Name: Inżynieria komórek mikrogleju indukowanych ludzką krwią do badań mózgu z odwrotną translacją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Poznaj metodę inżynierii komórek mikrogleju indukowanych ludzką krwią do badań mózgu z odwrotną translacją. Ten model komórkowy pozwala oceniać stan zapalny mózgu i zaburzenia neuropsychiatryczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez następujące granty na badania naukowe: (1) Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (KAKENHI; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773, a JP22H00494 do TAK, JP22H03000 do M.O.); (2) Japońska Agencja Badań i Rozwoju Medycznego (AMED; JP21wm0425010 do TAK, JP22dk0207065 do M.O.) oraz (3) Japońska Agencja Nauki i Technologii CREST (JPMJCR22N5 do TAK). Organy finansujące nie odgrywały żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowywaniu manuskryptu. Serdecznie dziękujemy firmie Editage (www.editage.jp) za redakcję w języku angielskim.

Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet Etyki Uniwersytetu Kiusiu i był zgodny ze wszystkimi postanowieniami Deklaracji Helsińskiej. Uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich uczestników, w tym zdrowych ochotników i pacjentów, na analizę ich krwi i opublikowanie danych. Materiały i wyposażenie są wymienione w Tabeli Materiałów, a składy roztworów są szczegółowo opisane w Tabeli 1.
1. Przygotowanie pożywek i do eksperymentów
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę izolacyjną, uzupełniając RPMI-1640 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (56 °C, 30 min) i 1% penicyliną-streptomycyną.</li>
	<li>Przygotować bufor izolacyjny, uzupełniając zasadowy roztwór buforowy 0,5% roztworem podstawowym albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i wysterylizować go przez filtrację (0,22 μm).</li>
</ol>
2. Izolacja komórek jednojądrzastych z krwi pełnej
<ol>
	<li>Przenieść 15 ml pożywki o gradionym natężeniu gęstości do probówki wirówkowej o gradiacji gęstości o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 000 × g przez 1 minutę w temperaturze 20 °C. 
	UWAGA: Wyizoluj 15 ml krwi na probówkę wirówkową o gradiacji gęstości o pojemności 50 ml. Zwiększ liczbę probówek, gdy objętość krwi jest wysoka.</li>
	<li>Homogenizować krew zebraną w probówkach z heparyną przez odwrócenie i zdjąć pokrywkę z probówki do pobierania krwi za pomocą pęsety sterylizowanej ogniowo.</li>
	<li>Dozować równą objętość (10-15 ml) krwi do pożywki o gradiencie gęstości w probówce wirówkowej z gradientem gęstości.</li>
	<li>Ustaw poziom opóźnienia wirówki na 1 z 4 poziomów i odwiruj przy 1 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Przy tej prędkości zwalniania prędkość obrotowa 180 × g (1 000 obr./min) zatrzymuje się w ciągu 3 minut.</li>
	<li>Przygotować taką samą liczbę probówek wirówkowych o pojemności 50 ml jak probówki wirówkowe z gradientem gęstości o pojemności 50 ml i napełnić każdą probówkę 10 ml PBS (−).</li>
	<li>Po odwirowaniu usunąć wierzchnią warstwę osocza do około 1 cm powyżej kożuchówki. 
	UWAGA: Włóż pipetę zasysającą pionowo do probówki i ostrożnie odsysaj od środka powierzchni cieczy. Nie przesadzaj, aby nie naruszyć kożuchwowej sierści.</li>
	<li>Zdekantować cały pozostały supernatant z probówki wirówkowej o gradiacji gęstości o pojemności 50 ml do probówki wirówkowej zawierającej 10 ml PBS (−).</li>
	<li>Zresetuj poziom opóźnienia wirówki do 3 z 4 poziomów i odwiruj przy 250 × g przez 10 minut przy temperaturze pokojowej. Na tym etapie przygotuj jedną probówkę wirówkową o pojemności 50 ml i dwie probówki o pojemności 15 ml oraz sitko do komórek o pojemności 100 μm.</li>
	<li>Po odwirowaniu ustalić temperaturę wirówki na 4 °C. Szukać białego osadu z czerwonym obrzeżem na dnie probówki wirówkowej. Usunąć supernatant przez aspirację i delikatnie poluzować osad, stukając.</li>
	<li>Umieść sitko o średnicy 100 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml za pomocą pęsety sterylizowanej ogniowo.</li>
	<li>Dodać 13 ml pożywki izolacyjnej do jednej z odwirowanych probówek i umyć wewnętrzną ściankę, aby prawidłowo zebrać komórki. Pobrać zawiesinę komórkową i kolejno przemyć pozostałe odwirowane probówki. Po zebraniu komórek ze wszystkich probówek, przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 
	UWAGA: Podłoże izolacyjne musi być schłodzone przez cały proces izolacji (kroki 2.11-2.16).</li>
	<li>Ponownie przemyć każdą probówkę 13 ml pożywki izolacyjnej, jak opisano w kroku 2.11. Zbierz łącznie 26 ml zawiesiny komórek.</li>
	<li>Dozować równe ilości do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml, policzyć komórki i obliczyć odpowiednie stężenie buforu izolacyjnego (60 μl buforu na 107 wszystkich komórek) dla kroku 2.16. 
	UWAGA: Stożkowa rurka o pojemności 15 ml jest lepsza w obsłudze, ponieważ objętość cieczy jest niewielka, a ciecz łatwo bąbelkuje podczas pipetowania w kroku 2.16.</li>
	<li>Wirować przy 250 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podczas wirowania należy dokładnie zdezynfekować stojak magnetyczny (zwłaszcza część stykającą się z kolumną) 70% etanolem i umieścić go na stole do wyschnięcia na powietrzu. Przechowywać bufor izolacyjny na lodzie.</li>
	<li>Usunąć supernatant przez aspirację (na tym etapie należy poszukać czerwonych granulek o grubości ~1 mm ze względu na obecność czerwonych krwinek), dodać odpowiednią ilość buforu izolacyjnego i delikatnie poluzować osad, pipetując ~20x.</li>
</ol>
3. Izolacja monocytów za pomocą mikrogranulek CD11b
<ol>
	<li>Wiruj ludzki odczynnik blokujący FcR przez 10 s przed aplikacją. Wprowadzić wymaganą ilość odczynnika (20 μl odczynnika blokującego FcR na 10-7 wszystkich komórek) i inkubować w komorze w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Wiruj mikrogranulki CD11b przez 10 s przed aplikacją. Wprowadzić wymaganą ilość odczynnika (20 μl mikrogranulek CD11b na 107 wszystkich komórek) i inkubować w komorze o temperaturze 4 °C przez 20 minut, mieszając ręcznie co 5 minut.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 10 ml buforu izolacyjnego, zawiesić przez delikatne pipetowanie i odwirować przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podczas wirowania umieść kolumnę magnetyczną na stojaku magnetycznym i przepłucz ją 3 ml buforu izolacyjnego. 
	UWAGA: Powstrzymaj się od dotykania magnetycznej części kolumny i ustaw kolumnę prawidłowo. Jeśli bąbelki dostaną się do kolumny, usuń je pipetą. Bufor izolacyjny musi być schładzany przez cały proces izolacji (kroki 3.4-3.9).</li>
	<li>Usunąć supernatant po odwirowaniu przez aspirację, dodać 1 ml buforu izolacyjnego, delikatnie wymieszać pipetując i nałożyć zawiesinę na kolumnę.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 3x, dodając 3 ml buforu izolacyjnego za każdym razem, gdy zbiornik kolumny jest pusty</li>.
	<li>Umieścić kolumnę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, nie dotykając części magnetycznej; wprowadzić 5 ml buforu izolacyjnego do kolumny i wypchnąć ciecz przez kolumnę za pomocą tłoka włożonego do probówki.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową zebraną w probówce o stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce izolacyjnej. Ponieważ ~5-10% liczby komórek zliczonych w kroku 2.13 zostanie odzyskanych, dostosuj objętość zawiesiny do liczby komórek. 
	UWAGA: Podłoże izolacyjne powinno być używane w temperaturze pokojowej i nie powinno być podgrzewane, aby uniknąć gwałtownych zmian temperatury od 4 °C.</li>
	<li>Zliczyć komórki i podwielokrotność 500 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 24-dołkowej płytki o stężeniu 40 × 104 komórki/ml i inkubować przez noc. 
	UWAGA: Zawiesiny komórek powinny być odpowiednio pipetowane zgodnie z dostosowaną objętością wysiewu wymaganą dla różnych płytek. Na przykład 1 ml na jedną studzienkę w 12-dołkowej płytce i 250 μl na jedną studzienkę w 8-dołkowym szkiełku macierzystym.</li>
	<li>Na koniec należy zutylizować lub zdezynfekować skażony sprzęt zgodnie z polityką postępowania z odpadami zakaźnymi ustanowioną przez zakład.</li>
</ol>
4. Indukcja komórek iMG z monocytów
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę indukcyjną, uzupełniając podstawową pożywkę indukcyjną 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym, 10 ng/ml rekombinowanego ludzkiego GM-CSF i 100 ng/ml rekombinowanego ludzkiego IL-34.</li>
	<li>Zastąp pożywkę izolacyjną z siewu z poprzedniego dnia pożywką indukcyjną. Przechylić płytkę do przodu i natychmiast odessać zubożone podłoże od przedniej krawędzi dna studzienki za pomocą pipety Pasteura. Wymieniaj pożywkę w ilości maksymalnie 1 płytki (= 24 dołki) na raz i natychmiast delikatnie dodaj 500 μl pożywki indukcyjnej. 
	UWAGA: Na tym etapie należy wybrać przylegające monocyty.</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 14 dni, aby zakończyć indukcję.</li>
	<li>Po 14 dniach ponownie zastąpić pożywkę 500 μl pożywki indukcyjnej. Następnie, w celu konserwacji ogniw po indukcji, należy co tydzień zastępować pożywkę indukcyjną 500 μl świeżej pożywki indukcyjnej.</li>
</ol>
5. Immunocytochemia
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę z szkiełka 8-dołkowego z komórkami wysianymi komórkami w kroku 3.10 przez aspirację i przepłukać PBS (−).</li>
	<li>Utrwal komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej za pomocą 4% paraformaldehydu.</li>
	<li>Usunąć odczynnik utrwalający i płukać komórki przez 3 x 5 minut PBS (−).</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą PBS (−) zawierającego 0,1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować permeabilizowane komórki z roztworem blokującym (3% BSA/PBS (−)) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować komórki przez noc z przeciwciałami pierwszorzędowymi (tabela materiałów) w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Wszystkie przeciwciała rozcieńcza się w roztworze blokującym.</li>
	<li>Płukać komórki przez 3 x 5 min PBS (−) przez 5 minut każda.</li>
	<li>Inkubować wypłukane komórki z odpowiednimi fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w RT (Tabela Materiałów).</li>
	<li>Przepłukać komórki przez 3 x 5 minut PBS (−) w celu usunięcia przeciwciał drugorzędowych.</li>
	<li>Inkubować komórki z roztworem DAPI (1:10 000) rozcieńczonym PBS (−) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przepłukać komórki przez 3 x 5 minut PBS (−).</li>
	<li>Zamontuj studzienkę za pomocą podłoża montażowego i zwizualizuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>

Developing Blood-Induced Microglia-Like Cells for Studying Human Brain Disorders

<ol><li>Steiner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+aspects+in+the+neurobiology+of+suicide%3A+elevated+microglial+density+in+schizophrenia+and+depression+is+associated+with+suicide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychiatr+Res%22%5BJournal%5D)">Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide.</a> J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).</li>
<li>Setiawan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+translocator+protein+total+distribution+volume+with+duration+of+untreated+major+depressive+disorder%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study.</a> Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).</li>
<li>Holmes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+translocator+protein+in+anterior+cingulate+in+major+depression+and+a+role+for+inflammation+in+suicidal+thinking%3A+a+positron+emission+tomography+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study.</a> Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).</li>
<li>Meyer, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+in+psychiatric+disorders%3A+PET+imaging+and+promising+new+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets.</a> Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).</li>
<li>Ohgidani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+induction+of+ramified+microglia-like+cells+from+human+monocytes%3A+dynamic+microglial+dysfunction+in+Nasu-Hakola+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease.</a> Sci Rep. 4, 4957(2014).</li>
<li>Method of producing microglial cells. France patent EP. , 3 092 305 B1 (2023).</li>
<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
<li>Mattis, V. B., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+revolution+for+clinical+neurology%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology.</a> Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).</li>
<li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).</li>
<li>Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+adult+mouse+resting+microglia+into+an+APC+is+promoted+by+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+and+interaction+with+Th1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells.</a> J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).</li>
<li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia%2C+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6 (10), e26317(2011).</li>
<li>Nandi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CSF-1+receptor+ligands+IL-34+and+CSF-1+exhibit+distinct+developmental+brain+expression+patterns+and+regulate+neural+progenitor+cell+maintenance+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The CSF-1 receptor ligands IL-34 and CSF-1 exhibit distinct developmental brain expression patterns and regulate neural progenitor cell maintenance and maturation.</a> Dev Biol. 367 (2), 100-113 (2012).</li>
<li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia.</a> Stem Cell Rep. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li>
<li>Yonemoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+mitochondrial+vulnerability+configurate+the+divergent+immunoreactivity+of+human+induced+microglia-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and mitochondrial vulnerability configurate the divergent immunoreactivity of human induced microglia-like cells.</a> Clin Immunol. 255, 109756(2023).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD206+expression+in+induced+microglia-like+cells+from+peripheral+blood+as+a+surrogate+biomarker+for+the+specific+immune+microenvironment+of+neurosurgical+diseases+including+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD206 expression in induced microglia-like cells from peripheral blood as a surrogate biomarker for the specific immune microenvironment of neurosurgical diseases including glioma.</a> Front Immunol. 12, 2424-2424 (2021).</li>
<li>Ohgidani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibromyalgia+and+microglial+TNF-alpha%3A+Translational+research+using+human+blood+induced+microglia-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fibromyalgia and microglial TNF-alpha: Translational research using human blood induced microglia-like cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 11882(2017).</li>
<li>Ohgidani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+CD206+gene+has+potential+as+a+state+marker+of+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial CD206 gene has potential as a state marker of bipolar disorder.</a> Front Immunol. 7, 676(2016).</li>
<li>Ohgidani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+bipolar+disorder+with+AIF1+%28coding+gene+of+Iba-1%29+deletion%3A+A+pilot+in+vitro+analysis+using+blood-derived+microglia-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatry+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A case of bipolar disorder with AIF1 (coding gene of Iba-1) deletion: A pilot in vitro analysis using blood-derived microglia-like cells.</a> Psychiatry Clin Neurosci. 77 (2), 128-130 (2023).</li>
<li>Shirozu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+and+inflammatory+responses+in+human+induced+microglia-like+%28iMG%29+cells+from+patients+with+Moyamoya+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Angiogenic and inflammatory responses in human induced microglia-like (iMG) cells from patients with Moyamoya disease.</a> Sci Rep. 13 (1), 14842(2023).</li>
<li>Sellgren, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+models+of+microglia-mediated+engulfment+of+synapses+and+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors.</a> Mol Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).</li>
<li>Sellgren, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+synapse+elimination+by+microglia+in+schizophrenia+patient-derived+models+of+synaptic+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning.</a> Nat Neurosci. 22 (3), 374-385 (2019).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+induced+microglia-like+cells+%28iMG+Cells%29+for+future+studies+of+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Validation of induced microglia-like cells (iMG Cells) for future studies of brain diseases.</a> Front Cell Neurosci. 15, 629279(2021).</li>
<li>You, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+characterization+and+clinical+relevance+of+microglia-like+cells+derived+from+patients+with+panic+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A molecular characterization and clinical relevance of microglia-like cells derived from patients with panic disorder.</a> Transl Psychiatry. 13 (1), 48(2023).</li>
<li>Rocha, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+activation+in+basal+ganglia+is+a+late+event+in+Huntington+disease+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Microglia activation in basal ganglia is a late event in Huntington disease pathophysiology.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 8 (3), e984(2021).</li>
<li>Sargeant, T. J., Fourrier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monocyte-derived+microglia-like+cell+models%3A+A+review+of+the+benefits%2C+limitations+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations.</a> Brain Behav Immun. 107, 98-109 (2023).</li>
<li>Lannes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+human+microglia+cells+with+Japanese+encephalitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Interactions of human microglia cells with Japanese encephalitis virus.</a> Virol J. 14 (1), 8(2017).</li>
<li>Ryan, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+microglia-like+cellular+model+for+assessing+the+effects+of+neurodegenerative+disease+gene+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A human microglia-like cellular model for assessing the effects of neurodegenerative disease gene variants.</a> Sci Transl Med. 9 (421), 7635(2017).</li>
<li>Etemad, S., Zamin, R. M., Ruitenberg, M. J., Filgueira, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+human+microglia+model%3A+characterization+of+human+monocyte-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro human microglia model: characterization of human monocyte-derived microglia.</a> J Neurosci Methods. 209 (1), 79-89 (2012).</li>
<li>Bortolotti, D., Gentili, V., Rotola, A., Caselli, E., Rizzo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HHV-6A+infection+induces+amyloid-beta+expression+and+activation+of+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">HHV-6A infection induces amyloid-beta expression and activation of microglial cells.</a> Alzheimers Res Ther. 11 (1), 104(2019).</li>
<li>Ormel, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+characterization+of+the+molecular+phenotype+and+inflammatory+response+of+schizophrenia+patient-derived+microglia-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">A characterization of the molecular phenotype and inflammatory response of schizophrenia patient-derived microglia-like cells.</a> Brain Behav Immun. 90, 196-207 (2020).</li>
<li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+HIV-1+intron-containing+RNA+in+microglia+induces+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Expression of HIV-1 intron-containing RNA in microglia induces inflammatory responses.</a> J Virol. 95 (5), e01386-e01420 (2021).</li>
<li>Nielsen, M. C., Andersen, M. N., Moller, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+isolation+techniques+significantly+impact+the+phenotype+of+both+isolated+monocytes+and+derived+macrophages+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro.</a> Immunology. 159 (1), 63-74 (2020).</li>
<li>Kelly, A., Grabiec, A. M., Travis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of human monocyte-derived macrophages.</a> Methods Mol Biol. 1784, 1-11 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Techniki analityczne wykorzystujące komórki iMG mogą służyć jako silne narzędzia badawcze odwrotnej translacji 5,6. Aby wygenerować wystarczającą ilość ludzkich komórek iMG, eksperymentatorzy powinni zaprojektować swoje badania z uwzględnieniem pewnych kwestii. Próbki krwi pochodzące od ludzi są niezwykle wrażliwe; W związku z tym uzyskane próbki wymagają szybkiego przetwarzania i skrupulatnego obchodzenia się z nimi, aby uniknąć zanieczyszczenia. W szczególności próbki krwi powinny być oddzielone natychmiast po pobraniu i nie pozostawiane bez opieki przez dłuższy czas. Doświadczenia zwykle rozpoczyna się w ciągu 3 godzin od pobrania krwi w celu potwierdzenia ich ważności; Możliwe jest jednak przechowywanie próbek krwi w temperaturze 4°C przez ponad 3 godziny i doprowadzenie ich do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem protokołów separacji.
Aby zapewnić stabilne wyniki, zaleca się użycie odczynników, takich jak pożywki hodowlane, w ciągu miesiąca od rozpieczętowania i wyrzucenie po upływie terminu. Podczas oddzielania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą wirowania w gradionym gradiencie gęstości, w niektórych próbkach można zaobserwować agregację komórek. W takich przypadkach próbka krwi pełnej musi być rozcieńczona PBS (−) w celu zapobieżenia agregacji. Podczas indukcji różnicowania do mikrogleju pożywka hodowlana nie jest wymieniana przez 14 dni, aby uniknąć niepotrzebnej stymulacji komórek. Po zakończeniu indukcji różnicowania, zastąpienie pożywki świeżą pożywką może przywrócić osłabione komórki i utrzymać żywotność przez jakiś czas.
Technika iMG ustalona w tym badaniu stanowi ograniczenie; Eksperymentalnie wywołane "komórki podobne do mikrogleju" są porównywalne, ale nie całkowicie identyczne z rzeczywistymi komórkami mikrogleju w ludzkim mózgu. Ponadto wcześniejsze badania udokumentowały metodologię indukcji ludzkich komórek podobnych do mikrogleju pochodzących z monocytów, a różne grupy badawcze zaproponowały własne odrębne protokoły i nazwy zależne od oryginalnych metod iMG28. Na przykład niektóre protokoły wykorzystują M-CSF 29,30,31,32 lub TGF-β 33, które według doniesień promują fenotyp podobny do mikrogleju w kulturach mikrogleju pochodzących z iPSC lub na powłokach, takich jak Geltrex24,34; Czynniki te mogą okazać się skuteczne w indukowaniu komórek podobnych do mikrogleju.
Oryginalna technologia iMG jest korzystna ze względu na prosty i łatwy do odtworzenia protokół z zaledwie dwiema cytokinami i bez powłok, który umożliwia różnorodne eksperymenty z odwrotną translacją z wykorzystaniem ludzkiej krwi. I odwrotnie, postęp technologiczny ułatwił rozwój wielu produktów. Metody separacji magnetycznej obejmują selekcję pozytywną opartą na kolumnach, podobną do naszego protokołu, a także selekcję negatywną i metody bez kolumn. Ponadto zamiast separacji magnetycznej można rozważyć alternatywną metodę separacji wykorzystującą adhezję plastyczną. Pozytywna selekcja oparta na kolumnach zapewnia czystość, ale technika ta jest czasochłonna, a stymulacja za pomocą kulek magnetycznych znacząco wpływa na komórki35. Przeciwnie, selekcja negatywna i adhezja plastyczna mogą być mniej szkodliwe dla komórek; Niemniej jednak podejścia te mogą być mniej czyste 35,36. W przyszłości może być konieczna dalsza modyfikacja w oparciu o inne protokoły.
Powyższe wyniki potwierdzają, że główną zaletą tej technologii iMG jest jej krótki czas trwania, opłacalna metodologia i zdolność do przetwarzania dużej liczby próbek do badań o wysokiej przepustowości. W związku z tym technologia ta może być wykorzystywana do pozyskiwania wiedzy z próbek pobranych od ludzi, a następnie do przeprowadzania dalszych badań walidacyjnych z wykorzystaniem różnych modeli zwierzęcych. Ponadto korzystne mogą być wyniki badań przeprowadzonych na modelach komórkowych i zwierzęcych z zastosowaniem techniki iMG. W ten sposób nasza technika iMG może być stosowana do dwukierunkowych badań translacyjnych w sposób od łóżka do łóżka pacjenta i od stołu do łóżka.

W ostatnich latach sugerowano, że zapalenie mózgu odgrywa kluczową rolę w patofizjologii różnych zaburzeń mózgowych i neuropsychiatrycznych; mikroglej został wyróżniony jako kluczowe komórki immunomodulujące przez ludzką analizę pośmiertną mózgu i techniki bioobrazowania oparte na pozytonowej tomografii emisyjnej (PET)1,2,3,4. Pośmiertne analizy obrazowania mózgu i PET przyniosły znaczące wyniki; Niemniej jednak podejścia te są nieskuteczne pod względem uchwycenia dynamicznej aktywności molekularnej ludzkiego mikrogleju w mózgu w całości. W związku z tym potrzebne są nowe strategie, które umożliwią kompleksową ocenę funkcji i dysfunkcji mikrogleju u ludzi na poziomie molekularnym i komórkowym.
W 2014 roku pierwotnie opracowaliśmy nowatorską technikę wytwarzania bezpośrednio indukowanych komórek mikrogleju (iMG)5,6, przed pierwszą publikacją ludzkich komórek podobnych do mikrogleju pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w 2016 roku7. W ciągu zaledwie 2 tygodni udało nam się przekształcić ludzkie monocyty krwi obwodowej w komórki iMG poprzez optymalizację cytokin, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) i interleukiny 34 (IL-34). Kiedy opracowaliśmy tę technikę, innowacyjna metoda przeprogramowania polegająca na indukowaniu komórek neuronalnych z komórek iPS lub fibroblastów dopiero zaczynała dominować na świecie8,9,10,11. Jednak w tym czasie nie opisano jeszcze metody indukcji komórek mikrogleju pochodzących z iPS i pożądane było stworzenie modelu mikrogleju pochodzącego z ludzkich komórek somatycznych. Ponieważ cytokiny takie jak GM-CSF i IL-34, czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów, zostały uznane za niezbędne do rozwoju i utrzymania mikrogleju12,13,14,15, postawiliśmy hipotezę, że kombinacja tych cytokin może być bezpośrednio zastosowana do wygenerowania modelu komórkowego mikrogleju z monocytów krwi. Na koniec udało nam się opracować model mikrogleju pochodzącego z monocytów, łącząc GM-CSF i IL-345. Ponadto niektóre z tych kombinacji cytokin są również wykorzystywane do indukowania mikrogleju z komórek iPS7,16 i zakłada się, że są ważnym czynnikiem w uzyskiwaniu cech mikrogleju.
W przeciwieństwie do metod iPSC, komórki iMG nie wymagają żadnych modyfikacji genetycznych i mogą być generowane w bardzo krótkim czasie przez prostą indukcję chemiczną, co skutkuje niższym czasem i kosztami finansowymi. Co więcej, komórki iMG nie wymagają przeprogramowania genetycznego, dlatego uważamy, że komórki iMG są silnymi komórkami zastępczymi do oceny nie tylko cech, ale także stanów ludzkiego mikrogleju. We wstępnym artykule na temat techniki iMG w 2014 roku potwierdziliśmy, że komórki iMG wykazują fenotyp ludzkiego mikrogleju, który może różnić się od monocytów i makrofagów. Na przykład komórki iMG wykazywały współczynnik nadekspresji receptora chemokiny CX3C 1 (CX3CR1) i receptora chemokiny C-C typu 2 (CCR2) niż monocyty i typowe markery mikrogleju, w tym białko transbłonowe 119 (TMEM 119) i receptor purynergiczny P2RY125,17. Niedawno potwierdziliśmy, że komórki iMG pochodzące z krwi obwodowej przypominają mikroglej mózgu pod względem profilu ekspresji genów dobrze znanych markerów mikrogleju u tego samego pacjenta, który przeszedł operacje mózgu18. Komórki iMG mogą być analizowane pod kątem dynamicznych funkcji na poziomie molekularnym, takich jak fagocytoza i produkcja cytokin, i oczekuje się, że zrekompensują wady pośmiertnych badań mózgu i badań PET.
Odkryliśmy wcześniej nieznane dynamiczne mechanizmy patofizjologiczne z udziałem mikrogleju u pacjentów, u których zdiagnozowano chorobę Nasu-Hakola5, fibromialgia19, choroba afektywna dwubiegunowa20,21, lub choroba Moyamoya22. Ponadto, w oparciu o naszą oryginalną metodologię, różne laboratoria wykorzystały komórki iMG (niektóre laboratoria wyznaczyły alternatywne nazwy dla tych komórek) jako kluczowe narzędzie do badań odwrotnej translacji23,24,25,26,27. Sellgren i wsp. z powodzeniem wygenerowali komórki iMG zgodnie z naszymi zaleceniami i przeprowadzili analizę mikromacierzy, która wykazała, że komórki te bardzo przypominają mikroglej ludzkiego mózgu23. Niedawno potwierdziliśmy podobieństwo między ludzkimi komórkami iMG a pierwotnym mikroglejem w mózgu, używając sekwencjonowania RNA18.
To badanie miało na celu udokumentowanie metodologii generowania komórek iMG z ludzkiej krwi obwodowej, aby ułatwić badania nad odwrotną translacją skoncentrowane na chorobach neuropsychiatrycznych. Technika ta ma potencjał jako rozsądne narzędzie analityczne, które może bez wysiłku wytworzyć modele komórkowe mikrogleju w krótkim czasie, nawet w źle wyposażonych laboratoriach, które nie mają aparatury do transferu genów lub wykwalifikowanego personelu.

<table><tbody><tr><td>0,1% Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30-5140-5</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09154-14</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100x)</td><td>gibco</td><td>15240-062</td><td>opisany jako "roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy"</td></tr><tr><td>autoMACS Roztwór do płukania</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>opisany jako "podstawowy roztwór buforowy" i stosowany jako "bufor izolacyjny"</td></tr><tr><td>CD11b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130&ndash; 049-601</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór DAPI</td><td>DOJINDO</td><td>28718-90-3</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco,</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td>opisana jako "PBS (&minus;)"</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>biowest</td><td>S1760-500</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki odczynnik blokujący FcR</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130&ndash; 059-901</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227290</td><td>opisany jako "probówka wirówkowa z gradientem gęstości"</td></tr><tr><td>Kolumny MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>opisany jako "kolumna magnetyczna"</td></tr><tr><td>MACS BSA Roztwór podstawowy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>opisany jako "roztwór podstawowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA)"</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>opisany jako "stojak magnetyczny"</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253&ndash; 84</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td>opisany jako "medium montażowe"</td></tr> <tr><td>rekombinowany ludzki GM-CSF</td><td>R& D Systems</td><td>215-GM</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowana ludzka IL-34</td><td>R& D Systems</td><td>5265-IL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium + Suplement GlutaMAX (pożywka wstępnie uzupełniona)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870036</td><td>opisany jako "podstawowa pożywka indukcyjna"</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30264<</td><td></td></tr><tr><td>strong>przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-P2RY12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA014518</td><td>przeciwciało pierwszorzędowe, królik, 1:100</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-TMEM119</td> Przeciwciało pierwszorzędowe <td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA051870</td><td>, królik, 1:100</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) z adsorbacją krzyżową wtórną, Alexa Fluor 568</td><td>invitrogen</td><td>A-11011</td><td>przeciwciało drugorzędowe, królik, 1:1000</td></tr></tbody></table>

inżynieria komórek mikrogleju indukowanych ludzką krwią do badań mózgu z odwrotną translacją

Engineering of Human Blood-Induced Microglia-like Cells for Reverse-Translational Brain Research

Ostatnie badania z wykorzystaniem modeli zwierzęcych podkreśliły znaczenie mikrogleju jako kluczowych modulatorów immunologicznych w różnych chorobach neuropsychiatrycznych i fizycznych. Pośmiertna analiza mózgu i obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej są reprezentatywnymi metodami badawczymi, które oceniają aktywację mikrogleju u ludzi; Odkrycia ujawniły aktywację mikrogleju w mózgach pacjentów z różnymi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi i przewlekłym bólem. Niemniej jednak wspomniana technika jedynie ułatwia ocenę ograniczonych aspektów aktywacji mikrogleju. 
Zamiast biopsji mózgu i techniki indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, początkowo opracowaliśmy technikę generowania bezpośrednio indukowanych komórek mikrogleju (iMG) ze świeżo pozyskanych ludzkich monocytów krwi obwodowej poprzez uzupełnianie ich czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów oraz interleukiną 34 przez 2 tygodnie. Te komórki iMG mogą być wykorzystywane do przeprowadzania dynamicznych analiz morfologicznych i na poziomie molekularnym dotyczących pojemności fagocytarnej i uwalniania cytokin po stymulacji stresem na poziomie komórkowym. Ostatnio kompleksowa analiza transkryptomu została wykorzystana do zweryfikowania podobieństwa między ludzkimi komórkami iMG a pierwotnym mikroglejem w mózgu. 
Pochodzące od pacjentów komórki iMG mogą służyć jako kluczowe zastępcze markery do przewidywania aktywacji mikrogleju w ludzkich mózgach i pomogły w odkryciu wcześniej nieznanej dynamicznej patofizjologii mikrogleju u pacjentów z chorobą Nasu-Hakola, fibromialgią, chorobą afektywną dwubiegunową i chorobą Moyamoya. W związku z tym technika oparta na iMG służy jako cenne narzędzie do odwrotnej translacji i dostarcza nowych informacji na temat dynamiki patofizjologii molekularnej mikrogleju w różnych chorobach psychicznych i fizycznych.

Ważne jest, że w cechach komórek iMG, w tym w ich morfologii i ekspresji genów, występuje znaczna heterogenność zarówno na poziomie osobniczym, jak i czasowym. Komórki iMG u niektórych osobników przyjmują wygląd silnie rozgałęziony (Rysunek 1A), podczas gdy u innych pozostają sferyczne (Rysunek 1B). Charakterystyka iMG może różnić się nawet w obrębie jednego osobnika, co czyni komórki iMG kluczowym narzędziem do wykrywania biomarkerów stanu chorobowego. Z drugiej strony, badanie takich różnic międzyosobniczych wymaga zminimalizowania błędów technicznych. Komórki iMG definiuje się jako monocyty indukowane GM-CSF i IL-34 przez co najmniej 14 dni. Aby zminimalizować błędy techniczne, zaleca się standaryzację czasu indukcji, stosowanie tych samych ilości odczynników oraz unikanie używania odczynników po terminie ważności.
Walidacja immunobarwienia potwierdza również, że komórki iMG wykazują ekspresję markerów mikroglejalnych, w tym P2RY12 i TMEM119 (Rysunek 2). Wcześniejsze badania wykazały, że cechy morfologiczne i profil ekspresji genów komórek iMG są powiązane z patofizjologią zaburzeń afektywnych dwubiegunowych20,21. Pierwsze komórki rozgałęzione zaobserwowano w 3. dniu po zastosowaniu GM-CSF i IL-34; komórki iMG w optymalnych warunkach mogą przeżyć ponad 1 miesiąc, przy założeniu wymiany pożywki raz w tygodniu. Komórki iMG mogą być wykorzystywane do analizy ekspresji genów. Na przykład pod wpływem stymulacji interferonem gamma lub IL-4 komórki iMG zmieniały wzorzec ekspresji genów, co może służyć do funkcjonalnej oceny mikrogleju spolaryzowanego do fenotypów M1 i M25,22. Ponadto kuleczki FITC wywołują morfologiczne zmiany typu ameboidalnego oraz zwiększają ekspresję TNFα i innych genów5. Co więcej, fagocytozę można ocenić poprzez pomiar intensywności fluorescencji kuleczek5,22. Ponieważ komórki iMG są żywe, ich rzeczywisty ruch oraz zmiany morfologiczne można obserwować poprzez wykonywanie zdjęć komórek (Rysunek 3) lub za pomocą fotografii time-lapse (Wideo 1).
<img alt="Obraz mikroskopowy, różnice w morfologii komórek, próbka A vs. B, analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66819/66819fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Morfologia komórek iMG. (A) Typowe rozgałęzione komórki iMG charakteryzują się małymi ciałami komórkowymi (soma) i licznymi rozgałęzionymi wypustkami. (B) Niektóre próbki różniły się wyglądem, wykazując np. typ ameboidalny. Pasek skali, 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna wykazująca ekspresję białek TMEM119 i P2RY12 w komórkach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66819/66819fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Immunocytobarwienie komórek iMG. Komórki iMG wykazują ekspresję typowych markerów mikroglialnych: (A) TMEM 119, (B) P2RY12. Jądra barwiono DAPI (niebieski). Pasek skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Morfologia komórek, obraz mikroskopowy; analiza porównawcza, różnicowanie komórek, oznaczenia A-C, czerwony pasek skali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66819/66819fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Modyfikacje morfologiczne w komórkach iMG. Komórki iMG zmieniają swoją morfologię podczas procesu indukcji. Wypustki komórkowe pojawiają się (A) około 3. dnia i wydłużają się w dniach (B) 7. i (C) 14. wraz z postępem indukcji. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Wideo 1: Fotografia poklatkowa komórek iMG. Rozgałęziona komórka iMG w centrum wydawała się nawiązywać kontakt z otaczającymi komórkami, jednocześnie wysuwając i cofając swoje wypustki. Ponadto komórka przeprowadzała fagocytozę uszkodzonych komórek. Interwały akwizycji obrazów wynosiły 46 s, a czas filmowania trwał około 14 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/Mov.1.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.</a>
Tabela 1: Skład roztworów <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66819/66819_Table%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do tworzenia ludzkich komórek mikrogleju (iMG) pochodzących z monocytów, które umożliwiają pośrednią ocenę stanu zapalnego mózgu. Przedstawia to model komórkowy, który może być korzystny dla badań koncentrujących się na potencjalnym zapaleniu mózgu i związanych z nim zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

Inżynieria komórek mikrogleju indukowanych ludzką krwią do badań mózgu z odwrotną translacją

Recent investigations employing animal models have highlighted the significance of microglia as crucial immunological modulators in various ...

Nasze laboratorium na Uniwersytecie Kiusiu ma na celu kwalifikację praw dysfunkcji mikrogleju w różnych zaburzeniach neuropsychiatrycznych. Wierzymy, że nasza technologia komórkowa IMG wyśle neuron na mikrodynamiczną funkcję/dysfunkcję na poziomie komórkowym u człowieka, poza ograniczeniami analizy ludzkiego mózgu, takiej jak badania postmitotyczne, a także badania mózgu Pitta. Nawet teraz eksperymenty na zwierzętach są niezbędne do zakwalifikowania patofizjologii mózgu w zaburzeniach psychicznych.Nie jest jednak jasne, jak dobrze dane można zastosować do patofizjologii człowieka. Nasza ludzka krew w tej technologii komórkowej IMG wypełni tę lukę między danymi dotyczącymi obciążenia, danymi klinicznymi a funkcją i/lub dysfunkcją mikrogleju. Opracowano również model choroby komórkowej pochodzenia ludzkiego, ludzki napęd komórek iPS Opracowywane są również komórki mikrogleju, które potrzebują dużo czasu i pieniędzy, aby się opracować, i mogą oceniać markery cech, ale nie markery macierzyste.Zaletą naszych metod IMG jest to, że są znacznie prostsze, mniej czasochłonne i opłacalne. Zbudowaliśmy już kilka potencjalnych czynników mikrogleju dzięki naszym badaniom iMG z odwrotną translacją skoncentrowaną na zaburzeniach neuropsychiatrycznych, takich jak demencja, choroba psychiczna, choroba afektywna dwubiegunowa, fibromialgia, glejaki i wiele innych chorób. Wierzymy, że nasza technologia komórkowa IMG wyśle neurony do mikrodynamicznej funkcji/dysfunkcji na poziomie komórkowym w różnych zaburzeniach neuropsychiatrycznych.Na początek umieść 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości w 50-mililitrowej probówce wirówkowej i wiruj ją w temperaturze 1,000G przez minutę w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Odwróć probówkę zawierającą ludzką krew zebraną w heparynie i za pomocą wysterylizowanej ogniowo pęsety zdejmij pokrywkę z probówki do pobierania krwi. Dozuj około 10 do 15 mililitrów krwi do pożywki o gradiencie gęstości w probówce.Ustaw poziom opóźnienia wirówki na jeden i odwiruj probówkę z krwią o sile 1 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usuń górną warstwę plazmy do jednego centymetra powyżej kożuchowego płaszcza. Zdekantować pozostały supernatant z probówki wirówkowej do innej probówki wirówkowej zawierającej 10 mililitrów PBS.Zresetuj poziom opóźnienia wirówki do trzech i odwiruj probówkę z PBS i supernatantem. Zassać supernatant i delikatnie postukać w probówkę, aby poluzować osad. Następnie wlej 13 mililitrów pożywki izolacyjnej do probówki wirówkowej i umyj wewnętrzną ścianę, aby prawidłowo zebrać komórki.Za pomocą pęsety sterylizowanej ogniowo umieść sitko o średnicy 100 mikrometrów na stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko do 50-mililitrowej stożkowej rurki. Dozuj równe ilości zawiesiny komórkowej do dwóch 15-mililitrowych stożkowych probówek.Wylicz komórki, aby obliczyć odpowiednie stężenie buforu izolacyjnego. Granuluj komórki w temperaturze 250G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Po usunięciu supernatantu dodać odpowiednią ilość bufora izolacyjnego i pipetę około 20 razy, aby poluzować osad.Na początek uzyskaj ludzkie komórki jednojądrzaste z krwi pełnej. Odwiruj ludzki odczynnik blokujący FcR i dodaj wymaganą ilość odczynnika do komórek. Inkubować probówkę z komórkami w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Dodaj 20 mikrolitrów mikrogranulek CD11b, które osiągają moc siedmiu komórek i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Dokładnie zdezynfekuj stojak magnetyczny 70% etanolem. Po inkubacji dodać 10 mililitrów buforu izolacyjnego.Wymieszaj i odwiruj probówkę o sile 300 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wyschnięciu stojaka umieść kolumnę magnetyczną na stojaku magnetycznym. Po usunięciu supernatantu dodać jeden mililitr buforu izolacyjnego i delikatnie wymieszać pipetą.Następnie załadować zawiesinę ogniw na kolumnę i przemyć ją trzykrotnie trzema mililitrami buforu izolacyjnego za każdym razem, gdy zbiornik kolumny jest pusty. Umieść kolumnę w stożkowej rurze o pojemności 15 mililitrów, nie dotykając części magnetycznej. Po dodaniu pięciu mililitrów buforu izolacyjnego wepchnij tłok do rurki, aby wypchnąć ciecz przez kolumnę.Odwirować zawiesinę komórkową zebraną w probówce. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce izolacyjnej. Po zliczeniu komórek należy podać 500 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki na 24-dołkowej płytce i inkubować przez noc.Aby indukować komórki podobne do mikrogleju, należy zastąpić pożywkę izolacyjną z miejsca siedzenia poprzedniego dnia pożywką indukcyjną i inkubować komórki przez 14 dni. Indukowane komórki podobne do mikrogleju wykazywały drobne ciała soma i liczne rozgałęzione boczki.

engineering-human-blood-induced-microglia-like-cells-for-reverse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Parajuli, B., et.al. Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje przeznosowe przeszczepienie indukowanych pluripotencjalnych komórek ludzkiego mikrogleju pochodzących z ludzkich komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu myszy. Hialuronidazę nakłada się na nozdrza myszy zubożonej w mikroglej w celu zwiększenia przepuszczalności.

Przeznosowe przeszczepienie indukowanych pluripotencjalnych ludzkich komórek mikrogleju pochodzących z ludzkich komórek gleju do mózgu myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Dostarczamy protokół izolacji mikrogleju z różnych wypreparowanych obszarów półkuli mózgu dorosłej myszy, a następnie półautomatyczne przygotowanie biblioteki do głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki transkryptomów pełnej długości. Metoda ta pomoże wyjaśnić funkcjonalną heterogeniczność mikrogleju w zdrowiu i chorobie.

Izolacja specyficznego dla regionu mikrogleju z jednej dorosłej półkuli mózgu myszy w celu głębokiego sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

Ten protokół jest wydajną, opłacalną i solidną metodą izolowania pierwotnego mikrogleju od żywej, dorosłej, ludzkiej tkanki mózgowej. Wyizolowany pierwotny mikroglej ludzki może służyć jako narzędzie do badania procesów komórkowych w homeostazie i chorobie.

Pozyskiwanie ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka

Prezentujemy metodę bez modyfikacji genetycznie (GMO) do uzyskania komórek z fenotypem neuronalnym z przeprogramowanych komórek krwi obwodowej. Aktywacja szlaku sygnałowego powiązanego z nowym ludzkim białkiem połączonym z GPI ujawnia skuteczną, wolną od GMO metodę pozyskiwania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Wytwarzanie komórek neuronalnych pochodzących z krwi bez GMO

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na przeszczepienie indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu drogą przeznosową u myszy immunokompetentnych. Przedstawiono metodę przygotowania i przeznosowego przeszczepienia komórek oraz podawania mieszaniny cytokin w celu utrzymania iPSMG.

Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową

Ten protokół opisuje proces różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w komórki podobne do mikrogleju do eksperymentów in vitro. Dołączamy również szczegółową procedurę generowania ludzkich synaptosomów z dolnych neuronów ruchowych pochodzących z iPSC, które można wykorzystać jako substrat do testów fagocytozy in vitro przy użyciu systemów obrazowania żywych komórek.

Ludzkie komórki podobne do mikrogleju: różnicowanie z indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi i test fagocytozy żywych komórek in vitro przy użyciu ludzkich synaptosomów

Mikroglej to unikalne komórki odpornościowe rezydentne w siatkówce, odgrywające kluczową rolę w różnych chorobach zwyrodnieniowych siatkówki. Stworzenie modelu kohodowli organoidów siatkówki z mikroglejem może ułatwić lepsze zrozumienie patogenezy i postępów w rozwoju chorób siatkówki.

Składanie organoidów siatkówki z mikroglejem

Przedstawiamy protokół generowania organoidu ludzkiego mózgu z rezydującym mikroglejem poprzez włączenie do rozwoju organoidów komórek progenitorowych pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do rozwoju organoidów.

Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

Poznaj metodę inżynierii komórek mikrogleju indukowanych ludzką krwią do badań mózgu z odwrotną translacją. Ten model komórkowy pozwala oceniać stan zapalny mózgu i zaburzenia neuropsychiatryczne.

Inżynieria komórek mikrogleju indukowanych ludzką krwią do badań mózgu z odwrotną translacją

Przeglądaj więcej filmów