Name: Komórki tuczne w mikrośrodowisku raka wątrobowokomórkowego dają korzystne rokowanie: badanie retrospektywne przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu QuPath (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj analizę komórek tucznych w mikrośrodowisku raka wątrobowokomórkowego przy użyciu oprogramowania QuPath. Ta metoda umożliwia dokładną kwantyfikację komórek immunologicznych w tkankach nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Doceniamy wkład Mgr. Ondřeja Šebesty (Vinicna Microscopy Core Facility, Faculty of Science, Charles University) za skanowanie całego preparatu oraz projekt "e-Infrastruktura CZ" (e-INFRA LM2018140), który dostarczył nam zasobów obliczeniowych do tego badania. Technicy Jana Dosoudilova i Jan Javurek zostali docenieni za doskonałą pomoc techniczną. Badania te zostały sfinansowane przez program Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020, grant nr 856620 oraz Ministerstwo Zdrowia Republiki Czeskiej, grant AZV NU21-03-00506, a także przez program Cooperatio (dyscypliny chirurgiczne). Główny Ośrodek Mikroskopii Vinicna jest współfinansowany przez LM2023050 dużego projektu RI realizowanego przez Czech-BioImaging.

Ten protokół był częścią badania przeprowadzonego zgodnie ze standardami etycznymi określonymi w Deklaracji Helsińskiej (wersja z 2013 roku); został zatwierdzony przez Komisję Etyki Wydziału Lekarskiego i Szpitala Uniwersyteckiego w Pilźnie (118/2021, 11 marca 2021). Rysunek 1 pokazuje podsumowanie zastosowanych metod.
1. Wybór bloków tkankowych FFPE
<ol>
	<li>Odzyskaj identyfikatory bloków FFPE z akt pacjentów z pomocą lekarzy prowadzących lub patologów.</li>
	<li>Poproś o bloki FFPE z lokalnego archiwum patologii.</li>
	<li>Dla każdego pacjenta wybierz 2-3 bloki FFPE zawierające żywotną tkankę nowotworową, preferencyjnie z otaczającym obszarem okołoguzowym i wątrobą nienowotworową. 
	UWAGA: Zaleca się uzyskanie opinii eksperta patologa w sprawie tego wyboru. Ocena histologiczna wątroby nienowotworowej wraz z danymi wywiadowczymi, klinicznymi i laboratoryjnymi została wykorzystana do określenia podstawowej etiologii HCC.</li>
</ol>
2. Deparafinizacja i rehydratacja tkanki FFPE
<ol>
	<li>Wytnij jeden lub dwa odcinki tkanki o grubości 4 μm z każdego bloku tkanki FFPE na mikrotomie. 
	UWAGA: Grubość odcinków może wynosić od 3 μm do 5 μm bez zauważalnego wpływu barwienia; Standardem jest jednak grubość 4 μm.</li>
	<li>Umieść skrawki w kąpieli wodnej (42°C), aby usunąć zmarszczki.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka, podnosząc je i umieszczając na dodatnio naładowanym szklanym szkiełku mikroskopijnym. Następnie nałóż szkiełka do suszenia w temperaturze otoczenia (AT) przez 24 godziny.</li>
	<li>Umieść szkiełka w termostacie (56 °C) na 1 godzinę.</li>
	<li>Za pomocą automatycznego barwnika odparafinować skrawki w roztworze dewax-1 (30 s w 72 °C), roztworze dewaxu-2 (10 s w 72 °C), roztworze dewaxu-3 (10 s w AT), etanolu 96%-1 (10 s), etanolu 96%-2 (10 s) i etanolu 96%-3 (10 s).</li>
	<li>Użyj automatycznego barwnika, aby ponownie nawodnić sekcje w roztworze myjącym-1 (10 s, AT), roztworze myjącym-2 (10 s, AT) i roztworze myjącym-3 (5 min, AT).</li>
</ol>
3. Wykonywanie IHC w pełni zautomatyzowanej barwierce
UWAGA: IHC jest wykonywane zgodnie z protokołem producenta. Kroki są pokrótce wyjaśnione poniżej.
<ol>
	<li>Metoda pobierania antygenu
	<ol>
		<li>Pobrać antygen za pomocą procedury pobierania epitopów indukowanych ciepłem (ER) w roztworze ER o wysokim pH (np. Tris-EDTA): ER roztwór-1 (10 s, AT), ER roztwór-2 (10 s, AT), ER roztwór-3 (20 min w 100 °C), ER roztwór-4 (12 min, AT).</li>
		<li>Płucz szkiełko w roztworze myjącym przez 3x (30 s każdy) i 1x (3 min).</li>
		<li>Blokować endogenną peroksydazę za pomocą roztworu bloku nadtlenkowego przez 5 minut w AT.</li>
		<li>Płukać w roztworze myjącym przez 3x (30 s każdy).</li>
		<li>Blokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał z blokiem białkowym dla NKp46 tylko przez 30 minut w AT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiązanie z przeciwciałami pierwszorzędowymi: Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 15 minut w AT, a następnie płukać roztworem płuczącym przez 3x (po 30 s).</li>
	<li>W przypadku wtórnego wiązania przeciwciał należy postępować zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej.
	<ol>
		<li>Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą chrzanową przez 8 minut w AT.</li>
		<li>Płukać roztworem myjącym przez 2x (po 2 minuty) i 1x wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Wizualizację reakcji należy przepłukać szkiełka roztworem diaminobenzydyny (DAB), a następnie inkubować je z roztworem DAB przez 10 minut w AT.</li>
		<li>Spłukiwać przez 3x (30 s) wodą dejonizowaną.</li>
		<li>Przeciwbarwić skrawki hematoksyliną Mayera.</li>
		<li>Spłukiwać wodą dejonizowaną przez 1x (30 s), roztworem myjącym przez 1x (30 s) i wodą dejonizowaną przez 1x (30 s).</li>
		<li>Użyj w pełni zautomatyzowanego barwnika szkiełkowego, aby odwodnić skrawki w etanolu 70% (2 min), etanolu 80% (2 min), etanolu 96%-1 (3 min), etanolu 96%-2 (3 min), etanolu 100% (3 min), ksylenie-1 (4 min), ksylenie-2 (4 min) i ksylenie-3 (4 min).</li>
		<li>Użyj w pełni zautomatyzowanego szklanego szkiełka nakrywkowego, aby zamontować sekcje na szkiełkach w medium montażowym. 
		UWAGA: Przez cały czas używano ujemnych i dodatnich (migdałków) próbek kontrolnych tkanek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Uzyskiwanie skanów całego slajdu
<ol>
	<li>Skanuj poplamione szkiełka za pomocą obiektywu 20x i umiarkowanie wysokiej gęstości ostrości na skanerze całych slajdów.</li>
</ol>
5. Analiza IHC za pomocą oprogramowania
<ol>
	<li>Utwórz projekt dla obrazów IHC w oprogramowaniu.
	<ol>
		<li>Pobierz i otwórz aplikację QuPath-0.4.3 (lub nowszą).exe</li>
		<li>Utwórz nowy folder o odpowiedniej nazwie.</li>
		<li>Kliknij przycisk Utwórz projekt w lewym górnym rogu oprogramowania i wybierz nowo utworzony folder.</li>
		<li>Przeciągnij zeskanowane obrazy do okna oprogramowania. Gdy automatycznie pojawi się nowe okno, wybierz Ustaw typ obrazu > H-DAB i kliknij Importuj (Rysunek 2).</li>
		<li>Obserwuj listę obrazów w lewym oknie menu; kliknij dwukrotnie, aby otworzyć obraz.</li>
		<li>Wybierz z menu głównego u góry Plik, aby zapisać obrazy jako projekt. 
		UWAGA: Oprogramowanie obsługuje szeroką gamę formatów obrazów, w tym wiele całych formatów slajdów. Jednak format tiff jest preferowany, aby zapobiec utracie nieprzetworzonych danych i powiązanych metadanych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodawanie adnotacji do obszarów zainteresowania
	<ol>
		<li>Wybierz narzędzie Pędzel lub narzędzie Różdżka z menu głównego u góry, aby dodać adnotacje do obszaru guza. W przypadku nieciągłych obszarów guza wykonaj kroki 5.2.1.1-5.2.1.3.
		<ol>
			<li>Opisuj je osobno.</li>
			<li>Naciśnij i przytrzymaj Ctrl podczas zaznaczania wszystkich regionów guza</li>
			<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz polecenie Edytuj wiele > Scal wybrane.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Upewnij się, że adnotacja guza jest zaznaczona (obramowania mają żółty kolor).</li>
		<li>Kliknij opcję Automatyzuj w menu głównym i wybierz opcję Pokaż edytor skryptów.</li>
		<li>Skopiuj skrypt dostępny w pliku uzupełniającym 1 lub w https://petebankhead.github.io/qupath/scripts/2018/08/08/three-regions.htmls i wklej go w Edytorze skryptów, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Zwroty akcji: centrum guza (TC), margines wewnętrzny (IM), margines zewnętrzny (OM) i obszar okołoguzowy (PT) zostaną utworzone i oznaczone automatycznie.</li>
		<li>Aby uzyskać alternatywny sposób tworzenia obszarów zainteresowania, wykonaj kroki 5.2.5.1-5.2.5.5.
		<ol>
			<li>Wybierz narzędzie Polilinia z menu głównego u góry, aby narysować obramowanie oddzielające gniazda komórek złośliwych i przylegającą tkankę nienowotworową.</li>
			<li>Zaznacz wynikową krawędź. Wybierz z menu głównego u góry Obiekty > Adnotacja > Rozwiń adnotacje > 500 μm dla Promień rozwinięcia > Płaski dla zakończenia linii. Aktywuj opcję Usuń wnętrze i aktywuj Ogranicz do elementu nadrzędnego.</li>
			<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy wynikową adnotację, Edytuj pojedynczą > Podziel. Dwie oddzielne adnotacje zostaną automatycznie rozszerzone jako obszary o szerokości 500 μm po każdej stronie granicy.</li>
			<li>Nazwij regiony z adnotacjami odpowiednio dla wiadomości błyskawicznych i OM, klikając prawym przyciskiem myszy adnotację na liście po lewej stronie, wybierając polecenie Ustaw właściwości i wprowadzając nazwę.</li>
			<li>TC reprezentuje pozostały obszar guza. Rozszerz obszar PT o szerokości 500 μm przylegający do OM zgodnie z tą samą procedurą. 
			UWAGA: Preparaty z adnotacjami i detekcje QuPath AF zostały ocenione przez biegłego histopatologa.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizacja klasyfikacji pikseli
	<ol>
		<li>Wybierz narzędzie Prostokąt z menu głównego. Następnie dodaj adnotacje do regionu, który zawiera wszystkie typy pikseli, które mają być rozróżniane (np. hematoksylina, DAB i tło).</li>
		<li>Z menu głównego wybierz opcję Analizuj > Przetwarzanie wstępne > Oszacuj wektor plamy.</li>
		<li>Gdy automatycznie pojawi się okno Visual Stain Editor, wybierz Auto > OK i ustaw H-DAB szacowane jako nazwę wektora plamy.</li>
		<li>Aby uzyskać alternatywną metodę, wykonaj kroki 5.3.4.1-5.3.4.3.
		<ol>
			<li>Wybierz narzędzie Prostokąt z menu głównego i dodaj adnotację do małego obszaru typowego jądra barwionego hematoksyliną.</li>
			<li>Wybierz Obraz z menu po lewej stronie i kliknij dwukrotnie Plama 1 > Tak.</li>
			<li>Wybierz narzędzie Prostokąt z menu głównego i dodaj adnotacje do małego obszaru pozytywnego barwienia za pomocą DAB. Wybierz Obraz z menu po lewej stronie i kliknij dwukrotnie Plama 2 > Tak.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena frakcji obszarowej dodatnich komórek odpornościowych za pomocą opcji Pixel Classification.
	<ol>
		<li>W menu głównym kliknij Klasyfikuj > Klasyfikacja pikseli > Utwórz proger.</li>
		<li>Wybierz wysoką rozdzielczość > Kanał: DAB > Filtr wstępny: Gaussian > Sigma: 0,5 > (<silna klasa="xfig">Rysunek 3) Próg: (0,2-0,3) > powyżej progu: dodatni > poniżej progu: negatywny.</li>
		<li>Dla regionu wybierz opcję Dowolna adnotacja, wpisz nazwę klasyfikatora > Zapisz > miary > OK. Komórki DAB-dodatnie zostaną zmienione na kolor czerwony (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4).</li>
		<li>Skopiuj wyniki z menu po lewej stronie do arkusza kalkulacyjnego.</li>
		<li>Możesz też otworzyć Miarkę w górnym menu głównym, wybrać opcję Pokaż pomiary adnotacji > Kopiuj do schowka i wkleić wyniki do arkusza kalkulacyjnego.</li>
		<li>Aby zamknąć obraz, kliknij prawym przyciskiem myszy > Multi View > Zamknij przeglądarkę. 
		UWAGA: Przed kwantyfikacją wszelkie artefakty zostały wyeliminowane. Próg był dostosowywany dla każdego przypadku ze słabym specyficznym zabarwieniem dodatnim. Poprawność adnotacji i klasyfikacji pikseli została najpierw sprawdzona, a następnie sprawdzona przez starszego histopatologa. Wszystkie analizy były wykonywane w sposób ślepy. Więcej informacji na temat analizy IHC za pomocą oprogramowania można znaleźć na stronie https://forum.image.sc/tag/QP.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Metody statystyczne i analiza danych
<ol>
	<li>Punktami końcowymi badania były: czas do nawrotu choroby (TTR), czas przeżycia wolnego od choroby (DFS) i czas przeżycia całkowitego (OS). Pacjenci, u których nie doszło do nawrotu choroby lub zgonu, zostali ocenzurowani podczas ostatniej wizyty kontrolnej. 
	UWAGA: Ciągłe dane o rozkładzie nienormalnym są wyrażone jako mediana (min.-maks.). Proporcje są wyrażone jako surowe dane (procenty). Frakcje obszarowe komórek odpornościowych w różnych regionach zainteresowania (ROI) porównano za pomocą Friedman ANOVA, a następnie testu dopasowanych par Wilcoxona z korekcją Bonferroniego. Ze względu na nieparametryczny rozkład większości zmiennych, do oceny powiązań między parami zmiennych porządkowych lub ilościowych wykorzystano korelację Spearmana. W celu wyznaczenia wartości prognostycznej poszczególnych predyktorów dla punktów końcowych przeprowadzono jednozmienną, a następnie wielowymiarową analizę regresji Coxa. Obliczono współczynniki ryzyka (HR). HR pokazywał względne ryzyko dla połączonej grupy średnio wysokiej w porównaniu do 1 dla grupy niskiej. Wszystkie oszacowania przeżycia obliczono metodą Kaplana-Meiera i porównano między grupami za pomocą testu log-rank. Do analiz statystycznych wykorzystano GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software LLC). Dwustronna wartość p < 0,05 została uznana za statystycznie istotną.</li>
</ol>

Prognostic Significance of Immune Cell Infiltration in Hepatocellular Carcinoma

Nie ma żadnych finansowych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

Dzięki monitorowaniu organizacji immunologicznej in situ w TME, dziedzina immunoonkologii może dodać nowe biomarkery prognostyczne i predykcyjne raka. Nasza wcześniej opublikowana praca na temat roli adaptacyjnych komórek odpornościowych w TME HCC wykazała pozytywne powiązania prognostyczne limfocytów T CD3+ i CD8+ oraz limfocytów B CD20+ w wybranych ROI do czasu do nawrotu2. W tym przypadku oprogramowanie do analizy obrazu QuPath wykorzystano do oceny obfitości komórek tucznych CD1a+, komórek tucznych CD117+ i komórek NK NKp46+ w kilku odrębnych regionach HCC i oceniono ich znaczenie prognostyczne . Ze względu na nieregularne kształty niektórych wrodzonych komórek odpornościowych ich kwantyfikacja może być niedokładna. Dlatego ocena frakcji obszarowej komórek immunologicznych była optymalną opcją. Spośród trzech typów komórek tylko komórki tuczne CD117 + wykazały znaczący wpływ prognostyczny: wyższe AF komórek tucznych w obszarze IM i PT wiązało się z dłuższym przeżyciem.
Komórki tuczne były najliczniejsze we wszystkich ROI, a związek ich AF w obszarze okołoguzowym i wewnętrznym marginesie z lepszym przeżyciem odzwierciedla przeciwnowotworową rolę komórek tucznych. Komórki tuczne mogą być przyciągane do TME przez chemoatraktanty uwalniane przez komórki nowotworowe, takie jak SCF lub CCL1518. Komórki tuczne mogą wpływać na odpowiedź przeciwnowotworową poprzez bezpośrednią cytotoksyczność komórek nowotworowych27 lub poprzez wydzielanie cytokin prozapalnych, które mogą hamować wzrost guza18. Zwiększona gęstość komórek tucznych chroniła przed nawrotem raka prostaty28, raka żołądka27 i HCC po przeszczepie wątroby29. Kompleksowe badanie obejmujące większą kohortę 245 pacjentów z HCC wykazało pozytywną korelację między bardziej znaczącą infiltracją komórek tucznych w próbkach guza a dłuższym przeżyciem po resekcji guza30. Rohr-Udilova i wsp. podali podobne wyniki dotyczące większego zagęszczenia komórek tucznych w otaczającej tkance HCC; Jednak tylko gęstość komórek tucznych wewnątrz guza wiązała się z niższym wskaźnikiem nawrotów29.
W tym badaniu komórki tuczne wywierały działanie przeciwnowotworowe tylko w wątrobie IM i PT. TME różnych nowotworów jest niejednorodne pod względem przestrzennego rozmieszczenia komórek odpornościowych31. Znaczenie prognostyczne komórek odpornościowych w TME jest również krytycznie związane z ich rozmieszczeniem przestrzennym 32,33. Zaproponowano różne podejścia do opisywania brzegu inwazyjnego guza, w tym cały margines o różnych szerokościach 4,34,35, margines wewnętrzny i zewnętrzny, ponownie o różnych szerokościach36,37, z PT 2,7 lub bez. Postępowaliśmy zgodnie z powtarzalną, znormalizowaną metodologią Międzynarodowej Grupy Roboczej ds. Biomarkerów Immunoonkologicznych, aby zdefiniować margines inwazyjny jako obszar 1 mm wyśrodkowany na granicy oddzielającej gniazda komórek nowotworowych od tkanki gospodarza i reprezentujący centralny guz jako pozostały obszar guza38. Ponieważ wcześniejsze badanie wykazało istotne różnice w wynikach wewnętrznego i zewnętrznego marginesu inwazyjnego2, obszary te (każdy o szerokości 500 μm) zostały przeanalizowane oddzielnie. Przestrzenne profilowanie immunologiczne obszaru okołoguzowego ma swoje wyraźne znaczenie predykcyjne39,40, a zatem uwzględniono również obszar PT.
Analizę TC, marginesu guza i wątroby PT przeprowadzono w WSI, w przeciwieństwie do opcji oceny wybranych pól widzenia w odpowiednich regionach. Obrazowanie całego preparatu jest potencjalnie bogatym źródłem danych41. Ponieważ Trybunał nie przeprowadził podpróbkowania, "rzeczywistą wartość oczekiwaną" uzyskano w sposób efektywny czasowo10. Ponadto system ten był rozsądny, ponieważ analizowano tylko 1 lub 2 slajdy na blok, co pozwoliło nam uniknąć stronniczości wyboru łaty42. Powolny przepływ pracy stanowił dla nas wyzwanie w poprzednim badaniu, w którym do ilościowego oznaczania komórek odpornościowychzastosowano stereologię 2.
IHC umożliwia bezpośrednią lokalizację CD1a+ iDCs, NKp46+NK i ekspresji komórek tucznych CD117+ w tkance wątroby, ilościowe określenie ich rozmieszczenia, a tym samym podklasyfikację kohorty. Analiza IHC daje temu badaniu ważne korzyści w porównaniu z testami biochemicznymi w rozpuszczonej tkance, które mogą prowadzić do fałszywie ujemnych wyników, gdy obecnych jest tylko kilka komórek dodatnich pod względem biomarkerów43 i nie odzwierciedlają one regionalnej reakcji komórek odpornościowych na cechy histopatologiczne44. IHC jest również preferowany w stosunku do analizy w sekcjach barwionych H&E. Badania nad rakiem jelita grubego i drobnokomórkowym rakiem płuca wykazały, że ocena skrawków barwionych H&E może dostarczyć solidnych, ilościowych biomarkerów immunologicznychnowotworu 45,46,47; Jednak ograniczenia odzwierciedlające rzeczywistą obecność określonych podtypów są nadal obecne.
Wysoka jakość skrawków tkanek i barwienie IHC jest warunkiem wstępnym dokładnej oceny. Wysokie tło, artefakty na krawędziach i specyficzne, ale niepożądane barwienie (np. barwienie komórek śródbłonka sinusoidalnych przestrzeni wątroby przeciwciałami anty-CD4) mogą zniekształcić wszystkie wyniki. Przeciwciało CD56 było pierwszym wyborem w obecnym badaniu do wykrywania komórek NK, ale zostało zastąpione przeciwciałem NKp46 ze względu na ekspresję CD56 w niedojrzałych drogach żółciowych. Kolejną kwestią do rozważenia jest wybór najbardziej odpowiedniego markera pod względem specyficzności, wytrzymałego wzoru barwienia i stabilności w blokach FFPE. Na przykład CD117 został wybrany zamiast tryptazy, ponieważ ekspresja tryptazy może być silnie obniżona, poza tym komórki, które nie wyrażają CD117, nie są komórkami tucznymi48.
QuPath daje możliwość wygładzenia granic ROI od zewnątrz i usunięcia wszelkich artefaktów, dużych naczyń, tkanki martwiczej, niespecyficznych barwień, tła i agregacji erytrocytów, które nie powinny być częścią ROI. Operator musi wybrać zwrot z inwestycji i nacisnąć "Alt" podczas dodawania adnotacji do tych artefaktów. Niespecyficzne barwienie zostało wyeliminowane w tym badaniu jako artefakty przed kwantyfikacją, aby nie wpłynęło na wyniki. W przypadku systematycznie niskiego zabarwienia właściwego lub wysokiego tła należy dokonać przeglądu protokołu, aby uniknąć ewentualnej stronniczości. Próg był dostosowywany dla każdego przypadku ze słabym specyficznym zabarwieniem dodatnim. Przed każdym rutynowym użyciem protokół powinien zostać zoptymalizowany. Wszystkie analizy powinny być wykonywane w sposób ślepy i najlepiej, aby dokładność progowania zasługiwała na kontrolę krzyżową.
QuPath to przyjazne dla użytkownika, intuicyjne, rozszerzalne rozwiązanie typu open source do patologii cyfrowej i analizy obrazu całego slajdu9, przetestowane wcześniej pod kątem analizy obrazu w HCC49 i różnych nowotworach50,51. Głównymi zaletami są łatwa obsługa oprogramowania dla WSIs oraz opcje adnotacji obszarów zainteresowania (np. obszarów nowotworowych lub okołonowotworowych).
Zastosowanie istniejących, zmodyfikowanych lub stworzonych de novo skryptów może znacznie przyspieszyć analizę. Zastosowano skrypt do tworzenia adnotacji dla ROI, który umożliwił szybką i dokładną segmentację regionalną zamiast ręcznego wyznaczania. Skrypt nie jest stały i można go łatwo dostosować do marginesów mniejszych niż 500 μm dla obszarów o niewystarczających granicach tkankowych. Szerokość obszaru IM, OM lub PT można dostosować za pomocą edytora skryptów Automate > Show > dostosowując linię 30 mikronów podwójnego rozszerzania marginesu = 500 μm do dostępnej szerokości > Run. Zwroty z inwestycji można również dodawać lub usuwać. Ogólnie rzecz biorąc, przepływy pracy w oprogramowaniu nie są stałe, a operator może je dowolnie rozwijać i modyfikować.
Dostępnych jest już wiele narzędzi programowych do patologicznej analizy obrazu, w tym CellProfiler, ImageJ, Fiji, Microscopy Image Browser i inne. Jednak QuPath wyróżnia się szeregiem zalet, takich jak architektura open source, przyjazny dla użytkownika interfejs, możliwości dostosowywania algorytmów i integracja zaawansowanych narzędzi uczenia maszynowego. Te cechy sprawiają, że to oprogramowanie do analizy obrazu jest solidnym wyborem do szczegółowej analizy tkanek nowotworowych w dziedzinie patologii cyfrowej.
QuPath wykazał najniższą zmienność w porównaniu z komercyjnym oprogramowaniem HALO (IndicaLab) i QuantCenter (3DHistech) do wykrywania ekspresji Ki67 w raku piersi52. Oprogramowanie może również zostać poinstruowane, aby uruchomić skrypt dla wszystkich obrazów projektu w powtarzalny sposób przetwarzania wsadowego.
QuPath umożliwił nam tworzenie ilościowych danych ciągłych zamiast porządkowych (półilościowych). Dane porządkowe uzyskane za pomocą oceny wizualnej są obarczone problemami wynikającymi z subiektywizmu interpretacji, zmienności między obserwatorami i słabej odtwarzalności53. Szybkość obecnej analizy została poprawiona przez fakt, że osoby bez rozległego wykształcenia histopatologicznego i wiedzy programistycznej mogą wykonywać automatyczną analizę, pod warunkiem, że dokładność adnotacji została sprawdzona przez patologa. Badanie nad nowotworami głowy i szyi wykazało przydatność QuPath do szybkiej i powtarzalnej oceny wartości prognostycznej limfocytów naciekających nowotwór CD57+50. Badanie wykazało również znaczną zgodność między ludzkimi obserwatorami a QuPath. Wysoką zgodność między obserwacją manualną a oceną za pomocą QuPath wykazano również w raku jamy ustnej54 i raku piersi55. We wspomnianym artykule porównano kwantyfikację IHC 5 klinicznych biomarkerów raka piersi przy użyciu QuPath i 2 komercyjnych produktów programowych (Definiens Tissue Studio i inForm) z ręczną oceną przez patologa. Przez cały czas trwania tego badania QuPath konsekwentnie wykazywał najlepszą wydajność, a także najkrótszy czas instalacji i aplikacji, okazując się tym samym doskonałą przyszłościową alternatywą dla monitoringu wizyjnego i oprogramowania komercyjnego. Nawet w porównaniu z ImageJ, najbardziej znanym oprogramowaniem typu open source do analizy obrazów biomedycznych, QuPath doskonale radzi sobie z dużymi WSIs56.
Istnieje otwarte forum internetowe QuPath, na którym użytkownicy zamieszczają swoje pytania dotyczące metod patologii cyfrowej oraz prezentują aktywną i zaangażowaną społeczność wspierającą rozwój narzędzi do analizy obrazu (https://forum.image.sc/tag/qupath).
Kohorta wykorzystana w tym badaniu była wyjątkowa i nie była reprezentatywna dla populacji ogólnej z HCC, ponieważ obejmowała tylko pacjentów, którzy kwalifikowali się do resekcji wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, mniejszość pacjentów z HCC (20%-30%) kwalifikuje się do resekcji wątroby57. Może to być również powód, dla którego mniej pacjentów miało potwierdzoną marskość wątroby, ponieważ pacjenci z tą etiologią HCC prawdopodobnie mieli wyższe wyniki Childa-Pugha i nie byli uważani za resekcyjnych. Kohorta była również dość mała, a większość pacjentów miała wczesne stadia choroby TNM. W związku z tym należy zachować ostrożność przy ekstrapolacji wyników na inne populacje.
W obecnym badaniu liczebność wrodzonych komórek odpornościowych w mikrośrodowisku HCC została oszacowana poprzez ocenę ich migotania przedsionków, ponieważ precyzyjne liczenie komórek odpornościowych o nieregularnych kształtach, takich jak komórki dendrytyczne, może okazać się trudne. Z drugiej strony, frakcja obszarowa komórek odpornościowych zwykle silnie koreluje z ich gęstością58. Znakowanie immunoperoksydazą dostarcza danych dotyczących lokalizacji antygenu, frakcji obszarowej lub gęstości komórek, które go wyrażają, ale intensywność barwienia jest nieliniowo związana z ilością antygenu. W związku z tym IHC nie powinno być stosowane do ilościowej oceny poziomu ekspresji określonego białka. Dokładność metody zależy również od jednorodności grubości przekroju, jakości obrazu i wybranej rozdzielczości do klasyfikacji pikseli. Wszelkie wyniki analizy obrazu powinny być walidowane i traktowane z ostrożnością. Ponieważ pojedynczy marker nie jest w stanie w pełni uchwycić złożoności komórek odpornościowych, potrzeba więcej markerów IHC i barwienia multipleksowego, aby uzyskać wiarygodny obraz immunologicznego TME HCC. Użycie tylko jednego markera IHC do fenotypowania komórek odpornościowych stanowi przybliżenie, a wyniki należy interpretować z ostrożnością.
Wykorzystanie oprogramowania do analizy obrazu QuPath do oceny szkiełek barwionych IHC umożliwiło nam ocenę rozmieszczenia i frakcji obszarowej lokalnych iDC, komórek tucznych i NK w guzie i okołoguzie pacjentów z HCC, a następnie przeanalizowanie ich zależności od rokowania. Obfitość komórek tucznych na wewnętrznym brzegu i wątrobie okołonowotworowej HCC jest związana z dłuższym DFS i OS, co podkreśla przeciwnowotworowe działanie tych wrodzonych komórek odpornościowych. Analityczny przepływ pracy QuPath jest przyjazny dla użytkownika, szybki i łatwy w użyciu, z przydatnymi ustawieniami domyślnymi i łatwym eksportem danych. Oprogramowanie to zostało uznane za obiecującą platformę do cyfrowej analizy obrazu, która może zaspokoić potrzebę odtwarzalności, spójności i dokładności w patologii cyfrowej.

Udowodniono, że organizacja przestrzenna i obfitość komórek odpornościowych naciekających nowotwór wpływają na przeżywalność w różnych nowotworach, w tym w raku wątrobowokomórkowym (HCC)1,2,3,4. Znaczenie prognostyczne limfocytów naciekających nowotwór w nowotworach po raz pierwszy wykazano na skrawkach barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E)5,6. Następnie pionierskie badanie przeprowadzone przez Galona i wsp. przy użyciu immunohistochemii (IHC) wykazało powiązania gęstości limfocytów T CD3 + i CD8 + w tkance raka jelita grubego z rokowaniem4.
IHC to złoty standard wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w tkance nowotworowej w celu dalszego powiązania z wynikami klinicznymi7. IHC ma kilka zalet, takich jak niski koszt, powszechna dostępność i kompatybilność z tkankami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie8. Jednak dokładna ocena komórek odpornościowych barwionych IHC jest dużym wyzwaniem. Tradycyjna punktacja w wybranych mikroskopowych polach widzenia jest czasochłonna i nie wystarcza już do zapewnienia wysokiej jakości, powtarzalnej, obiektywnej analizy niezbędnej do wyboru potencjalnych biomarkerów i wiarygodnej korelacji klinicznej9. Skany całych slajdów mogą być oceniane jako cały obraz lub po podpróbkowaniu10.
Komputerowa ocena ilościowa obfitości komórek odpornościowych w próbkach tkanek może zapewnić praktyczne, dokładne, wiarygodne i klinicznie istotne dane11. QuPath to bezpłatne oprogramowanie typu open source, które umożliwia cyfrową analizę obrazu preparatów barwionych IHC i maksymalizuje ilość informacji uzyskanych z poszczególnych próbek12.
Ponieważ niedojrzałe komórki dendrytyczne (iDCs), komórki NK i komórki tuczne biorą udział w przeciwnowotworowych odpowiedziach immunologicznych i wykazano, że korelują z wynikami pacjentów13,14,15, przedstawiamy tutaj krok po kroku protokół oceny ich przestrzennego rozmieszczenia w tkance FFPE HCC i zbadania ich prognostycznego wpływu. CD1a ulega ekspresji głównie na błonie niedojrzałych komórek dendrytycznych, których gęstość jest związana z wynikami klinicznymi w różnych nowotworach ludzkich16,17. Komórki tuczne mogą odgrywać rolę protumorową lub przeciwnowotworową w mikrośrodowisku guza (TME)18. Mogą wspomagać angiogenezę i ułatwiać przerzuty19. I odwrotnie, doniesiono, że komórki tuczne mogą pośredniczyć w apoptozie komórek nowotworowych poprzez produkcję IL-420. Barwienie anty-CD117 jest powszechnie stosowane do wizualizacji i ilościowego oznaczania komórek tucznych w tkance nowotworowej21. Uważa się, że komórki NK przyczyniają się do nadzoru i kontroli HCC22 poprzez zabijanie komórek rakowych23. Ekspresja NKp46 przez NK jest kluczowym parametrem dla ich aktywności przeciwnowotworowej24. Jednak komórki NK NKp46+ korelowały dodatnio ze średnicą guza u pacjentów z HCC25. Mimo to niewiele wiadomo na temat ich korelacji z przeżywalnością pacjentów.
Naszym celem było ilościowe oszacowanie obfitości komórek tucznych CD1a+ iDC, komórek tucznych CD117+ i komórek NK NKp46+ w różnych regionach HCC i podkreślenie ich znaczenia prognostycznego. Do obecnego badania retrospektywnego włączono łącznie 70 kolejnych pacjentów z patologicznie potwierdzonym HCC w stadium I-IV, którzy kwalifikowali się do resekcji zgodnie z wytycznymi BCLC i przeszli resekcję wątroby z zamiarem wyleczenia w Szpitalu Uniwersyteckim w Pilźnie w latach 1997-2019. Dokonano przeglądu raportów patologicznych pacjentów. Żaden z pacjentów włączonych do tego badania nie miał odległych przerzutów ani nie otrzymywał leczenia neoadjuwantowego, takiego jak chemioterapia lub radioterapia przed operacją. Łącznie wykluczono 3 pacjentów ze złej jakości próbkami histologicznymi, a pozostałych 67 pacjentów włączono do badania (Tabela 1).

<table><tbody><tr><td>Identyfikator anty-CD1a</td><td>Leica Biosystems</td><td>PA0235</td><td>- niedojrzałe komórki dendrytyczne; RTU, Protokół F, ER2/20 min</td></tr><tr><td>Anty-CD117</td><td>Leica Biosystems</td><td>&nbsp; PA0007</td><td>Identyfikator - ogniwa tuczne; RTU, Protokół F, ER2/20 min</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe BOND Plus Leica</td><td>Biosystems, Niemcy</td><td>S21.2113.A</td><td></td></tr><tr><td>BOND RXm</td><td>Leica Biosystems</td><td>49.1501</td><td>W pełni zautomatyzowany wiant IHC&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia sondy aspirującej Bond</td><td>Leica Biosystems</td><td>CS9100</td><td></td></tr><tr><td>Bond&nbsp; Odwoskowanie&nbsp; Rozwiązanie Leica</td><td>Biosystems</td><td>AR9222</td><td></td></tr><tr><td>Bond&nbsp; Zestaw do detekcji</td><td>polimerów Leica Biosystems</td><td>DS9800</td><td></td></tr><tr><td>BondTM Epitope Retrieval 2</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9640</td><td></td></tr><tr><td>BondTM Primary Antibody Dilurent</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>BondTM Wash Solution 10X Koncentrat</td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9590</td><td></td></tr><tr><td>Specyfikacja komputera: Intel(R) Core™) i5-10500 CPU @ 3.10GHz&nbsp; &nbsp; 3,10 GHz Zainstalowana pamięć RAM: 128 G</td><td>Intel</td><td></td><td>64-bitowy system operacyjny z systemem Windows 7. Dostępny jest dowolny komputer z systemem operacyjnym opartym na Javie i</td></tr><tr><td>Excelem Szkiełka nakrywkowe</td><td>Leica Biosystems, Niemcy</td><td>14071135636</td><td></td></tr><tr><td>CV Mount</td><td>Leica Biosystems, Niemcy</td><td>14046430011</td><td></td></tr><tr><td>CV5030 W pełni zautomatyzowane szkiełko nakrywkowe Suszarka do szkiełek nakrywkowych</td><td>Leica Biosystems</td><td>149CVTS5025</td><td></td></tr><tr><td>UN30</td><td>Memmert GmbH&nbsp;</td><td>UN30</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9.0</td><td>Oprogramowanie GraphPad LLC&nbsp;</td><td></td><td>Wersja 12</td></tr><tr><td>Ludzkie przeciwciało NKp46 / NCR1, monoklonalny mysi klon IgG2B # 195314</td><td>R& D Systems, Inc., Stany Zjednoczone</td><td>MAB1850</td><td>Identyfikator - komórki NK ; Rozcieńczenie 1:150, Protokół F + BLOK, ER2/20 min</td></tr><tr><td>Leica HI1210 - Kąpiel wodna</td><td>Leica Biosystems</td><td>14041521466</td><td></td></tr><tr><td>Protein Block</td><td>Agilent Dako, Stany Zjednoczone</td><td>X0909</td><td></td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2 lub nowsza wersja&</td><td></td><td></td><td>nbsp; wersja (QuPath v.0.3.2)&nbsp;</td></tr><tr><td>RM2235 Mikrotom obrotowy</td><td>Leica Biosystems</td><td>149AUTO00C1</td><td></td></tr><tr><td>ST5020 Multistainer Stainer Stainer</td><td>Leica Biosystems</td><td>DEV-ST5010-CV5030</td><td></td></tr><tr><td>Statistica</td><td>StatSoft Inc.</td><td></td><td>wersja 7</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Scan.Z1</td><td>ScienceServices GmbH, Niemcy</td><td>430038-9000-000&nbsp;</td><td>Skaner slajdów&nbsp;</td></tr></tbody></table>

komórki tuczne w mikrośrodowisku raka wątrobowokomórkowego dają korzystne rokowanie: badanie retrospektywne przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu qupath

Mast Cells in the Microenvironment of Hepatocellular Carcinoma Confer Favorable Prognosis: A Retrospective Study using QuPath Image Analysis Software

Wgląd w wyniki badań in situ komórek odpornościowych w obrębie raka wątrobowokomórkowego (HCC) może dostarczyć informacji na temat wyników leczenia pacjentów. Badania badające ekspresję i lokalizację komórek odpornościowych w tkankach nowotworowych wiążą się z kilkoma wyzwaniami, w tym brakiem precyzyjnej adnotacji dla regionów nowotworowych i losowym doborem mikroskopijnych pól widzenia. QuPath to przyjazne dla użytkownika oprogramowanie typu open source, które może zaspokoić rosnące zapotrzebowanie na patologię cyfrową w analizie obrazu całego slajdu (WSI).
Infiltracja HCC i sąsiednich tkanek przez niedojrzałe komórki dendrytyczne CD1a+ (iDCs), komórki tuczne CD117+ i komórki NK (NKs) NKs, zostały ocenione immunohistochemicznie w reprezentatywnych próbkach 67 pacjentów z HCC, którzy przeszli leczniczą resekcję. Frakcja obszarowa (AF) dodatnio wybarwionych komórek była oceniana automatycznie w WI przy użyciu QuPath w centrum guza (TC), wewnętrznym (IM), zewnętrznym (OM) i obszarze okołoguzowym (PT). Znaczenie prognostyczne komórek odpornościowych oceniano pod kątem czasu do nawrotu (TTR), przeżycia wolnego od choroby (DFS) i przeżycia całkowitego (OS).
AF komórek tucznych było znacznie większe niż AF NK, a AF iDC było znacznie niższe w porównaniu do NK w każdym obszarze zainteresowania. Wysokie AF komórek tucznych w obszarach IM i PT były związane z dłuższym DFS. Ponadto wysokie migotanie komórek tucznych w IM wiązało się z dłuższym systemem operacyjnym.
Analiza wspomagana komputerowo za pomocą tego oprogramowania jest odpowiednim narzędziem do uzyskiwania informacji prognostycznych dla komórek odpornościowych naciekających nowotwór (iDC, komórki tuczne i NK) w różnych regionach HCC po resekcji. Komórki tuczne wykazywały największy AF we wszystkich obszarach zainteresowania (ROI). Komórki tuczne w okolicy okołonowotworowej i IM wykazały dodatnie znaczenie prognostyczne

Dane demograficzne i charakterystyka kliniczna pacjentów przedstawiono w Tabeli 1. Mediana wieku pacjentów wynosiła 69 lat, a większość z nich stanowili mężczyźni (77,6%). W odniesieniu do etiologii HCC, najczęstszym schorzeniem towarzyszącym było przewlekłe nieviralowe zapalenie wątroby, z występowaniem niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH) (23,9%). Tylko 15 pacjentów (22,4%) miało w wywiadzie marskość wątroby. Większość pacjentów (68,7%) znajdowała się w stadium I według klasyfikacji TNM. Bardziej szczegółowe wyniki kliniczne i patomorfologiczne opisano w naszej poprzednio opublikowanej pracy2,26.
Wyniki 
Podczas ostatniej wizyty kontrolnej u 29 (41,8%) pacjentów zaobserwowano nawrót nowotworu, z czego u 89,7% był to nawrót miejscowy, a 38 (56,7%) pacjentów zmarło. W piątym roku po operacji odsetek przeżycia wolnego od choroby (DFS) wynosił 33,2%, odsetek przeżycia całkowitego (OS) 49,4%, a odsetek wolny od nawrotów (RFP) wyniósł 48,7% (Tabela 2).
Rozkład komórek odpornościowych w różnych obszarach zainteresowania 
Białko CD117 stwierdzono przede wszystkim w błonie cytoplazmatycznej zaokrąglonych komórek (Rysunek 5A). W TC i IM były one zlokalizowane głównie w zrębie oraz w przestrzeni naczyniowej. W obszarach OM i PT komórki CD117+ zaobserwowano w torebce guza oraz w przestrzeni naczyniowej.
Białko NKp46 stwierdzono głównie w błonie cytoplazmatycznej zaokrąglonych komórek, które występowały w przestrzeniach przypominających sinusoidy w TC i IM, a także były związane ze zrębem (Rysunek 5B). W obszarze OM i PT zaobserwowano komórki NKp46+ w torebkach wokół gniazd nowotworowych oraz w zrębie dróg wrotnych.
Białko CD1a stwierdzono w TC i IM, głównie w błonie cytoplazmatycznej zaokrąglonych komórek (rozproszonych lub w agregatach) w zrębie, wewnątrz oraz wzdłuż granic przestrzeni przypominających zatoki (Rycyna 5C). W obszarze PT zaobserwowano DC CD1a+ wewnątrz i wzdłuż granic zatok oraz w obrębie nabłonka przewodowego w drogach wrotnych.
AF komórek tucznych była znacznie wyższa niż AF komórek NKp46+ (p &lt; 0.001) (Rysunek 6). CD1a+ iDCs w każdym ROI wykazywały najniższą AF w porównaniu z komórkami tucznymi i komórkami NK (p &lt; 0.001) (Rysunek 6). AF komórek CD117+ i NKp46+ w TC lub IM była znacznie mniejsza niż w obszarze PT i OM (p &lt; 0.001) (Rysunek 6). W przypadku komórek CD1a+ AF nie różniła się istotnie między regionami.
Istotne powiązania dla poszczególnych komórek odpornościowych pomiędzy wszystkimi ROI przedstawiono w Tabeli 3. Rysunek 7 przedstawia mapę ciepła istotnych powiązań między różnymi komórkami odpornościowymi w różnych regionach. AF komórek tucznych CD117 + w TC korelowało istotnie z AF CD1a w TC i IM.
Wartość prognostyczna zmiennych klinicznych i patomorfologicznych 
Wśród zmiennych klinicznych i patomorfologicznych jedynie młodszy wiek wiązał się z większym ryzykiem nawrotu (HR = 0.96, CI: 0.93-0.99, p = 0.007), natomiast żadna zmienna nie była powiązana z DFS i OS (Tabela 4).
Wartości prognostyczne naciekających komórek odpornościowych 
Wysoka AF komórek tucznych CD117+ w IM wiązała się z dłuższym DFS (HR = 0.48, CI: 0.241 - 0.935, p = 0.031) i OS (HR = 0.34, CI: 0.167 - 0.703, p = 0.004) (Rysunek 8, Tabela 5). Ponadto wysoka AF komórek tucznych CD117+ w obszarze PT wiązała się z dłuższym DFS (HR = 0.48, CI: 0.247 - 0.945, p = 0.034) (Rysunek 8, Tabela 5). W przeciwieństwie do tego, AF komórek iDC i NK nie były powiązane z żadnym z wyników. Komórki tuczne CD117+ w marginesie wewnętrznym zachowały istotne powiązania z DFS (HR = 0.46, CI: 0.23-0.91, p = 0.027) i OS (HR = 0.33, CI: 0.16-0.68, p = 0.003) po skorygowaniu o stopień TNM (Tabela 6). W przypadku komórek tucznych w regionie PT powiązanie z DFS również pozostało istotne (HR = 0.47, CI: 0.24-0.93, p = 0.029) (Tabela 6).
<img alt="Schemat procesu barwienia IHC: przygotowanie FFPE, cięcie mikrotomem, montowanie na szkiełkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Reprezentatywny schemat metod."); Schematyczny przebieg prac w celu zidentyfikowania roli prognostycznej komórek tucznych, komórek dendrytycznych oraz komórek natural killer w HCC. Skróty: FFPE, utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie; H&amp;E, hematoksylina i eozyna; ROIs, obszary zainteresowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Interfejs QuPath do importowania obrazów z mikroskopii w świetle przechodzącym barwionych H-DAB, pokazujący ścieżki do plików." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Zrzut ekranu okna oprogramowania. Ilustracyjny zrzut ekranu przedstawiający etap importowania obrazów do projektu w oprogramowaniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Interfejs oprogramowania QuPath do analizy obrazów; konfiguracja progowania w kanale DAB dla histologii." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Zrzut ekranu opcji ułamka powierzchni. Zrzut ekranu z oprogramowania przedstawiający wybrane parametry do ilościowego oznaczenia ułamka powierzchni barwienia pozytywnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie obrazów mikroskopowych przedstawiające analizę przekroju tkanki przed i po zastosowaniu zabiegu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Zrzut ekranu opcji klasyfikacji pikseli. Zrzut ekranu z oprogramowania przedstawiający komórki DAB-dodatnie przed i po klasyfikacji pikseli. Brązowe barwienie DAB zostało zamienione na kolor czerwony po przeprowadzeniu klasyfikacji pikseli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat analizy histologicznej markerów tkanek ludzkich CD117, NKp46, CD1a; obrazy mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne barwienie immunocytochemiczne komórek odporności wrodzonej u pacjentów z HCC. Reprezentatywne barwienie immunocytochemiczne komórek (A) CD117+, (B) NKp46+ oraz (C) CD1a+ w centrum guza (TC, powiększenie 400x) i w inwazyjnym marginesie guza (TIM, powiększenie 200x) w przypadku HCC. Skróty: HCC, rak hepatokomórkowy; TC, centrum guza; TIM, inwazyjny margines guza, z marginesem wewnętrznym (IM) i zewnętrznym (OM). Linia przerywana reprezentuje granicę między tkanką nowotworową a pozanowotworową. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres kropkowy przedstawiający frakcje powierzchni komórek immunopozytywnych dla markerów CD117, NK i CD1a; analiza statystyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Statystyki opisujące frakcję powierzchni wrodzonych komórek odpornościowych u pacjentów z HCC.Statystyki dla frakcji powierzchni komórek dendrytycznych CD1a+, komórek tucznych CD117+ oraz komórek NK NKp46+ w obszarach TC, IM, OM i PT w HCC. Linie czarne oznaczają mediany. Do porównań zastosowano test Wilcoxona dla par zależnych z korekcją Bonferroniego. Skróty: HCC, rak hepatokomórkowy; TC, centrum guza; IM, wewnętrzna krawędź; OM, zewnętrzna krawędź; PT, obszar okołoguzowy. ***: p &lt;0.001 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Macierz korelacji pokazująca CD1a, CD117, NKp46 w TC, IM, OM, PT do analizy statystycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Mapa ciepła istotnych korelacji między ułamkami powierzchni komórek tucznych, komórek DC i NK w różnych obszarach zainteresowania. Mapa ciepła istotnych korelacji między ułamkami powierzchni komórek tucznych CD117+, komórek DC CD1a+ i komórek NK NKp46+ w TC, IM, OM i PT (ρ Spearmana, p &lt; 0.05). Skróty: TC, centrum guza; IM, margines wewnętrzny; OM, margines zewnętrzny; PT, obszar okołoguzowy; DC, komórki dendrytyczne; NK, komórki natural killer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza przeżycia nowotworowego, wykresy Kaplana-Meiera, DFS, OS, ekspresja CD117, wartości p, wyniki kliniczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66743/66743fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Krzywe Kaplana-Meiera dla DFS i OS dla mastocytów naciekających guz u pacjentów z HCC. Analiza Kaplana-Meiera dla DFS i OS w zależności od niskiego i wysokiego AF mastocytów naciekających guz w marginesie wewnętrznym (A, C) oraz w PT (B) przy HCC. Skróty: HCC, rak wiel hokomórkowy; DFS, przeżycie bez choroby; IM, wewnętrzny obszar nacieku; PT, obszar okołoguzowy. Rysunek zaadaptowano za zgodą Ali i wsp.26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/66743fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Charakterystyka kliniczna włączonych pacjentów z rakiem hepatokomórkowym. Charakterystyka kliniczna włączonych przypadków raka hepatokomórkowego. Skróty: NAFLD, niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Szacowane prawdopodobieństwo wyników w analizie Kaplana-Meiera. Szacowane prawdopodobieństwo RFP, DFS i OS w analizie Kaplana-Meiera. Skróty: RFP, odsetek wolny od nawrotów; DFS, przeżycie wolne od choroby; OS, przeżycie całkowite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Korelacja między udziałem powierzchniowym mastocytów, komórek dendrytycznych i komórek natural killer naciekających guz w różnych ROI. Korelacja Spearmana (ρ) między udziałem powierzchniowym mastocytów, komórek dendrytycznych i komórek natural killer naciekających guz w różnych ROI, p &lt; 0,038. Skróty: TC, centrum guza; IM, margines wewnętrzny; OM, margines zewnętrzny; PT, obszar okołoguzowy; ROIs, obszary zainteresowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%203.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Analiza jednowymiarowa zmiennych klinicznych i patologicznych powiązanych z czasem do nawrotu (TTR), przeżyciem bez choroby (DFS) oraz przeżyciem całkowitym (OS). Kategorie referencyjne dla zmiennych dychotomicznych stanowiły odpowiednio: „Nie”, płeć żeńska lub „A”. Pogrubione wartości wskazują na istotność statystyczną na poziomie p &lt; 0,05. Skróty: HR, hazard ratio (iloraz hazardu); CI, przedział ufności; TTR, czas do nawrotu; DFS, przeżycie bez choroby. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%204.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 5: Analiza jednowymiarowa związku frakcji powierzchniowej komórek tucznych CD117+, komórek dendrytycznych CD1a+ i komórek natural killer NKp46+ z TTR, DFS i OS dla poszczególnych obszarów zainteresowania przy użyciu regresji Coxa (67 pacjentów z HCC).Frakcja powierzchniowa komórek odpornościowych na przekrój powierzchniowy (mm2) została przekonwertowana na percentyle, a następnie podzielona na niską (0-25 percentyl) i wysoką (25-100 percentyl). Współczynniki hazardu wskazują ryzyko względne w porównaniu z wartością 1 dla niskiej AF. Wartości pogrubione oznaczają istotność statystyczną na poziomie p &lt; 0,05. Skróty: AF, frakcja powierzchniowa; DFS, przeżycie wolne od choroby; OS, przeżycie całkowite; HR, współczynnik hazardu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%205.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 6: Frakcja powierzchniowa komórek tucznych CD117+ na pojedynczy ROI w powiązaniu z przeżyciem wolnym od choroby i przeżyciem całkowitym (analiza wielowymiarowa). Analiza wielowymiarowa powiązania frakcji powierzchniowej komórek tucznych CD117+ z DFS i OS w obszarze IM i PT przy użyciu regresji Coxa (67 pacjentów z HCC). Frakcja powierzchniowa komórek odpornościowych na sekcję obszaru (mm2) została przeliczona na percentyle, a następnie podzielona na grupę niską (0-24 percentyl) i wysoką (25-100 percentyl). Współczynniki hazardu (HR) wskazują ryzyko względne w porównaniu do wartości 1 dla niskiej AF. Wartości pogrubione oznaczają istotność statystyczną na poziomie p &gt; 0,05. Skróty: AF, frakcja powierzchniowa; DFS, przeżycie wolne od choroby; OS, przeżycie całkowite; HR, współczynnik hazardu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Table%206.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Skrypt do tworzenia ROI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66743/Supplemental%20File%20(Script%20for%20ROI).zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Obecność komórek tucznych na wewnętrznym brzegu i obszarach okołonowotworowych raka wątrobowokomórkowego po resekcji daje korzystne rokowanie. Badanie to potwierdza oprogramowanie do analizy obrazu QuPath jako obiecującą platformę, która może zaspokoić potrzebę odtwarzalności, spójności i dokładności w patologii cyfrowej.

Komórki tuczne w mikrośrodowisku raka wątrobowokomórkowego dają korzystne rokowanie: badanie retrospektywne przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu QuPath

The insights provided by in-situ detection of immune cells within hepatocellular carcinoma (HCC) might present information on patient outcomes. Studies ...

Koncentrujemy się na ocenie rozmieszczenia komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza. Po pierwsze, pomagamy w infiltracji komórek odpornościowych w próbce guza i przylegającej wokół tkanki nowotworowej, a następnie określamy ich wpływ prognostyczny w raku wątrobowokomórkowym. Pierwszym wyzwaniem jest złożoność struktur nowotworowych, co sprawia, że oddzielenie tkanki nowotworowej od nienowotworowej jest trudne.Ponadto ręczne badania w celu ilościowego oznaczania komórek są czasochłonne. Również barwienie niespecyficzne jest problemem dziedzicznym dla wszystkich metod immunohistochemicznych. Większość rokowań przekazywanych przez komórki główne w zakopanym obszarze guza i wewnętrznym marginesie jest wykorzystywana do pierwszych badań nad komórkami głównymi w raku wątrobowokomórkowym i innych nowotworach.Taka analiza przyniosłaby korzyści z zastosowania oprogramowania do analizy obrazu w celu dokładnej adnotacji obszaru zainteresowania i prawidłowej kwantyfikacji komórek odpornościowych. Na początek zdobądź obrazy wybarwionych immunologicznie skrawków HCC. Pobierz i otwórz program QuPath 0.4.3.exe na komputerze. Utwórz nowy folder o odpowiedniej nazwie do organizowania projektów QuPath. Kliknij przycisk tworzenia projektu w lewym górnym rogu oprogramowania i wybierz nowo utworzony folder.Następnie przeciągnij zeskanowane obrazy do okna oprogramowania QuPath. Gdy pojawi się nowe okno, wybierz ustaw typ obrazu i kliknij H-DAB, a następnie importuj. Aby wyświetlić zaimportowane obrazy, sprawdź listę w lewym oknie menu i kliknij dwukrotnie obraz, aby go otworzyć.Wybierz plik z menu głównego i kontynuuj zapisywanie obrazów jako projektu. Wybierz narzędzia pędzla lub różdżki w menu głównym, aby dodać adnotację do obszaru guza. W przypadku nieciągłych regionów guza należy opisać każdy region osobno.Naciśnij i przytrzymaj Control podczas wybierania wszystkich regionów. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz edytuj wiele i wybierz scal wybrane. Następnie kliknij automatyczną w menu głównym i wybierz pokaż edytor skryptów.Skopiuj wymagany skrypt, wklej go do edytora skryptów, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Alternatywnie wybierz narzędzie Polilinia z menu głównego, aby dokładnie narysować granicę oddzielającą gniazda komórek złośliwych i przylegającą tkankę nienowotworową. Następnie wybierz obramowanie z menu głównego.Wybierz obiekty, kliknij adnotację i wybierz, rozwiń adnotacje. Ustaw promień rozprężania na 500 mikrometrów i wybierz płaski jako nasadkę linii. Aktywuj usuń wnętrze i upewnij się, że aktywowany jest ograniczony do rodzica.Teraz kliknij prawym przyciskiem myszy nowo utworzoną adnotację. Wybierz opcję edytuj pojedynczy i wybierz opcję podziału. Aby poprawnie nazwać regiony z adnotacjami, kliknij prawym przyciskiem myszy adnotację na liście po lewej stronie, wybierz ustaw właściwości i wprowadź odpowiednie nazwy regionów marginesów wewnętrznych i zewnętrznych.Zdefiniuj pozostały obszar guza jako centrum guza. Rozciągnij obszar okołonowotworowy o szerokości 500 mikrometrów przylegający do zewnętrznego brzegu, jak pokazano wcześniej. Aby uzyskać szczegółową analizę pikseli, wybierz narzędzie prostokąt z menu głównego.Następnie opisz region obejmujący wszystkie typy pikseli, które mają zostać rozróżnione. Następnie przejdź do menu głównego. Wybierz opcję Analizuj i kliknij przycisk Przetwarzanie wstępne.Następnie kliknij oszacuj wektor plamy. Po aktywowaniu wizualnego edytora plam wybierz auto i kliknij OK. Nazwij szacowany wektor plamy H-DAB.W przypadku analizy pikseli alternatywna metoda polega na użyciu narzędzia prostokąt z menu głównego w celu podświetlenia niewielkiej części jądra wybarwionego hematoksyliną. Następnie uzyskaj dostęp do menu po lewej stronie i wybierz obraz. Następnie kliknij dwukrotnie plamę i wybierz tak.Ponownie użyj narzędzia prostokąta, aby dodać adnotację do małego obszaru wykazującego pozytywne barwienie za pomocą DAB. Następnie wybierz obraz z menu po lewej stronie i kliknij dwukrotnie plamę drugą, a następnie tak. Aby ocenić ułamek obszarowy dodatnich komórek odpornościowych z menu głównego, kliknij opcję klasyfikacji, wybierz klasyfikację pikseli i kliknij utwórz próg.Następnie ustaw rozdzielczość na wysoką, wybierz kanał DAB i zastosuj wstępny filtr Gaussa o Sigma 0,5. Dostosuj próg w zakresie od 0,2 do 0,3. Zdefiniuj piksele powyżej progu jako dodatnie, a poniżej progu jako ujemne.Aby wybrać region, wybierz dowolną adnotację, nadaj klasyfikatorowi nazwę, a następnie kliknij Zapisz, Zmierz i OK. Aby udokumentować wyniki, skopiuj wyniki wyświetlane w menu po lewej stronie i przenieś je do arkusza kalkulacyjnego. Wybierz pomiar z górnego menu głównego jako alternatywną metodę.Następnie wybierz, pokaż pomiary adnotacji. Wybierz opcję kopiuj do schowka i wklej te wyniki do arkusza kalkulacyjnego, aby uzyskać szczegółowy rekord. Na koniec kliknij obraz prawym przyciskiem myszy, przejdź do widoku wielu i kliknij zamknij przeglądarkę, aby zamknąć obraz.Białko CD117 obserwowano głównie w błonach cytoplazmatycznych zaokrąglonych komórek w zrębie guza i przestrzeniach okołonaczyniowych. Komórki CD117-dodatnie obserwowano również w torebkach guza i obszarach okołonaczyniowych na zewnętrznym brzegu i okołoguzie. Białko NKp46 obserwowano głównie w błonach cytoplazmatycznych zaokrąglonych komórek w przestrzeniach sinusoidalnych, zrębie centrum guza i wewnętrznym brzegu.Komórki NKp46-dodatnie obserwowano w torebkach wokół gniazd nowotworowych i zrębu dróg wrotnych na zewnętrznym brzegu i obszarach okołonowotworowych. Białko CD1a obserwowano głównie w błonach cytoplazmatycznych zaokrąglonych komórek, rozproszonych lub w agregatach w zrębach i przestrzeniach przypominających sinusoidy w centrum guza i obszarach wewnętrznego marginesu. Komórki CD1a dodatnie znaleziono w sinusoidach i nabłonku dróg żółciowych w okolicy okołoguzowej.

mast-cells-microenvironment-hepatocellular-carcinoma-confer-favorable

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Brakuje kompleksowych modeli in vitro, które wiernie odwzorowują daną chorobę ludzką. Obecne badanie przedstawia trójwymiarowe (3D) tworzenie i hodowlę sferoidów guza, wiarygodne narzędzie in vitro do badania interakcji guz-zręb w ludzkim raku wątrobowokomórkowym.

Trójwymiarowy model sferoidalny do badania interakcji guz-zręb w raku wątrobowokomórkowym

Tutaj prezentujemy protokół tworzenia ortotopowych ksenoprzeszczepów raka wątrobowokomórkowego z podwiązaniem tętnicy wątrobowej i bez niej oraz wykonywania nieinwazyjnego obrazowania hipoksji guza za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) przy użyciu [18F]Fluoromisonidazolu ([18F]FMISO) i [18F]Fluorodeoksyglukozy ([18F]FDG).

Nieinwazyjne obrazowanie PET/MR w ortotopowym mysim modelu raka wątrobowokomórkowego

W tym artykule opisany jest protokół ręcznego wzmacniania sygnału tyramidowego (TSA) multipleksowego immunofluorescencji (mIF) połączonego z analizą obrazu i analizą przestrzenną. Protokół ten może być stosowany z sekcjami zatopionymi w parafinie (FFPE) utrwalonymi w formalinie do barwienia od dwóch do sześciu antygenów na szkiełko, w zależności od skanera do szkiełek dostępnego w laboratorium.

Multipleksowa immunofluorescencja połączona z przestrzenną analizą obrazu w celu klinicznej i biologicznej oceny mikrośrodowiska guza

Ten protokół opisuje kompleksową metodę analizy cytometrii masowej (cytometria czasu przelotu [CyTOF]) do oceny zarówno ogólnoustrojowych, jak i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym (HCC). Podejście to ma na celu zapewnienie wglądu w krajobraz immunologiczny HCC, oferując głębsze zrozumienie mikrośrodowiska guza i powiązanych mechanizmów immunologicznych.

Analiza cytometrii masowej układowych i lokalnych odpowiedzi immunologicznych w raku wątrobowokomórkowym

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Recellularna macierz zewnątrzkomórkowa zdecelularizowanej wątroby szczura może być używana jako humanizowany, trójwymiarowy model ex vivo do badania dystrybucji i ekspresji transgenu wirusa lub wektora wirusowego.

Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2

Myszy z rakiem okrężnicy-26 (C26) reprezentują klasyczny model kacheksji nowotworowej. Postępujący zanik mięśni występuje w związku ze wzrostem guza, nadmierną ekspresją specyficznych dla mięśni ligaz ubikwityny i zmniejszeniem pola przekroju poprzecznego mięśni. Obserwuje się również utratę tkanki tłuszczowej. Kaeksja jest badana w sposób zależny od czasu z rosnącym nasileniem wyniszczenia.

Mysz z rakiem okrężnicy 26 jako model do badania kacheksji nowotworowej

Ten protokół służy jako schemat do tworzenia funkcjonalnego systemu Tet-ON w liniach komórek nowotworowych i jego późniejszego wykorzystania, w szczególności do badania roli białek pochodzących z komórek nowotworowych w rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza.

Warunkowe obniżenie ekspresji genów w liniach komórek nowotworowych w celu zbadania rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza

Rezonans paramagnetyczny elektronów o niskim polu (pasmo L, 1,2 GHz) przy użyciu rozpuszczalnych sond nitroksylowych i trytylowych jest demonstrowany do oceny fizjologicznie ważnych parametrów w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi.

In vivo (in vivo) Ocena EPR pH, pO2, stanu redoks oraz stężeń fosforanów i glutationu w mikrośrodowisku guza

Poznaj analizę komórek tucznych w mikrośrodowisku raka wątrobowokomórkowego przy użyciu oprogramowania QuPath. Ta metoda umożliwia dokładną kwantyfikację komórek immunologicznych w tkankach nowotworowych.

Komórki tuczne w mikrośrodowisku raka wątrobowokomórkowego dają korzystne rokowanie: badanie retrospektywne przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu QuPath (Wideo) | JoVE Journal

Komórki tuczne w mikrośrodowisku raka wątrobowokomórkowego dają korzystne rokowanie: badanie retrospektywne przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu QuPath

Przeglądaj więcej filmów