Name: Skuteczne wykrywanie komórek populacji bocznej Hoechsta za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Poznaj metodę wykrywania komórek populacji bocznej Hoechsta za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem laserów 375 nm i 405 nm jako alternatywy dla drogiego lasera UV 355 nm.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty dla J.H. z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81800207). Pomoc firmy Beckman Coulter, Inc. w zapewnieniu wsparcia w zakresie cytometrii przepływowej i kalibracji parametrów jest bardzo doceniana. Dziękujemy Jiao Chen z Państwowego Kluczowego Laboratorium Chorób Jamy Ustnej Zachodniochińskiego Szpitala Stomatologicznego Uniwersytetu Syczuańskiego oraz Yu Qi z Centrum Badawczego Medycyny Regeneracyjnej Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Sichuan za pomoc w pozyskiwaniu danych cytometrii przepływowej.

Eksperymenty w tym badaniu wykorzystały łącznie 10 myszy C57BL/6 w wieku od 8 do 12 tygodni. Operacje eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z protokołem, który został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Syczuańskiego (#201609309). Materiały doświadczalne i parametry cytometrii przepływowej wykorzystane w tym artykule wymieniono w Tabeli Materiałów.
1. Izolacja i pobieranie komórek szpiku kostnego myszy
<ol>
	<li>Eutanazja myszy odbywa się w ścisłej zgodności z wytycznymi instytucji. W celu wywołania utraty przytomności u myszy, należy podać wziewne środki znieczulające, zaczynając od 2% izofluranu, a następnie stopniowo zwiększać dawkę do 5% izofluranu, aż do ustania oddychania.</li>
	<li>Przeprowadź sekcję myszy na sali operacyjnej lub w dygestorium. Oczyść i wysterylizuj myszy 70% etanolem.</li>
	<li>Całkowicie przetnij skórę i mięsień nogi ostrymi nożyczkami i wypreparuj kości udowe.</li>
	<li>Delikatnie zmiażdżyć kość udową prętem szlifierskim w moździerzu i wypłukać komórki szpiku kostnego pożywką DMEM, aż kość stanie się biała.</li>
	<li>Uzyskane komórki szpiku kostnego przefiltrować filtrem 100 μm do probówek o pojemności 15 ml. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i poddać lizie resztki krwinek czerwonych za pomocą 1 ml buforu do lizy krwinek czerwonych przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu ponownie przemyć pożywką DMEM.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 2 ml roztworu inkubacyjnego (pożywka DMEM + 5% FBS), policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i dostosować stężenie komórek do 1,0 x 106 komórek/ml z roztworem do inkubacji.</li>
</ol>
2. Barwienie komórkowe
<ol>
	<li>Uzupełnić 2 ml zawiesiny komórek szpiku kostnego od każdej myszy za pomocą 5 μg/ml Hoechst 33342. Do kolejnej 1 ml porcji dodać 100 μM werapamilu jako kontrolę ujemną.</li>
	<li>Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 90 minut, delikatnie mieszając co 30 minut.</li>
	<li>Po inkubacji schłodzić komórki na lodzie przez 5 minut, a następnie odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w roztworze chłodzącym (HBSS + 2% FBS). Wirować w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić powstały osad komórkowy w 500 μl roztworu bieżącego na próbkę. Przed analizą FCM należy uzupełnić komórki 2 μg/ml jodku propidyny (PI) i umieścić na lodzie na około 5 minut.</li>
</ol>
3. Cytometria przepływowa
UWAGA: Podsumowanie różnych używanych systemów i konfiguracji znajduje się w Tabeli 1.
<ol>
	<li>Skalibruj wartości współczynnika zmienności (CV) wymaganych kanałów za pomocą fluorosfer codziennej kontroli jakości (QC) w FCM i wykonaj badanie próbki po pomyślnym zakończeniu kontroli jakości.
	<ol>
		<li>Wybierz skrót oprogramowania na pulpicie i uruchom oprogramowanie.</li>
		<li>Wybierz opcję Start QC/Standaryzacja w menu QC/Standaryzacja, aby uzyskać dostęp do eksperymentu QC.</li>
		<li>Włóż probówkę z fluorosferą QC do uchwytu probówki.</li>
		<li>Wybierz opcję Uruchom, aby załadować próbkę i rozpocząć uruchamianie procedury kontroli jakości. FCM są gotowe do użycia po przejściu kontroli jakości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbudzić barwnik Hoechst 33342 z tych samych próbek za pomocą lasera o długości fali 355 nm, 375 nm i 405 nm, odpowiednio w celu wykrycia czerwieni Hoechst w kanale 690/50 nm i błękitu Hoechst w kanale 450/50 nm.
	<ol>
		<li>Utwórz nowy eksperyment, wybierając pozycję Nowy eksperyment w menu Plik, określ ścieżkę pliku i zapisz eksperyment.</li>
		<li>Wybierz Ustaw kanał w menu Ustawienia. Zaznacz pole wyboru sygnału kanału (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660), a następnie dodaj nazwę odczynnika w kolumnie Etykieta (Y585: PI; V450: Hoechst niebieski – 405 nm; V660: Hoechst czerwony-405 nm; NUV450: Hoechst Niebieski-375 nm; NUV660: Hoechst Niebieski-375 nm; UV450: Hoechst Niebieski-355nm; UV660: Hoechst Blue-355 nm).</li>
		<li>Kliknij ikony Wykresy pseudokolorowe w obszarze kreślenia, aby utworzyć wykresy. Wybierz nazwę osi, aby zmienić wyświetlany kanał.</li>
		<li>Kliknij przycisk Dodaj probówkę na ekranie probówki, aby utworzyć nowe probówki z próbkami i zmienić ich nazwy.</li>
		<li>Wybierz pozycję Uruchom, aby załadować próbkę, wyświetlić wykresy i ustanowić bramy. Dostosuj ustawienia wzmocnienia i progu. Wybierz opcję Nagraj, aby zapisać dane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaprojektuj logikę ustawień bramy.
	<ol>
		<li>Na pierwszym wykresie kliknij oś X, aby wybrać FSC-W, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać FSC-A. Wybierz Bramka wielokątna, aby narysować bramkę A, aby zakreślić pojedynczą komórkę i wykluczyć przylegające komórki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>W przypadku drugiego wykresu kliknij oś X, aby wybrać FSC-A, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać SSC-A. Wybierz Bramka wielokątna, aby narysować bramkę B w celu oddzielenia niefragmentarycznych komórek i wykluczenia szczątków komórkowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>W przypadku trzeciego wykresu kliknij oś X, aby wybrać PI-A, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać SSC-A. Wybierz bramkę wielokątną, aby narysować bramkę D. Wybierz żywe komórki wykazujące ujemne PI (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1C) i narysuj bramkę C, aby uzyskać żywe komórki.</li>
		<li>Dla czwartego wykresu dwuwymiarowego kliknij oś X, aby wybrać opcję Czerwony Hoechst, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać opcję Niebieski Hoechsta. Kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Wykres i wybierz opcję Właściwość z menu rozwijanego. Wybierz opcję Format liniowy flub oś X i oś Y. Wybierz Bramka wielokątna, aby narysować bramkę SP, aby uzyskać komórki SP (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby ocenić kwalifikowalność próbki, użyj 355 nm specyficznego cytometru przepływowego23 do wykrywania komórek SP.</li>
	<li>Użyj jednocześnie laserów 355 nm (moc lasera: 20 mW) i 405 nm (moc lasera: 80 mW), aby wykryć zarówno komórki kontrolne (z dodatkiem werapamilu), jak i komórki eksperymentalne.</li>
	<li>Zbieraj sygnały fluorescencyjne w kanałach 690/50 nm i 450/50 nm odpowiadających dwóm laserom. Obserwuj skuteczną stymulację barwnika Hoechst 33342 za pomocą laserów 355 nm i 405 nm z przezroczystymi komórkami SP (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B-C).</li>
	<li>W przypadku tych samych próbek do wykrywania komórek należy użyć laserów 375 nm (moc lasera: 60 mW) i 405 nm (moc lasera: 80 mW).</li>
</ol>

Alternative Laser Excitation Method for Easy Side Population Cell Detection

<ol><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li>
<li>Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells+do+not+engraft+with+absolute+efficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies.</a> Blood. 107 (2), 501-507 (2006).</li>
<li>Challen, G. A., Boles, N. C., Chambers, S. M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hematopoietic+stem+cell+subtypes+are+differentially+regulated+by+TGF-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 265-278 (2010).</li>
<li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li>
<li>Terrace, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+in+developing+human+liver+are+primarily+haematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Side population cells in developing human liver are primarily haematopoietic progenitor cells.</a> Exp Cell Res. 315 (13), 2141-2153 (2009).</li>
<li>Martin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10 (2), 140-151 (2008).</li>
<li>Challen, G. A., Bertoncello, I., Deane, J. A., Ricardo, S. D., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+side+population+reveals+multilineage+potential+and+renal+functional+capacity+but+also+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity.</a> J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1896-1912 (2006).</li>
<li>Mouthon, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+from+mouse+forebrain+are+contained+in+a+population+distinct+from+the+%27side+population%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells from mouse forebrain are contained in a population distinct from the 'side population'.</a> J Neurochem. 99 (3), 807-817 (2006).</li>
<li>Cordon-Cardo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells.</a> Ann Oncol. 21 (Suppl 7), 93-94 (2010).</li>
<li>Lapidot, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).</li>
<li>Yun, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+in+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells in castration-resistant prostate cancer.</a> Clin Cancer Res. 22 (3), 670-679 (2016).</li>
<li>Lupia, M., Cavallaro, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+stem+cells%3A+still+an+elusive+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity.</a> Mol Cancer. 16 (1), 64(2017).</li>
<li>Zhao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AQP5+complements+LGR5+to+determine+the+fates+of+gastric+cancer+stem+cells+through+regulating+ULK1+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination.</a> J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 322(2022).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+lncRNA+ROPM-mediated+lipid+metabolism+governs+breast+cancer+stem+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 178(2021).</li>
<li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li>
<li>Chiba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+purified+from+hepatocellular+carcinoma+cells+harbors+cancer+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties.</a> Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).</li>
<li>Haraguchi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+side+population+of+cancer+cells+from+human+gastrointestinal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system.</a> Stem Cells. 24 (3), 506-513 (2006).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+PTEN%2FmTOR%2FSTAT3+pathway+in+breast+cancer+stem-like+cells+is+required+for+viability+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of the PTEN/mTOR/STAT3 pathway in breast cancer stem-like cells is required for viability and maintenance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16158-16163 (2007).</li>
<li>Ota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADAM23+is+downregulated+in+side+population+and+suppresses+lung+metastasis+of+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells.</a> Cancer Sci. 107 (4), 433-443 (2016).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+regulates+multiple+myeloma+chemoresistant+side+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">ALCAM regulates multiple myeloma chemoresistant side population.</a> Cell Death Dis. 13 (2), 136(2022).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homoharringtonine+synergizes+with+quizartinib+in+FLT3-ITD+acute+myeloid+leukemia+by+targeting+FLT3-AKT-c-Myc+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Homoharringtonine synergizes with quizartinib in FLT3-ITD acute myeloid leukemia by targeting FLT3-AKT-c-Myc pathway.</a> Biochem Pharmacol. 188, 114538(2021).</li>
<li>Dong, X. L., Wei, Y. Y., Xu, T., Tan, X. Y., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+side+population+in+solid+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of side population in solid tumor cell lines.</a> J Vis Exp. (168), e60658(2021).</li>
<li>Bhowmick, D., Sheridan, R. T. C., Bushnell, T. P., Spalding, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+optimization+and+characterization+of+the+Beckman+Coulter+CytoFLEX+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for optimization and characterization of the Beckman Coulter CytoFLEX platform.</a> Cytom Part A. 97 (8), 800-810 (2020).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Użyliśmy opisanego protokołu do przeprowadzenia trzech eksperymentów, z których każde obejmowało 3-4 myszy, w wyniku czego uzyskano w sumie 10 myszy. Udział komórek SP wahał się od 0,05% do 0,76%. Należy zauważyć, że wśród myszy zaobserwowano indywidualne różnice. Do analizy próbek Hoechst wykorzystaliśmy cztery cytometry przepływowe. Zaobserwowano, że wzbudzenie barwnika Hoechsta przez laser o długości fali 20 mW i długości fali 355 nm w nowej wersji cytometrii przepływowej jest równoważne wzbudzeniu przez laser o długości fali 355 nm o mocy 100 mW w staromodnej cytometrii przepływowej. Zjawisko to można przypisać różnicom w typach laserów stosowanych w obu systemach. Potencjalną przyczyną obserwowanego efektu laserów 375 nm i 405 nm może być znaczna moc wyjściowa obu laserów w połączeniu z wykorzystaniem detektora fotodiody lawinowej (APD). Kanał Hoechst Red-A uchwycił prawie czerwoną długą falę o długości 690 nm, gdzie wydajność konwersji fotoelektrycznej lampy fotopowielacza (PMT) była stosunkowo niska. Jednak APD wykazał wydajność konwersji fotoelektrycznej około dziesięciokrotnie wyższą niż PMT24. Dlatego w połączeniu z laserami o dużej mocy 375 nm i 405 nm, detektory APD skutecznie rozróżniają ogniwa SP. Laser o długości fali 405 nm nie tylko skutecznie wykrywa komórki SP, ale także wykazuje lepszą zdolność do rozróżniania podzbioru populacji słabo dodatnich w kolorze czerwieni Hoechsta w porównaniu z laserem o długości fali 355 nm.
Kluczowym etapem protokołu jest zastosowanie cytometrii przepływowej z laserem 375 nm lub laserem 455 nm do wykrywania komórek z kanałami 690/50 nm (Hoechst-czerwony) i 450/50 nm (Hoechst-niebieski). Podczas gdy technika ta wykrywa komórki SP za pomocą laserów 375 nm i 405 nm zamiast lasera 355 nm (tradycyjny laser do analizy komórek SP1), które są bardziej powszechne w FCM, wymagane są lasery o dużej mocy 375 nm i 405 nm. Prowadzi to do ograniczeń tej technologii. Znaczenie tej metody polega na rozszerzeniu zakresu laserów stosowanych do wykrywania barwników Hoechsta, tak aby inne modele cytometrii przepływowej mogły być wykorzystywane do wykrywania komórek SP.

Komórki populacji bocznej (SP) są identyfikowane za pomocą barwienia Hoechst 33342 i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Komórki SP charakteryzują się pompowaniem fluorescencyjnego barwnika DNA z komórek przez transporter kasety wiążącej ATP (ABC)1,2. Metoda została pierwotnie opracowana do izolowania mysich hematopoetycznych komórek macierzystych szpiku kostnego (HSC)1. Komórki SP szpiku kostnego wzbogacono populacją HSC charakteryzującychsię niską ekspresją CD117+Sca-1+Lin-Thy13,4. Następnie metoda ta była szeroko stosowana do izolowania i wzbogacania komórek macierzystych z innych tkanek, w tym mięśnia sercowego5, liver6, lung7, kidney8 i forebrain9. W szczególności w ciągu ostatniej dekady metoda ta została zastosowana do izolowania nowotworowych komórek macierzystych (CSC). CSCs reprezentują niewielką populację komórek, które posiadają właściwości inicjacji nowotworu, samoodnowy, oporności na chemioterapię i potencjału przerzutowego10. CSC zostały początkowo zidentyfikowane w nowotworach układu krwiotwórczego układu krwiotwórczego11, a następnie zaobserwowano je w różnych guzach litych, takich jak raki prostaty12, ovarian13, gastric14, breast15 i lung16 raków. Pomimo dostępności różnych technik identyfikacji CSC, technika SP pozostaje preferowanym wyborem ze względu na jej szerokie zastosowanie w różnych tkankach i liniach komórkowych. Co więcej, jest to cenna technika, która izoluje CSC za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)16,17,18. Wyniki eksperymentu pokazują, że komórki SP wykazują wyraźną rakotwórczość i wykazują podwyższony poziom ekspresji genów związanych z komórkami macierzystymi19,20. Nasze poprzednie badanie21 wykazało również, że analiza transkryptomiczna izolowanych komórek SP w szpiczaku mnogim ujawnia wzbogacenie szlaków sygnałowych związanych z komórkami macierzystymi, takich jak szlak jeża. W międzyczasie przeprowadziliśmy analizy wzbogacania szlaku na genach o zróżnicowanej ekspresji w komórkach SP ostrej białaczki szpikowej 22. Zmienione geny zostały wzbogacone w szlaki związane z komórkami macierzystymi (Wnt/β-katenina, TGF-β, Hedgehog, Notch). Odkryliśmy, że 1 x 105 komórek SP może tworzyć guzy u myszy o zerowym BALB/c22, podczas gdy komórki inne niż SP nie mogą, co wskazuje, że komórki SP mają cechy komórek macierzystych białaczki. Skuteczność metody Hoechst SP w identyfikacji CSC jest oczywista.
Protokół Hoechst SP został udoskonalony i ulepszony w miarę postępu badań. Protokół obejmuje ścisłą kontrolę stężenia barwnika, gęstości komórek, temperatury i czasu trwania inkubacji, składu buforu i wartości pH. Próbki komórek przygotowane zgodnie z tym protokołem poddano analizie cytometrii przepływowej. Ze względu na wzbudzenie barwnika Hoechst za pomocą lasera UV o długości fali 355 nm i detekcję jego emisji fluorescencyjnej za pomocą zarówno filtra 690/50 nm (Hoechst Red), jak i filtra 450/50 nm (Hoechst Blue), do FCM wymagany jest laser o długości fali 350 nm. Jednak lasery 350 nm nie są powszechnie wyposażone w większość FCM ze względu na ich wysoki koszt. W związku z tym podjęliśmy próbę znalezienia alternatywnego podejścia do wzbudzania barwnika w celu skutecznego wykrywania komórek SP za pomocą cytometrii przepływowej. W tym badaniu oceniono zdolność laserów 375 nm i 405 nm do wykrywania komórek SP i porównano je z laserem 355 nm. Nasze odkrycia wykazują niezwykłe podobieństwo między komórkami SP wykrytymi przez lasery 355 nm, 375 nm i 405 nm. Wyniki te sugerują, że lasery o dużej mocy 375 nm i 405 nm mogą służyć jako realna alternatywa dla lasera 355 nm do wykrywania komórek SP. Włączenie dodatkowych źródeł światła wzbudzającego dla Hoechst 33342 ułatwia stosowanie większej liczby modeli cytometrii przepływowej.

<table><tbody><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td> Filtr komórkowy <td>Countstar</td><td>1M1200</td><td></td></tr><tr><td>(100 &micro; m)</td><td>BIOFIL</td><td>CSS-013-100</td><td></td></tr><tr><td>Codzienna kontrola jakości fluorosfery</td><td>Beckman Coulter</td><td>B5230</td><td></td></tr><tr><td>Modyfikacja pożywki Eagle's Dulbecco z 4,5 g / l glukozy (pożywka DMEM)</td> <td>CORNING</td><td>10-013-CVRC</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu CORNING</td><td>35-081-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon HBSS</td><td></td><td>SH30030.02</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczne wykrywanie komórek populacji bocznej hoechsta za pomocą cytometrii przepływowej

Effective Detection of Hoechst Side Population Cells by Flow Cytometry

Komórki populacji bocznej (SP) są identyfikowane za pomocą barwienia Hoechst 33342 i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Metoda Hoechst SP jest wykorzystywana do izolacji komórek macierzystych w oparciu o właściwości wypływu barwnika transporterów kasetowych wiążących ATP (ABC). Metoda ta była początkowo stosowana do identyfikacji i izolacji hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), ale obecnie ewoluowała, koncentrując się przede wszystkim na identyfikacji i izolacji nowotworowych komórek macierzystych (CSC). Tradycyjna metoda wykrywania FCM wykorzystuje laser o długości fali 355 nm do wzbudzania barwnika w celu wykrycia komórek SP. Dzięki temu badaniu udało nam się zidentyfikować alternatywne podejścia do wzbudzania barwnika, które mogą skutecznie zastąpić wykrywanie komórek SP za pomocą lasera 355 nm. Osiąga się to dzięki wykorzystaniu laserów o dużej mocy 375 nm lub 405 nm. Pozwala nam to na zwiększenie selektywności w wykrywaniu komórek SP, a nie ograniczanie się wyłącznie do laserowej cytometrii przepływowej 355 nm.

Na Rysunku 2 grupa kontrolna została poddana działaniu werapamilu, który blokuje transportery ABC w komórkach macierzystych, zapobiegając usuwaniu Hoechst 33342. W związku z tym komórki macierzyste w grupie bez werapamilu usuwają Hoechst 33342 i tworzą negatywną populację komórek znaną jako komórki SP. Laser o długości fali 355 nm skutecznie wzbudził barwnik Hoechst 33342, co pozwoliło na wyraźną obserwację komórek SP szpiku kostnego (Rysunek 2A). Stwierdzono, że komórki SP z tych samych próbek wykryte za pomocą lasera 355 nm i lasera 405 nm były w zasadzie identyczne (Rysunek 2D).
Z Rycina 2 i Rysunek 3wykazaliśmy, że inne modele nietradycyjnych cytometrów przepływowych mogą również identyfikować komórki SP. Wyniki wskazują, że lasery o długości fali 375 nm i 405 nm skutecznie wzbudzają Hoechst 33342 w celu wyizolowania komórek SP (Rycina 3A-B). W przypadku konieczności wykrycia lub izolacji CSC lub HSC można wybrać laser o długości fali 375 nm lub 405 nm zamiast lasera 355 nm.
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej; FSC, SSC, barwienie PI i Hoechst; analiza wielkości i ziarnistości komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67012/67012fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Logika ustawiania bramkowania w cytometrii przepływowej w celu wykrycia komórek SP. (A) Do wykluczenia komórek adherentnych wykorzystano parametry FSC-A i FSC-W. Bramka A reprezentuje skupienie pojedynczych komórek. (B) Do usunięcia szczątków komórkowych zastosowano parametry FSC-A i SSC-A. Bramka B reprezentuje skupienie komórek niepofragmentowanych. (C) Wyselekcjonowano żywe komórki wykazujące negatywny wynik barwienia jodkiem propidium (PI). Bramka C reprezentuje skupienie żywych komórek. (D) Sygnały fluorescencyjne zarejestrowano za pomocą kanałów 690/50 nm (Hoechst-red) i 450/50 nm (Hoechst-blue). Bramka SP reprezentuje skupienie komórek SP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67012/67012fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza cytometryczna z użyciem werapamilu. Wykresy przedstawiają komórki barwione Hoechstem, dane wzbudzenia i emisji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67012/67012fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Laser 405 nm o dużej mocy wykrywa komórki SP równie skutecznie jak laser 355 nm. (A) Barwnik Hoechst 33342 został wzbudzony laserem 355 nm w konwencjonalnym cytometrze przepływowym w celu wykrycia komórek SP szpiku kostnego. (B, C) Komórki SP szpiku kostnego zostały zidentyfikowane za pomocą laserów 355 nm i 405 nm w tym samym FCM. (D) Stwierdzono, że komórki SP z tych samych próbek, wykryte laserem 355 nm oraz laserem 405 nm, są w zasadzie identyczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67012/67012fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej, barwienie Hoechstem, analiza cyklu komórkowego, rozkład intensywności fluorescencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67012/67012fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Lasery o wysokiej mocy 375 nm i 405 nm umożliwiają wykrywanie komórek SP. (A) Laser o wysokiej mocy 375 nm może wykrywać komórki SP. (B) Komórki SP szpiku kostnego można wykrywać również przy użyciu laserów 405 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67012/67012fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Typ lasera</td>
			<td>Długość fali lasera (nm)</td>
			<td>Moc lasera (mW)</td>
			<td>filtr czerwony do barwnika Hoechst (nm)</td>
			<td>filtr Hoechst blue (nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moflo Astrios EQ </td>
			<td>Gaz argonowy</td>
			<td>355</td>
			<td>100</td>
			<td>692/75</td>
			<td>448/59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">CytoFLEX LX </td>
			<td rowspan="2">Półprzewodnik</td>
			<td>355</td>
			<td>20</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405</td>
			<td>80</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX S </td>
			<td>Półprzewodnik</td>
			<td>375</td>
			<td>60</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX SRT </td>
			<td>Półprzewodnik</td>
			<td>405</td>
			<td>80</td>
			<td>690/50</td>
			<td>450/50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Podsumowanie konfiguracji cytometru przepływowego.

Tutaj pokazujemy, że lasery o dużej mocy 375 nm i 405 nm mogą skutecznie wzbudzić Hoechst 33342 i służyć jako realna alternatywa dla lasera 355 nm do wykrywania komórek populacji bocznej (SP), rozszerzając tym samym zakres dostępnych laserów w zastosowaniach cytometrii przepływowej.

Skuteczne wykrywanie komórek populacji bocznej Hoechsta za pomocą cytometrii przepływowej

The side population (SP) cells are identified through Hoechst 33342 staining and analyzed using flow cytometry (FCM). The Hoechst SP method is utilized ...

Stosujemy metodę populacji barwnika Hoechsta do wykrywania komórek inicjujących nowotwór. W tym artykule staramy się znaleźć alternatywne podejścia do wzbudzenia Hoechsta. Odkryliśmy, że lasery o dużej mocy 375 nanometrów i 405 nanometrów mogą służyć jako realna alternatywa dla tradycyjnego lasera 355 nanometrów.Konwencjonalnie barwnik Hoechst jest wzbudzany laserem UV o długości 355 nanometrów. Ze względu na wysoki koszt laserów UV nie są one powszechnie stosowane w większości modeli cytometrii przepływowej. Nasz protokół rozszerza zakres laserów, które mogą być używane do wykrywania barwienia metodą Hoechst.Dla naukowców koncentrujących się na prawidłowych i złośliwych komórkach macierzystych można wykorzystać więcej modeli cytometrii przepływowej do wykrywania komórek populacji bocznej. Na początek pobierz komórki szpiku kostnego od myszy i dodaj pięć mikrogramów na mililitr Hoechst 33342 do dwóch mililitrów zawiesiny komórkowej. Przygotować również probówkę z kontrolą ujemną.Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut z delikatnym mieszaniem co 30 minut Po inkubacji schłodzić komórki na lodzie przez pięć minut, a następnie odwirować w temperaturze 250 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawieś komórki w zimnym roztworze zawierającym zrównoważony roztwór soli Hanka z 2% FBS. Ponownie odwirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie ponownie zawieś powstałe osady komórkowe w 500 mikrolitrach roztworu bieżącego na próbkę. Przed analizą cytometrii przepływowej należy uzupełnić komórki dwoma mikrogramami na mililitr jodku propydyny i umieścić je na lodzie na około pięć minut. Na początek wybarwij lustrzane komórki szpiku kostnego za pomocą Hoechst 33342.W przypadku cytometrii przepływowej uruchom wymagane oprogramowanie. Następnie wybierz w standaryzacji QC. Włóż probówkę z próbką fluoro sphere do kontroli jakości lub kontroli jakości do uchwytu probówki przed wybraniem początku procedury kontroli jakości.Aby utworzyć nowy eksperyment, kliknij nowy eksperyment w menu plików, określ ścieżkę pliku i zapisz eksperyment. Następnie wybierz ustaw kanał w menu ustawień. Zaznacz pole wyboru sygnału kanału i dodaj nazwę odczynnika w kolumnie etykiety.Następnie kliknij ikonę pseudo kolorowych wykresów w obszarze kreślenia, aby utworzyć wykresy. Kliknij dodaj probówkę na ekranie probówki, aby utworzyć nowe probówki z próbkami i zmienić ich nazwy. Następnie wybierz pozycję uruchom, aby załadować przykład.Obejrzyj działki i ustaw bramy. Dostosuj ustawienia wzmocnienia i progu, a następnie wybierz nagrywanie, aby zapisać dane. Aby zaprojektować logikę ustawień bramy, kliknij oś x, aby wybrać FSEW, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać FSEA.Wybierz bramkę wielokątną, aby narysować bramkę A, aby zakreślić pojedynczą komórkę i wykluczyć komórki przylegające. W przypadku drugiego wykresu kliknij oś x, aby wybrać FSEA, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać SSCA. Wybierz bramkę wielokątną, aby narysować bramkę B, aby oddzielić niefragmentaryczne komórki i wykluczyć szczątki komórkowe.W przypadku trzeciego wykresu kliknij oś x, aby wybrać PIA. I kliknij oś Y, aby wybrać SSCA. Po narysowaniu bramki B wybierz żywe komórki wykazujące ujemny jodek propidyny i narysuj bramkę C, aby uzyskać żywe komórki.W przypadku czwartego wykresu dwuwymiarowego kliknij oś x, aby wybrać kolor czerwony Hoechst, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać kolor niebieski Hoechst. Kliknij prawym przyciskiem myszy działkę i wybierz właściwość z menu rozwijanego. Wybierz format liniowy zarówno dla osi x, jak i osi Y.I narysuj bramę dla bocznych komórek populacji. Użyj jednocześnie laserów 355 nanometrów i 405 nanometrów, aby wykryć zarówno komórki kontrolne, jak i komórki eksperymentalne. Zbieraj sygnały fluorescencyjne w kanałach 690 na 50 i 450 na 50 nanometrów odpowiadających dwóm laserom.Obserwuj skuteczną stymulację barwnika Hoechst 33342 za pomocą laserów 355 i 405 nanometrów, aby uwidocznić przezroczyste komórki populacji bocznej. W przypadku tych samych próbek należy użyć laserów 375 nanometrów i 405 nanometrów do wykrywania komórek. Laser o długości 355 nanometrów, skutecznie wzbudza barwnik Hoechst 33342, co skutkuje wyraźną obserwacją komórek SP szpiku kostnego.Okazało się, że komórki SP w tych samych próbkach wykrytych przez laser 355 nanometrowy i laser 405 nanometrowy są zasadniczo identyczne. Zarówno lasery o długości fali 375 nanometrów, jak i 405 nanometrów skutecznie wzbudziły Hoechst 33342 w celu uzyskania komórek SP.

effective-detection-of-hoechst-side-population-cells-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Poniższy protokół opisuje metodę izolowania populacji bocznej komórek nowotworowych ostrej białaczki limfoblastycznej (T-ALL) komórek T, składającej się z komórek macierzystych, od dorosłego danio pręgowanego. W populacji bocznej brakuje wyraźnych markerów komórkowych, dlatego do ich izolacji używamy testu wypływu barwnika Hoechst 33342.

Test populacji bocznej: metoda izolowania bocznej populacji komórek nowotworowych od danio pręgowanego

W tym filmie opisujemy izolację subpopulacji komórek macierzystych nowotworowych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją lub FACS. Wyizolowaną populację boczną komórek można wykorzystać do dalszej analizy.

Test dyskryminacji populacji po stronie raka: metoda izolowania rakowych komórek macierzystych za pomocą testu wypływu barwnika Hoechsta

Ten protokół opisuje wykorzystanie wychwytu bromodeoksyurydyny (BrdU), aby umożliwić czasowe śledzenie komórek, które były w fazie S w określonym momencie. Dodanie barwników DNA i znakowanie przeciwciałami ułatwia szczegółową analizę losów komórek fazy S w późniejszym czasie.

Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji

Zrozumienie roli nowotworowych komórek macierzystych w nawrotach nowotworów i oporności na terapie stało się tematem wielkiego zainteresowania w ostatniej dekadzie. W artykule opisano izolację i charakterystykę subpopulacji nowotworowych komórek macierzystych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC).

Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

Odsłonięta normalna powierzchnia oka składa się z rogówki i spojówki. Komórki nabłonkowe, komórki kubkowe i komórki odpornościowe są obecne w spojówce. W tym miejscu opisano nieinwazyjną technikę cytologii wyciskowej z wykorzystaniem urządzenia do cytologii wyciskowej i cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w spojówce.

Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki

Metody pozwalające na charakterystykę i izolację populacji komórek macierzystych z próbek biologicznych są kluczowe dla rozwoju terapii komórek macierzystych w leczeniu raka i nie tylko. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji nowotworowych komórek macierzystych przy użyciu fenotypu populacji bocznej wywołanego barwnikiem.

Wykorzystanie fenotypu populacji bocznej wyzwalanego barwnikiem DNA do wykrywania i oczyszczania nowotworowych komórek macierzystych z próbek biologicznych

Tutaj opisujemy technikę izolowania komórek populacji bocznej z modelu danio pręgowanego z indukowaną przez myc ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej (T-ALL). Ten boczny test populacyjny jest bardzo czuły i jest opisany dla T-ALL danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych złośliwych i niezłośliwych typów komórek danio pręgowanego.

Izolacja populacji bocznej w ostrej białaczce limfoblastycznej indukowanej przez limfokomórki T indukowanej przez Myc u danio pręgowanego

Ta praca opisuje standaryzację metody uzyskiwania oczyszczonych populacji komórek rozrodczych z tkanki jąder różnych gatunków ssaków. Jest to prosty protokół, który łączy mechaniczną dysocjację jąder, barwienie za pomocą Hoechst-33342 i jodku propidyny oraz sortowanie FACS, z szerokim zastosowaniem w badaniach porównawczych biologii rozrodu mężczyzn.

Ustandaryzowane podejście do wielogatunkowego oczyszczania męskich komórek rozrodczych ssaków za pomocą mechanicznej dysocjacji tkanek i cytometrii przepływowej

Prezentowana jest wygodna, szybka i opłacalna metoda pomiaru proporcji komórek populacji bocznej w liniach komórkowych guzów litych.

Analiza populacji bocznej w liniach komórkowych guzów litych

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Poznaj metodę wykrywania komórek populacji bocznej Hoechsta za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem laserów 375 nm i 405 nm jako alternatywy dla drogiego lasera UV 355 nm.

Skuteczne wykrywanie komórek populacji bocznej Hoechsta za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów