Skuteczne wykrywanie komórek populacji bocznej Hoechsta za pomocą cytometrii przepływowej
23 sierpnia 2024
Tutaj pokazujemy, że lasery o dużej mocy 375 nm i 405 nm mogą skutecznie wzbudzić Hoechst 33342 i służyć jako realna alternatywa dla lasera 355 nm do wykrywania komórek populacji bocznej (SP), rozszerzając tym samym zakres dostępnych laserów w zastosowaniach cytometrii przepływowej.
Stosujemy metodę populacji barwnika Hoechsta do wykrywania komórek inicjujących nowotwór. W tym artykule staramy się znaleźć alternatywne podejścia do wzbudzenia Hoechsta. Odkryliśmy, że lasery o dużej mocy 375 nanometrów i 405 nanometrów mogą służyć jako realna alternatywa dla tradycyjnego lasera 355 nanometrów.
Konwencjonalnie barwnik Hoechst jest wzbudzany laserem UV o długości 355 nanometrów. Ze względu na wysoki koszt laserów UV nie są one powszechnie stosowane w większości modeli cytometrii przepływowej. Nasz protokół rozszerza zakres laserów, które mogą być używane do wykrywania barwienia metodą Hoechst.
Dla naukowców koncentrujących się na prawidłowych i złośliwych komórkach macierzystych można wykorzystać więcej modeli cytometrii przepływowej do wykrywania komórek populacji bocznej. Na początek pobierz komórki szpiku kostnego od myszy i dodaj pięć mikrogramów na mililitr Hoechst 33342 do dwóch mililitrów zawiesiny komórkowej. Przygotować również probówkę z kontrolą ujemną.
Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 90 minut z delikatnym mieszaniem co 30 minut Po inkubacji schłodzić komórki na lodzie przez pięć minut, a następnie odwirować w temperaturze 250 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawieś komórki w zimnym roztworze zawierającym zrównoważony roztwór soli Hanka z 2% FBS. Ponownie odwirować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.
Następnie ponownie zawieś powstałe osady komórkowe w 500 mikrolitrach roztworu bieżącego na próbkę. Przed analizą cytometrii przepływowej należy uzupełnić komórki dwoma mikrogramami na mililitr jodku propydyny i umieścić je na lodzie na około pięć minut. Na początek wybarwij lustrzane komórki szpiku kostnego za pomocą Hoechst 33342.
W przypadku cytometrii przepływowej uruchom wymagane oprogramowanie. Następnie wybierz w standaryzacji QC. Włóż probówkę z próbką fluoro sphere do kontroli jakości lub kontroli jakości do uchwytu probówki przed wybraniem początku procedury kontroli jakości.
Aby utworzyć nowy eksperyment, kliknij nowy eksperyment w menu plików, określ ścieżkę pliku i zapisz eksperyment. Następnie wybierz ustaw kanał w menu ustawień. Zaznacz pole wyboru sygnału kanału i dodaj nazwę odczynnika w kolumnie etykiety.
Następnie kliknij ikonę pseudo kolorowych wykresów w obszarze kreślenia, aby utworzyć wykresy. Kliknij dodaj probówkę na ekranie probówki, aby utworzyć nowe probówki z próbkami i zmienić ich nazwy. Następnie wybierz pozycję uruchom, aby załadować przykład.
Obejrzyj działki i ustaw bramy. Dostosuj ustawienia wzmocnienia i progu, a następnie wybierz nagrywanie, aby zapisać dane. Aby zaprojektować logikę ustawień bramy, kliknij oś x, aby wybrać FSEW, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać FSEA.
Wybierz bramkę wielokątną, aby narysować bramkę A, aby zakreślić pojedynczą komórkę i wykluczyć komórki przylegające. W przypadku drugiego wykresu kliknij oś x, aby wybrać FSEA, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać SSCA. Wybierz bramkę wielokątną, aby narysować bramkę B, aby oddzielić niefragmentaryczne komórki i wykluczyć szczątki komórkowe.
W przypadku trzeciego wykresu kliknij oś x, aby wybrać PIA. I kliknij oś Y, aby wybrać SSCA. Po narysowaniu bramki B wybierz żywe komórki wykazujące ujemny jodek propidyny i narysuj bramkę C, aby uzyskać żywe komórki.
W przypadku czwartego wykresu dwuwymiarowego kliknij oś x, aby wybrać kolor czerwony Hoechst, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać kolor niebieski Hoechst. Kliknij prawym przyciskiem myszy działkę i wybierz właściwość z menu rozwijanego. Wybierz format liniowy zarówno dla osi x, jak i osi Y.
I narysuj bramę dla bocznych komórek populacji. Użyj jednocześnie laserów 355 nanometrów i 405 nanometrów, aby wykryć zarówno komórki kontrolne, jak i komórki eksperymentalne. Zbieraj sygnały fluorescencyjne w kanałach 690 na 50 i 450 na 50 nanometrów odpowiadających dwóm laserom.
Obserwuj skuteczną stymulację barwnika Hoechst 33342 za pomocą laserów 355 i 405 nanometrów, aby uwidocznić przezroczyste komórki populacji bocznej. W przypadku tych samych próbek należy użyć laserów 375 nanometrów i 405 nanometrów do wykrywania komórek. Laser o długości 355 nanometrów, skutecznie wzbudza barwnik Hoechst 33342, co skutkuje wyraźną obserwacją komórek SP szpiku kostnego.
Okazało się, że komórki SP w tych samych próbkach wykrytych przez laser 355 nanometrowy i laser 405 nanometrowy są zasadniczo identyczne. Zarówno lasery o długości fali 375 nanometrów, jak i 405 nanometrów skutecznie wzbudziły Hoechst 33342 w celu uzyskania komórek SP.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje alternatywne metody wzbudzenia barwnika Hoechst 33342 stosowanego w wykrywaniu komórek inicjujących nowotwór. Wykazujemy, że lasery o wysokiej mocy o długości fali 375 nm i 405 nm mogą skutecznie zastąpić tradycyjny laser 355 nm, co rozszerza możliwości zastosowań w cytometrii przepływowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Cytometria przepływowa
- Detekcja komórek
- Techniki wzbudzania laserowego
Wstęp
- Hoechst 33342 jest powszechnie stosowany do identyfikacji komórek populacji bocznej (SP).
- Tradycyjne wzbudzanie opiera się na laserze UV o długości fali 355 nm, który jest kosztowny.
- Istnieje zapotrzebowanie na bardziej dostępne opcje laserowe w cytometrii przepływowej.
- Niniejsze badanie analizuje skuteczność alternatywnych długości fal laserowych.
Cel badania
- Zidentyfikowanie możliwych do zastosowania alternatywnych laserów do wzbudzenia barwnika Hoechst.
- Zwiększenie dostępności technik cytometrii przepływowej.
- Usprawnienie detekcji komórek inicjujących nowotwór.
Zastosowane metody
- Porównanie wzbudzania barwnika Hoechst przy użyciu laserów 375 nm i 405 nm.
- Ocena wydajności detekcji w cytometrii przepływowej.
- Ocena opłacalności alternatywnych laserów.
- Wdrożenie protokołów detekcji komórek SP.
Główne wyniki
- Lasery 375 nm i 405 nm skutecznie wzbudzają Hoechst 33342.
- Lasery te stanowią praktyczną alternatywę dla lasera 355 nm.
- Rozszerzenie opcji laserowych może zwiększyć możliwości wykrywania komórek SP.
- Zaproponowano kosztowo efektywne rozwiązania dla zastosowań w cytometrii przepływowej.
Wnioski
- Lasery o wysokiej mocy o długości fali 375 nm i 405 nm są odpowiednie do wzbudzania Hoechst.
- Alternatywy te mogą zwiększyć dostępność w warunkach badawczych.
- Przyszłe badania mogą zgłębiać dalsze zastosowania tych laserów w detekcji komórek.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna detekcja komórek populacji bocznej (side population, SP) za pomocą barwienia Hoechst 33342 ma kluczowe znaczenie dla badań nad komórkami macierzystymi i nowotworowymi komórkami macierzystymi w początkowych etapach odkrywania leków oraz w procesach translacyjnych. Możliwość wykorzystania laserów o wysokiej mocy 375 nm lub 405 nm zamiast tradycyjnych laserów UV 355 nm rozszerza dostęp do zwalidowanych testów komórek SP na większej liczbie platform cytometrii przepływowej. Ta elastyczność usprawnia walidację celów terapeutycznych w całym portfolio oraz minimalizuje ryzyko mechanistyczne zarówno w programach badawczych nad normalnymi, jak i złośliwymi komórkami macierzystymi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia niezawodną identyfikację komórek SP w celu funkcjonalnej walidacji celów w badaniach nad komórkami macierzystymi oraz w onkologii.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez potwierdzenie właściwości odpływu barwnika powiązanych z aktywnością transporterów ABC.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w testach populacji komórek macierzystych na potrzeby selekcji projektów w portfolio.
Przesiew i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane systemy detekcji komórek SP do dalszych etapów workflow przesiewania związków.
- Poprawia powtarzalność i standaryzację analizy poprzez rozszerzenie zakresu kompatybilnej aparatury.
- Umożliwia skalowalność i przenoszalność analiz komórek SP pomiędzy różnymi modelami cytometrów przepływowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uzesuje detekcję komórek SP z modelami istotnymi dla przebiegu choroby w celu prowadzenia translacyjnych badań nad biomarkerami.
- Zapewnia ciągłość od etapu wczesnego odkrywania po przedkliniczną walidację celów związanych z komórkami macierzystymi.
- Zmniejsza ryzyko wystąpienia wąskich gardeł technicznych w badaniach wieloośrodkowych lub z wykorzystaniem wielu urządzeń.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając detekcję komórek SP na szerszym zakresie cytometrów przepływowych, co wspiera zarówno wczesną walidację punktu uchwytu, jak i badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia solidną platformę do testowania hipotez i wyjaśniania szlaków w biologii komórek macierzystych i nowotworów.
- Przesiewy: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne wyniki odczytu komórek SP do oceny związków.
- Analityka: Generuje ilościowe dane fluorescencyjne do analizy porównawczej populacji komórkowych.
- Badania translacyjne: Zapewnia spójność biomarkerów i ciągłość techniczną w różnych fazach badań.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwość wielokrotnego wykorzystania, niezależną od instrumentu, zdolność detekcji komórek SP dla różnorodnych zespołów R&D.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w testach komórek macierzystych.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów detekcji pojedynczych komórek (SP).
- Wartość strategiczna: Wspiera lepsze podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez minimalizację ograniczeń technicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów z zakresu komórek macierzystych i onkologii.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu cytometrii przepływowej oraz strategii bramkowania (gatingu) komórek SP.
- Niezbędny jest dostęp do laserów o wysokiej mocy 375 nm lub 405 nm oraz kompatybilnej infrastruktury analitycznej.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów bramkowania i detekcji fluorescencji pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych typów komórek lub systemów modelowych.
- Kompatybilność aparatury oraz moc lasera muszą zostać zweryfikowane dla każdej platformy.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:14
Staining Mouse Bone Marrow Cells with Hoechst to Detect Side Population Cells by Flow Cytometry
2:22
Flow Cytometry of Hoechst‐Stained Mouse Bone Marrow Cells for Effective Detection of Side Population Using High‐Power 375 nm and 405 nm Lasers
