Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem
September 27th, 2024
Tutaj przedstawiamy protokół użycia komplementarnych systemów układów mikroelektrod o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEAs) do rejestrowania aktywności podobnej do napadu z wycinków mózgu ex vivo.
W laboratorium Parrisha zależy nam na zrozumieniu, w jaki sposób napady rozpoczynają się, rozprzestrzeniają i kończą. Jesteśmy szczególnie zainteresowani badaniem nowych terapii stanu padaczkowego, stanu zagrażającego życiu, w którym napad nie usta samoistnie. W naszych badaniach wykorzystujemy systemy matryc mikroelektrod o wysokiej gęstości firmy CMA.
Te zaawansowane technologie pozwalają nam rejestrować dane elektrofizjologiczne o wysokiej rozdzielczości z wycinków mózgu, rejestrując szczegółowe lokalne potencjały pola. Pomaga nam to zrozumieć złożone czynności mózgu, takie jak wzorce napadów, z dużą precyzją przestrzenną i czasową. W przyszłości planujemy zbadać przestrzenne i czasowe wzorce rozprzestrzeniania się stanu padaczkowego, przedłużonego stanu napadowego, który często staje się oporny na leki przeciwpadaczkowe.
Planujemy wykorzystać informacje z tych badań w celu znalezienia skuteczniejszych metod leczenia stanu padaczkowego. Przed przystąpieniem do przygotowywania wiórów należy wyznaczyć pipety transferowe do różnych zadań. Napełnij studzienkę układu mikroelektrod lub chipa MEA etanolem o próbie 190 procent, tak aby dno studzienki chipa było całkowicie zakryte.
Pozostaw etanol na 30 do 60 sekund, a następnie usuń go za pomocą pipety. Napełnij studzienkę chipa MEA ACSF i wyjmij ją pipetą, aby wypłukać resztki etanolu z dołka chipa. Następnie dodaj ACSF i odstaw na co najmniej 30 sekund.
Przed zadokowaniem chipa MEA za pomocą antystatycznej chusteczki z 190-procentowym etanolem i użyciem go do wytarcia pinów chipa, delikatnie wsuń chip MEA na platformę MEA i włącz mechanizm dokujący, aby zablokować chip na miejscu. Sprawdź, czy na elektrodach rejestrujących i referencyjnych nie ma pęcherzyków. Jeśli obecne są bąbelki, weź czysty pędzel i delikatnie przeciągnij po elektrodach, aby je usunąć.
Sprawdź chip pod kątem szumów za pomocą oprogramowania HDMEA CMOS i wizualnie zeskanuj mapę fałszywych kolorów w poszukiwaniu pęcherzyków, niebiologicznych oscylacji lub skoków spowodowanych zakłóceniami elektrycznymi. Odpowiednio uziemić system MEA, aby zniwelować napotkany hałas. Na początek umieść platynową harfę w łodzi do ważenia w pobliżu platformy MEA.
Następnie przykryj harfę około trzema mililitrami ACSF, aby zmniejszyć jej tendencje hydrofobowe. Użyj nożyczek, aby przyciąć około 1.5 cala od wąskiej końcówki pipety transferowej. Następnie użyj zmodyfikowanej pipety, aby pobrać wycinek mózgu z komory na plasterki.
Delikatnie dozuj plasterek mózgu i dowolny roztwór z pipety do dołka na chip. Aby prawidłowo ustawić plasterek, użyj miękkiego pędzla, aby wytworzyć prąd w roztworze, który popycha plasterek mózgu na elektrody rejestrujące. Za pomocą kleszczy delikatnie umieść harfę na wycinku mózgu nitkami w dół, aby docisnąć plasterek do elektrod nagrywających.
Ustaw harfę tak, aby strona bez ramki była skierowana w stronę igły dopływowej, a rama harfy nie stykała się z żadną z elektrod nagrywających. Teraz weź pipetę do wyrzucenia i usuń XSACSF. Następnie weź chusteczkę antystatyczną, przekręć róg, aby utworzyć końcówkę, i użyj jej, aby wchłonąć pozostały ACSF otaczający elektrody nagrywające, nie dotykając elektrod nagrywających, wycinka mózgu lub harfy.
Używając przeznaczonej do tego pipety ACSF, szybko dodaj około dwóch mililitrów karbogenicznego ACSF, aby pokryć wycinek mózgu. Napełnij studzienkę około trzema mililitrami karbogenicznego ACSF, aż będzie wypełniona w około trzech czwartych. Następnie użyj mikroskopu lub kamery, aby zrobić zdjęcie w wysokiej rozdzielczości wycinka mózgu na chipie MEA.
Umieścić rurki doprowadzające i odpływowe w zlewce wypełnionej ACSF. Umieść igłę dopływową blisko dna studzienki chipowej, tuż poza elektrodami rejestrującymi. Następnie umieść igłę odpływową blisko górnej części studni wiórowej w kierunku krawędzi, tak aby ciecz uniosła się prawie do brzegu studzienki chipa, około czterech mililitrów.
Teraz ustaw dopływ perfuzji na pięć mililitrów na minutę, a odpływ perfuzji na siedem mililitrów na minutę. Włącz dopływ i odpływ. Wyjmij igłę dopływową ze studzienki wióra, aż zacznie wypuszczać roztwór zamiast powietrza.
Następnie umieść igłę z powrotem w chipie. Następnie użyj podgrzewacza roztworu, aby utrzymać roztwór w temperaturze fizjologicznej lub zbliżonej do temperatury fizjologicznej około 34 do 37 stopni Celsjusza. Pozwól ACSF przenikać przez plasterek mózgu przez 10 minut.
Po upływie 10 minut przesunąć rurkę odpływową do zlewki do odrzutów. Następnie przesunąć rurkę dopływową do zlewki zawierającej roztwór prodrgawkowy. Pozostawić niedrgawkowy ACSF do wypłukania z systemu profuzji do zlewki na 10 minut.
Na koniec przenieś rurkę odpływową do zlewki zawierającej roztwór prodrgawkowy i pozwól jej krążyć aż do zakończenia eksperymentu. Silna aktywność elektrograficzna podobna do napadów była często obserwowana w regionach kory nowej zarówno w paradygmacie zerowego magnezu, jak i 4-aminopuryny. Regiony hipokampa wykazywały większą zmienność między wycinkami mózgu, przy czym niektóre wykazywały aktywność podobną do napadów, a inne wykazywały przejściowe wyładowania.
Aktywność kory nowej w paradygmacie zerowego magnezu wykazała wyższą moc w wielu pasmach częstotliwości w porównaniu z paradygmatem 4-aminopuryny. Aktywność hipokampa w paradygmacie zerowego magnezu wykazała wyższą moc w pasmach częstotliwości wysokiego promieniowania gamma w porównaniu z korą nową w obu regionach mózgu w paradygmacie 4-aminopuryny.
Przegląd
To badanie opisuje protokół stosowania uzupełniających układów mikroelektrodowych z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEAs) do badania aktywności przypominającej napady z eks vivo kromek mózgu. Badanie ma na celu poprawę rozumienia inicjacji, propagacji i zakończenia napadów, ze skupieniem na opracowaniu nowych terapii dla stanu padaczkowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Elektrofizjologia
- Padaczka
Tło
- Napady mogą mieć złożone mechanizmy inicjacji i propagacji.
- Stan padaczkowy jest krytycznym stanem, który często opiera się na leczeniu.
- Mikroelektrodowe układy o wysokiej gęstości dostarczają szczegółowych danych elektrofizjologicznych.
- Różne paradygmaty oferują wgląd w dynamikę aktywności przypominającej napad.
Cel badania
- Ustanowić niezawodny protokół rejestracji aktywności napadu.
- Zbadać przestrzenne i czasowe wzorce stanu padaczkowego.
- Informacje na temat opracowania skuteczniejszych terapii dla ciężkich napadów.
Zastosowane metody
- Główną platformą używaną są CMOS-HD-MEAs z eks vivo kromkami mózgu.
- Kromki mózgu są poddawane różnym paradygmatom leczenia w celu zbadania aktywności przypominającej napad.
- Dostarczane są szczegółowe kroki przygotowania i utrzymania dla optymalnych rejestracji.
- Protokół obejmuje kroki przygotowania mikroelektrodowego układu i zapewnienia odpowiednich warunków środowiskowych.
- Zapobiega się aktywności elektrofizjologicznej w celu analizy cech napadów.
Główne wyniki
- Regiony neokorteksu wykazują znaczącą aktywność przypominającą napad w określonych warunkach.
- Regiony hipokampu wykazywały zmienność w aktywności przypominającej napad.
- Różne paradygmaty ujawniły odrębne dynamiki mocy w częstościach napadów.
Wnioski
- To badanie ułatwia głębsze zrozumienie mechanizmów napadów przy użyciu zaawansowanej technologii.
- Wyniki mogą przyczynić się do zidentyfikowania nowych docelowych terapii dla leczenia padaczki.
- Badanie podkreśla znaczenie analizy przestrzennej i czasowej w zrozumieniu aktywności napadów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-density CMOS microelectrode array systems enable unprecedented spatial and temporal resolution for ex vivo seizure-like activity mapping, directly supporting mechanistic de-risking in early CNS drug discovery. This platform provides quantitative, reproducible electrophysiological data critical for target validation and predictive confidence in epilepsy and neurotherapeutic pipelines. Reliable induction and measurement of seizure-like events in acute brain slices facilitate risk-adjusted advancement decisions for novel anti-epileptic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of seizure initiation, propagation, and termination mechanisms in disease-relevant brain tissue.
- Supports functional target validation by quantifying local field potential changes under controlled paradigms.
- Provides mechanistic de-risking for candidate targets implicated in epileptogenesis and status epilepticus.
- Facilitates predictive confidence for portfolio triage in CNS therapeutic programs.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-resolution electrophysiological readouts for assay development in seizure models.
- Enables reproducible induction of seizure-like activity for compound screening and comparative analysis.
- Supports quantitative assessment of pharmacological modulation in acute brain slice systems.
- Prepares validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ex vivo seizure models with translational biomarker strategies for CNS disorders.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of anti-epileptic interventions.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative seizure metrics.
- Supports predictive de-risking for late-stage candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation for CNS drug development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for seizure mechanisms in acute brain slices.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and quantitative electrophysiological outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables high-content measurement of local field potentials and seizure frequency bands for comparative analytics.
- Translational Research: Bridges ex vivo findings to in vivo and clinical biomarker strategies in epilepsy research.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized platform for CNS electrophysiology across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in seizure research.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible electrophysiological assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of neurotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology and acute brain slice preparation.
- Demands access to high-density CMOS-MEA instrumentation and analytical software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility and data quality.
- May require adaptation for different brain regions or disease models.
- Consistent induction of seizure-like activity can be limited by slice variability and chamber configuration.
