Name: Kwantyfikacja gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy w poprzek zrazików (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy przy użyciu barwienia isolectin B4 i analizy ImageJ. Protokół uwzględnia różnice anatomiczne między zrazikami oraz zmiany związane z wiekiem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy wyrażają swoją wdzięczność za nieocenione wsparcie otrzymane od publicznej platformy eksperymentalnej w West China School of Pharmacy. Szczególne uznanie kierujemy do Wendong Wanga za udzielanie krytycznych i bardzo cennych porad dotyczących patologii. Badania te były możliwe dzięki finansowaniu z Departamentu Nauki i Technologii Prowincji Syczuan (granty 2023NSFSC0130 i 2023NSFSC1992) oraz "Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych" dla TJ.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z etycznymi wytycznymi Komitetu Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Syczuańskiego (nr K2023023).
1. Przygotowanie skrawków parafiny dla płatów płuc myszy
<ol>
	<li>Pozyskaj tkankę płucną od myszy.
	<ol>
		<li>Wybierz samca myszy C57Bl/6 w wieku 6 tygodni i 16 miesięcy, aby ocenić gęstość mikronaczyniową w płucach myszy w różnych grupach wiekowych.</li>
		<li>Podawać 100 mg/kg pentobarbitalu sodu we wstrzyknięciu dootrzewnowym myszom. Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy po znieczuleniu. Otwórz klatkę piersiową i uzyskaj tkankę płucną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj skrawki parafiny.
	<ol>
		<li>Utrwal tkankę, umieszczając ją w 4% roztworze paraformaldehydu, który jest 10 razy większy od objętości tkanki, aby zachować jej morfologię i strukturę oraz zapobiec degradacji. 
		UWAGA: Niedawno opracowano nową metodę nadmuchiwania powietrza podczas utrwalania perfuzji naczyniowej w płucach myszy. Doniesiono, że metoda ta pozwala zachować lepszą morfologię i lokalizację dróg oddechowych, komórek pęcherzyków płucnych i śródmiąższu, co czyni je bardziej odpowiednimi do badań histologicznych płuc. Ta metoda jest zalecana dla laboratoriów z odpowiednim sprzętem i materiałami eksploatacyjnymi z własnymi instrumentami8.</li>
		<li>Wytnij płat płuca, aby określić kierunek osadzania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).
		<ol>
			<li>Po 3 godzinach od stabilizacji oddzielić pięć płatów płucnych (pod bezpośrednią obserwacją oczu) i oddzielnie osadzić płaty czaszki, środkowe i dodatkowe prawego płuca, z sekcjami zorientowanymi w kierunku pionowego połączenia płata z oskrzelami.</li>
			<li>Przeciąć płat ogonowy prawego płuca na 2 części na 4 mm od lewej do prawej w kierunku prostopadłym do połączenia płat płuca z oskrzelami i zatopić plastry w bloku woskowym z powierzchnią cięcia skierowaną do góry.</li>
			<li>Wykonaj trzy nacięcia w lewym płacie płuca. Pierwsze cięcie wykonaj poprzecznie powyżej głównego połączenia oskrzelowego, 2 mm poniżej góry. Wykonaj drugie cięcie poprzecznie powyżej głównego połączenia oskrzelowego, 5 mm poniżej góry. Wykonaj trzecie cięcie na końcu płata, 8 mm poniżej góry. Wyrzuć najwyższy kawałek tkanki i zamknij pozostałe trzy kawałki w bloku wosku z powierzchnią cięcia skierowaną do góry. 
			UWAGA: W przypadku osadzania wielu kawałków płuc razem, można użyć bibuły do wycierania mikroskopu, aby owinąć je przed umieszczeniem w pudełku do zatapiania tkanek, aby kontynuować proces odwadniania.</li>
			<li>Ponownie utrwalić tkankę w utrwalaczu na 24 godziny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść blok tkanki w pojemniku i płucz go pod bieżącą wodą przez 15 minut.</li>
		<li>Kolejno umieść tkankę w następujących roztworach: 65% etanol przez 30 min, 75% etanol przez 30 min, 85% etanol przez 30 min, 95% etanol I przez 60 min, 95% etanol II przez 60 min, etanol absolutny I przez 60 min, etanol absolutny II przez 60 min, 70% etanol przez 120 min, 80% etanol przez 120 min, 90% etanol przez 120 min, 95% etanol przez 120 min, etanol absolutny I przez 120 min i etanol absolutny II przez 120 min.</li>
		<li>Umieść tkankę w ksylenie I na 30 minut, a ksylenu II na 30 minut.</li>
		<li>Umieść chusteczkę w miękkim wosku w temperaturze poniżej 54 °C na 1 godzinę, twardym wosku I w temperaturze 58 °C na 1 godzinę i twardym wosku II w temperaturze 58 °C na 30 minut.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni rozmiar formy, wypełnij ją odpowiednią ilością płynnej parafiny i za pomocą kleszczyków umieść tkankę w ramie do osadzania w środku formy we właściwym kierunku. Umieść formę i chusteczkę w obszarze zamrażania maszyny do zatapiania i delikatnie dociśnij tkankę kleszczami.</li>
		<li>Gdy parafina zacznie lekko bieleć, szybko umieść odkrytą ramkę do osadzania na wierzchu formy i wykonaj drugi wtrysk wosku, uszczelniając otwory w dolnej części ramy do zatapiania. Przenieś całą formę na stół do zamrażania w celu formowania.</li>
		<li>Po zamocowaniu bloku wosku na krajalnicy i odsłonięciu gładkiej i płaskiej powierzchni cięcia poprzez zgrubne i dokładne przycinanie, obróć korbę koła mikrotomu, aby pokroić plastry o grubości 4 μm.</li>
		<li>Płynnie umieść usunięte sekcje na powierzchni wody w kolejności sekwencyjnej. Gdy sekcje zostaną w pełni wysunięte, oddziel połamane kawałki na skrzyżowaniach między każdą sekcją.</li>
		<li>Przechyl szklaną zjeżdżalnię pod sekcją i po zetknięciu się powoli i równomiernie podnieś zjeżdżalnię z powierzchni wody ruchem pionowym. Sekcje będą przylegać do szklanego szkiełka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie immunofluorescencyjne do wykrywania mikrokrążenia płucnego
<ol>
	<li>Plastry zatopione w parafinie wstawić do piekarnika o temperaturze 65°C na 60 minut.</li>
	<li>Umieść plastry na stojaku do szkiełków i wykonaj następujące czynności w słoikach do barwienia: zanurz ksylen 1, ksylen 2 i ksylen 3 na 15 minut każdy, a następnie zanurz w ksylenie/etanolu (1:1) na 5 minut, 100% etanolu #1, 100% etanolu #2, 85% etanolu, 75% etanolu i wodzie destylowanej na 5 minut każdy.</li>
	<li>Zmodyfikowany roztwór do odzyskiwania antygenu cytrynianu sodu rozcieńczyć 50-krotnie wodą dejonizowaną. Rozgrzej kuchenkę mikrofalową na dużej mocy do wrzenia, a następnie umieść szkiełko w ekstrakcie antygenowym. Pozwól szkiełku gotować się w ekstrakcie antygenowym przez 15 minut, a następnie ostudź naturalnie do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka dwukrotnie PBS przez 5 minut każde. Przepuszczalność 0,25% Tritonu dwa razy po 10 minut.</li>
	<li>Otocz tkankę pisakiem immunohistochemicznym i inkubuj ją z 5% BSA w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę. Umyj szkiełka raz PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Wykonaj barwienie IB4 i DAPI sprzężone z Alexa-647 Fluor.
	<ol>
		<li>Trzymaj IB4 na lodzie i rozcieńczyć go w stosunku 1:50 z 1% BSA. Usuń nadmiar wody wokół okręgu, dodaj 50-100 μl rozcieńczonego IB4 do każdego odcinka tkanki i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C (od tego kroku wszystkie zabiegi należy wykonywać w ciemności).</li>
		<li>Umyj szkiełka trzykrotnie PBS przez 5 minut każde. Przepuszczalność 0,25% Tritonu przez 10 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć DAPI (10 μg/ml) PBS w stosunku 1:10 i dodać 50-100 μl do każdego odcinka tkanki w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
	<li>Umyj szkiełka trzykrotnie PBS przez 5 minut każde.</li>
	<li>Nałóż kroplę środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na szkiełka, unikając ekspozycji na światło. Wysuszyć szkiełko na powietrzu, a następnie obserwować i rejestrować obrazy jądra i sygnałów docelowych pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja gęstości mikronaczyniowej płuc
<ol>
	<li>Pobieranie obrazów.
	<ol>
		<li>Obserwuj sygnały gęstości mikrokrążenia w płucach i sygnały DAPI pod 10-krotnym obiektywem dla każdego płata płuc zarówno w młodych, jak i starszych grupach wiekowych.</li>
		<li>Ustandaryzuj natężenie źródła światła i czas ekspozycji dla każdego kanału na podstawie wyników obserwacji. Uchwyć dwukanałowe obrazy obejmujące cały obszar każdego płata płuca. Zapisz obraz w formacie ND2 z dwoma kanałami (Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo za pomocą obrazu J (rysunek uzupełniający 1).
	<ol>
		<li>Uruchom oprogramowanie ImageJ.</li>
		<li>Zaimportuj wskazane obrazy do ImageJ, a następnie przystąp do ładowania i wybierz je. Odpowiednio podziel kanały. Załaduj plik w formacie ND2 zarówno dla kanałów DAPI, jak i IB4.</li>
		<li>Przejdź do opcji Analizuj > ustaw skalę > skonfiguruj parametry obrazu jako 0,48 μm/piksel (w zależności od parametrów fotografii) > Globalne > OK.</li>
		<li>Ustaw ten sam zakres wyświetlania, aby dostosować efekt prezentacji obrazu. Wybierz Obraz> Dostosuj > Jasność/Kontrast > ustawione. Ustaw zakres wyświetlania dla każdego z dwóch kanałów osobno, IB4: 0-10000; DAPI: 0-20000.</li>
		<li>Aby wyeliminować wpływ sygnałów tła, wykonaj następujące czynności: Kliknij Przetwarzaj > Matematyka > Odejmij; Odejmij sygnał tła na podstawie wartości sygnału wykrytych przez narzędzie Magiczna różdżka na tle, IB4: 3000; DAPI:300.</li>
		<li>Aby wybrać wartość progową, która najlepiej pasuje do oryginalnego obrazu, przejdź do opcji Obraz > duplikat.</li>
		<li>Wybierz zarówno oryginalny, jak i zduplikowany obraz > Wpisz > 8 bitów.</li>
		<li>Wybierz odpowiednią wartość progową, aby precyzyjnie określić mikrokrążenie płuc. Kliknij Obraz > Dostosuj próg > > Intermodes (wybierz najbardziej realistyczny próg w stosunku do oryginalnego diagramu), zaznacz > Ciemne tło > Zastosuj.</li>
		<li>Wyeliminuj dodatnie sygnały IB4 z dużych naczyń krwionośnych w płucach myszy, w tym tętnic i żył: Użyj narzędzia Magiczna różdżka, aby wybrać większe naczynia krwionośne w porównaniu ze zduplikowanym obrazem, a następnie kliknij Usuń (powtarzaj to, aż dodatnie sygnały IB4 w komórkach śródbłonka większych naczyń krwionośnych zostaną usunięte). 
		UWAGA: Sygnały barwienia IB4 są wykrywane w komórkach śródbłonka tętnic i żył w płucach myszy. W celu uzyskania specyficznego badania występowania mikrokrążenia płucnego zaleca się równomierne usuwanie ognisk sygnałowych w komórkach śródbłonka większych naczyń krwionośnych.</li>
		<li>Policz liczbę sygnałów docelowych, kliknij przycisk Analizuj > ustaw pomiary, a następnie zaznacz pola wyboru Obszar, Ogranicz do progu i Wyświetl etykietę. Następnie wybierz Analizuj cząstki i ustaw Rozmiar: 0-nieskończoność; Cyrkularność: 0,00-1,00; Pokaż: Nadmiernie maskuje; zaznacz opcję Podsumuj i kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Wybierz opcję Podsumuj wyniki > pliku > Zapisz jako.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych i statystyki
	<ol>
		<li>Dopasuj i uporządkuj liczbę ognisk dodatnich IB4 i ognisk dodatnich DAPI, odpowiednio, na tym samym obrazie w ujednoliconą tabelę.</li>
		<li>Podsumuj łączną liczbę ognisk dodatnich IB4 i ognisk dodatnich DAPI dla każdego płata we wskazanych grupach młodych lub wiekowych.
		<ol>
			<li>Obliczyć procent ognisk dodatnich IB4 (%), dzieląc całkowitą liczbę ognisk dodatnichIB4 przez całkowitą liczbę ognisk barwienia DAPI w każdym płacie przez różne grupy. Przedstaw liczbę ognisk dodatnich IB4, liczbę ognisk barwienia DAPI oraz procent ognisk dodatnich IB4 (%), jak pokazano na <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie do analizy danych i utwórz nową tabelę kolumn. 
		UWAGA: GraphPad Prism 9 został tutaj użyty do analizy statystycznej.</li>
		<li>Kolejno nazwij je od grupy A do grupy J jako "Młody płat czaszki", "Stary płat czaszki", "Młody płat środkowy", "Stary płat środkowy", "Młody płat ogonowy", "Stary płat ogonowy", "Młody płat dodatkowy", "Stary płat dodatkowy", "Młody lewy płat", "Stary lewy płat". Następnie wprowadź odpowiednie dodatnie ogniska IB4 (%) do tabeli (tabela uzupełniająca 1).</li>
		<li>Wykorzystaj niesparowane testy t do porównania parami, aby ocenić znaczące różnice w odpowiednich regionach między dwiema grupami wiekowymi. Przeprowadź w sumie pięć porównań dla pięciu płatów.</li>
		<li>Utwórz wykres do wizualizacji wyników (Rysunek 3B). Wybierz wykres słupkowy i uwzględnij analizę statystyczną na rysunku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Assessing Pulmonary Microvasculature with Isolectin B4 Staining in Mice

<ol><li>Jia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf-2+promotes+angiogenesis+through+a+srsf1%2Fsrsf3%2Fsrpk1-dependent+axis+that+controls+vegfr1+splicing+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Fgf-2 promotes angiogenesis through a srsf1/srsf3/srpk1-dependent axis that controls vegfr1 splicing in endothelial cells.</a> BMC Biol. 19 (1), 173(2021).</li>
<li>Schneider, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+lung%3A+Physiology%2C+disease%2C+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The aging lung: Physiology, disease, and immunity.</a> Cell. 184 (8), 1990-2019 (2021).</li>
<li>Rafii, S., Butler, J. M., Ding, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiocrine+functions+of+organ-specific+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiocrine functions of organ-specific endothelial cells.</a> Nature. 529 (7586), 316-325 (2016).</li>
<li>Lipskaia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+telomerase+in+p21-positive+cells+counteracts+capillaries+rarefaction+in+aging+mice+lung%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Induction of telomerase in p21-positive cells counteracts capillaries rarefaction in aging mice lung.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Hoshino, M., Takahashi, M., Aoike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+vascular+endothelial+growth+factor%2C+basic+fibroblast+growth+factor%2C+and+angiogenin+immunoreactivity+in+asthmatic+airways+and+its+relationship+to+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of vascular endothelial growth factor, basic fibroblast growth factor, and angiogenin immunoreactivity in asthmatic airways and its relationship to angiogenesis.</a> J Allergy Clin Immunol. 107 (2), 295-301 (2001).</li>
<li>Ackermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+vascular+endothelialitis%2C+thrombosis%2C+and+angiogenesis+in+covid-19%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary vascular endothelialitis, thrombosis, and angiogenesis in covid-19.</a> New Engl J Med. 383 (2), 120-128 (2020).</li>
<li>Wertheim, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+pulmonary+microvascular+endothelial+cells+ex+vivo%3A+Implications+for+pulmonary+arterial+hypertension%2C+and+a+caution+on+the+use+of+commercial+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolating pulmonary microvascular endothelial cells ex vivo: Implications for pulmonary arterial hypertension, and a caution on the use of commercial biomaterials.</a> PLoS One. 14 (2), e0211909(2019).</li>
<li>Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air-inflation+of+murine+lungs+with+vascular+perfusion-fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation.</a> J Vis Exp. (168), e62215(2021).</li>
<li>Ramasamy, S. K., Kusumbe, A. P., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tissue+morphogenesis+by+endothelial+cell-derived+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tissue morphogenesis by endothelial cell-derived signals.</a> Trends Cell Biol. 25 (3), 148-157 (2015).</li>
<li>Amersfoort, J., Eelen, G., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulation+by+endothelial+cells+-+partnering+up+with+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunomodulation by endothelial cells - partnering up with the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 22 (9), 576-588 (2022).</li>
<li>Niethamer, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+role+of+pulmonary+endothelial+cell+heterogeneity+in+the+response+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Defining the role of pulmonary endothelial cell heterogeneity in the response to acute lung injury.</a> eLife. 9, e53072(2020).</li>
<li>Corliss, B. A., Mathews, C., Doty, R., Rohde, G., Peirce, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+label%2C+image%2C+and+analyze+the+complex+structural+architectures+of+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Methods to label, image, and analyze the complex structural architectures of microvascular networks.</a> Microcirculation. 26 (5), e12520(2019).</li>
<li>Phillips, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+evaluating+the+murine+pulmonary+vasculature+using+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A method for evaluating the murine pulmonary vasculature using micro-computed tomography.</a> J Surg Res. 207, 115-122 (2017).</li>
<li>Chadwick, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+network+extraction+and+analysis+of+mouse+pulmonary+vasculature+via+x-ray+micro-computed+tomographic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Vessel network extraction and analysis of mouse pulmonary vasculature via x-ray micro-computed tomographic imaging.</a> PLoS Comput Biol. 17 (4), e1008930(2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Badanie gęstości mikrokrążenia w płucach ma istotne implikacje dla zrozumienia procesów fizjologicznych płuc, a także dla zdefiniowania biomarkera (biomarkerów) chorób układu oddechowego. Krążenie płucne ma rozległą powierzchnię naczyń włosowatych otoczoną smukłą warstwą komórek śródbłonka. Harmonijne zestawienie tych komórek i komórek nabłonka pęcherzyków płucnych powoduje powstanie delikatnej błony pęcherzykowo-kapilarnej zaprojektowanej specjalnie w celu ułatwienia skomplikowanego procesu wymiany gazowej<sup class="xr...

Komórki śródbłonka (ECs) to specjalny rodzaj komórek znajdujących się na wewnętrznej wyściółce naczyń krwionośnych, pokrywających całe drzewo tętnicze i żylne i odgrywających kluczową rolę w utrzymaniu stabilności naczyń krwionośnych i narządów1. Płuca są silnie unaczynionymi narządami i odgrywają w płucach podstawowe role fizjologiczne i patologiczne, takie jak tworzenie ściany naczyniowej, regulacja przepływu krwi, ułatwianie wymiany gazowej, modulowanie reakcji zapalnych, kontrolowanie aktywności płytek krwi, wydzielanie substancji regulatorowych zaangażowanych we wzrost naczyń krwionośnych, naprawę i utrzymanie równowagi krzepnięcia.
Komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc (LMEC) są specyficznymi komórkami śródbłonka tkanki płucnej, szczególnie w mikrokrążeniach (naczyniach włosowatych) płuc, co odróżnia je od bardziej uogólnionych komórek śródbłonka tętniczego i żylnego w płucach. Komórki te pełnią różne funkcje, w tym regulują napięcie naczyniowe, kontrolują przepuszczalność naczyń, uczestniczą w regulacji reakcji zapalnych i regulują tworzenie się skrzeplin. Odgrywają kluczową rolę w krążeniu płucnym, regulując wymianę gazową i transport składników odżywczych, a także biorą udział w różnych fizjologicznych i patologicznych procesach związanych z płucami, prawdopodobnie w przypadku starzenia się2. Co więcej, nieprawidłowa przemiana angiogenezy płucnej jest związana z dysfunkcją mikronaczyniową płuc3. Wykorzystując konwencjonalny marker komórek śródbłonka CD31 i lokalizację przestrzenną (w szczególności obwodowe regiony płuc), Larissa L. i in. zaobserwowali znaczny spadek gęstości komórek śródbłonka mikronaczyniowego u starszych myszy (18 miesięcy) w porównaniu z ich młodszymi odpowiednikami (4 miesiące)4. W kontekście patologii płuc związanej z astmą, Makoto H. i wsp. wykazali znaczny wzrost indukcji naczyń w próbkach biopsji oskrzeli barwionych antykolagenem IV od pacjentów z astmą w porównaniu z osobami kontrolnymi5. Niedawno, wprowadzając techniki transmisyjnej i skaningowej mikroskopii elektronowej, Maximilian A. i wsp. poinformowali o znaczącym wzroście gęstości liczbowej cech związanych z angiogenezą wgłobienia i kiełkowania u pacjentów, którzy zmarli z powodu Covid-19 lub grypy A (H1N1)6. Najwyraźniej nieprawidłowa geneza mikrokrążenia jest związana z dysfunkcją płuc. Jednak obecnie nie ma prostej, ekonomicznej metody ilościowego określania zmian gęstości mikrokrążenia.
W modelach mysich płuca są tradycyjnie podzielone na pięć odrębnych płatów: prawy czaszkowy, prawy środkowy, prawy ogonowy, lewy czaszkowy i lewy. Każdy płat wykazuje unikalne cechy pod względem wielkości, kształtu, lokalizacji i prawdopodobnego unaczynienia, przyczyniając się do efektywnej wymiany gazowej i potencjalnie synergicznej regulacji krążenia płucnego. Jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, żadna metodologia nie wyjaśnia różnic między tymi płatami płuc podczas badania zmian mikronaczyniowych w płucach.
To badanie przedstawia nową metodę cięcia zrazików u myszy, wykorzystującą IB4, dobrze zdefiniowany marker komórek mikrośródbłonka płuc7, do bezstronnej ilościowej oceny gęstości mikronaczyniowej płuc. To innowacyjne podejście odpowiada na potrzebę bardziej wszechstronnego zrozumienia zmian mikronaczyniowych w płucach myszy poprzez uwzględnienie odrębnych właściwości poszczególnych płatów myszy. Jak wykazano, u starzejących się myszy znaczne zmniejszenie płuc 
Gęstość mikronaczyniową obserwuje się szczególnie zarówno w płacie ogonowym, jak i w płacie lewym. W protokole podkreślono znaczenie integracji analiz specyficznych dla płata z badaniami zmian w krajobrazie mikronaczyniowym płuc myszy. Warto zauważyć, że metoda ta dostarcza cennych punktów odniesienia dla badaczy poszukujących kompleksowego zrozumienia zarówno fizjologicznej, jak i patologicznej progresji rozwoju i zmian w płucach, wykraczającej poza angiogenezę.

<table><tbody><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td>Utrwalacz tkanek</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol</td><td>MCE</td><td>HY-D0814</td><td>Barwniki nukleinowe</td></tr><tr><td>Alexa-647 Fluor sprzężony izolektyna B4</td><td>Thermo</td><td>I32450</td><td>Wiążące mikronaczynia</td></tr><tr><td>Antyfluorescencyjny uszczelniacz</td><td>tabletek Abcam</td><td>AB104135</td><td>Utrwalanie próbki</td></tr><tr><td>Płyn naprawczy antygenu</td><td>Biosharp</td><td>BL151A</td><td>Naprawa miejsc antygenowych</td></tr><tr><td>Kaseta do biopsji</td><td>ActivFlo</td><td>39LC-500-1</td><td>Utrwalanie i pozycjonowanie próbek tkanek</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma</td><td>B2064-50G</td><td>Roztwór uszczelniający</td></tr><tr><td>Zimna płyta</td><td>Leica</td><td>HistoCore Arcadia H&nbsp;</td><td>Zamrażanie próbek</td></tr><tr><td>Elektryczny piec do suszenia o stałej temperaturze</td><td>Taisite</td><td>101-0AB</td><td>Naprawa w wysokiej temperaturze</td></tr><tr><td>Jednorazowe ostrze mikrotomu</td><td>Leica</td><td>14035838383</td><td>Cięcie próbek tkanek w celu przygotowania sekcji</td></tr><tr><td>Osadzanie form</td><td>Shitai</td><td>26155166627</td><td>Utrwalanie próbek tkanek</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Kelong</td><td>CAS 64-17-5</td><td>Roztwór do odwadniania tkanek</td></tr><tr><td>Podgrzana parafina Stacja osadzania</td><td>Leica</td><td>EG1150</td><td>Osadzanie próbek Tssue w parafinie</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna HistoCore</td><td>Leica</td><td>HI1220</td><td>Spłaszczanie i utrwalanie próbek tkanek</td></tr><tr><td>ImageJ (Fidżi)&nbsp;</td><td>NIH</td><td>1.54f</td><td>Narzędzie ilościowe</td></tr><tr><td>Długopisy immunohistochemiczne</td><td>Biosharp</td><td>BC004</td><td>Środek blokujący wodę</td></tr><tr><td>Kleszcze medyczne</td><td>Szanghaj Sprzęt</td><td>medyczny Nie dotyczy</td><td>Chwytanie, manipulowanie lub przenoszenie próbek tkanek</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Urządzenie do obrazowania</td><td>Nikon</td><td>Ts2</td></tr><tr><td>Media montażowe</td><td>Jiangyuan</td><td>Bezsmakowe</td><td>utrwalanie i konserwowanie Sekcje tkanek</td></tr><tr><td>Wosk parafinowy</td><td>SCHLEDEN</td><td>80200-0014</td><td>Utrwalanie struktury tkanki</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Beyotime</td><td>C0221A</td><td>Bufor do mycia</td></tr><tr><td>Pentobarbital Sól sodowa</td><td>Pekin Odczynnik chemiczny Firma</td><td>Q / H82-F158-2002</td><td>Znieczulający</td></tr><tr><td>rotacyjny mikrotom</td><td>Biobase</td><td>Bk-2258</td><td>Przygotowanie plastrów</td></tr><tr><td>Sterylne nożyczki</td><td>Shanghai Medical Sprzęt</td><td>Nie dotyczy</td><td>segmentacji Próbki tkanek</td></tr><tr><td>Skalpel chirurgiczny</td><td>Szanghaj Sprzęt medyczny</td><td>Nie dotyczy</td><td>Cięcie próbek tkanek Triton</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td>Roztwór przepuszczalny</td></tr><tr><td>Szkiełko bez mycia</td><td>PLATINUM PRO</td><td>PRO-04</td><td>Utrwalanie próbek do barwienia</td></tr><tr><td>ksylenu</td><td>SUM</td><td>XK13-011-00031</td><td>Roztwór do usuwania wosku tkankowego</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy w poprzek zrazików

Quantifying Pulmonary Microvascular Density in Mice Across Lobules

Nieprawidłowa zmiana angiogenezy płuc jest związana z dysfunkcją mikronaczyniową płuc i jest głęboko związana z integralnością ścian naczyniowych, regulacją przepływu krwi i wymianą gazową. W modelach mysich płaty płuc wykazują znaczne różnice w rozmiarze, kształcie, lokalizacji i unaczynieniu, jednak istniejące metody nie uwzględniają tych różnic przy ilościowym określaniu gęstości mikrokrążenia. To ograniczenie utrudnia kompleksowe badanie dysfunkcji mikrokrążenia płuc i potencjalną przebudowę krążenia mikrokrążenia w różnych zrazikach. Nasz protokół rozwiązuje tę lukę, stosując dwie metody podziału w celu ilościowego określenia zmian gęstości mikronaczyniowej płuc, wykorzystując rozmiar, kształt i rozmieszczenie gałęzi dróg oddechowych w różnych płatach u myszy. Następnie wykorzystujemy barwienie izolektyną B4 (IB4) do znakowania komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc na różnych warstwach, a następnie przeprowadzamy bezstronną analizę gęstości mikronaczyniowej przy użyciu bezpłatnego oprogramowania ImageJ. Przedstawione tutaj wyniki podkreślają różne stopnie zmian gęstości mikronaczyniowej w zrazikach płuc wraz ze starzeniem się, porównując młode i stare myszy. Protokół ten oferuje proste i opłacalne podejście do bezstronnej kwantyfikacji gęstości mikrokrążenia w płucach, ułatwiając badania zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych aspektów mikrokrążenia płuc.

Aby odróżnić zmiany w głównych oskrzelach od zmian w małych odgałęzieniach dróg oddechowych, kluczowe jest zapewnienie obserwacji ciągłości struktur zmian w obu tych typach dróg oddechowych. Można to osiągnąć, stosując procedury cięcia i zatapiania przedstawione na Rysunku 1. Ze względu na liczne płaty płuc myszy, które są zorientowane w różnych kierunkach i mają strukturę siateczkową, są one bardziej podatne na zapadnięcie się w porównaniu z innymi tkankami litego organu. Aby uzyskać przejr...

Tutaj opisujemy prosty i ekonomiczny protokół do przeprowadzenia bezstronnej kwantyfikacji gęstości mikrokrążenia płuc dla całej tkanki płucnej myszy za pomocą pojedynczego barwienia izolektyny B4.

Kwantyfikacja gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy w poprzek zrazików

The abnormal alternation of pulmonary angiogenesis is related to lung microvascular dysfunction and is deeply linked to vascular wall integrity, blood ...

Nasze badania mają na celu ilościowe określenie gęstości mikronaczyniowej płuc w różnych zrazikach płuc myszy z uwzględnieniem różnic anatomicznych i zmian związanych z wiekiem za pomocą barwienia izolektyną B4 i analizy ImageJ. Kluczowe pytania, na które staramy się odpowiedzieć, dotyczą tego, jak dokładnie określić ilościowo gęstość mikronaczyniową w różnych zrazikach płuc oraz jakie zmiany zachodzą w gęstości mikronaczyniowej w zrazikach wraz z wiekiem. Najnowsze postępy w badaniach mikrokrążenia płucnego, w tym ulepszone techniki oczyszczania i utrwalania tkanek, zaawansowane obrazowanie i narzędzia programowe do dokładnej oceny ilościowej.Odkrycia te poszerzają naszą wiedzę na temat zmian mikronaczyniowych w starzeniu się i powiązanych chorobach, takich jak astma i COVID-19, oferując wgląd w potencjalne terapie. Głównymi wyzwaniami są dokładna lokalizacja zmian, prawidłowe cięcie tkanek płucnych, łagodzenie uszkodzeń tkanek związanych z utrwalaczem oraz brak specyficznych markerów dla komórek śródbłonka płuc. Tradycyjne metody często pomijają różnice w kształcie i unaczynieniu w różnych płatach płuc.Nasz protokół wypełnia tę lukę, zapewniając kompleksowe podejście do cięcia płatów płuc i ilościowego określania gęstości mikrokrążenia za pomocą izolektyny przed barwieniem. Połączenie barwienia IB4 z darmowym oprogramowaniem ImageJ do zaawansowanej analizy gęstości mikronaczyniowej zapewnia dokładne i użyteczne wyniki. Mechanizmy komórkowe i molekularne, dzięki którym zmiany mikronaczyniowe w płucach uczestniczą w progresji chorób związanych z płucami i rozwijają nowe strategie lub cele ratowania funkcji mikrokrążenia płuc w celu wspomagania naprawy płuc i indukowania powrotu do sprawności.

quantifying-pulmonary-microvascular-density-in-mice-across-lobules

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Specyficzny i szybki protokół do jednoczesnego badania funkcji prawego serca, zapalenia płuc i odpowiedzi immunologicznej jest opisany jako narzędzie do nauki.  Filmy i rysunki opisują fizjologię i techniki mikrodysekcji w zorganizowanym podejściu zespołowym, które można dostosować do stosowania w małych i dużych badaniach.

Pomiary ciśnienia skurczowego prawej komory w połączeniu z pobieraniem próbek płuc i tkanek immunologicznych u myszy

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Niedotlenienie naczyń płucnych (HPV) jest ważnym zjawiskiem fizjologicznym, dzięki któremu przy niedotlenieniu pęcherzyków płucnych perfuzja płuc jest dopasowana do wentylacji. Głównym segmentem naczyniowym przyczyniającym się do HPV jest tętnica wewnątrzgroniasta. W tym miejscu opisujemy nasz protokół analizy HPV mysich naczyń płucnych o średnicach 20-100 μm.

Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi umożliwia wizualizację sieci mikronaczyń na powierzchni płuc. W tym miejscu opisujemy podejście do ilościowego określania przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Opisujemy sposób szybkiego i prostego pomiaru zdolności dyfuzyjnej płuc u myszy i pokazujemy, że jest ona wystarczająco wrażliwa na zmiany fenotypu w wielu powszechnych patologiach płuc.  Metryka ta ma zatem bezpośrednie znaczenie translacyjne dla modeli mysich, ponieważ zdolność dyfuzji można również łatwo zmierzyć u ludzi.

Fenotypowanie funkcji płuc myszy in vivo ze zdolnością dyfuzyjną płuc

Tutaj prezentujemy protokół prostego i wiarygodnego pomiaru krzywej ciśnienia i objętości płuc u myszy, pokazując, że jest ona wystarczająco czuła, aby wykryć fenotypowe zmiany miąższowe w dwóch powszechnych patologiach płuc, zwłóknieniu płuc i rozedmie płuc. Ta metryka zapewnia sposób na ilościowe określenie zmian strukturalnych płuc wraz z rozwijającą się patologią.

Pomiar krzywej ciśnienie-objętość w płucach myszy

Wewnętrzna powierzchnia płuc (ISA) jest krytycznym kryterium oceny morfologii i fizjologii płuc w chorobach płuc i regeneracji pęcherzyków płucnych wywołanej urazem. Opisujemy tutaj znormalizowaną metodę, która może zminimalizować błąd systematyczny pomiaru ISA zarówno w modelach myszy do pneumonektomii płuc, jak i implantacji protez.

Ustandaryzowana metoda pomiaru wewnętrznej powierzchni płuc za pomocą pneumonektomii u myszy i implantacji protezy

Dotchawicze (IT) podawanie eksperymentalnych środków myszom często powoduje asymetryczne dostarczanie do dystalnych płuc. W tym raporcie opisujemy bezpośrednie podejście dooskrzelowe (IB) do kanniulacji każdego płuca u żywych myszy bez operacji. To podejście może być stosowane do selektywnego podawania środków do jednego płuca lub może być dostosowane do poprawy symetrycznego dostarczania środka do obu płuc.

Bezpośrednie podanie dooskrzelowe w celu poprawy selektywnego odkładania się czynnika w płucach myszy

Prezentujemy dość prostą i czułą metodę dokładnego oznaczania gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy. Metoda ta może pomóc w określeniu wpływu modyfikatorów genetycznych i środowiskowych oraz skuteczności potencjalnych terapii w mysich modelach chorób dróg żółciowych.

Określanie gęstości dróg żółciowych w wątrobie myszy

Celem tej techniki jest wizualizacja ex vivo sieci tętnic płucnych u myszy wcześnie urodzonych i dorosłych poprzez napompowanie płuc i wstrzyknięcie przez tętnicę płucną nieprzezroczystego związku na bazie polimeru radiologicznego. Omówiono również potencjalne zastosowania tkanek odlewanych.

Odlew naczyniowy płuc myszy dorosłych i wczesnych po urodzeniu do obrazowania mikro-CT

Poznaj metodę kwantyfikacji gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy przy użyciu barwienia isolectin B4 i analizy ImageJ. Protokół uwzględnia różnice anatomiczne między zrazikami oraz zmiany związane z wiekiem.

Kwantyfikacja gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy w poprzek zrazików

Przeglądaj więcej filmów