Name: Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Poznaj metodę rejestracji aktywności napadów z ostrych wycinków mózgu przy użyciu układów CMOS-HD-MEAs. Technika ta umożliwia szczegółową analizę przestrzenną i czasową padaczki, wspierając rozwój nowych terapii dla stanu padaczkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują byłym i obecnym członkom laboratorium Parrish za ich zmiany w tym manuskrypcie. Chcielibyśmy również podziękować Alessandro Maccione z 3Brain za jego opinie na temat tej pracy. Praca ta została sfinansowana ze środków AES/EF Junior Investigator Award oraz przez Kolegium Nauk Przyrodniczych oraz Nauk Fizycznych i Matematycznych Uniwersytetu Brighama Younga.

Consistent Induction and Recording of Seizure-Like Activity Using CMOS-HD-MEAs

Autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów związanego z tym badaniem.

Protokół ten zawiera szczegółowe wytyczne związane z leczeniem ostrych wycinków mózgu, które dotyczą typowych problemów, z jakimi borykają się użytkownicy CMOS-HD-MEA, a mianowicie powstawania hałasu pod wycinkiem mózgu i utrzymywania zdrowego środowiska dla wycinka mózgu. Powstawanie szumu pod wycinkiem występuje, gdy wycinek nie jest prawidłowo przylegający do tablicy; Jeśli wycinek mózgu nie jest odpowiednio przylegający, pod wycinkiem mogą tworzyć się kieszenie powietrzne, co powoduje hałas. Spowoduje to brak możliwości pozyskania danych. Aby złagodzić te wyzwania, protokół kładzie nacisk na dwa kluczowe kroki: po pierwsze, zapewnienie właściwej orientacji harfy podczas umieszczania, aby zapobiec przepychaniu się przez perfuzję napływową (krok 4.1.4), a po drugie, użycie chusteczki antystatycznej do usunięcia nadmiaru aCSF wokół elektrod, promując w ten sposób skuteczną przyczepność plastrów (kroki 4.1.5-4.1.7). Innym częstym problemem poruszonym w protokole jest hydrofobowość chipów, która może prowadzić do tworzenia się pęcherzyków i powodować szumy podczas nagrań. W celu złagodzenia tych problemów zaleca się takie kroki, jak uzdatnianie etanolu, a następnie płukanie wodą dejonizowaną (kroki 3.1.2, 3.1.3 i 3.1.6). Jeśli jednak problem będzie się powtarzał, można podjąć dodatkowe kroki. Napełnij dobrze chip 140-procentowym etanolem i użyj pędzla, aby delikatnie szczotkować tablicę przez 30 s do 60 s. Usuń etanol i dobrze wypłucz wiór trzy razy wodą dejonizowaną. Następnie napełnij studzienkę plikiem CSF i kontynuuj protokół w kroku 4.
Utrzymanie zdrowego środowiska dla wycinka mózgu jest niezbędne i jest zarządzane poprzez właściwe umieszczenie igieł dopływu i odpływu oraz szybkość przepływu systemu perfuzyjnego (krok 4.2.1). Konieczne jest odpowiednie natlenienie plastra i znalezienie najskuteczniejszej szybkości perfuzji23,51. Ze względu na te problemy, komory interfejsu są powszechnie używane do nagrań ostrych wycinków mózgu i zapewniają stabilniejsze natlenienie. Jednak doniesiono, że nagrywanie z komorami interfejsu kompresuje przestrzeń zewnątrzkomórkową między neuronami, co może zmienić fizjologię wycinka w czasie 24,52,53. Dynamika napięcia powierzchniowego wynikająca z tej zmienionej fizjologii skutkuje wyższą podstawową wrażliwością elektryczną neuronów54. Ta dodatkowa pobudliwość zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzeń podobnych do napadów padaczkowych i innych LFP będących przedmiotem zainteresowania. Dla porównania, komory zanurzeniowe, z którymi współpracuje większość platform CMOS-HD-MEA, mogą wydajniej dostarczać leki i glukozę do warstwy23,51. Aby utrzymać zdrowe środowisko dla wycinka podczas sesji nagraniowej, która trwałaby ponad 2 godziny z platformami CMOS-HD-MEA, korzystne jest przygotowanie innego roztworu prodrgawkowego (krok 4.2.1.9). Zapewni to, że plasterek będzie miał wystarczającą ilość glukozy, aby kontynuować aktywność.
Brak rozdzielczości przestrzennej może być poważnym ograniczeniem w elektrofizjologii23,55. Na przykład zaciskanie łat jest techniką często stosowaną w elektrofizjologii, która może dostarczyć bardzo szczegółowych informacji na temat tego, jak zachowuje się pojedyncza komórka podczas aktywności sieciowej; Jednak jednym z ograniczeń zaciskania krosek jest to, że nagrywanie jest wykonywane z jednej komórki i domyślnie z jednej lokalizacji. Patch-clamping może być wykorzystany do badania aktywności sieciowej, ale oferuje raczej ograniczony przestrzenny obraz aktywności sieci41,56. Niektóre techniki obrazowania zapewniają szerokie przestrzenne szczegóły aktywności neuronalnej, takie jak genetycznie kodowane bioczujniki fluorescencyjne; Odbywa się to jednak kosztem czasowej rezolucji 57,58,59. Podejścia multimodalne, takie jak jedno- lub wielokanałowe zapisy elektrodowe, można połączyć z obrazowaniem wapnia w celu uzyskania większej rozdzielczości czasoprzestrzennej; Rozdzielczość przestrzenna zapisu elektrofizjologicznego jest jednak nadal ograniczona do kilku lokalizacji60,61. Przy prawidłowym zastosowaniu technologia CMOS-HD-MEA pozwala użytkownikom przezwyciężyć te ograniczenia poprzez nagrywanie z dużą gęstością przestrzenną (elektrody są zwykle oddalone od siebie o 20-200 μm) z wielu obszarów mózgu jednocześnie (ilustracja 4). Dane CMOS-HD-MEA mogą pozwolić naukowcom na rozróżnienie i scharakteryzowanie wzorców rozprzestrzeniania się aktywności w całym wycinku mózgu z większą szczegółowością niż większość innych technik rejestracji 10,62,63. Chociaż technologia CMOS-HD-MEA wykazuje doskonałą zdolność mapowania przestrzennego z dużą szczegółowością czasową64, istnieją ograniczenia, takie jak niemożność niezawodnego nagrywania z pojedynczych komórek za pomocą wycinków korowych ze względu na zastosowanie niepenetrujących matryc 2D oraz niemożność wykorzystania do eksperymentów in vivo. Systemy CMOS-HD-MEA zazwyczaj rejestrują tylko lokalne potencjały pola z wycinków kory mózgowej; Mogą jednak wychwytywać zewnątrzkomórkowe potencjały czynnościowe na niektórych kanałach za pomocą wysokiej jakości preparatów plastrowych, chociaż ta zdolność może być zawodna. Aktywność jednostek jednokomórkowych można badać na nagranych kanałach z systemu CMOS-HD-MEA za pomocą filtra górnoprzepustowego (~50 Hz górnoprzepustowego) w połączeniu z oprogramowaniem do sortowania szczytów 65,66,67. Warto podkreślić, że możliwe jest połączenie zapisów mikroelektrodowych z systemami CMOS-HD-MEA w celu uzyskania informacji o pojedynczej komórce z kilku lokalizacji, nałożonych na bogate informacje CMOS-HD-MEA5. Obecna metoda z niepenetrującymi chipami 2D jest ograniczona trudnościami w wykrywaniu aktywności o wyższej częstotliwości (150-500 Hz) w korowych obszarach mózgu. Jest to prawdopodobnie spowodowane odległością między neuronami wytwarzającymi aktywność a elektrodami rejestrującymi (ryc. 6B). Wyzwanie to można przezwyciężyć dzięki zastosowaniu nowych penetrujących chipów 3D-CMOS-HD-MEA, które nagrywają z wnętrza wycinka mózgu, a nie tylko z jego powierzchni68.
Korzystając z powyższego protokołu, wygenerowaliśmy przykładowe dane, aby zademonstrować wysokiej jakości sygnały LFP w postaci aktywności podobnej do napadu, którą można osiągnąć za pomocą tych instrumentów (Rysunek 4 i Rysunek 5). Wykazaliśmy, że aktywność podobną do napadów można zaobserwować przy różnych paradygmatach rejestracji (w szczególności 4-AP i 0 Mg2+) przy użyciu systemów CMOS-HD-MEA pomimo idiosynkratycznych różnic między paradygmatami.
Podsumowując, protokół i przykładowe dane przedstawione za pomocą CMOS-HD-MEA stanowią mapę drogową, za pomocą której można gromadzić przestrzenne i czasowe dane LFP o wysokiej wierności. Przyszłe zastosowania tej techniki obejmują zastosowanie tego protokołu do dodatkowych paradygmatów, które indukują aktywność padaczkową oraz integrację CMOS-HD-MEA z technikami uzupełniającymi, takimi jak obrazowanie. Badania te niewątpliwie pomogą nam w zrozumieniu zaburzeń napadowych u ludzi przy użyciu tych prostych modeli wycinków mózgu69. Na przykład, rozszerzenie tego protokołu może zapewnić wnikliwe badanie krzyżowe zachowań elektrofizjologicznych i mapowania genetycznego z różnych zwierzęcych modeli padaczki z mutacjami w klinicznie istotnych genach70. Podczas gdy skupiliśmy się na aktywności padaczkowej, inna ważna aktywność sieciowa, taka jak długoterminowe wzmocnienie, może być również badana z niespotykaną rozdzielczością przestrzenną za pomocą systemów CMOS-HD-MEA. Mamy nadzieję, że ten protokół i technologia zostaną wdrożone, aby pomóc innym w tej dziedzinie przezwyciężyć wyzwania związane z gromadzeniem danych i opracować bardziej precyzyjne metody badawcze w celu zrozumienia różnych zaburzeń neurologicznych, takich jak padaczka.

Komercyjnie dostępne systemy matryc mikroelektrod o wysokiej gęstości (HD-MEA), które zawierają układ MEA z tysiącami punktów zapisu1,2 oraz platforma MEA do wzmacniania i digitalizacji danych, są nowym narzędziem do badań elektrofizjologicznych. Te systemy HD-MEA wykorzystują komplementarną technologię półprzewodników metal-tlenek-półprzewodnik (CMOS) do rejestrowania danych elektrofizjologicznych z wysoką czułością z hodowli komórkowych i preparatów ex vivo wycinków mózgu. Te systemy MEA zapewniają bezprecedensową rozdzielczość przestrzenną i czasową dla badań neurofizjologicznych dzięki wysokiej gęstości elektrod i wysokiej jakości stosunkom sygnału do szumu3. Technologia ta była najczęściej wykorzystywana do badania zewnątrzkomórkowych potencjałów czynnościowych, ale może również wychwytywać wysokiej jakości lokalne potencjały pola (LFP) z różnych preparatów neuronalnych wycinków mózgu4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Dzięki wyżej wspomnianym możliwościom nagrywania w wysokiej rozdzielczości systemów CMOS-HD-MEA, użytkownicy mogą śledzić aktywność elektrofizjologiczną z dużą dokładnością przestrzenną16,17,18. Ta funkcja jest szczególnie istotna do śledzenia wzorców propagacji sieci LFPs5,12,15,19,20,21. W związku z tym systemy CMOS-HD-MEA mogą zapewnić bezprecedensowe zrozumienie wzorców propagacji aktywności fizjologicznej i patologicznej z różnych kultur komórkowych i preparatów do wycinków mózgu. Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że możliwości systemów CMOS-HD-MEA mogą pozwolić naukowcom na jednoczesne porównywanie wzorców napadów padaczkowych w różnych regionach mózgu i badanie, w jaki sposób różne związki przeciwpadaczkowe wpływają na te wzorce. W ten sposób zapewnia innowacyjną metodę badania iktogenezy i propagacji ictal oraz zrozumienia, w jaki sposób farmakologia zakłóca patologiczną aktywność sieci7,10,14. W związku z tym te nowatorskie możliwości systemów CMOS-HD-MEA mogą znacząco przyczynić się do badań nad zaburzeniami neurologicznymi, a także pomóc w badaniach nad odkrywaniem leków5,7,11,22. Naszym celem jest dostarczenie szczegółowych informacji na temat wykorzystania systemów CMOS-HD-MEA do badania aktywności podobnej do napadów padaczkowych.
Podczas korzystania z systemów CMOS-HD-MEA do badania LFP, takich jak aktywność epileptiform w ostrych wycinkach mózgu, użytkownicy mogą napotkać wiele wyzwań, w tym paraliżujący szum elektryczny, utrzymanie wycinka w zdrowiu podczas eksperymentów i wykrywanie sygnału jakości z dwuwymiarowego (2D) CMOS-MEA chipa, który nagrywa tylko z powierzchni wycinka mózgu. Protokół ten opisuje podstawowe kroki prawidłowego uziemienia platformy MEA i innego sprzętu używanego w eksperymentach, kluczowy krok, który może wymagać indywidualnego dostosowania dla każdej konfiguracji laboratorium. Ponadto omawiamy kroki, które pomogą w utrzymaniu zdrowego wycinka mózgu podczas długich nagrań w zanurzonych komorach używanych z systemami CMOS-HD-MEA23,24,25. Dodatkowo, w przeciwieństwie do bardziej powszechnych metod zapisu elektrofizjologicznego, które nagrywają z głębi wycinka mózgu, większość systemów CMOS-HD-MEA wykorzystuje chipy 2D, które nie wnikają w wycinek. Dlatego systemy te wymagają zdrowej zewnętrznej warstwy neuronalnej do wytworzenia większości zarejestrowanych sygnałów LFP. Inne wyzwania obejmują wizualizację ogromnej ilości danych generowanych przez tysiące elektrod. Aby przezwyciężyć te wyzwania, zalecamy prosty, ale skuteczny protokół, który zwiększa prawdopodobieństwo osiągnięcia wysokiej jakości sieciowej aktywności padaczkowej, która rozprzestrzenia się w całym wycinku mózgu. Zamieszczamy również krótki opis publicznie dostępnego graficznego interfejsu użytkownika (GUI), który opracowaliśmy wraz z powiązanymi zasobami, aby pomóc w wizualizacji danych10.
Poprzednie publikacje zawierały powiązane protokoły do korzystania z systemów zapisu MEA26,27,28,29. Jednak praca ta ma na celu pomóc eksperymentatorom korzystającym z systemów CMOS-HD-MEA z chipami 2D, w szczególności tym, którzy chcą badać wysokiej jakości aktywność padaczkową z wycinków mózgu. Ponadto porównujemy dwie z najczęstszych manipulacji roztworami w celu indukcji aktywności podobnej do napadów, a mianowicie paradygmaty 0 Mg2+ i 4-AP, aby pomóc użytkownikom zidentyfikować najbardziej odpowiednie media drgawkowe dla ich konkretnego zastosowania. Chociaż protokół koncentruje się przede wszystkim na generowaniu aktywności podobnej do napadów, może być modyfikowany w celu zbadania innych zjawisk elektrofizjologicznych za pomocą wycinków mózgu.

<table><tbody><tr><td>Stół warsztatowy 2D</td><td>Cloudray</td><td>LM04CLLD26B</td><td></td></tr><tr><td>4-aminopirydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>275875</td><td></td></tr><tr><td>Accura Chip</td><td>3Brain</td><td>Układ Accura HD-MEA</td><td>CMOS-HD-MEA</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>Stół wibroizolacyjny</td><td>Kinetic Systems</td><td>91010124</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka do komora na plastry, 270 ml</td><td>VWR</td><td>10754-772</td><td></td></tr><tr><td>Platforma BioCam</td><td>3Brain</td><td>BioCAM DupleX</td><td>CMOS-HD-MEA</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Brainwave</td><td>3Brain</td><td>Wersja 4</td><td>Oprogramowanie CMOS-HD-MEA</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>X02OX95C2003102</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>12005</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen Stones</td><td>Supelco</td><td>59277</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna</td><td>kompresja</td><td>VF-300-0Z</td><td></td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Dell</td><td>Precission3650</td><td></td></tr><tr><td>uziemiające z zaciskiem krokodylkowym</td><td>JWQIDI</td><td>B06WGZG17W</td><td></td></tr><tr><td>Detergent</td><td>Metrex</td><td>10-4100-0000</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4912-12</td><td></td></tr><tr><td>Diwodór Fosforan sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP329-500</td><td></td></tr><tr><td>DinoCam</td><td>Dino-Lite</td><td>AM73915MZTL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A407P-4</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11980-13</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SP88857200</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do lodu</td><td>Hoshizaki</td><td>F801MWH</td><td></td></tr><tr><td>Igły doprowadzające i odpływowe</td><td>Jensen Global</td><td>JG 18-3.0X</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewacz roztworu liniowego</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Izofluor</td><td>Dechra</td><td>08PB-STE22002-0122</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Magnez Mikropipety Chloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FLM33500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gilson</td><td>F144069</td><td></td></tr><tr><td>Mili-Q Filtr do wody</td><td>Mili-Q</td><td>ZR0Q008WW</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td>Daler Rowney</td><td>AF85 Okrągły: 0</td><td></td></tr><tr><td>Filtr papierowy</td><td>Whatman</td><td>EW-06648-24</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American National Puszka</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>System perfuzyjny</td><td>System wielokanałowy</td><td>Pipetor PPS2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Harp</td><td>3Brain</td><td>3Brain</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P330-3</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Personna</td><td>BP9020</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>Metter Toledo</td><td>AB204</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Solingen</td><td>92008</td><td></td></tr><tr><td>Komora do przechowywania plastrów</td><td>Niestandardowy</td><td></td><td>niestandardowy projekt drukarki 3D, dostępny na żądanie</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>7412-06</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka kontrolna temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>TC344B</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Genesee Scientific</td><td>30-200</td><td></td></tr><tr><td>Rurka</td><td>Tygon</td><td>B-44-3</td> Wibratom TPE <td></td></tr><tr><td>VZ-300</td><td>Precyzyjna</td><td>VF-00-VM-NC</td><td></td></tr><tr><td>Łódź do ważenia</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>70040</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem

High-Quality Seizure-Like Activity from Acute Brain Slices Using a Complementary Metal-Oxide-Semiconductor High-Density Microelectrode Array System

Komplementarne układy mikroelektrod o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEA) mogą rejestrować aktywność neurofizjologiczną z kultur komórkowych i wycinków mózgu ex vivo z niespotykanymi dotąd szczegółami elektrofizjologicznymi. CMOS-HD-MEA zostały najpierw zoptymalizowane pod kątem rejestrowania wysokiej jakości aktywności jednostek neuronalnych z hodowli komórkowych, ale wykazano również, że dostarczają wysokiej jakości danych z ostrych wycinków siatkówki i móżdżku. Naukowcy wykorzystali ostatnio CMOS-HD-MEA do rejestrowania lokalnych potencjałów pola (LFP) z ostrych, korowych wycinków mózgu gryzoni. Jednym z interesujących LFP jest aktywność podobna do napadów. Podczas gdy wielu użytkowników wytwarzało krótkie, spontaniczne wyładowania padaczkowe za pomocą CMOS-HD-MEA, niewielu użytkowników niezawodnie wytwarza wysokiej jakości aktywność podobną do napadów. Wiele czynników może przyczyniać się do tej trudności, w tym szum elektryczny, niespójny charakter wytwarzania aktywności podobnej do napadów padaczkowych podczas korzystania z zanurzonych komór nagraniowych oraz ograniczenie, że chipy 2D CMOS-MEA nagrywają tylko z powierzchni wycinka mózgu. Techniki wyszczególnione w tym protokole powinny umożliwić użytkownikom konsekwentne wywoływanie i rejestrowanie wysokiej jakości aktywności podobnej do napadu padaczkowego z ostrych wycinków mózgu za pomocą systemu CMOS-HD-MEA. Ponadto protokół ten określa prawidłowe traktowanie chipów CMOS-HD-MEA, zarządzanie roztworami i wycinkami mózgu podczas eksperymentów oraz konserwację sprzętu.

Jak to jest standardem przy wizualizacji aktywności z wielu kanałów1,4,5,10, uważamy, że korzystne jest najpierw wygenerowanie wykresu rastrowego danych, które pozyskujemy za pomocą CMOS-HD-MEA (Rysunek 4A,C,E). Ten wykres może stworzyć widok z lotu ptaka na aktywność we wszystkich kanałach rejestrujących w każdym wycinku mózgu, wyświetlając każdy kanał na osi y, a czas na osi x. Na tym wykresie rastrowym każdy punkt sygnału reprezentuje kanał, który przekroczył ustawiony próg napięcia LFP (patrz krok 5.2.6 i poprzednio opublikowany work10). Takie wykresy rastrowe wskazują, kiedy i gdzie zachodzi aktywność elektrofizjologiczna w przestrzeni i czasie (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A,C,E). Wizualizacja danych w ten sposób pozwala użytkownikowi w pełni wykorzystać możliwości systemu CMOS-HD-MEA w zakresie rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Reprezentatywne ślady kory nowej i hipokampa z kanałów odpowiadających wykresom rastrowym pokazują, w jaki sposób można również wizualizować określone dane LFP dla każdego kanału (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B, D, F). Powiększone zdarzenia wyładowań padaczkowych są wyświetlane dla różnych regionów mózgu i paradygmatów w <silna klasa="xfig">Rysunek 5, a porównanie względnych mocy częstotliwości, które zaobserwowaliśmy na podstawie paradygmatów 0 Mg2+ i 4-AP, podsumowano w <silna klasa="xfig">Rysunek 6. We wszystkich wyświetlanych pasmach częstotliwości (1-150 Hz) aktywność podobna do napadów zarówno w regionach hipokampa, jak i kory nowej przy obu paradygmatach była znacznie większa niż wartość wyjściowa, po odjęciu wszystkich szumów elektrycznych 60 Hz (częstotliwość AC w Ameryce Północnej) za pomocą cyfrowego filtra wycinającego.
Podczas korzystania z paradygmatu 0 Mg2+ lub 4-AP, często obserwowano silną aktywność podobną do napadu elektrograficznego w obszarach kory nowej. Regiony hipokampa wykazywały większą zmienność między wycinkami mózgu, przy czym niektóre fragmenty mózgu wykazywały aktywność podobną do napadów, a inne wykazywały krótsze (~1 s) przejściowe wyładowania (<silna klasa="xfig">Rycina 4 i <silna klasa="xfig">Rycina 5). Moc dla każdego nagrania została znormalizowana do 10-sekundowej "cichej" sekcji podstawowej na początku każdego nagrania, w której nie zaobserwowano żadnych wyładowań. Cała dalsza dyskusja na temat "mocy" oznacza moc widmową w porównaniu z kontrolną linią bazową w próbie. Stwierdzono, że aktywność kory nowej jest silniejsza w wielu pasmach częstotliwości w paradygmacie 0 Mg2+ w porównaniu z paradygmatem 4-AP. Dotyczyło to pasm częstotliwości delta (1-4 Hz), theta (4-8 Hz), niskiej gamma (30-60 Hz) i wysokiej gamma (60-150 Hz) (<klasa silna="xfig">Rysunek 6). Ponadto aktywność hipokampa w paradygmacie 0 Mg2+ wykazała wyższą moc w pasmach częstotliwości wysokiego pasma gamma (60-150 Hz) w porównaniu z korą nową w paradygmacie 0 Mg2+, a także w porównaniu z obydwoma regionami mózgu testowanymi w paradygmacie 4-AP (<klasa silna = "xfig">Ryc. 6). Chociaż paradygmat 4-AP wykazywał mniejszą moc w większości pasm częstotliwości w naszych badaniach, w porównaniu z warunkami 0 Mg2+, próbki hipokampa 4-AP wykazywały tendencję do wykazywania bardziej ogólnych wyładowań padaczkowych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4D). Nie zaobserwowaliśmy żadnej różnicy między regionami mózgu lub paradygmatami podczas analizy aktywności o wysokiej częstotliwości (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B). Jest to prawdopodobne, ponieważ nagrania są wykonywane na dwuwymiarowym, niepenetrującym chipie rejestrującym, co oznacza, że aktywność o wysokiej częstotliwości może nie zostać wychwycona ze względu na odległość między neuronami wytwarzającymi aktywność a miejscami rejestracji elektrod. Podsumowując, przedstawione tutaj wyniki sugerują, że przy użyciu systemów CMOS-HD-MEA z układami 2D CMOS-MEA, generalnie osiąga się większą moc ogólną podczas wyładowań padaczkowych przy użyciu paradygmatu 0 Mg2+, gdzie dane o jakości mogą być rejestrowane do wysokich pasm gamma (od 1 do 150 Hz). Ponadto przedstawione tutaj dane sugerują, że model 4-AP może nie być dobrym wyborem dla tego systemu, jeśli ktoś chce badać informacje z pasm gamma za pomocą tego protokołu. Dostarcza jednak bogatych danych w niższych pasmach mocy, jednocześnie wyświetlając wiele wyładowań padaczkowych. Co ważne, oba modele będą wykazywać wysokiej jakości aktywność podobną do napadu padaczkowego z powyższym protokołem.
Różnice w modelach napadów prawdopodobnie skutkują charakterystycznie unikalnymi wzorcami indukowanej aktywności podobnej do napadu, opartymi na mechanizmach komórkowych tych paradygmatów i ze względu na mikroanatomię regionu mózgu41. Na przykład, 4-AP blokuje pewne klasy kanałów K+ bramkowanych napięciem (głównie rodzinę Kv3), wydłużając czas pobudliwości neuronów i powodując początek aktywności padaczkowej w ciągu kilku minut od ekspozycji w obrębie hipokampa42,43,44,45,46. Jednak kora nowa zazwyczaj ma znacznie opóźniony początek aktywności padaczkowej niż hipokamp po wystawieniu na działanie 4-AP41. Z drugiej strony, paradygmat 0 Mg2+ indukuje aktywność padaczkową głównie poprzez wypłukiwanie bloku Mg2+ receptorów NMDA w neuronach glutaminergicznym, co skutkuje wczesną aktywnością padaczkowatą kory nowej47,48,49,50. Chociaż w wielu z wyróżnionych grup istniały znaczące różnice między regionami mózgu i paradygmatami, pozostały również pewne kluczowe podobieństwa między paradygmatami a regionami mózgu. Moc zarówno w pasmach częstotliwości alfa, jak i beta była porównywalna we wszystkich regionach mózgu i paradygmatach, a w regionach hipokampa paradygmaty wykazały podobną wydajność w paśmie delta (<silna klasa = "xfig">Ryc. 6). Dodatkowo, zgodnie z oczekiwaniami, ogólny wzrost mocy w porównaniu z wartością wyjściową dla wszystkich częstotliwości (1-150 Hz) zaobserwowano podczas aktywności padaczkowej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5 i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 6). Ostatnią godną uwagi obserwacją obszarów kory nowej podczas ekspozycji na 4-AP był prążkowany wzór obserwowany na spektrogramach przedstawiający większą aktywność dla wyższych częstotliwości podczas początku ictal, po którym następował stopniowy spadek częstotliwości w miarę postępu aktywności (<silna klasa = "xfig">Figura 5C), co może sugerować wysoką synchronizację międzyneuronalną podczas początku ictal.

Tutaj przedstawiamy protokół użycia komplementarnych systemów układów mikroelektrod o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEAs) do rejestrowania aktywności podobnej do napadu z wycinków mózgu ex vivo.

Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem

Complementary metal-oxide-semiconductor high-density microelectrode array (CMOS-HD-MEA) systems can record neurophysiological activity from cell cultures ...

W laboratorium Parrisha zależy nam na zrozumieniu, w jaki sposób napady rozpoczynają się, rozprzestrzeniają i kończą. Jesteśmy szczególnie zainteresowani badaniem nowych terapii stanu padaczkowego, stanu zagrażającego życiu, w którym napad nie usta samoistnie. W naszych badaniach wykorzystujemy systemy matryc mikroelektrod o wysokiej gęstości firmy CMA.Te zaawansowane technologie pozwalają nam rejestrować dane elektrofizjologiczne o wysokiej rozdzielczości z wycinków mózgu, rejestrując szczegółowe lokalne potencjały pola. Pomaga nam to zrozumieć złożone czynności mózgu, takie jak wzorce napadów, z dużą precyzją przestrzenną i czasową. W przyszłości planujemy zbadać przestrzenne i czasowe wzorce rozprzestrzeniania się stanu padaczkowego, przedłużonego stanu napadowego, który często staje się oporny na leki przeciwpadaczkowe.Planujemy wykorzystać informacje z tych badań w celu znalezienia skuteczniejszych metod leczenia stanu padaczkowego. Przed przystąpieniem do przygotowywania wiórów należy wyznaczyć pipety transferowe do różnych zadań. Napełnij studzienkę układu mikroelektrod lub chipa MEA etanolem o próbie 190 procent, tak aby dno studzienki chipa było całkowicie zakryte.Pozostaw etanol na 30 do 60 sekund, a następnie usuń go za pomocą pipety. Napełnij studzienkę chipa MEA ACSF i wyjmij ją pipetą, aby wypłukać resztki etanolu z dołka chipa. Następnie dodaj ACSF i odstaw na co najmniej 30 sekund.Przed zadokowaniem chipa MEA za pomocą antystatycznej chusteczki z 190-procentowym etanolem i użyciem go do wytarcia pinów chipa, delikatnie wsuń chip MEA na platformę MEA i włącz mechanizm dokujący, aby zablokować chip na miejscu. Sprawdź, czy na elektrodach rejestrujących i referencyjnych nie ma pęcherzyków. Jeśli obecne są bąbelki, weź czysty pędzel i delikatnie przeciągnij po elektrodach, aby je usunąć.Sprawdź chip pod kątem szumów za pomocą oprogramowania HDMEA CMOS i wizualnie zeskanuj mapę fałszywych kolorów w poszukiwaniu pęcherzyków, niebiologicznych oscylacji lub skoków spowodowanych zakłóceniami elektrycznymi. Odpowiednio uziemić system MEA, aby zniwelować napotkany hałas. Na początek umieść platynową harfę w łodzi do ważenia w pobliżu platformy MEA.Następnie przykryj harfę około trzema mililitrami ACSF, aby zmniejszyć jej tendencje hydrofobowe. Użyj nożyczek, aby przyciąć około 1.5 cala od wąskiej końcówki pipety transferowej. Następnie użyj zmodyfikowanej pipety, aby pobrać wycinek mózgu z komory na plasterki.Delikatnie dozuj plasterek mózgu i dowolny roztwór z pipety do dołka na chip. Aby prawidłowo ustawić plasterek, użyj miękkiego pędzla, aby wytworzyć prąd w roztworze, który popycha plasterek mózgu na elektrody rejestrujące. Za pomocą kleszczy delikatnie umieść harfę na wycinku mózgu nitkami w dół, aby docisnąć plasterek do elektrod nagrywających.Ustaw harfę tak, aby strona bez ramki była skierowana w stronę igły dopływowej, a rama harfy nie stykała się z żadną z elektrod nagrywających. Teraz weź pipetę do wyrzucenia i usuń XSACSF. Następnie weź chusteczkę antystatyczną, przekręć róg, aby utworzyć końcówkę, i użyj jej, aby wchłonąć pozostały ACSF otaczający elektrody nagrywające, nie dotykając elektrod nagrywających, wycinka mózgu lub harfy.Używając przeznaczonej do tego pipety ACSF, szybko dodaj około dwóch mililitrów karbogenicznego ACSF, aby pokryć wycinek mózgu. Napełnij studzienkę około trzema mililitrami karbogenicznego ACSF, aż będzie wypełniona w około trzech czwartych. Następnie użyj mikroskopu lub kamery, aby zrobić zdjęcie w wysokiej rozdzielczości wycinka mózgu na chipie MEA.Umieścić rurki doprowadzające i odpływowe w zlewce wypełnionej ACSF. Umieść igłę dopływową blisko dna studzienki chipowej, tuż poza elektrodami rejestrującymi. Następnie umieść igłę odpływową blisko górnej części studni wiórowej w kierunku krawędzi, tak aby ciecz uniosła się prawie do brzegu studzienki chipa, około czterech mililitrów.Teraz ustaw dopływ perfuzji na pięć mililitrów na minutę, a odpływ perfuzji na siedem mililitrów na minutę. Włącz dopływ i odpływ. Wyjmij igłę dopływową ze studzienki wióra, aż zacznie wypuszczać roztwór zamiast powietrza.Następnie umieść igłę z powrotem w chipie. Następnie użyj podgrzewacza roztworu, aby utrzymać roztwór w temperaturze fizjologicznej lub zbliżonej do temperatury fizjologicznej około 34 do 37 stopni Celsjusza. Pozwól ACSF przenikać przez plasterek mózgu przez 10 minut.Po upływie 10 minut przesunąć rurkę odpływową do zlewki do odrzutów. Następnie przesunąć rurkę dopływową do zlewki zawierającej roztwór prodrgawkowy. Pozostawić niedrgawkowy ACSF do wypłukania z systemu profuzji do zlewki na 10 minut.Na koniec przenieś rurkę odpływową do zlewki zawierającej roztwór prodrgawkowy i pozwól jej krążyć aż do zakończenia eksperymentu. Silna aktywność elektrograficzna podobna do napadów była często obserwowana w regionach kory nowej zarówno w paradygmacie zerowego magnezu, jak i 4-aminopuryny. Regiony hipokampa wykazywały większą zmienność między wycinkami mózgu, przy czym niektóre wykazywały aktywność podobną do napadów, a inne wykazywały przejściowe wyładowania.Aktywność kory nowej w paradygmacie zerowego magnezu wykazała wyższą moc w wielu pasmach częstotliwości w porównaniu z paradygmatem 4-aminopuryny. Aktywność hipokampa w paradygmacie zerowego magnezu wykazała wyższą moc w pasmach częstotliwości wysokiego promieniowania gamma w porównaniu z korą nową w obu regionach mózgu w paradygmacie 4-aminopuryny.

high-quality-seizure-like-activity-from-acute-brain-slices-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten protokół polega na użyciu układu mikroelektrod (MEA) do rejestrowania aktywności elektrycznej w wycinku mózgu wystawionym na działanie leku wywołującego drgawki. Procedura obejmuje umieszczenie wycinka mózgu w komorze rejestracyjnej MEA, zastosowanie stymulacji elektrycznej w celu wywołania sztucznych napadów i analizę uzyskanych sygnałów.

Monitorowanie aktywności elektrycznej neuronów wywołanej napadami padaczkowymi w wycinkach mózgu za pomocą układów mikroelektrod

W tym filmie badane są efekty przezczaszkowej stymulacji prądem stałym (tDCS) na wycinki mózgu zawierające przednią korę obręczy (ACC) i obszary wzgórza, używając matrycy wieloelektrodowej (MEA) do pomiaru sygnałów elektrycznych. Dostarczając impulsy elektryczne i podając leki wywołujące napady, badanie bada odpowiedź ACC na napady.

Monitorowanie kory mózgowej za pomocą układu wieloelektrodowego w odpowiedzi na czynniki wywołujące napady

Tutaj opisujemy, jak wykonywać zapisy wieloelektrodowe tkanki ludzkiej kory padaczkowej. Szczegółowo zademonstrowano resekcję tkanki padaczkowej, przygotowanie plastrów i zapisy wieloelektrodowe zdarzeń międzynapadowych i ictalowych.

Wieloelektrodowe zapisy pooperacyjnej tkanki korowej ludzkiego epilepsji

Badania wykazały, że katodowa przezczaszkowa stymulacja prądem stałym może powodować efekt tłumiący napady oporne na leki. W tym badaniu opracowano konfigurację eksperymentalną in vitro, w której oceniano stymulację prądem stałym i rejestrację wieloelektrodową aktywności podobnej do napadu w przygotowaniu wycinków mózgu myszy. Ocenie poddano parametry stymulacji prądem stałym.

Stymulacja prądem stałym i wieloelektrodowa rejestracja aktywności podobnej do napadów w przygotowaniu do wycinka mózgu myszy

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

W niniejszym artykule omówiono metody, które można wykorzystać do określenia funkcji okołodobowej oraz reaktywności na światło u myszy.

Pomiar reakcji okołodobowych i ostrych na światło u myszy z wykorzystaniem aktywności w kołowrotku

W niniejszym artykule opisano procedurę chirurgiczną oraz wskazówki dotyczące obsługi związane z implantacją ultrasciennej macierzy mikroelektrod na bazie poliimidu (PBM-array) na czaszkę myszy w celu rejestracji wysokiej gęstości encefalografii (EEG) w modelu mysim.

Rejestracja EEG o wysokiej gęstości u swobodnie poruszających się myszy z wykorzystaniem mikroelektrod na bazie poliamidu

Korzystając z kamery internetowej oraz kombinacji darmowych i niedrogich programów, wzorce lokomotyw u Drosophila melanogaster mogą być analizowane w celu wykrycia różnic w prędkości, odległości i czasie różnych aktywności motorycznych.

Tania metoda analizy aktywności i ruchu podobnego do napadów u Drosophila

Ten artykuł wideo opisuje eksperymentalne procedury badania długoterminowej plastyczności i jej procesów asocjacyjnych, takich jak znakowanie synaptyczne, przechwytywanie i krzyżowanie w neuronach piramidowych CA1 przy użyciu ostrych wycinków hipokampa od gryzoni.

Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Poznaj metodę rejestracji aktywności napadów z ostrych wycinków mózgu przy użyciu układów CMOS-HD-MEAs. Technika ta umożliwia szczegółową analizę przestrzenną i czasową padaczki, wspierając rozwój nowych terapii dla stanu padaczkowego.

Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem (Wideo) | JoVE Journal

Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem

Przeglądaj więcej filmów