Agregacja komórek w kapsułkach macierzy błony podstawnej do badania tworzenia mysiej tkanki śledziony

Ogólnym celem tego protokołu jest agregacja i zamknięcie komórek w półstałej matrycy. Osadzone agregaty komórkowe mogą być następnie wykorzystane w trójwymiarowej hodowli in vitro lub jako nośnik do eksperymentów transplantacyjnych in vivo. Główną zaletą tej metody jest to, że wykorzystuje prostą metodologię i sprzęt do osiągnięcia agregacji komórek.

Można go również zastosować do wielu typów komórek i liczb. Technika ta ujawniła specyficzny typ komórek, który jest niezbędny do regeneracji śledziony. Być może uda się odkryć kolejne regulatory regeneracji tkanki śledziony lub posłużyć jako platforma do szerszych badań z zakresu inżynierii tkankowej.

Zacznij od wstępnego schłodzenia pudełka z końcówkami do pipet o pojemności 200 mikrolitrów w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie zanurz Parafilm w 80% etanolu na 10 minut, a następnie umyj go 10 minutami w PBS. Aby przygotować roztwór komórkowy, podwielokrotnić żądaną liczbę komórek do stożkowej probówki o pojemności 14 mililitrów.

Odwiruj komórki w temperaturze 200 g i 4 stopni Celsjusza przez 5 minut. Następnie ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około 20 mikrolitrów objętości. Osad komórkowy może być następnie ponownie zawieszony w pozostałej objętości supernatantu.

Za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki pipety odessać 2 mikrolitry lodowatego Matrigelu. Delikatnie przekręć i wysuń, aby wyjąć końcówkę pipety. Rozciągnij wstępnie wysterylizowany pasek Parafilm i umieść go na końcu końcówki pipety, uważając, aby nie przebić folii.

Kontynuuj owijanie Parafilmu wokół boku, aby upewnić się, że końcówka jest uszczelniona. Następnie delikatnie nałóż roztwór komórkowy na Matrigel. Pozostaw końcówkę pipety na lodzie i przygotuj stożkową probówkę o pojemności 14 mililitrów z umieszczoną w środku rurką zbiorczą o pojemności 1,2 mililitra.

Końcówkę pipety można następnie włożyć do zagnieżdżonej probówki i odwirować w temperaturze 400 g i 4 stopni Celsjusza przez 5 minut. Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Rurkę można umieścić na lodzie do czasu, gdy będzie ona dalej potrzebna.

Ostrożnie usunąć Parafilm z końcówki pipety, a następnie włożyć tłok z cienkiego drutu i wylać zatyczkę Matrigel do pożywki do hodowli tkankowej. Zagregowane komórki można hodować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Ogol sierść za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia i przetrzyj skórę 80% etanolem.

Wykonaj dwucentymetrowe nacięcie w skórze prostopadle do kręgosłupa i odsłoń ścianę otrzewnej. Następnie wykonuje się drugie, mniejsze nacięcie w ścianie otrzewnej nad nerką. Zastosuj nacisk i zewnętrznij nerkę.

Upewnij się, że nerka jest wilgotna, regularnie stosując sterylny PBS. Ściśnij torebkę nerkową parą ultracienkich kleszczyków i za pomocą drugiej pary delikatnie rozerwij w przeciwnych kierunkach. Ostrożnie oddzielić błonę torebki od miąższu nerki.

Podnieś kapsułkę nerkową za pomocą jednej pary kleszczyków i powoli wsuń końcówkę pipety przez otwór. Delikatnie włożyć druciany tłok do końcówki pipety i usunąć zatyczkę Matrigel. Zwilż nerkę PBS i ponownie wewewnętrznij do jamy otrzewnej.

Zamknij ścianę otrzewnej szwami 5-O-Vicryl i zamknij nacięcie skóry za pomocą aplikatora AutoClip i dwóch 9-milimetrowych klipsów do ran. Kluczowym krokiem w tym protokole jest agregacja komórek w półstałej matrycy. Pozycjonowanie warstwy środkowej uzyskuje się dzięki optymalnym prędkościom wirowania.

Wyższe prędkości napędzają komórki do samej końcówki pipety, podczas gdy niewystarczające prędkości uniemożliwiają przemieszczanie się komórek przez matrycę. Po zestaleniu konstrukt Matrigel może zostać wyrzucony z końcówki pipety. Konstrukty zrębu śledziony, które są hodowane in vitro, tworzą trójwymiarowe sferyczne struktury organoidowe.

Organoidy mają niepustą strukturę z komórkami obecnymi na całej średnicy tkanki. Składają się z trzech szerokich populacji komórek, w tym białych krwinek, czerwonych krwinek oraz niekrwiotwórczych komórek zrębu i śródbłonka. Konstrukty mogą być również przeszczepiane pod torebkę nerkową w celu badań nad regeneracją tkanek.

Po czterech tygodniach można zaobserwować uporządkowaną strukturę tkanki śledziony, w tym tętniczki centralne, pęcherzyki komórek B, komórki siatkowate fibroblastów, komórki szpikowe miazgi czerwonej, makrofagi metalofilowe strefy brzeżnej, sinusoidy miazgi czerwonej i sieci komórek dendrytycznych pęcherzyków, strefę komórek T, makrofagi miazgi czerwonej i komórki siatkowate strefy brzeżnej. Próbując agregować i kapsułkować komórki, należy pamiętać o szybkiej pracy i utrzymywaniu wszystkich materiałów na lodzie. Najważniejszym etapem przeszczepu jest usunięcie zatyczki Matrigel przy jednoczesnym wyjęciu końcówki pipety z nerki.

Należy uważać, aby nie przebić błony torebki ani nie doszło do pęknięcia miąższu nerki. Protokół ten wykorzystano do zbadania wymagań dla dwóch populacji komórek zrębu w regeneracji tkanki śledziony. W tym reprezentatywnym eksperymencie tylko agregaty pozbawione receptora beta-ujemnego receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego MAdCAM nie zainicjowały wzrostu tkanki, co sugeruje, że ta konkretna populacja komórek jest niezbędna do regeneracji śledziony.