Name: Agregacja komórek w kapsułkach macierzy błony podstawnej do badania tworzenia mysiej tkanki śledziony (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj metodę agregacji komórek śledziony w macierzy błony podstawnej do trójwymiarowej kultury i transplantacji in vivo. Technika ta pozwala identyfikować typy komórek niezbędne do regeneracji tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych Australii (#GNT1078247).

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami eksperymentalnymi zatwierdzonymi przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Queensland (UQBR/079/19).
1. Pobieranie tkanek i przygotowanie komórek zrębu
<ol>
	<li>Poddać eutanazji 0,5-1,5 dnia samca i/lub samicy nowonarodzonych myszy dawców BALB/c poprzez indukcję hipotermii poprzez owinięcie zwierząt w bibułkę i umieszczenie ich pod kruszonym lodem przez >10 min. 
	UWAGA: Ten protokół można dostosować do różnych szczepów myszy, wieku i liczby zwierząt.</li>
	<li>Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne.</li>
	<li>Połóż mysz w prawej pozycji bocznej. Przetrzyj skórę 80% etanolem i wykonaj 1 cm nacięcie nożyczkami chirurgicznymi Iris, aby odsłonić ścianę otrzewnej.</li>
	<li>Wykonaj drugie 0,5 cm nacięcie powyżej śledziony i użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie podnieść tkankę. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć naczynia krwionośne i wyciąć tkankę. Przenieść tkankę na szalkę Petriego zawierającą lodowatą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Usuń pozostałą tkankę łączną przyczepioną do śledziony. 
	UWAGA: Mikroskop stereoskopowy może wspomagać drobne ruchy motoryczne wymagane do manipulowania narzędziami chirurgicznymi.</li>
	<li>Aby oddzielić całe tkanki, przenieś śledziony noworodków (pule 10 lub mniej) do wewnętrznej krawędzi odwróconej stożkowej nasadki rurki o pojemności 14 ml. Mechanicznie rozerwać tkanki ruchem uciskającym za pomocą plastikowej końcówki tłoka strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Umieść i szczelnie zabezpiecz nakrętkę na stożkowej probówce o pojemności 14 ml zawierającej 10 ml zimnego PBS. Odwróć probówkę 5x, aby zmyć całą uszkodzoną tkankę z nakrętki do tuby.</li>
	<li>Powtórz krok 1.6 dla pozostałej tkanki.</li>
	<li>Pozostaw probówkę na lodzie na 1 minutę, aby tkanka osiadła na dnie tubki.</li>
	<li>Ostrożnie wyrzucić supernatant (zawierający komórki krwiotwórcze), przepuszczając roztwór przez odwracalne sitko do komórek o średnicy 70 μm.</li>
	<li>Odzyskaj nierozpuszczalną frakcję zrębu poprzez odwrócenie sitka i przemycie tkanki zrębu z powrotem do stożkowej probówki o pojemności 14 ml przy użyciu świeżo przygotowanych 2 ml uzupełnionej pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (sDMEM) zawierającej 1 mg/ml kolagenazy IV, 40 μg/ml DNazy I i 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). 
	UWAGA: Kolagenaza IV i Kolagenaza D są substancjami niebezpiecznymi i muszą być obsługiwane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.</li>
	<li>Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową, należy enzymatycznie trawić zebraną tkankę (do 20) przez 10 minut w temperaturze 37 °C ze stałą rotacją.</li>
	<li>Dodaj 4 ml świeżo przygotowanego sDMEM zawierającego 1 mg/ml kolagenazy D, 40 μg/ml DNazy I i 2% FBS bezpośrednio do probówki zawierającej tkankę zrębu. Inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C przy stałej rotacji.</li>
	<li>Zatrzymaj trawienie, dodając 8 ml lodowatego PBS. Zebrać komórki, odwirowując przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć komórki, ponownie zawieszając w 1 ml zimnego PBS i odwirowując w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Utrzymać komórki na lodzie. 
	UWAGA: Komórki można zliczać i dostosowywać do żądanego stężenia. Może to wymagać optymalizacji dla różnych populacji komórek. Korzystając z tego protokołu, 0,5 x 106- 1 x 106 komórek zrębu/śledziony jest zwykle odzyskiwanych, w zależności od wieku myszy dawcy. Na tym etapie komórki mogą być opcjonalnie barwione, a sortowane metodą FACS w celu określenia składu komórek.</li>
</ol>
2. Enkapsulacja macierzy agregatów komórkowych
<ol>
	<li>Sterylne końcówki pipet P200 należy wstępnie schłodzić w zamrażarce o temperaturze -20°C.</li>
	<li>Pokrój elastyczną folię laboratoryjną (np. Parafilm) na kawałki o wymiarach 1 cm x 2 cm i sterylizuj, zanurzając w 80% etanolu na 10 minut, a następnie PBS na 10 minut. Folię laboratoryjną można przygotować wcześniej i przechowywać w sterylnej formie.</li>
	<li>Przygotować 0,5 x 10 6-2,5 x 106 komórek, odwirowując przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około 20 μl pozostałej objętości PBS. Trzymaj osad komórkowy na lodzie. 
	UWAGA: Pozostały PBS można delikatnie zassać bez naruszania osadu komórkowego w celu potwierdzenia objętości.</li>
	<li>Odessać 2 μl lodowatej matrycy membrany podstawnej do wstępnie schłodzonej końcówki pipety P200 za pomocą pipetora P20. 
	UWAGA: Wysoce skoncentrowana matryca błony podstawnej (np. Corning Matrigel Matrix High Concentration) pomaga w tworzeniu silnego, zestalonego czopu.</li>
	<li>Delikatnie przekręć, aby wysunąć końcówkę pipety. Rozciągnij wstępnie wysterylizowany pasek folii laboratoryjnej i umieść go na końcu końcówki pipety, uważając, aby nie przebić folii. Kontynuuj owijanie końcówki folią, aby uszczelnić końcówkę pipety. Ostrożnie umieść uszczelnioną końcówkę bezpośrednio na lodzie, uważając, aby nie rozerwać folii.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w pozostałym PBS i delikatnie nałożyć roztwór na matrycę błony podstawnej. Trzymaj konstrukcję na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj probówkę wirówkową, umieszczając probówkę zbiorczą o pojemności 1,2 ml w stożkowej probówce o pojemności 14 ml.</li>
	<li>Umieścić końcówkę pipety w zagnieżdżonej probówce i wirować w temperaturze 400 x g i 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Ustawić probówkę stożkową o pojemności 14 ml w orientacji pionowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy błony podstawnej wewnątrz końcówki pipety. 
	UWAGA: Probówkę stożkową o pojemności 14 ml można umieścić na lodzie, dopóki nie będzie potrzebna do dalszej aplikacji.</li>
</ol>
3. Trójwymiarowa hodowla organoidów
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń folię laboratoryjną z końcówki pipety.</li>
	<li>Włożyć cienki tłok z drutu ze stali nierdzewnej przez większy otwór końcówki pipety.</li>
	<li>Wyrzuć czop matrycowy, aż zostanie uwolniony przez końcówkę, do jednego dołka niepoddanej działaniu substancji 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 2 ml sDMEM uzupełnionego 10% FBS, 1x Glutamax, 1x Aminokwasy endogenne (NEAA), 10 μM inhibitor skał, 10 U/ml penicyliny/streptomycyny i 50 μM β-merkaptoetanolu. 
	UWAGA: Naczynie do hodowli tkankowej i odpowiadającą mu objętość pożywki można regulować zgodnie z wymaganiami. 
	UWAGA: NEAA, penicylina/streptomycyna i β-merkaptoetanol są substancjami niebezpiecznymi i muszą być obsługiwane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.</li>
	<li>Hoduj organoidy w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% przez 4-12 tygodni.</li>
	<li>Wymieniaj połowę podłoża co 5 dni. 
	UWAGA: Jeśli organoidy zaczną przyczepiać się do płytki kultury tkankowej, przenieś do świeżej studzienki.</li>
</ol>
4. Przeszczep torebki nerkowej
<ol>
	<li>Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne.</li>
	<li>Wykonaj podtorebkowy przeszczep nerki czopa macierzy błony podstawnej:
	<ol>
		<li>Znieczulić 8-tygodniową samicę myszy biorcy BALB/c izofluranem zgodnie z Instytucjonalnymi Wytycznymi Etycznymi Zwierząt. 
		UWAGA: Izofluran jest substancją niebezpieczną. Gaz odlotowy musi zostać usunięty, aby zapobiec przedostawaniu się do środowiska pracy.</li>
		<li>Połóż mysz w prawej pozycji bocznej.</li>
		<li>Ogolić włosy w miejscu operacji i zdezynfekować skórę zgodnie z wytycznymi instytucji. 
		UWAGA: Zaleca się trzykrotną dezynfekcję pola operacyjnego ruchami okrężnymi za pomocą naprzemiennego peelingu na bazie jodu lub chlorheksydyny i alkoholu.</li>
		<li>Wykonaj 2 cm nacięcie w skórze prostopadłej do kręgosłupa, aby odsłonić ścianę otrzewnej. 
		UWAGA: Do nacinania skóry można użyć cienkich nożyczek chirurgicznych lub ostrza skalpela. Użytkownicy powinni postępować zgodnie z Instytucjonalnymi Wytycznymi Etycznymi Zwierząt lub Standardowymi Procedurami Operacyjnymi.</li>
		<li>Wykonaj mniejsze 0,5 cm nacięcie w ścianie otrzewnej nad nerką. 
		UWAGA: Nacięcie powinno być zbliżone do szerokości nerki, aby zapewnić, że nerka pozostanie zewnętrzna podczas przeszczepu.</li>
		<li>Zewnętrznie nerkę należy wyprowadzić przez otwór otrzewnej, wywierając nacisk w dół za pomocą kciuka i palca wskazującego. Para pęset pierścieniowych może być użyta do pomocy w eksterioryzacji. Upewnij się, że nerka jest wilgotna przez cały czas trwania zabiegu, regularnie nakładając sterylny PBS za pomocą bawełnianego wacika.</li>
		<li>Pod mikroskopem stereoskopowym uszczypnij tłuszcz okołonerkowy torebki nerkowej za pomocą pary zgiętych ultracienkich kleszczyków w jednym biegunie nerki. Użyj drugiej pary zgiętych, bardzo cienkich kleszczyków, aby delikatnie rozerwać błonę torebki nerkowej w przeciwnym kierunku, tworząc mały otwór.</li>
		<li>Ostrożnie włóż bolec jednego kleszcza pod membranę kapsułki. Użyj powolnego, zamaszystego ruchu, aby oddzielić błonę torebki od miąższu nerki.</li>
		<li>Przygotować zatyczkę macierzy błony podstawnej do przeszczepu, usuwając film laboratoryjny z końcówki pipety.</li>
		<li>Podnieś torebkę nerkową za pomocą jednego bolca kleszczy i włóż końcówkę pipety przez otwór, popychając ją w kierunku przeciwległego bieguna nerki.</li>
		<li>Włożyć druciany tłok do końcówki pipety i usunąć zatyczkę matrycową, jednocześnie wyjmując końcówkę pipety z nerki.</li>
		<li>Zwilż nerkę PBS i ponownie zinternalizuj.</li>
		<li>Zamknij ścianę otrzewnej jednym szwem 5-0 Vicryl i zamknij skórę dwoma automatycznymi klipsami.</li>
		<li>Podawać leki przeciwbólowe (buprenorfina w dawce 0,05-0,1 mg/kg podskórnie lub zgodnie z Instytucjonalnymi Wytycznymi Etyki Zwierząt). 
		UWAGA: Buprenorfina jest substancją niebezpieczną i należy się z nią obchodzić przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyłącz przepływ izofluranu, ale utrzymuj przepływ tlenu włączony, aby mysz mogła oddychać czystym tlenem, dopóki nie zacznie odzyskiwać przytomności.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce. Utrzymuj zwierzę w cieple podczas rekonwalescencji, częściowo umieszczając klatkę na poduszce grzewczej lub pod lampą grzewczą i monitoruj, aż mysz w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.</li>
	<li>Monitoruj rekonwalescencję pooperacyjną przez pierwsze dwa tygodnie lub zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.</li>
</ol>

<ol><li>Jarcho, S., Andersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+autotransplantation+of+splenic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Traumatic autotransplantation of splenic tissue.</a> American Journal of Pathology. 15 (5), 527-546 (1939).</li>
<li>Storsteen, K. A., ReMine, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rupture+of+the+spleen+with+splenic+implants%3A+splenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis.</a> Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).</li>
<li>Mizrahi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttraumatic+autotransplantation+of+spleen+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Posttraumatic autotransplantation of spleen tissue.</a> Archives of Surgery. 124 (7), 863(1989).</li>
<li>Miko, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen+autotransplantation.+Morphological+and+functional+follow-up+after+spleen+autotransplantation+in+mice%3A+A+research+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary.</a> Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).</li>
<li>Grikscheit, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+spleen+protects+against+overwhelming+Pneumococcal+sepsis+in+a+rodent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered spleen protects against overwhelming Pneumococcal sepsis in a rodent model.</a> Journal of Surgical Research. 149 (2), 214-218 (2008).</li>
<li>Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoarchitecture+of+regenerated+splenic+and+lymph+node+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants.</a> International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).</li>
<li>Tan, J. K. H., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+spleen+tissue+regeneration+from+neonatal+spleen+capsule+requires+lymphotoxin+priming+of+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells.</a> The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).</li>
<li>Tan, J. K. H., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+subsets+directing+neonatal+spleen+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration.</a> Scientific Reports. 7 (1), 40401(2017).</li>
<li>Gee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spleen+organoid+units+generate+functional+human+and+mouse+tissue-engineered+spleen+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model.</a> Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).</li>
<li>Ueno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+Tlx1+marks+a+subset+of+lymphoid+tissue+organizer-like+mesenchymal+progenitor+cells+in+the+neonatal+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen.</a> Scientific Reports. 9 (1), 20408(2019).</li>
<li>Tourle, K., Rucinski, A., Grainger, A., Limnios, I. J., Gonzalez Ruiz, M., Tan, J. K. H. Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01">https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01</a> (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Agregacja noworodkowych komórek śledziony w półstałym podłożu stanowi realną metodę generowania konstruktów śledziony. Podobne protokoły oparte na macierzy błony podstawnej zostały wykorzystane do zainicjowania trójwymiarowych kultur śledziony10. W tym miejscu pokazujemy, że konstrukty śledziony są równie podatne na systemy hodowli organoidów in vitro , jak i na modele przeszczepów in vivo . Warto zauważyć, że przeszczepianie organoidów śledziony hodowanych in vitro nie zostało jeszcze przetestowane, ale interesujące byłoby określenie zdolności do pełnej lub częściowej regeneracji tkanki śledziony. Protokół ten dziedziczy również techniki agregacji komórek opisane w poprzednich badaniach dotyczących przeszczepiania śledziony8. Badania te polegały na załadowaniu agregatów komórkowych na arkusz kolagenu, a następnie przeszczepie pod torebkę nerkową. Zamknięcie agregatów komórkowych w macierzy błony podstawnej daje wyraźną przewagę pod względem orientacji przeszczepu, gdzie eliminowane są różnice związane z przeszczepem kolagenu stroną do dołu w porównaniu z przeszczepem komórkowym zagregowaną stroną do dołu.
Metodologia przygotowania konstrukcji matrycy membrany podstawnej jest stosunkowo prosta. Zastosowanie matrycy błony podstawnej o wysokim stężeniu zapewnia, że komórki są początkowo podtrzymywane w stanie zagregowanym, zanim matryca rozproszy się w ciągu kilku dni. Z naszego doświadczenia wynika, że po starannym warstwowaniu (krok 2.6) i odwirowaniu (krok 2.8) roztworu komórkowego zawieszonego PBS następuje minimalne mieszanie i rozcieńczanie matrycy błony podstawnej. Większość optymalizacji koncentruje się na umieszczeniu osadu ogniwa w korku matrycy (rysunek 1). Można temu zaradzić, testując kilka zmiennych, takich jak prędkość wirowania, czas, skład objętościowy matrycy błony podstawnej, objętość roztworu komórek zawieszonych w PBS i rozmiar końcówki pipety. Liczba komórek i charakterystyka (rozmiar, gęstość) mogą również wpływać na ustawienia, a każde przygotowanie komórek powinno być zoptymalizowane indywidualnie.
Należy zwrócić uwagę na kilka ograniczeń. Matryca membrany podstawnej może być produktem wrażliwym na temperaturę i należy zachować ostrożność, aby działać szybko, aby odczynniki były zimne. Zapobiega to przedwczesnemu krzepnięciu macierzy i zapewnia prawidłowe zamknięcie komórek. Podczas gdy wszystkie istotne materiały są przechowywane, przygotowywane lub konserwowane w chłodnym środowisku, czynności związane z ręczną obsługą (np. wyrzucanie końcówki pipety, uszczelnianie elastyczną folią laboratoryjną [Krok 2.5]) mogą w różny sposób wprowadzać ciepło zewnętrzne od użytkownika, zmieniając lepkość matrycy i wpływając na charakterystykę migracji komórek podczas wirowania. Powtarzalność w ramach eksperymentów i pomiędzy nimi może być zatem trudna do osiągnięcia w sposób konsekwentny.
Drugim ograniczeniem jest wymóg doświadczenia i biegłości użytkownika. Niektóre techniki manualne mogą wymagać przedłużonego treningu, aby działać wydajnie i skutecznie. Na przykład uszczelnienie końcówki pipety folią laboratoryjną (krok 2.5) może początkowo skutkować niskimi wskaźnikami sukcesu, ale nieuchronnie poprawi się to wraz z praktyką. Kompetencje w zakresie technik mikrochirurgicznych na zwierzętach uzyskuje się również poprzez powtarzanie. W przypadku przeszczepów należy zachować ostrożność, zwłaszcza podczas wkładania końcówki pipety pod torebkę nerkową (krok 4.2.10), wkładania drucianego tłoka w celu wysunięcia zatyczki (krok 4.2.11) i wyjmowania końcówki z nerki. Ważne jest, aby korek był delikatnie i równomiernie wysuwany, podczas gdy końcówka pipety jest jednocześnie wyjmowana. Nadmierny ruch może spowodować perforację torebki nerkowej lub uszkodzenie miąższu, co prowadzi do nadmiernego krwawienia.
Podsumowując, opisano tutaj proces zamykania komórek w półstałej matrycy, koncentrując się na zrozumieniu tworzenia tkanki śledziony. System ten może być również stosowany do szerokiej gamy typów komórek, z potencjałem do wielu zastosowań in vitro lub in vivo .

Urazowe pęknięcie śledziony i pojawienie się wielu guzków śledziony w ciele było jednym z pierwszych sygnałów, że tkanka śledziony posiada zdolność regeneracyjną1,2. Autotransplantacje śledziony zostały później wprowadzone do kliniki w celu zachowania tkanki śledziony u pacjentów wymagających pilnej splenektomii3. Jednak pomimo tego, że jest częścią praktyki klinicznej od dziesięcioleci, bardzo niewiele wiadomo o tym, jak śledziona się regeneruje. Modele przeszczepiania zwierząt dostarczyły informacji na temat wielu parametrów regeneracji śledziony i funkcji immunologicznej4,5. W szczególności eksperymentalne modyfikacje metody przygotowania przeszczepów pozwoliły na bardziej szczegółowe zbadanie regeneracji tkanek na poziomie komórkowym i molekularnym.
Przeszczepy obejmujące całe plastry śledziony przechodzą fazę masowej martwicy, zanim nowa struktura śledziony zostanie odbudowana6. Początkowa faza martwicy przeszczepu sugeruje, że większość przeszczepionej tkanki składa się w dużej mierze z czerwonych i białych krwinek i nie jest potrzebna do regeneracji śledziony. Zbadano to eksperymentalnie, wykluczając komórki krwiotwórcze z przeszczepów śledziony przed przeszczepem pod torebkę nerkową myszy. W tym przypadku wykazano, że frakcja nieleukocytowa/nieerytrocytowa śledziony, która obejmuje komórki zrębu i śródbłonka, jest wystarczająca do indukowania tworzenia tkanek de novo7. Tkanka zrębu śledziony może być dalej przetwarzana na zawiesinę jednokomórkową, co umożliwi wykorzystanie technologii sortowania komórek do manipulowania składem przeszczepu komórkowego. Poprzez selektywne usuwanie typów komórek kandydujących zidentyfikowano dwie populacje komórek zrębu CD45-TER-119, które były niezbędne do rozwoju przeszczepu: śródbłonkową populację komórek CD31 + CD105 + MAdCAM-1 + i szerzej zdefiniowaną populację komórek mezenchymalnych PDGFRβ + 8.
Budowa przeszczepów z komórek śledziony różni się pod względem materiałów podporowych i procesów ładowania komórek. Śledziony modyfikowane tkankowo były wcześniej przygotowywane przez ładowanie jednostek śledziony na rusztowanie polimerowe z kwasem poliglikolowym/poli-litrem kwasu mlekowego5,9. Co ciekawe, komórki zrębu śledziony wchłonięte przez gąbkę kolagenową nie zdołały się wszczepić, podczas gdy komórki zrębu zagregowane i załadowane na arkusz kolagenu ułatwiały regenerację śledziony8. Wykazano również, że ponowne zawieszenie komórek zrębu śledziony w matrycy Matrigel indukuje agregację komórek w warunkach hodowli trójwymiarowej10. Jednak metoda ta nie została przetestowana pod kątem stosowania w modelach transplantacyjnych. Ogólnym celem obecnego protokołu jest wymuszona agregacja i hermetyzacja komórek zrębu śledziony bezpośrednio w macierzy błony podstawnej, która następnie może zostać przeniesiona do trójwymiarowego systemu hodowli tkankowej in vitro lub wykorzystana jako nośnik do przeszczepów modeli zwierzęcych (rysunek uzupełniający 1).

<table><tbody><tr><td>96 Well Polipropylenowe probówki klastrowe 1,2 ml</td><td>Corning</td><td>CLS4401</td><td>Do umieszczenia w stożkowej probówce o pojemności 14 ml</td></tr><tr><td>B-merkaptoetanolu</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>Stock 55 mM, stosować przy 50 uM</td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>Z Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I (DNaza I)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej, typ II-S, liofilizowany proszek, białko &ge; 80 % &ge; 2 000 jednostek/mg białka</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>4500 mg / L Glukoza, L-glutamina i wodorowęglan sodu, bez pirogronianu sodu, płyn. Sterylne z filtrem.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, sterylnie filtrowana</td></tr><tr><td>Eclipse 200 &mu; l Końcówki do pipet</td><td>Labcon</td><td>1030-260-000</td><td>Bevel Point</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>Lot# 1382243</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Stock 100X, użyj przy 1X</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354263</td><td>Matrigel matrix membrana podstawna Wysokie stężenie, Lot# 7330186</td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>Zapas 100X, użyj przy 1X</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Zapas 10 000 jednostek/ml Penicyliny, 10 000 ug/ml Streptomycyna</td></tr><tr><td>Odwracalny sitko komórkowe</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27216</td><td>70 &mu; </td></tr><tr><td>m Pęseta pierścieniowa</td><td>NAPOX</td><td>A-26</td><td>Rozmiar pierścienia: 3 mm</td></tr><tr><td>Inhibitor skały (Y-27632)</td><td>MedChemExpres</td><td>HY-10071</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Thermofisher Heraeus Megafuge 40R</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>Prędkości przyspieszenia i zwalniania zostały ustawione na 8</td></tr><tr><td>Ultra Fine Pęseta</td><td>EMS</td><td>78340-51S</td><td>Styl 51S. Pęseta z antymagnetycznej/przeciwkwasowej SA ze stali austenitycznej o niskiej zawartości węgla jest odporna na korozję. Satynowe wykończenie z powłoką przeciwodblaskową.</td></tr><tr><td>Vicryl 5/0 Szew Ligapak Kołowrotek</td><td>Ethicon</td><td>J283G</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol II Długi drut</td><td>Tłok Drummond</td><td>5-000-2002-L</td><td>ze stali nierdzewnej, 25 i 50 &mu; L/WRTL II, Długie&nbsp;</td></tr><tr><td>Klips do nawijania</td><td>MikRon</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Klips do nawijania</td><td>ran MikRon</td><td>427631</td><td>9 mm</td></tr></tbody></table>

agregacja komórek w kapsułkach macierzy błony podstawnej do badania tworzenia mysiej tkanki śledziony

Basement Membrane Matrix Encapsulated Cell Aggregation for Investigating Murine Spleen Tissue Formation

Śledziona jest organem odpornościowym, który odgrywa kluczową rolę w krwiopochodnych odpowiedziach immunologicznych. Anatomiczna lub funkcjonalna utrata tej tkanki zwiększa podatność na ciężkie infekcje krwi i sepsę. Autotransplantacja plastrów śledziony jest stosowana klinicznie w celu zastąpienia utraconej tkanki i przywrócenia funkcji immunologicznej. Jednak mechanizm napędzający solidną i immunologicznie funkcjonalną regenerację tkanki śledziony nie został w pełni wyjaśniony. W tym przypadku naszym celem jest opracowanie metody agregacji i hermetyzacji komórek śledziony w półstałej matrycy w celu zbadania wymagań komórkowych dotyczących tworzenia tkanki śledziony. Konstrukty komórkowe otoczone macierzą błony podstawnej są podatne zarówno na hodowlę tkankową trójwymiarowych organoidów in vitro, jak i na przeszczep pod torebkę nerkową w celu bezpośredniej oceny tworzenia tkanek in vivo. Manipulując komórkami wejściowymi do agregacji i enkapsulacji, wykazujemy, że komórki zrębu noworodków PDGFRβ + MAdCAM-1 pochodzące z przeszczepu są wymagane do regeneracji tkanki śledziony w modelach przeszczepu zwierząt.

Agregacja komórek jest istotna dla promowania kontaktu i sygnalizacji międzykomórkowej. Zamknięcie agregatów komórkowych w macierzy błony podstawnej wspierało zarówno hodowle trójwymiarowe do tworzenia organoidów tkankowych in vitro, jak i ułatwiało mechaniczne dostarczanie komórek do torebki nerki w celu transplantacji przeszczepu. Aby stworzyć te konstrukty, macierz błony podstawnej była najpierw utrzymywana w stanie płynnym w warunkach niskiej temperatury (na lodzie). Agregację komórek osiągano następnie poprzez nałożenie skoncentrowanej zawiesiny komórek na wierzch i wykorzystanie siły odśrodkowej do przepchnięcia komórek przez gęstą macierz. Optymalizacja prędkości wirowania (200-2000 x g) była niezbędna do uzyskania pozycjonowania komórek w środkowej warstwie (Rycina 1A), co było również zależne od liczby komórek. Wyższe siły odśrodkowe (&gt;500 x g) przesuwały komórki na samą końcówkę pipety (Rycina 1B); należy zachować ostrożność przy mniejszej liczbie komórek (t.j. &lt;5 x 105), które mogą zostać utracone podczas usuwania elastycznej folii laboratoryjnej. I odwrotnie, komórki mogą nie przenikać odpowiednio przez macierz błony podstawnej, jeśli siły g są zbyt niskie (≤200 x g) (Rycina 1C). Prędkość wirowania dla liczby komórek &lt;1 x 105 lub &gt;2,5 x 106 może wymagać dalszej optymalizacji. Po wirowaniu komórki zostawały utrwalone w macierzy błony podstawnej poprzez ogrzewanie konstruktu w temperaturze 37 °C przez 15 min. Ten proces krzepnięcia umożliwił całkowite wysunięcie „czopa” macierzy (Rycina 1D) za pomocą cienkiego drucianego tłoka.
In vitro tworzenie organoidów śledziony 
Wtyki z macierzy błony podstawnej wyrzucone do odpowiedniego naczynia do hodowli tkanek w sposób powtarzalny tworzyły trójwymiarowe struktury przypominające organoidy, które można było utrzymywać zgodnie ze standardowymi technikami i warunkami hodowli tkanek (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności)11. W hodowli wspierający substrat macierzy błony podstawnej stopniowo zanikał między dniem 0 a 14 (Rysunek 2A, i-iii) i nie był już widoczny w 21. dniu, pozostawiając nienaruszoną, sferyczną masę komórkową przypominającą organoid (Rysunek 2A, vi) o średnicy około 545 µm (s.d. = 120 µm, n = 6)11. Struktury organoidalne te były utrzymywane w hodowli powyżej 30 dni, lecz nie zwiększały swojej wielkości w czasie (Rysunek 2B). Organoidy śledziony składały się z komórek zrębowych CD45-TER-119-, erytrocytów CD45-TER-119+ oraz komórek limfoidalnych CD45+TER-119- (Rysunek 2C), jednak częstotliwość występowania każdej z populacji była zmienna w poszczególnych organoidach (n = 4; Tabela 1). Aby ocenić ogólną strukturę organoidów śledziony, przygotowano i zwizualizowano krioprzekroje tkanki o grubości 50 µm. Organoidy posiadały strukturę pełną, z komórkami obecnymi w całym przekroju tkanki (Rysunek 2D). Ocena przekrojów organoidów przy grubości pojedynczej warstwy komórkowej 7 µm wykazała, że komórki były rozmieszczone w strukturach przypominających sznury, bez wyraźnej orientacji przestrzennej (Rysunek 2D), z obszarami pozbawionymi jąder między pasmami komórek. Barwienie przeciwciałami CD45 potwierdziło obecność jądrzastych komórek hematopoetycznych, które gęsto otaczały obszary obwodowe organoidu (Rysunek 2E). Dodatkowo w bardziej centralnych obszarach organoidu zaobserwowano komórki CD45+ o wyraźnej, wrzecionowatej morfologii. Ogólny brak barwienia przeciwciałami CD90.2 (limfocyty T) i CD19 (limfocyty B), przy jednoczesnym pozytywnym barwieniu CD11b, wykazał specyficzną obecność komórek mieloidalnych (Rysunek 2F). W wielu organoidach wykryto również niehematopoetyczne komórki śródbłonka CD105+ i CD31+11.
In vivo transplantacja przeszczepu śledziony 
Enkapsulacja zagregowanych komórek zialnych śledziony w macierzy półstałej ułatwia prowadzenie badań nad transplantacją u zwierząt. Technikę tę zastosowano w celu osadzenia niefrakcjonowanych lub sortowanych metodą FACS preparatów neonatalnych komórek zialnych śledziony CD45-TER-119- wewnątrz zatyczki z macierzy błony podstawnej, służącej jako nośnik do transplantacji pod torebkę nerki myszy. Zgodnie z podobnymi protokołami agregacji komórek8, konstrukty komórkowe enkapsulowane w macierzy błony podstawnej (MECC) z sukcesem zregenerowały tkankę śledziony w 4/5 niezależnych transplantacji zwierzęcych, potwierdzając tym samym żywotność tej techniki konstrukcji przeszczepu. Aby przetestować użyteczność MECC w określaniu typów komórek wymaganych do regeneracji śledziony, konstrukty MECC przygotowano z neonatalnych komórek śledziony, z których specyficznie usunięto komórki zialne (CD45-) PDGFRβ+MAdCAM-1+ lub PDGFRβ+MAdCAM-1-11. Przeszczepy pozbawione komórek PDGFRβ+MAdCAM-1+ zachowały zdolność do makroskopowej regeneracji tkanki (4/4 przeszczepów; Rysunek 3A)11. Trzy z czterech zregenerowanych tkanek wykazywały prawidłowy skład i strukturę komórkową śledziony, wykazując obecność tętniczek centralnych, pęcherzyków miazgi białej, odseparowanych przedziałów limfocytów T i B, komórek dendrytycznych pęcherzykowych, komórek retikularnych strefy marginalnej i metalofilnych makrofagów strefy marginalnej, zatok miazgi czerwonej, komórek mieloidalnych oraz makrofagów (Rysunek 3B)11. W przeciwieństwie do nich, przeszczepy pozbawione komórek PDGFRβ+MAdCAM-1- w dużej mierze nie zregenerowały tkanki śledziony (1/4 przeszczepów)11. Dane te potwierdzają znaczenie pochodzących z przeszczepu komórek PDGFRβ+ w regeneracji tkanki śledziony8 oraz wskazują na konkretny wymóg obecności komórek zialnych PDGFRβ+MAdCAM-1-.
<img alt="Mikroskopia zarodka w probówce; proces umieszczania i wyjmowania zarodka; badanie biologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66682/66682fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1Enkapsulacja agregatów komórek zrębu śledziony w macierzy błony podstawnej. A 200 µL końcówka pipety jest wykorzystywana w celu ułatwienia agregacji komórek wewnątrz macierzy błony podstawnej. Najpierw tworzy się warstwę macierzy fluidalnej poprzez aspirację 2 µL lodowatej macierzy błony podstawnej do schłodzonej końcówki pipety. Zawiesinę komórek nanosi się na warstwę macierzy, a następnie stosuje siłę odśrodkową, aby przemieścić i zagregować komórki w obrębie macierzy błony podstawnej. (AUstawienia prędkości wirówki są zoptymalizowane tak, aby agregaty komórkowe znajdowały się w połowie grubości warstwy macierzy.BZbyt wysoka prędkość wirowania powoduje agregację komórek na końcówce pipety.C) Niewystarczająca prędkość uniemożliwia przemieszczanie się komórek przez macierz. (D) Po inkubacji w temperaturze z końcówki pipety zostaje wypchnięty półstały korek matrycy 37 °C przez 15 minut. Groty strzałek wskazują rozmieszczenie agregatów komórkowych w obrębie macierzy. Pasek skali, 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66682/66682fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wzrost i analiza organoidów; obrazy mikroskopowe, wykres średnicy, cytometria przepływowa, immunofluorescencja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66682/66682fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. In vitro hodowla agregatów śledziony enkapsulowanych w macierzy błony podstawnej i formowanie trójwymiarowych struktur organoidowych. (A) Rozwój organoidów śledziony w ciągu 35 dni. Panele (i-vi) odpowiadają dniom 0, 7, 14, 21, 28 i 35 hodowli. Obrazy wykonano za pomocą odwróconego mikroskopu fazowego Nikon TS2. Pasek skali, 500 µm. (B) Średnica organoidów śledziony w dłuższych okresach hodowli. Każda linia reprezentuje pojedynczy organoid. (C) Charakterystyka populacji komórek zrębowych (CD45-TER-119-), limfoidalnych (CD45+TER-119-) i erytroidalnych (CD45-TER-119+) przy użyciu cytometrii przepływowej po 53 dniach hodowli. Panel górny: Tkanka kontrolna przygotowana ze zrębu śledziony noworodka. Panel dolny: Organoid śledziony, dzień 52. (D) Makroskopowa morfologia tkanki organoidu przy grubości cięć 50 µm (panele górne) i 7 µm (panele dolne) po 22 dniach hodowli. (E) Lokalizacja i morfologia komórek krwiotwórczych CD45+ po 34 dniach hodowli. Powiększony obszar pokazano na panelach po prawej stronie. Grubość cięć wynosi 7 µm. (F) Ocena komórek mieloidalnych (CD11b), T (CD90.2) i B (CD19) po 34 dniach hodowli. Powiększony obszar pokazano na wstawce. Grubość cięć wynosi 7 µm. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu do żywych komórek Nikon Eclipse Ti2-E. Paski skali (D, E, F), 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66682/66682fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat analizy histologicznej z multipleksową immunofluorescencją przedstawiający przekroje tkanek i nakładkę markerów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66682/66682fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza tkanki przeszczepionej macierzy błony podstawnej. Przeszczepy wykonano ze zwojów śledziony noworodka pozbawionych komórek PDGFRβ+MAdCAM-1+ (n = 4). Dodatkowe dane dostępne online11. (A) Wygląd makroskopowy zregenerowanego przeszczepu śledziony w 4 tygodniu po transplantacji pod torebkę nerki. Żółta obramowana область wskazuje zregenerowaną tkankę śledziony. Obraz wykonano za pomocą stereomikroskopu Leica M60 wyposażonego w adapter Snap zoom i Apple iPhone 6S. Pasek skali, 1000 µm. (B) Złożone wielokolorowe obrazy immunofluorescencyjne tkanek przeszczepu o grubości 30 µm, przeciętych w płaszczyźnie czołowej. Barwienie przeciwciałami wykonano z użyciem wskazanych markerów w celu wizualizacji mikroarchitektury tkanki śledziony. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu do żywych komórek Nikon Eclipse Ti2-E. Obramowane obszary pokazują regiony w większym powiększeniu. Pasek skali, 1000 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66682/66682fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nr organoidu</td>
			<td>Komórki zrębowe</td>
			<td>Erytrocyty</td>
			<td>Limfocyty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>62</td>
			<td>7.7</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>22</td>
			<td>24</td>
			<td>55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>3.6</td>
			<td>0.1</td>
			<td>96</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>76</td>
			<td>12</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Procentowy udział populacji komórek zrębowych, erytroidalnych i limfoidalnych w poszczególnych organoidach śledziony.
Rycina uzupełniająca 1. Schematyczny przegląd protokołu z wyróżnieniem głównych etapów tworzenia konstruktów komórkowych zatopionych w macierzy do badań in vitro oraz in vivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66682/Supplemantary%20Figure%201.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł opisuje protokół agregacji i hermetyzacji komórek śledziony w półstałej macierzy błony podstawnej. Konstrukty macierzy błony podstawnej mogą być wykorzystywane w hodowli trójwymiarowej do badania rozwoju organoidów lub do badań nad przeszczepami in vivo i regeneracją tkanek.

Agregacja komórek w kapsułkach macierzy błony podstawnej do badania tworzenia mysiej tkanki śledziony

The spleen is an immune organ that plays a key role in blood-borne immune responses. The anatomical or functional loss of this tissue increases ...

Ogólnym celem tego protokołu jest agregacja i zamknięcie komórek w półstałej matrycy. Osadzone agregaty komórkowe mogą być następnie wykorzystane w trójwymiarowej hodowli in vitro lub jako nośnik do eksperymentów transplantacyjnych in vivo. Główną zaletą tej metody jest to, że wykorzystuje prostą metodologię i sprzęt do osiągnięcia agregacji komórek.Można go również zastosować do wielu typów komórek i liczb. Technika ta ujawniła specyficzny typ komórek, który jest niezbędny do regeneracji śledziony. Być może uda się odkryć kolejne regulatory regeneracji tkanki śledziony lub posłużyć jako platforma do szerszych badań z zakresu inżynierii tkankowej.Zacznij od wstępnego schłodzenia pudełka z końcówkami do pipet o pojemności 200 mikrolitrów w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie zanurz Parafilm w 80% etanolu na 10 minut, a następnie umyj go 10 minutami w PBS. Aby przygotować roztwór komórkowy, podwielokrotnić żądaną liczbę komórek do stożkowej probówki o pojemności 14 mililitrów.Odwiruj komórki w temperaturze 200 g i 4 stopni Celsjusza przez 5 minut. Następnie ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około 20 mikrolitrów objętości. Osad komórkowy może być następnie ponownie zawieszony w pozostałej objętości supernatantu.Za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki pipety odessać 2 mikrolitry lodowatego Matrigelu. Delikatnie przekręć i wysuń, aby wyjąć końcówkę pipety. Rozciągnij wstępnie wysterylizowany pasek Parafilm i umieść go na końcu końcówki pipety, uważając, aby nie przebić folii.Kontynuuj owijanie Parafilmu wokół boku, aby upewnić się, że końcówka jest uszczelniona. Następnie delikatnie nałóż roztwór komórkowy na Matrigel. Pozostaw końcówkę pipety na lodzie i przygotuj stożkową probówkę o pojemności 14 mililitrów z umieszczoną w środku rurką zbiorczą o pojemności 1,2 mililitra.Końcówkę pipety można następnie włożyć do zagnieżdżonej probówki i odwirować w temperaturze 400 g i 4 stopni Celsjusza przez 5 minut. Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Rurkę można umieścić na lodzie do czasu, gdy będzie ona dalej potrzebna.Ostrożnie usunąć Parafilm z końcówki pipety, a następnie włożyć tłok z cienkiego drutu i wylać zatyczkę Matrigel do pożywki do hodowli tkankowej. Zagregowane komórki można hodować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Ogol sierść za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia i przetrzyj skórę 80% etanolem.Wykonaj dwucentymetrowe nacięcie w skórze prostopadle do kręgosłupa i odsłoń ścianę otrzewnej. Następnie wykonuje się drugie, mniejsze nacięcie w ścianie otrzewnej nad nerką. Zastosuj nacisk i zewnętrznij nerkę.Upewnij się, że nerka jest wilgotna, regularnie stosując sterylny PBS. Ściśnij torebkę nerkową parą ultracienkich kleszczyków i za pomocą drugiej pary delikatnie rozerwij w przeciwnych kierunkach. Ostrożnie oddzielić błonę torebki od miąższu nerki.Podnieś kapsułkę nerkową za pomocą jednej pary kleszczyków i powoli wsuń końcówkę pipety przez otwór. Delikatnie włożyć druciany tłok do końcówki pipety i usunąć zatyczkę Matrigel. Zwilż nerkę PBS i ponownie wewewnętrznij do jamy otrzewnej.Zamknij ścianę otrzewnej szwami 5-O-Vicryl i zamknij nacięcie skóry za pomocą aplikatora AutoClip i dwóch 9-milimetrowych klipsów do ran. Kluczowym krokiem w tym protokole jest agregacja komórek w półstałej matrycy. Pozycjonowanie warstwy środkowej uzyskuje się dzięki optymalnym prędkościom wirowania.Wyższe prędkości napędzają komórki do samej końcówki pipety, podczas gdy niewystarczające prędkości uniemożliwiają przemieszczanie się komórek przez matrycę. Po zestaleniu konstrukt Matrigel może zostać wyrzucony z końcówki pipety. Konstrukty zrębu śledziony, które są hodowane in vitro, tworzą trójwymiarowe sferyczne struktury organoidowe.Organoidy mają niepustą strukturę z komórkami obecnymi na całej średnicy tkanki. Składają się z trzech szerokich populacji komórek, w tym białych krwinek, czerwonych krwinek oraz niekrwiotwórczych komórek zrębu i śródbłonka. Konstrukty mogą być również przeszczepiane pod torebkę nerkową w celu badań nad regeneracją tkanek.Po czterech tygodniach można zaobserwować uporządkowaną strukturę tkanki śledziony, w tym tętniczki centralne, pęcherzyki komórek B, komórki siatkowate fibroblastów, komórki szpikowe miazgi czerwonej, makrofagi metalofilowe strefy brzeżnej, sinusoidy miazgi czerwonej i sieci komórek dendrytycznych pęcherzyków, strefę komórek T, makrofagi miazgi czerwonej i komórki siatkowate strefy brzeżnej. Próbując agregować i kapsułkować komórki, należy pamiętać o szybkiej pracy i utrzymywaniu wszystkich materiałów na lodzie. Najważniejszym etapem przeszczepu jest usunięcie zatyczki Matrigel przy jednoczesnym wyjęciu końcówki pipety z nerki.Należy uważać, aby nie przebić błony torebki ani nie doszło do pęknięcia miąższu nerki. Protokół ten wykorzystano do zbadania wymagań dla dwóch populacji komórek zrębu w regeneracji tkanki śledziony. W tym reprezentatywnym eksperymencie tylko agregaty pozbawione receptora beta-ujemnego receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego MAdCAM nie zainicjowały wzrostu tkanki, co sugeruje, że ta konkretna populacja komórek jest niezbędna do regeneracji śledziony.

basement-membrane-matrix-encapsulated-cell-aggregation-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Ten manuskrypt zawiera procedurę techniczną, która może być użyta do scharakteryzowania hodowli komórek C1498 in vitro oraz ostrej białaczki wywołanej u myszy po ich wstrzyknięciu. Analizy fenotypowe i funkcjonalne wykonywane są za pomocą cytometrii przepływowej, mikroskopii immunofluorescencyjnej, cytochemii i barwienia Maya-Grünwalda Giemsy.

Szczegółowy protokół charakteryzujący mysią linię komórkową C1498 i związany z nią mysi model białaczki

MALT1 reguluje wrodzoną odporność, ale jak to się dzieje, pozostaje niejasne. Użyliśmy selektywnego inhibitora parakaspazy MALT1 MLT-827, aby rozwikłać wkład MALT1 w sygnalizację wrodzoną za receptorami lektynopodobnymi Toll lub typu C, wykazując, że MALT1 reguluje produkcję cytokin szpikowych i za receptorami lektynopodobnymi typu C, selektywnie.

Mieloidowa wrodzona regulacja szlaku sygnalizacyjnego przez aktywność parakaspazy MALT1

Komórki strefy brzeżnej B (MZB) reagują na siłę przepływu ścinającego, reorientując swoją ścieżkę migracji w górę przepływu. Protokół ten pokazuje, jak rejestrować i analizować migrację za pomocą jednostki fluidyki, pompy, systemu obrazowania mikroskopowego i bezpłatnego oprogramowania.

Analiza indukowanej przepływem ścinającym migracji mysich komórek brzeżnej strefy B in vitro

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki chirurgiczne mysiego modelu unaczynionego heterotopowego przeszczepu śledziony, technicznie wymagającego modelu, który może służyć jako potężne narzędzie do badania losu i długowieczności komórek śledziony, mechanizmów różnych populacji komórek śledziony w progresji choroby oraz odporności po przeszczepie.

Mysi model unaczynionego heterotopowego przeszczepu śledziony do badania biologii komórek śledziony i odporności po przeszczepie

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Organoidy rewolucjonizują spersonalizowane modelowanie tkanek do rozwoju narządów, odkrywania leków i badań nad chorobami. Inżynieria organoidowa się naprzód w tworzeniu skomplikowanych tkanek syntetycznych. Celem jest zintegrowanie morfogenezy, technologii asembloidów i biomatryc w celu poczynienia postępów w inżynierii tkankowej. Protokół ten pomaga w modelowaniu organogenezy wątroby i ustalaniu wytycznych dotyczących budowy tkanek syntetycznych.

Techniki uprawy in vitro do modelowania organogenezy wątroby, budowania asembloidów i projektowania tkanek syntetycznych przy użyciu ludzkich linii komórkowych

Bezkomórkowa matryca śledziony (DSM) ma obiecujące zastosowania w dziedzinie inżynierii tkankowej wątroby. Protokół ten określa procedurę przygotowania DSM dla szczurów, która obejmuje zbieranie śledziony szczurów, ich decellularację poprzez perfuzję i ocenę powstałego DSM w celu potwierdzenia jego cech.

Wytwarzanie zdecelularizowanej matrycy śledziony pochodzącej od szczurów

Ten protokół opisuje, jak wytworzyć funkcjonalną tkankę węzłową zatok z mysich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC). Nadekspresja T-Box3 (TBX3) oraz dobór antybiotyków promotora miozyny o ciężkim łańcuchu (Myh6) prowadzi do wysoce czystych agregatów komórek rozrusznika serca. Te "indukowane ciała zatokowo-przedsionkowe" ("iSAB") zawierają ponad 80% komórek rozrusznika serca, wykazują znacznie zwiększoną szybkość bicia i są w stanie nadawać tempo mięśnia sercowego ex vivo.

Generowanie agregatów komórek mysiego rozrusznika serca w oparciu o programowanie komórek ES w połączeniu z selekcją promotora Myh6

Poznaj metodę agregacji komórek śledziony w macierzy błony podstawnej do trójwymiarowej kultury i transplantacji in vivo. Technika ta pozwala identyfikować typy komórek niezbędne do regeneracji tkanek.

Agregacja komórek w kapsułkach macierzy błony podstawnej do badania tworzenia mysiej tkanki śledziony

Przeglądaj więcej filmów