
Kluczowe znaczenie ma również przezroczystość optyczna GelMA31. W przeciwieństwie do innych hydrożeli na bazie ECM - takich jak kolagen, który staje się nieprzezroczysty po usieciowaniu - GelMA zachowuje przezroczystość, umożliwiając w ten sposób analizę komórkową w czasie rzeczywistym w kanałach, nawet gdy rozmiar kanału rośnie. Ten aspekt zapewnia dużą przewagę nad metodami wymagającymi cienkich przekrojów do obserwacji, gdy rozmiar konstrukcji jest zwiększony32. Biodegradowalność GelMA ułatwia wymianę rusztowania ECM na nową, funkcjonalną tkankę w trakcie jej rozpadu, zapewniając w ten sposób niezbędną przestrzeń do wzrostu nowo powstałej tkanki funkcjonalnej33,34. Dodatkowo, jego udowodniona niska cytotoksyczność sprawia, że doskonale nadaje się do zastosowań w inżynierii tkankowej35,36. Doskonałe właściwości mechaniczne GelMA sprawiają, że jest on dobrym kandydatem do zastosowań w inżynierii tkanek naczyniowych37. Jego skuteczność w ułatwianiu śródbłonka przewodów naczyniowych za pomocą HUVEC została dobrze udokumentowana38.
Komórki wykorzystane do endotelializacji w tym badaniu, HUVEC, wykazują wysoki wskaźnik sukcesu izolacji i są wyjątkowym modelem do badania szerokiego zakresu chorób sercowo-naczyniowych i metabolicznych39. Jednak podejście to można dostosować do różnych typów komórek śródbłonka, w tym tych pochodzących z tętnic lub bezpośrednio od pacjentów. Ta zdolność adaptacji umożliwia tworzenie specyficznych dla pacjenta modeli tkanki naczyniowej, ułatwiając ocenę indywidualnych reakcji na określone leki.
Ten protokół zawiera kilka krytycznych kroków, o których czytelnicy powinni pamiętać. Po pierwsze, obróbka plazmowa ma kluczowe znaczenie dla modyfikacji charakterystyki powierzchni płytki, w szczególności w celu zwiększenia hydrofilowości, ponieważ większość komercyjnych płyt studziennych jest hydrofobowa. Obróbka plazmowa wprowadza polarne grupy funkcyjne na powierzchnię, poprawiając w ten sposób zdolność wiązania z komorą krzemową i hydrożelem. Po drugie, kontrola temperatury ma kluczowe znaczenie, ponieważ atrament protektorowy upłynnia się w niższych temperaturach, a atrament silikonowy wymaga niższych temperatur, aby zapobiec przedwczesnemu utwardzaniu, co może utrudniać wytłaczanie atramentu przez dyszę. Po trzecie, dokładne usunięcie wszystkich śladów PF127 ma kluczowe znaczenie, ponieważ wszelkie pozostałości PF127 mogą niekorzystnie wpływać na procesy komórkowe, na przykład zakłócając adhezję komórek40. Po czwarte, podczas hodowli komórkowej, jeśli komórki osiągną zbieżność przekraczającą 90%, mogą doświadczać stresu z powodu konkurencji o przestrzeń i składniki odżywcze. Stres ten może powodować zmienione zachowanie komórek, zmniejszoną żywotność komórek i modyfikacje mikrośrodowiska komórkowego. Aby utrzymać zdrowie komórek i prawidłową proliferację, zaleca się utrzymywanie kultur poniżej 90% konfluencji. Po piąte, ważne jest, aby utrzymać płytkę płasko wewnątrz inkubatora przed i po odwróceniu, aby uzyskać równomierną adhezję komórek wewnątrz kanału i ostatecznie równomierną śródbłonek. Wreszcie, utrzymanie stałego czasu ekspozycji, intensywności lasera wzbudzenia i ostrości mikroskopu ma kluczowe znaczenie podczas akwizycji obrazu, ponieważ zmiany tych parametrów mogą zmienić intensywność sygnału emisyjnego, potencjalnie wpływając w ten sposób na dokładność wyników.
Nasze podejście pozwala na tworzenie kanałów w wielu konfiguracjach, takich jak proste, rozwidlone i zawiłe wzorce pokazane tutaj. Ta zdolność adaptacji jest niezbędna do odtworzenia różnorodnych geometrii sieci naczyniowych w ludzkim ciele i przewyższa możliwości tradycyjnych metod, takich jak odlewanie hydrożelu wokół formy lub koncentryczne techniki biodruku oparte na dyszach stosowane w strukturach przypominających rurki 30,41,42. Jednak jednym z ograniczeń tej metody jest to, że nie zapewnia ona okrągłości kanałów, ponieważ wzór ofiarny jest ułożony na płaskiej powierzchni.
Zaleta konstruowania kanałów w wielu rozmiarach jest kluczem do przezwyciężenia ograniczeń platform mikroprzepływowych, które często są ograniczone do mikrokanałów. To ograniczenie może być wadą w konwencjonalnych testach biochemicznych. Na przykład, aby uzyskać wystarczającą ilość materiału do standardowych testów ekspresji białek, takich jak western blotting, należy połączyć dane wyjściowe z kilku urządzeń mikroprzepływowych. Dodatkowo, gdy powstają puste kanały, hydrożel musi zachować wystarczającą sztywność, aby wytrzymać proces usuwania igły. Nasze podejście wykorzystuje termoodwracalny materiał protektorowy, który staje się płynny, gdy temperatura spada, ułatwiając w ten sposób ten proces bez naruszania integralności żelu. Co więcej, inne termoodwracalne materiały żelujące, takie jak żelatyna43, mogą być również wykorzystywane jako materiały ofiarne w tej metodzie.
Takie podejście umożliwia łatwe dostosowywanie struktur tkankowych na płytce, zapewniając w ten sposób obiecujące narzędzie do badań farmakologicznych w odkrywaniu leków. Metoda ta może ułatwić badania przesiewowe leków poprzez ocenę ich wpływu na przepuszczalność naczyń krwionośnych – kluczowy czynnik w opracowywaniu terapii chorób związanych z dysfunkcją naczyń krwionośnych. Nasz model może być wykorzystany do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych w określonych warunkach, takich jak stan zapalny, oraz do opracowania strategii normalizacji naczyń, co jest istotne w leczeniu różnych chorób związanych z nieprawidłową przepuszczalnością naczyń44, pogłębiając zrozumienie tego procesu i rozwijając potencjalne zastosowania kliniczne45.
Aby ocenić przepuszczalność naczyń krwionośnych, przeprowadziliśmy perfuzję dekstranu o stężeniu 70 kDa przez kanał naczyniowy. Zazwyczaj zdrowy śródbłonek naczyniowy służy jako skuteczna bariera dla cząsteczek dekstranu o tej masie cząsteczkowej46. Jednak w przypadku stanu zapalnego dochodzi do przerwania połączeń ścisłych, co pozwala tym cząsteczkom przeciekać, zwiększając w ten sposób przepuszczalność naczyńkrwionośnych 30. Dodatkowo, znakowany fluorescencyjnie dekstran jest wykorzystywany do oceny dystrybucji leków w zmodyfikowanych tkankach47. Chociaż przepływ dwukierunkowy i ograniczona dynamika przepełnienia sterującego w kanale są ograniczeniami tego modelu, przewidujemy, że użytkownicy końcowi będą mogli dostosować system do swoich wymagań, używając niestandardowych wahaczy do sterowania dynamiką przepływu w kanałach. Adaptacja ta może obejmować wdrożenie bezpompowego przepływu jednokierunkowego48.
W przyszłości ta metoda wytwarzania może zostać rozszerzona w celu konstruowania złożonych tkanek. Dzięki precyzyjnemu pozycjonowaniu innych typów komórek w pobliżu kanałów naczyniowych można stworzyć przepuszczalne, unaczynione tkanki, pokonując w ten sposób poważne wyzwanie związane z biodrukowaniem tkanek wolumetrycznych. Uważamy również, że metoda ta może zostać zaadaptowana do symulacji innych typów pustych, przepuszczalnych tkanek, takich jak naczynia limfatyczne i jelita, w sposób wysokoprzepustowy do różnych zastosowań biomedycznych.

Sieć naczyniowa w całym ludzkim ciele funkcjonuje jako kluczowa bariera transportowa, dynamicznie regulując wymianę cząsteczek i komórek między krwią a otaczającymi tkankami. Regulacja ta jest niezbędna do zapobiegania obrzękom tkanek i umożliwienia selektywnej wymiany składników odżywczych i komórek, wspierając w ten sposób metabolizm tkankowy i homeostazę1. Zmieniona przepuszczalność śródbłonka, czynnik wielu schorzeń, wpływa zarówno na nasilenie choroby, jak i na skuteczność leczenia2. Śródbłonek naczyniowy działa jak selektywna bariera, ułatwiając przenoszenie między naczyniami, tkankami i narządami. Regulacja ta obejmuje kilka mechanizmów, takich jak podstawowe filtrowanie substancji rozpuszczonych i małych cząsteczek, celowe przerwanie bariery naczyniowej oraz wpływ cząsteczek, takich jak prostaglandyny i czynniki wzrostu, na poziom przepuszczalności3.
Kluczowe czynniki w tej regulacji obejmują połączenia komórek śródbłonka, migrację leukocytów oraz funkcjonalność bariery krew-mózg4. Biorąc pod uwagę jego złożoność, proces ten różni się w różnych środowiskach, obejmując różne typy naczyń krwionośnych i wykorzystując różne ścieżki anatomiczne. Zrozumienie biologicznych podstaw przepuszczalności naczyń krwionośnych ma kluczowe znaczenie dla opracowania podejść terapeutycznych w leczeniu stanów związanych z nieprawidłową przepuszczalnością naczyń. Utrzymanie przepuszczalności naczyń ma kluczowe znaczenie dla zdrowia układu naczyniowego i otaczających tkanek; W konsekwencji upośledzenie tej funkcji prowadzi do dysfunkcji śródbłonka, stanu, w którym śródbłonek traci swoją normalną funkcjonalność.
Dysfunkcja śródbłonka jest prekursorem wielu powszechnych chorób u ludzi, w tym nadciśnienia, choroby wieńcowej, cukrzycy i raka5,6,7. Stan ten może objawiać się na kilka sposobów, w tym zmniejszonym rozszerzeniem naczyń krwionośnych, zwiększoną przepuszczalnością naczyń krwionośnych i tendencją do stanu prozapalnego. Ten patologiczny stan jest najwcześniejszym etapem kilku krytycznych problemów sercowo-naczyniowych, takich jak choroba wieńcowa, udar mózgu i choroba tętnic obwodowych8, które nadal są głównymi przyczynami śmiertelności w Stanach Zjednoczonych1. Dysfunkcja śródbłonka wpływa na zdrowie układu sercowo-naczyniowego, a także na barierę krew-mózg (BBB) i odgrywa ważną rolę w postępie różnych zaburzeń neurologicznych. Dysfunkcja może zwiększać przepuszczalność bariery krew-mózg, umożliwiając w ten sposób przenikanie toksyn, patogenów i komórek odpornościowych do ośrodkowego układu nerwowego i przyczyniając się do zaburzeń neurologicznych, takich jak udar, choroba Alzheimera, stwardnienie rozsiane i infekcje mózgu9.
Dysfunkcja śródbłonka w cukrzycy charakteryzuje się upośledzoną zdolnością śródbłonka do regulowania napięcia naczyniowego i wytwarzania mediatorów rozszerzających naczynia krwionośne, takich jak tlenek azotu, co prowadzi do upośledzenia rozszerzenia naczyń krwionośnych10. Stan ten jest pogarszany przez szlaki wywołane hiperglikemią, takie jak aktywacja kinazy białkowej C i stres oksydacyjny, co znacząco przyczynia się do postępu cukrzycowej choroby naczyniowej11. Co więcej, stwierdzono, że środowisko zapalne zwiększa adhezję komórek nowotworowych do komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, podczas gdy nieszczelny śródbłonek został uznany za główny czynnik przerzutów raka12,13. Stwierdzono, że geometria naczyń krwionośnych ma bezpośredni wpływ na przerzuty raka mózgu. Komórki nowotworowe preferencyjnie przyczepiają się do obszarów o większej krzywiźnie naczyń krwionośnych7. Odkrycie to podkreśla znaczenie geometrii naczyń krwionośnych w przerzutach raka. Co ważniejsze, w stanach takich jak zwłóknienie i rak, zaburzona funkcja bariery śródbłonkowej nie tylko odgrywa rolę w rozwoju choroby, ale także utrudnia skuteczność leczenia, utrudniając odpowiednie dostarczanie leków14. Badania nad przepuszczalnością naczyń krwionośnych mają kluczowe znaczenie dla postępu w leczeniu chorób sercowo-naczyniowych i oferują wgląd w radzenie sobie z innymi chorobami związanymi z upośledzoną funkcją naczyń krwionośnych.
Biorąc pod uwagę kluczową rolę przepuszczalności naczyń krwionośnych w zdrowiu i chorobie, wiele badań skupiło się na zbadaniu selektywnej natury bariery śródbłonkowej dla rozwoju terapeutycznego przy użyciu modeli zwierzęcych, obok tradycyjnych platform testowych 2D i 3D in vitro. Modele zwierzęce mają jednak ograniczenia wynikające z różnic gatunkowych i kwestii etycznych, a także wysokich kosztów15,16. Na przykład firma Pfizer w 2004 roku stwierdziła, że w ciągu ostatnich 10 lat wydała ponad 2 miliardy dolarów na opracowanie leków, które wykazały obiecujące efekty w modelach zwierzęcych, ale ostatecznie zawiodły na zaawansowanych etapach testów na ludziach17. Co więcej, tradycyjne modele 2D nie naśladują dokładnie architektury trójwymiarowej (3D) i złożonej struktury geometrycznej kanałów naczyniowych.
Wraz z postępem w technologiach biofabrykacji, szeroko zakrojone wysiłki zostały skierowane na wytwarzanie kanałów naczyniowych przy jednoczesnym podsumowaniu architektury 3D. Kanały naczyniowe w mikroskali mogą być skutecznie wytwarzane w mikroprzepływowych chipach przy użyciu miękkiej litografii, oferując w ten sposób przewagę analizy w czasie rzeczywistym18,19. Alternatywne metody, takie jak odlewanie hydrożelowe lub owijanie arkuszy komórkowych wokół formy lub trzpienia, mogą być stosowane do tworzenia wolnostojących konstrukcji rurowych o pożądanej średnicy20,21. Metody te mają jednak ograniczenia; Na przykład chipy mikroprzepływowe są ograniczone do konfiguracji mikrokanałowych, a odlewanie hydrożelu wokół formy nie odwzorowuje skutecznie wielu geometrii.
Wraz z pojawieniem się technologii biodruku 3D22, możliwe stało się replikowanie złożonych geometrii poprzez precyzyjne osadzanie różnych materiałów hydrożelowych na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)23,24. Niektóre metody biodruku, takie jak te wykorzystujące koncentrycznie ułożone dysze, np. koncentryczne i trójosiowe25,26, nie mogą tworzyć rozwidlonych rur; Jednak złożone struktury można osiągnąć za pomocą metod tworzenia wzorców ofiarnych<klasa SUP="xref">27. Wykazano, że żadna z tych metod biodruku nie umożliwia wysokoprzepustowego modelowania in vitro, co jest kluczowym wymogiem dla badań farmakologicznych w odkrywaniu leków. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę wydajnego wytwarzania śródbłonkowych kanałów naczyniowych z efektywną kontrolą wymiarów.
Ustaliliśmy proste podejście, używając dostępnych na rynku płytek sześciodołkowych, w połączeniu z metodą wzorowania ofiarnego, w której biodrukarka wytwarza kanały naczyniowe o pożądanych rozmiarach i wzorach w hydrożelu ECM. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wysiane w celu endotelializacji tych kanałów i oceny funkcjonalności śródbłonka za pomocą testu przepuszczalności. Taka konstrukcja umożliwia perfuzję bez pompy, tworząc zbiorniki mediów po obu stronach kanału i wykorzystuje przepływ napędzany grawitacją za pomocą powszechnie używanego kołyska 2D do naśladowania dynamicznej kultury. Takie podejście eliminuje potrzebę stosowania pomp perystaltycznych i ułatwia skalowalność tej platformy dla zastosowań o wysokiej przepustowości. Sterowany komputerowo charakter technologii biodruku 3D usprawnia również proces produkcji, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo wystąpienia błędów podczas produkcji. Model VOP jest obiecujący jako cenne narzędzie do badań farmakologicznych w procesie odkrywania leków.

<table><tbody><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>SPL</td><td>SPL 91010</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml&nbsp;</td><td>Shinchang Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubka stożkowa</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Biodrukarka 3D&nbsp;</td><td>T& R Biofab</td><td>3DX-Drukarka</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka&nbsp;</td><td>SPL</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Szafy bezpieczeństwa biologicznego</td><td>CHC LAB</td><td>PCHC-777A2-04,&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy odwrócone Brightfield Zestaw</td> do liczenia komórek <td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>(CCK8)</td>Zestaw do liczenia komórek <td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>(CCK8)</td>Kolba do hodowli komórkowych <td>GlpBio</td><td>GK10001</td><td></td></tr><tr><td>75T</td><td>SPL</td><td>70075</td><td></td></tr><tr><td>Matryca membrany podstawnej Corning Matrigel o obniżonym współczynniku wzrostu (GFR), bez LDEV, 10 ml</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr>Woda <td></td><td></td><td></td><td>destylowana</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Klasa</td> hodowli komórkowych <td>Sigma aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Zestaw</td><td>DOW</td><td>DC-184</td><td></td></tr><tr><td>DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1,1 KG Zestaw&nbsp;</td><td>DOW</td><td>2924404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS - 1x</td><td>Welgene</td><td>LB001-01</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MV 2 (gotowa do użycia)</td><td>Promocell</td><td>C-22022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Micro pipeta(1000,200,100,20,10)</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 99,9%</td><td>Duksan</td><td>D5</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen z osocza bydlęcego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8630-1G</td><td></td></tr><tr><td>FITC Dekstran 70 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46945-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne (1,0 &mu; m, zielony)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1030-1ML</td><td></td></tr><tr><td>GelMA-powder (metakrylan żelatyny) 50 g</td><td>Materiały 3D&nbsp;</td><td>20JT29</td><td></td></tr><tr><td>- Gibco, Pożywka do zamrażania kultur komórkowych z regeneracji, 50 ml</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HUVECs (ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej)</td><td>Oprogramowanie Promocell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td> Inkubator <td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>Forma STERI-CYCLE i160 Inkubator</td><td></td></tr> <tr><td>CO2Invitrogen, zestaw do żywej/martwej żywotności/cytotoksyczności (dla komórek ssaków)</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan litowo-fenylowy (2,4,6-trimetylobenzoilo) w proszku&nbsp;</td><td>Tokoyo Przemysł chemiczny CO.</td><td>Numer katalogowy: 85073-19-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, Pokrywa komory liczenia</td><td>Marienfeld Superior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld Superior, Hemocytometr, komora do liczenia komórek</td><td>Marienfeld Superior</td><td>HSU-0650030</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>eppendorf</td><td>Wirówka 5920 R</td><td></td></tr><tr><td>NCViewer.com</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik azotu</td><td>WORTHINGTON INDUSTRIES</td><td>LS750</td><td></td></tr><tr><td>Laser UV</td><td>Omnicure EXCELITAS</td><td>SERIES 1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny (100x)</td><td>GenDEPOT</td><td>CA005-010</td><td></td></tr><tr><td>Mikser planetarny</td><td>THINKY CORPORATION, japonia</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do obróbki plazmowej</td><td>FEMTO SCIENCE</td><td>CUTE-1MPR</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma aldrich</td><td>P2443-250G</td><td></td></tr><tr><td>Gotowy bufor, (P2007-1) 10x PBS</td><td>Biosesang</td><td>PR4007-100-00</td><td></td></tr><tr><td>Szafka do przechowywania odczynników</td><td>ZIO FILTER TECH</td><td>SC2-30F-1306D1-BC</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do obrazowania komórek na żywo w czasie rzeczywistym</td><td>Carl ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lodówka</td><td>SAMSUNG</td><td>RT50K6035SL</td><td></td></tr><tr><td>ROCKER 2D cyfrowy</td><td>IKA</td><td>4003000</td><td></td></tr><tr><td>Scoop-Spatula</td><td>CacheBy</td><td>SL-SCO7001-EA</td><td></td></tr><tr><td>sigma, Trypsyna-EDTA solition, 0,25%</td> <td>Sigma aldrich</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl siarczan sodu (SDS)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Nasadka na końcówkę lufy strzykawki</td><td>FISNAR</td><td>3051806</td><td></td></tr><tr><td>Licznik Tally</td><td>Firma kontrolna</td><td>&nbsp; C23-147-050</td><td></td></tr><tr><td>Dysza stożkowa (18 G)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-18G-U</td><td></td></tr><tr><td>Dysza stożkowa (22 G)</td><td>Mushashi</td><td>TPND-22G-U</td><td></td></tr><tr><td>Dysza stożkowa 20 G</td><td>Musashi</td><td>TPND-20G-U</td><td></td></tr><tr><td>Trombina z osocza bydlęcego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7326-1KU</td><td></td></tr><tr><td>Timer, 4-kanałowy</td><td>ETL</td><td>SL. Tim3005</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór neutralizujący trypsynę</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td></td></tr><tr><td>UG 24 mL słoik do maści UG</td><td>Yamayu</td><td>nr 3-53</td><td></td></tr><tr><td>UG 58 mL słoik maści UG</td><td>Yamayu</td><td>No. 3-55</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WB-11</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do ważenia</td><td>Sartorius</td><td>bce2241-1skr</td><td></td> powiedział:</tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru

High-Throughput Bioprinting Method for Modeling Vascular Permeability in Standard Six-well Plates with Size and Pattern Flexibility

Przepuszczalność naczyń jest kluczowym czynnikiem w opracowywaniu terapii zaburzeń związanych z uszkodzonym śródbłonkiem, takich jak dysfunkcja śródbłonka w tętnicach wieńcowych i upośledzona funkcja bariery krew-mózg. Istniejące techniki wytwarzania nie odtwarzają odpowiednio geometrycznej zmienności sieci naczyniowych w ludzkim ciele, co znacząco wpływa na postęp choroby; Co więcej, techniki te często obejmują wieloetapowe procedury produkcyjne, które utrudniają produkcję o wysokiej przepustowości niezbędną do przeprowadzania testów farmakologicznych. W artykule przedstawiono protokół biodruku do tworzenia wielu tkanek naczyniowych o pożądanych wzorach i rozmiarach bezpośrednio na standardowych płytkach sześciodołkowych, pokonując istniejące wyzwania związane z rozdzielczością i wydajnością w technologii biodruku. Ustalono uproszczone podejście do wytwarzania w celu skonstruowania sześciu pustych, przepuszczalnych kanałów w hydrożelu, które następnie wyłożono ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępowinowej, tworząc funkcjonalny i dojrzały śródbłonek. Sterowany komputerowo charakter biodruku 3D zapewnia wysoką powtarzalność i wymaga mniejszej liczby ręcznych etapów wytwarzania niż tradycyjne metody. Podkreśla to potencjał VOP jako wydajnej, wysokoprzepustowej platformy do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych i postępów w odkrywaniu leków.

Platformę VOP, charakteryzującą się elastycznością w zakresie rozmiaru i wzoru, wykonano za pomocą wielogłowicowego systemu biodruku. Kanały, zarówno puste w środku, jak i zdolne do perfuzji, zasiedlono komórkami HUVEC w celu umożliwienia endotelializacji, a następnie oceniono za pomocą testu przepuszczalności (Rysunek 1A). Aby zademonstrować wielkoskalowe możliwości produkcyjne tej metody, wydrukowaliśmy trzy różne konfiguracje: prostą, rozwidloną i skomplikowaną (Rysunek 1B). Dzięki prostemu podejściu do wykonania, wewnątrz standardowej płytki sześciodołkowej można wytworzyć sześć pustych, perfuzjowalnych kanałów naczyniowych zatopionych w macierzy hydrożelowej. Kanały te można następnie poddać endotelializacji za pomocą komórek HUVEC (Rysunek 2A). Komórki szybko przywierają i proliferują, pokrywając powierzchnię światła kanału naczyniowego (Rysunek 2B). Komórki przylegające zarówno do dolnej, jak i górnej powierzchni światła wykazują jednorodne rozmieszczenie wewnątrz światła (Rysunek dodatkowy S1).
Płytkę umieszczono w inkubatorze z nawilżaniem na 3 dni, aby umożliwić utwardzenie tuszu silikonowego, zapewniając jednocześnie, że wzór poświęcalny nie uległ wysuszeniu (Rycina 3A). Aby ocenić przepływ przez te kanały, wprowadzono zielone mikrokuleczki, co wykazało, że kanały są efektywnie przepuszczalne (Dodatkowy Film S1). Średnicę kanałów zmieniano w zakresie od 558 ± 38 µm do 1094 ± 45 µm poprzez zmianę rozmiaru dyszy z 22 G na 18 G podczas drukowania wzoru poświęcalnego. Dodatkowo, konfigurację geometryczną kanałów manipulowano poprzez modyfikację G-kodu biodrukarki (Plik dodatkowy 1), co umożliwiło drukowanie wzorów krętych i rozgałęzionych (Rycina 3B).
Czas sieciowania promieniami UV zoptymalizowano do 120 s, co sprzyja efektywnej proliferacji komórek (Rycina dodatkowa S2). Ten czas sieciowania doprowadził do powstania środowiska bardziej zbliżonego do fizjologicznego, które sprzyja proliferacji komórek śródbłonka, prawdopodobnie dzięki zrównoważonym właściwościom mechanicznym i porowatości hydrożelu, co ułatwia lepszą adhezję komórek i ich późniejszą proliferację. Komórki HUVEC proliferowały efektywnie na powierzchni luminalnej i do 5. dnia po wysianiu wykazywały morfologię przypominającą brukowaną. Dojrzałość śródbłonka oceniono za pomocą testu CCK8 przeprowadzonego w 1., 3. i 5. dniu (Rycina 4A,B). Dojrzałość śródbłonka zweryfikowano za pomocą immunobarwienia na CD31 w 5. dniu po wysiewie komórek, co wykazało lokalizację CD31 w obrębie połączeń ścisłych (Rycina 4D).
Aby ocenić funkcję barierową śródbłonka, w 5. dniu dojrzewania przeprowadzono perfuzję roztworu dekstranu 70 kDa przez kanały. Dla porównania wybrano kanał kontrolny bez śródbłonka (goły). W kanale z endotelializacją odnotowano minimalne zmiany fluorescencji w obszarze okołonaczyniowego żelu w czasie, co sugeruje, że śródbłonek skutecznie zachował swoją funkcję barierową. Natomiast w kanałach gołych zaobserwowano wzrost fluorescencji w obszarze okołonaczyniowego żelu, co wskazuje na wyższą przepuszczalność wynikającą z braku śródbłonka (Rycina 4C i Rycina 4E).
<img alt="Schemat procesu tworzenia organoidów naczyniowych; wytwarzanie VOP, endotelializacja, wyniki testu przepuszczalności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przygotowanie drukowanych kanałów naczyniowych i ich konfiguracje. (A) Schemat wytwarzania, endotelializacji i testu przepuszczalności drukowanych kanałów naczyniowych. (B) Schemat trzech konfiguracji zaprezentowanych w tej metodzie: prostej, rozgałęzionej i krętej. Skrót: VOPs = naczynia na płytce (vessels on a plate). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu hodowli komórkowej w hydrożelu z wzorowaniem poświęcalnym, drukowaniem komory i wysiewem komórek HUVEC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Harmonogram wytwarzania dla drukowania wzoru poświęcalnego i krzemowej komory, a także endotelializacji kanałów naczyniowych. (A) Ilustracja przedstawia pojedynczą studzienkę płytki wielodołkowej, a AA' odnosi się do widoku wzdłuż płaszczyzny przekroju poprzecznego. (B) Reprezentatywne obrazy etapów procesu wytwarzania. Paski skali = 5 mm (B1), 200 µm (B2-4). Skróty: GelFib = 15% żelatyny metakrylowej i 1% fibrynogenu w 0,05% w/v roztworze fenylo-2,4,6-trimetylobenzoylofosfinianu litu; HUVECs = ludzkie komórki śródbłonka żylnego pępowiny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Konfiguracja urządzenia mikrofluidycznego i mikroskopia fluorescencyjna kanałów przepływowych dla rozkładu cząstek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Naczynia na płytce. (A) Zdjęcie ogólne naczyń na płytce po wydrukowaniu wzoru poświęcalnego i komory krzemowej. (B) Demonstracja wielkoskalowej produkcji kanałów naczyniowych o różnych konfiguracjach i rozmiarach, perfundowanych zielonymi mikrokuleczkami. Paski skali = 200 µm (kanały proste), 1 000 µm (kanały kręte i rozgałęzione). Skróty: ID = średnica wewnętrzna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Test wzrostu komórek z mikroskopii fluorescencyjnej, analiza przepuszczalności i wyniki CCK8 przedstawione na wykresach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66676/66676fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Kanały naczyniowe oraz ich dojrzewanie śródbłonka i przepuszczalność. (A) Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej kanałów naczyniowych w dniach 1, 3 i 5 po wysianiu komórek HUVECs znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym, wykazujące proliferację i morfologię brukową HUVECs w dniu 5. (B) Dojrzewanie śródbłonka oceniono testem CCK-8 w dniach 1, 3 i 5 po wysianiu komórek. (C) Test przepuszczalności endotelializowanych (śródbłonek +) i niepokrytych śródbłonkiem (śródbłonek -) kanałów naczyniowych. (D) Reprezentatywne obrazy barwienia CD31 ilustrują lokalizację CD31 w połączeniach ścisłych w dniu 5. (E) Ilościowe oznaczenie przepuszczalności dyfuzyjnej. Paski skali = 200 µm (A, C, D). Skróty: HUVECs = ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej; GFP = zielone białko fluorescencyjne; GFP HUVECs = HUVECs znakowane GFP; CCK-8 = zestaw do zliczania komórek 8; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Farba drukarska</td>
			<td colspan="2">Parametry drukowania</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Próbnik średnicy dyszy</td>
			<td>Temperatura (°C)</td>
			<td>Ciśnienie powietrza (kPa)</td>
			<td>Prędkość głowicy (mm/min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tusz poświęcalny</td>
			<td>18</td>
			<td>37</td>
			<td>40-48</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>22</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tusz krzemowy</td>
			<td>22</td>
			<td>5</td>
			<td>100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry druku dla tuszy poświęcalnych i krzemowych.
Plik uzupełniający 1: Skrypt G-Code zawierający polecenia do druku 3D wzoru poświęcalnego i komory krzemowej wewnątrz płytki sześciodołkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_GCode%20File_Jove.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca S1: Reprezentatywne obrazy dolnej i górnej powierzchni światła po wysianiu komórek, przedstawiające przyleganie GFP-HUVEC w dolnej i górnej płaszczyźnie ogniskowania. Paski skali = 200 µm. Skróty: UU' = górna płaszczyzna ogniskowania; LL' = dolna płaszczyzna ogniskowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S1%20rev.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina dodatkowa S2: Proliferacja GFP-HUVEC przy różnych czasach sieciowania promieniowaniem UV (405 nm). Paski skali = 200 µm. Skróty: HUVECs = ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej; GFP = zielone białko fluorescencyjne; GFP HUVECs = HUVECs znakowane GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supp%20S2%20rev.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Wideo uzupełniające S1: Perfuzja z użyciem zielonych mikrokulek wykazująca efektywną perfuzję przez kanały proste, kręte i rozgałęzione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/Channels%20Perfusion.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca S1: Funkcje poleceń G-code i M-code.UWAGA: W G-code litery X, Y i Z wskazują odpowiednio współrzędne ruchu wzdłuż osi X, osi Y i osi Z. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66676/66676_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Prezentujemy protokół do wysokoprzepustowej produkcji kanałów naczyniowych o elastycznych rozmiarach i pożądanych wzorach na standardowej sześciodołkowej płytce przy użyciu technologii biodruku 3D, określanej jako naczynia na płytce (VOP). Platforma ta ma potencjał, aby przyspieszyć rozwój terapii zaburzeń związanych z upośledzonym śródbłonkiem.

Wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru

Vascular permeability is a key factor in developing therapies for disorders associated with compromised endothelium, such as endothelial dysfunction in ...

Opracowanie normalnych terapii ukierunkowanych na przepuszczalność naczyń krwionośnych, prekursora powszechnych chorób, takich jak miażdżyca, wymaga rygorystycznych badań przedklinicznych. Jednak złożone metody wytwarzania często utrudniają odtwarzalność i wysoką przepustowość produkcji modeli in vitro, co jest warunkiem wstępnym dla badań farmakologicznych. W tym przypadku wykorzystujemy automatyzację technologii biodruku wielomateriałowego, aby rozwiązać ten problem.Integrując konwencjonalny system płytek dołkowych ze sterowanym komputerowo drukiem 3D, usprawniamy proces wytwarzania, upraszczamy proces hodowli i umożliwiamy analizę w czasie rzeczywistym dzięki jego kompatybilności z czytnikami mikropłytek i zestawami obrazowania mikroskopowego. Jednak istniejące metody często obejmują wieloetapowe i ręczne procesy wytwarzania, co utrudnia ich odtwarzalność. Nasze badania wprowadzają związaną z oprogramowaniem produkcję modeli ludzkich naczyń krwionośnych in vitro o skomplikowanych parametrach geometrycznych.Biodruk na płytach wieloobróbczych pozwala na produkcję o wysokiej przepustowości na żądanie. Postępy te sugerują, że modele tkanek in vitro będą miały kluczowe znaczenie dla przyszłych odkryć medycznych. Na początek odwiedź internetowe narzędzie do symulacji G-code, takie jak NCViewer, aby wygenerować i zwizualizować ścieżkę drukowania.Kliknij ikonę Nowy plik w interfejsie, aby utworzyć nowy plik G-code. Ręcznie napisz polecenia G-code dla kanału protektorowego i komory krzemowej. Po zakończeniu G-code kliknij ikonę Zapisz plik w interfejsie, aby pobrać plik z rozszerzeniem nc.Połącz polimery silikonowe SE1700 i PDMS w stosunku 10 do dwóch. Następnie dodaj utwardzacz dla każdego polimeru w stosunku 10 do jednego polimeru do utwardzacza. Za pomocą miksera planetarnego dokładnie wymieszaj i odgazuj mieszaninę polimerów przy 2 000 obr./min.Teraz użyj szpatułki, aby przenieść zmieszany polimer silikonowy do jednorazowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów. Odwiruj załadowaną strzykawkę o masie 400 G przez trzy minuty w temperaturze pięciu stopni Celsjusza, aby zapewnić jednolitą konsystencję i uniknąć pęcherzyków powietrza podczas drukowania. Następnie dodaj zważoną ilość pluronu F127 do wody destylowanej i utwórz 40% roztwór podstawowy.Mieszaj pluroniczny roztwór F127 w mikserze planetarnym przez trzy minuty w temperaturze 400G. Utrzymuj homogenizowaną mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do całkowitego rozpuszczenia ciała stałego. Przed drukowaniem należy wymieszać 100 mikrolitrów trombiny z 900 mikrolitrami pluronu F127, aby przygotować jeden mililitr tuszu ofiarnego.Aby rozpocząć, przed wytwarzaniem, potraktuj sześciodołkową płytkę plazmą tlenową o mocy 100 watów przez jedną minutę. Ustaw temperaturę głowicy biodrukarki na 37 stopni Celsjusza dla tuszu protektorowego i pięć stopni Celsjusza dla tuszu silikonowego. Następnie przymocuj do silikonowej strzykawki dyszę stożkową z podwójnym gwintem o rozmiarze 22 mm.Załaduj atramenty silikonowe i protektorowe do głowicy drukującej biodrukarki. Załaduj żądany kod G i naciśnij i przytrzymaj przez trzy sekundy funkcję Servo Ready w interfejsie oprogramowania biodrukarki. Umieść płytkę na stole montażowym w punkcie początkowym kodu G i kliknij przycisk Start, aby rozpocząć proces drukowania.Teraz umieść pokrywkę na talerzu. Następnie utwardź silikonowe komory w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 72 godziny. Wzór ofiarny na VOP pozostał wolny od wysuszenia.Na początek rozpuść 0,01 grama LAP w 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej 20 mililitrów PBS. Do roztworu LAP dodać trzy gramy metakrylanu żelatyny i 0,2 grama fibrynogenu. Umieść mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Dodaj 300 mikrolitrów wstępnie podgrzanego żelu fib do każdej komory hydrożelowej platformy VOP, aby osadzić wzór ofiarny. Użyj światła UV, aby szybko usieciować metakrylan żelatyny. Po powtórzeniu sieciowania UV dla wszystkich innych studzienek, należy odpipetować jeden mililitr DPBS z każdej strony kanału naczyniowego każdej studzienki.Umieść płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 15 minut, aby upłynnić pluroniczny F127. Przed wprowadzeniem komórek do kanałów należy przez 30 minut przepuszczać DMEM F12 zawierający 1% matrigel. Na początek zanurz fiolkę z kriokonserwowanymi HUVEC w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni na dwie minuty.Następnie przepłukać fiolkę 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Odpipetować pięć mililitrów wstępnie podgrzanego ECGM do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Za pomocą mikropipety ostrożnie przenieść rozmrożone komórki z fiolki do stożkowej probówki.Następnie dodaj jeden mililitr świeżego, wstępnie ciepłego podłoża do fiolki kriogenicznej, aby przepłukać wnętrze i przenieść pozostałe komórki do stożkowej probówki. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach świeżego podłoża. Następnie przenieść komórki do kolby T75.Inkubować kolbę w nawilżanym inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przepłucz 90% zlewające się komórki HUVEC w kolbie T75 z 10 mililitrami DPBS. Następnie dodać jeden mililitr 0,25% TE do kolby.Po inkubacji delikatnie postukać w boki kolby i dodać pięć mililitrów roztworu neutralizującego trypsynę. Następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Zbierz pozostałe komórki z pięcioma mililitrami świeżego EKG i przenieś je do stożkowej rurki.Teraz odwiruj stożkową probówkę o sile 250 G przez trzy minuty, aby zebrać osad komórkowy. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawieś osad komórek w jednym mililitrze świeżego ECGM i policz komórki. Po ponownym odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 90 mikrolitrach świeżego EKGM.Następnie na krótko odkurz kanały wydrukowanych naczyń na płycie, aby oczyścić światło. Za pomocą mikropipety delikatnie napełnij kanał 15 mikrolitrami zawiesiny komórek HUVEC. Umieść płytkę płasko w inkubatorze na dwie godziny.Następnie odwróć płytkę do 180 stopni, utrzymując ją w płaskiej pozycji przez następne dwie godziny. Po czterech godzinach umyj kanał DPBS, aby usunąć nieprzylegające i martwe komórki. Następnie odpipetuj dwa mililitry świeżego ECGM do każdej studzienki.Umieść dynamiczną kulturę na bujaku pod kątem nachylenia 10 stopni i pięciu obr./min. Komórki HUVEC szybko przyczepiały się i namnażały, pokrywając powierzchnię światła kanałów naczyniowych VOP. Dojrzewanie śródbłonka zweryfikowano za pomocą barwienia immunologicznego dla CD31 pięć dni po wysiewie komórek, co wykazało lokalizację CD31 w połączeniach ścisłych.

high-throughput-bioprinting-method-for-modeling-vascular-permeability

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Przedstawiono metodę określania przepuszczalności w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych oraz optymalizacji parametrów in silico do obliczania współczynników dyfuzji za pomocą symulacji.

Metoda wyznaczania i symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelu tkankowym 3D w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych

Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.

Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro

Prezentowany tutaj jest prosty w użyciu, trójwymiarowy zestaw do biodruku z rdzeniem/powłoką, do jednoetapowego wytwarzania pustych rusztowań, odpowiedni do inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych i innych struktur rurowych.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Celem tego protokołu jest bezpośrednie biodrukowanie komórek nabłonka piersi jako wielokomórkowych sferoid na wstępnie utworzonych sieciach śródbłonka, aby szybko stworzyć modele 3D kokultury piersi i śródbłonka, które mogą być wykorzystane do badań przesiewowych leków.

Bezpośrednie biodrukowanie wielokomórkowych sferoid piersi 3D na sieciach śródbłonka

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Zaprojektowane klapy wymagają wbudowanej funkcjonalnej sieci naczyniowej. W tym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania wydrukowanego w 3D płata tkankowego zawierającego hierarchiczną sieć naczyniową i jej bezpośrednie zespolenia mikrochirurgiczne z tętnicą udową szczura.

Wytwarzanie zaprojektowanych płatów naczyniowych przy użyciu technologii druku 3D

Ten protokół przedstawia konfigurację i działanie nowo opracowanego, wydrukowanego w 3D bioreaktora do hodowli ex vivo naczyń krwionośnych w trakcie perfuzji. System został zaprojektowany tak, aby mógł być łatwo przyjęty przez innych użytkowników, praktyczny, niedrogi i możliwy do dostosowania do różnych zastosowań eksperymentalnych, takich jak podstawowa biologia i badania farmakologiczne.

Ex vivo Kultura perfuzyjna dużych naczyń krwionośnych w bioreaktorze wydrukowanym w 3D

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

Ten protokół opisuje rekonfigurowalną platformę hodowli komórkowych opartą na membranie, która integruje format otwartej studni z możliwościami przepływu płynów. Platforma ta jest kompatybilna ze standardowymi protokołami i umożliwia odwracalne przejścia między trybem hodowli w studni otwartej a mikroprzepływowym, dostosowując się do potrzeb zarówno laboratoriów inżynieryjnych, jak i biologicznych.

Przekształcanie statycznych modeli tkanek barierowych w dynamiczne systemy mikrofizjologiczne

Rozpuszczalne ekstrakty z błony podstawnej są najczęściej stosowanymi matrycami biologicznymi w badaniach nad rakiem, ale ich skomplikowane zachowanie reologiczne utrudnia ich biodrukowanie za pomocą dostępnych na rynku systemów biodruku. W pracy przedstawiono zindywidualizowaną strategię biodruku w celu uzyskania czystych konstruktów matrycowych o dobrej wierności kształtu zarówno w jednej, jak i wielu warstwach.

Projekt i walidacja biodrukarki do wytłaczania wolumetrycznego do biodruku rozpuszczalnego ekstraktu z błony podstawnej do badań translacyjnych

Poznaj wysokoprzepustową metodę biodruku 3D do tworzenia modeli naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych. Ta technologia poprawia powtarzalność i umożliwia analizę w czasie rzeczywistym.

Wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru

Przeglądaj więcej filmów