Name: Zestaw hybrydowy i test jednocząsteczkowy do obrazowania ruchu w pełni odtworzonego CMG (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj hybrydowy zestaw do badania dynamiki ruchu helikazy CMG na DNA z wykorzystaniem biochemii zespołowej i obrazowania jednocząsteczkowego. Ta metoda umożliwia ilościową analizę mechanizmów replikacji DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Anne Early, Lucy Drury, i Maxowi Douglasowi za dostarczenie szczepów drożdży do nadekspresji nieznakowanych białek, a także członkom laboratorium N.D. Anuj Kumar, Katinka Ligthart i Julien Gros za pomoc w oczyszczaniu czynników obciążających i DDK. Autorzy dziękują również Kaley McCluskey, Dorianowi Mikołajczakowi, Josephowi Yeelesowi, Jacobowi Lewisowi, Alessandro Coście, Hasanowi Yardimciemu i Taekjipowi Ha za użyteczne dyskusje naukowe. D.R.M. potwierdza finansowanie ze stypendium doktoranckiego Boehringer Ingelheim Fonds. N.D. potwierdza finansowanie ze strony Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO) w ramach grantu Top 714.017.002 i Spinozapremie SPI 81-772 oraz z Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach grantu dla zaawansowanych naukowców (REPLICHROMA; numer grantu 789267).

1. Synteza podwójnie funkcjonalizowanego liniowego substratu DNA i wiązanie z kulkami magnetycznymi
<ol>
	<li>Podwójna funkcjonalizacja substratu DNA z ugrupowaniami destiobiotyny i digoksygeniny
	<ol>
		<li>Nalinearyzować 20 μg plazmidu pGL50-ARS1 o zawartości 23,6 kb (zawierającego naturalny genezę replikacji ARS1, sklonowanego w domu i dostępnego na żądanie) z 200 jednostkami enzymu restrykcyjnego AflII przez 16 godzin w temperaturze 37 °C w końcowej objętości 200 μL 1x buforu (50 mM octanu potasu, 20 mM octanu tris, 10 mM octanu magnezu, 100 μg/ml BSA, pH 7,9). 
		UWAGA: Ten krok można skrócić do 4 godzin bez zmniejszania wydajności, jeśli jest to wygodniejsze.</li>
		<li>Dezaktywować AflII przez inkubację reakcji w temperaturze 65 °C przez 20 min. Stępić powstałe 4-nukleotydowe zwisy TTAA, uzupełniając 200 μl reakcji linearyzacji 60 jednostkami polimerazy fragmentu Klenowa (3' do 5' egzo-), 17 μL 10x buforu (500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 10 mM DTT, pH 7,9), 33 μM D-Desthiobiotin-7-dATP, 33 μM Digoxigenin-11-dUTP, 33 μM dCTP, 33 μM dGTP i ultraczystą wodą do końcowej objętości 370 μM. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 30 min. 
		UWAGA: Na tym etapie fragment Klenowa stępia zwisy na obu końcach zlinearyzowanego DNA poprzez włączenie dwóch nukleotydów D-desthiobiotyny-7-dATP i dwóch nukleotydów digoksygeniny-11-dUTP na każdym końcu.</li>
		<li>Uzupełnić reakcję 10 mM EDTA i dezaktywować fragment Klenowa, inkubując reakcję w temperaturze 75 °C przez 20 minut. Doprowadzić objętość reakcji do 400 μl ultraczystą wodą.</li>
		<li>Weź cztery kolumny wirujące S-400, wiruj je przez co najmniej 30 sekund, aby ponownie zawiesić żywicę, a następnie odwiruj je przez 1 minutę przy 735 x g, aby usunąć bufor magazynowy. Przenieść kolumny do czystych probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Natychmiast dodać 100 μl roztworu DNA do każdej kolumny i odwirować je przez 2 minuty przy 735 x g. DNA znajduje się teraz w przepływie, a kolumny mogą zostać wyrzucone.</li>
		<li>Połączyć ze sobą przepływ czterech kolumn, zmierzyć objętość za pomocą pipety i zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Zostanie to wykorzystane do obliczenia ilości DNA związanego z kulkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wiązanie podwójnie funkcjonalizowanego liniowego DNA z kulkami magnetycznymi pokrytymi streptawidyną
	<ol>
		<li>Kulki magnetyczne Vortex M-280 pokryte streptawidyną przez 30 s w celu ich ponownego zawieszenia.</li>
		<li>Przenieś 4 mg zawieszonych kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną M-280 do czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym, odczekaj 1 minutę, aż kulki zostaną zebrane i wyjmij bufor do przechowywania.</li>
		<li>Dodaj 1 ml 1x buforu A (5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA i 1 M NaCl) do kulek i ponownie zawieś przez wirowanie przez 5 s. Inkubuj kulki w temperaturze pokojowej przez 5 min. 
		UWAGA: Wszystkie powinny być sterylnie przefiltrowane. Zrób wcześniej dużą objętość 2x bufora A, 1x bufora B (patrz poniżej) i 1x bufora C (patrz poniżej), aby zaoszczędzić czas (zalecane). te są zalecane przez producenta kulek magnetycznych i mogą być przechowywane w temperaturze -20°C.</li>
		<li>Umieść probówkę w uchwycie magnetycznym, odczekaj 1 minutę, aż koraliki zostaną zebrane i usuń bufor A.</li>
		<li>Ponownie zawiesić kulki w 400 μl 2x buforu A przez pipetowanie, a następnie dodać 400 μl funkcjonalizowanego roztworu DNA (należy zauważyć, że rozcieńcza to 2x bufor A do końcowego stężenia 1x, które jest optymalne do wiązania DNA z kulkami). Delikatnie wymieszać, pipetując.</li>
		<li>Inkubować mieszaninę kulek/DNA przez noc w temperaturze 4 °C z rotacją od końca do końca, aby umożliwić funkcjonalizowanemu DNA związanie się z kulkami.</li>
		<li>Za pomocą stojaka magnetycznego usunąć supernatant (nie wyrzucać przed pomiarem jego objętości pipetą i stężenia niezwiązanego DNA za pomocą spektrofotometru) i przemyć kulki 2x 500 μl buforu B (10 mM HEPES-KOH pH 7,6, 1 mM EDTA i 1 M KOAc) w celu usunięcia niespecyficznie związanego DNA. Przemyj kulki 2x 500 μl buforu C (10 mM HEPES-KOH pH 7,6 i 1 mM EDTA), który jest buforem do przechowywania zalecanym przez producenta.
		<ol>
			<li>Oblicz całkowitą ilość DNA związanego z kulkami magnetycznymi, porównując całkowitą ilość DNA dodanego do kulek z ilością DNA pozostałą w supernatancie. Wydajność powinna mieścić się w przedziale 2,3-2,9 mg DNA (~150-190 fmol) na mg kulek magnetycznych. Jeśli uzyskane zostaną niższe plony, przed użyciem sprawdź, czy kolumny S400 nie są suche. Stale monitoruj integralność DNA za pomocą elektroforezy żelowej, aby upewnić się, że początkowy substrat plazmidowego DNA nie ulega degradacji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zawiesić kulki w 300 μl buforu C i przechowywać w temperaturze 4 °C. Aby zapobiec nacięciom, należy wykonać 4 jednorazowe porcje po 1 mg kulek magnetycznych i nie przechowywać DNA dłużej niż 2 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hybrydowy test zespołowy i jednocząsteczkowy do obrazowania i ilościowego określania ruchu w pełni odtworzonego CMG za pomocą korelacyjnej pęsety optycznej o podwójnej wiązce i mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Zespołowe składanie i aktywacja znakowanego fluorescencyjnie CMG na DNA związanym z kulkami magnetycznymi (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C). 
	UWAGA: Reakcje składania i aktywacji CMG przeprowadzono w dwóch etapach: ładowanie i fosforylacja Mcm2-7 oraz składanie i aktywacja CMG. O ile nie określono inaczej, wszystkie etapy wymiany buforu zostały przeprowadzone za pomocą stojaka magnetycznego, umożliwiając zebranie kulek przez magnes przez 1 minutę, a następnie usunięcie supernatantu. Wszystkie inkubacje przeprowadzono w bloku grzewczym o kontrolowanej temperaturze z pokrywką, aby zapobiec fotowybielaniu białek fluorescencyjnych. Jeśli pokrywka nie jest dostępna, probówki należy przykryć folią aluminiową. Oczyszczanie i znakowanie fluorescencyjne wszystkich białek zastosowanych w tym protokole zostało przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem10,11,28.
	<ol style="margines po lewej: 40px;">
		<li>Ładowanie i fosforylacja Mcm2-7
		<ol>
			<li>Pobrać 1 mg kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną związaną z DNA i usunąć bufor do przechowywania (bufor C).</li>
			<li>Przemyj kulki 200 μl buforu ładującego (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM K glutaminianu, 10 mM MgOAc, 0,02% substytut NP40, 10% glicerol, 2 mM DTT, 100 μg/ml BSA i 5 mM ATP).</li>
			<li>Wyjąć bufor załadowczy i ponownie zawiesić kulki w 75 μl bufora załadowczego. Delikatnie wymieszać, pipetując.</li>
			<li>Dodać ORC w końcowym stężeniu 37,5 nM do DNA związanego kulkami i inkubować reakcję przez 5 minut w temperaturze 30 °C z mieszaniem 800 obr./min.</li>
			<li>Dodać Cdc6 o końcowym stężeniu 50 nM i inkubować reakcję przez 5 minut w temperaturze 30 °C z mieszaniem 800 obr./min.</li>
			<li>Dodać Mcm2-7/Cdt1 (lub znakowany fluorescencyjnie Mcm2-7JF646-Halo-Mcm3/Cdt1) o końcowym stężeniu 100 nM i inkubować reakcję przez 20 minut w temperaturze 30 °C z mieszaniem 800 obr./min.</li>
			<li>Dodać DDK w końcowym stężeniu 100 nM i inkubować reakcję przez 30 minut w temperaturze 30 °C z mieszaniem 800 obr./min.</li>
			<li>Usunąć supernatant i przemyć DNA związane z kulkami (które teraz zawiera ufosforylowane heksamery Mcm2-7) 200 μl buforu do przemywania o wysokiej zawartości soli (HSW) (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 300 mM KCl, 10 mM MgOAc, 0,02% substytut NP40, 10% glicerol, 1 mM DTT i 400 μg/ml BSA). Wymieszać pipetując, upewniając się, że kulki są całkowicie ponownie zawieszone w buforze i nie są widoczne żadne grudki.</li>
			<li>Usunąć bufor HSW i przemyć kulki raz 200 μl buforu CMG (25 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM K glutaminianu, 10 mM MgOAc, 0,02% substytut NP40, 10% glicerol, 1 mM DTT i 400 μg/ml BSA).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Montaż i aktywacja znakowanego fluorescencyjnie CMG
		<ol>
			<li>Usunąć bufor CMG i ponownie zawiesić kulki związane z DNA w 50 μl buforu CMG uzupełnionego 5 mM ATP.</li>
			<li>Dodaj 50 nM Dpb11, 200 nM GINS, 30 nM Polɛ, 20 nM S-CDK, 50 nM Cdc45LD555, 30 nM Sld3/7, 55 nM Sld2 i 10 nM Mcm10 do DNA związanego z kulkami. Na tym etapie wymieszaj wszystkie białka w jednej probówce bezpośrednio przed dodaniem ich do DNA i umieść je na lodzie. Dodaj zawieszone DNA związane z kulkami do mieszanki białek. Inkubować reakcję przez 15 minut w temperaturze 30 °C z mieszaniem 800 obr./min.</li>
			<li>Koraliki przemyć 3x 200 μL buforu HSW. Przemyć kulki raz 200 μl buforu CMG.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Elucja nienaruszonych kompleksów DNA:CMG z kulek magnetycznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D)
		<ol>
			<li>Usunąć bufor CMG i wymyć kompleksy DNA:CMG z kulek magnetycznych poprzez ponowne zawieszenie kulek magnetycznych związanych z DNA zawierających CMG w 200 μl buforu elucyjnego (bufor CMG uzupełniony 10 mM biotyny). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z mieszaniem 800 obr./min.</li>
			<li>Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i pozwól na zebranie kulek przez 5 minut. Ostrożnie zbierz supernatant (który teraz zawiera eluowane kompleksy DNA:CMG) bez naruszania osiadłych kulek i przenieś go do nowej probówki.</li>
			<li>Aby upewnić się, że w roztworze nie pozostały żadne kulki (ponieważ kulki magnetyczne pozostawione w roztworze mogą zakłócać część testu dotyczącą pułapki optycznej), należy ponownie umieścić zebrany supernatant w stojaku magnetycznym i pozwolić, aby pozostałe kulki zostały zebrane przez kolejne 5 minut. Ostrożnie zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki.</li>
			<li>Dodać 1400 μl buforu CMG do 200 μl supernatantu. Próbka jest teraz gotowa do obrazowania pojedynczych cząsteczek.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w pełni odtworzonego CMG za pomocą korelacyjnej pęsety optycznej z podwójną wiązką i mikroskopii konfokalnej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E-G). 
	UWAGA: Część testu jednocząsteczkowego jest przeprowadzana w konfiguracji komercyjnej, która łączy pęsetę optyczną z dwuwiązką z mikroskopią konfokalną i mikrofluidyką45,46 (Rysunek 1E-G), ale może być również przeprowadzana w konfiguracji domowej. Zastosowana tutaj komercyjna konfiguracja jest wyposażona w mikroprzepływową komórkę przepływową z pięcioma wlotami (określanymi odpowiednio jako kanały 1-5) i jednym wylotem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). W poniższych krokach wszystkie nazwy przycisków i/lub paneli są specyficzne dla oprogramowania dostarczanego z tą konfiguracją komercyjną.
	<ol>
		<li>Użyj pięciu wlotów w konfiguracji komercyjnej w następujący sposób: Wstrzyknij kanały 1-3 od lewej strony i użyj ich do wychwytywania kulek (kanał 1), wiązania kompleksu DNA-białko (kanał 2) i sprawdzania obecności CMG (kanał 3). Kanały 4 i 5 służą jako rezerwuary białka i miejsca wymiany. Przed każdym eksperymentem pasywację mikroprzepływowej komory przepływowej przez co najmniej 30 minut za pomocą 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, a następnie 0,5% Pluronic F-127 rozpuszczonego w ultraczystej wodzie.
		<ol>
			<li>Upewnij się, że zawartość każdego kanału w każdym eksperymencie jest zgodna z opisem (Rysunek 1E): 
			Kanał 1: Kulki polistyrenowe powlekane antydigoksygeniną (średnica 2,06 μm) rozcieńczone w stosunku 1:50 w PBS; 
			Kanał 2: Kompleksy DNA:CMG eluowane z kulek magnetycznych; 
			Kanał 3: Bufor obrazowania (bufor CMG uzupełniony o 2 mM 1,3,5,7 cyklooktatetraen, 2 mM 4-nitrobenzyloalchohol i 2 mM Trolox); 
			Kanały 4 i 5: Bufor obrazowania uzupełniony o 25 nM RPA, 10 nM Mcm10 i 5 mM ATP, 5 mM ATPγS lub bez nukleotydu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przed eksperymentem dostosuj moc lasera pułapkowego, aby osiągnąć sztywność 0,3 pN/nm w obu pułapkach33,46, klikając przycisk Ponowna kalibracja w panelu Power Controls oprogramowania. Ustaw rozmiar piksela konfokalnego na 50 x 50 nm, rozmiar obrazu na 160 x 18 pikseli, czas oświetlenia na piksel na 0,2 ms, a liczbę klatek na sekundę na 5 s w panelu Skanowanie obrazu w oprogramowaniu. Ustaw regulator temperatury na 30 °C w panelu Temperatura. 
		UWAGA: Ponadto zalecamy ustawienie maksymalnej prędkości stolika (używanej do przemieszczania się między kanałami) na 0,2 mm/s, aby zminimalizować dysocjację CMG od DNA przez siłę oporu.</li>
		<li>Wszystkie roztwory należy wlać do komory przepływowej pod stałym ciśnieniem 0,5 bara w porcie wtryskowym (który można ustawić w panelu Pressure Bar w oprogramowaniu). Następnie wyłącz przepływ w kanałach 4 i 5. Po wstępnym przepłynięciu wszystkich roztworów zmniejszyć ciśnienie do 0,2 bara.</li>
		<li>Przesuwaj lasery pułapkowe do kanału 1, aż jedna ścieg zostanie złapana w każdą pułapkę optyczną. Przenieś uwięzione koraliki do kanału 2, przesuwając joystick i naciskając spust. Następnie namierz kompleks DNA:CMG, przesuwając prawy koralik w kierunku i od lewego koralika za pomocą joysticka bez naciskania spustu, aż do uwięzienia uwięzi DNA (co jest znane poprzez monitorowanie krzywej siły-wydłużenia uwięzionego DNA47 w panelu FD Viewer oprogramowania).
		<ol>
			<li>W przypadku tetheringu DNA upewnij się, że wprowadzono długość DNA i prawidłową wartość temperatury w panelu Model referencyjny, który automatycznie narysuje teoretyczny, rozszerzalny model łańcucha przypominającego robaka konstruktu DNA w panelu FD Viewer. Jeśli pojedyncza cząsteczka DNA zostanie złapana między dwoma kulkami, zachowanie siły i wydłużenia DNA powinno ściśle pasować do wykreślonego modelu rozciągliwego łańcucha przypominającego robaka. Upewnij się, że tak jest, monitorując eksperymentalną krzywą siła-wydłużenie, którą oprogramowanie automatycznie wykreśli na wierzchu teoretycznej. 
			UWAGA: Odchylenia od modelu teoretycznego mogą wskazywać na obecność wielu cząsteczek DNA związanych między kulkami i/lub obecność agregatów białkowych związanych z DNA i zagęszczających je. Aby zapobiec dysocjacji białek od DNA za pośrednictwem siły, nie należy przekraczać napięcia 10 pN podczas tego wstępnego testu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przesuń koraliki do kanału 3 i natychmiast zatrzymaj przepływ we wszystkich kanałach. Wykonaj jednoklatkowy skan testowy w kanale 3, aby potwierdzić obecność CMG, oświetlając laserem 561 nm o mocy 4 μW, mierzonej na obiektywie. Dostosuj moc lasera obrazowania w panelu Lasery wzbudzenia. Jeśli CMG jest obecne, pojawi się jako dwuwymiarowe plamki ograniczone dyfrakcją, jak pokazano na Rysunek 1G i <silna klasa="xfig">Rysunek 2A.
		<ol>
			<li>Jeśli nie można złapać DNA, sprawdź, czy w kanale 2 nie ma pęcherzyków, które mogą spowolnić przepływ w kanale 2 (w porównaniu z kanałami 1 i 3). Jeśli obecne są pęcherzyki, zwiększ ciśnienie w kanale od 2 do 1 bara, aby spróbować przepłukać pęcherzyki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Jeśli CMG jest obecne, przenieś linkę DNA na kanał 4 lub 5 w celu obrazowania; w przeciwnym razie włącz przepływ z powrotem, wyrzuć kulki i wróć do kroku 2.2.4.</li>
		<li>W kanałach 4 lub 5 dostosuj odległość między kulkami, aby uzyskać początkowe napięcie 2 pN w uwięzi DNA. W tym celu wprowadź 2 pN w panelu Spektroskopia sił i kliknij przycisk Włącz, aby uruchomić zacisk siłowy. Gdy napięcie początkowe osiągnie 2 pN, wyłącz zacisk siły przed obrazowaniem, klikając przycisk Włącz w panelu Spektroskopia sił.</li>
		<li>Obraz CMGCdc45-LD555 co 5 s za pomocą lasera 561 nm o mocy 4 μW mierzonej na obiektywie (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1F). W tym celu kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie w panelu Skanowanie obrazów. W takich skanach CMG będzie wyświetlany jako dwuwymiarowe plamki ograniczone dyfrakcją, takie jak przykład w <silna klasa="xfig">Rysunek 1G.
		<ol>
			<li>Jeśli zaobserwuje się CMG, ale wydaje się, że nie porusza się przed bieleniem, przetestuj wszystkie białka używane do aktywności nukleazy, ponieważ nacięcia na DNA spowodują dysocjację CMG od DNA41, znacznie zmniejszając jego pozorną procesyjność. 
			UWAGA: Moc lasera 4 μW powinna dać spójne wyniki przy użyciu używanego tutaj komercyjnego mikroskopu. W przypadku korzystania z konfiguracji do budowy w domu zalecamy empiryczne oszacowanie optymalnej mocy lasera. Optymalna moc lasera powinna dawać wystarczający sygnał z fluoroforu, aby zlokalizować go z pożądaną precyzją, oraz czas życia fluoroforu bliski pożądanemu zakresowi czasowemu eksperymentu. 
			UWAGA: Chociaż niniejsza publikacja koncentruje się na teście zespołu hybrydowego i pojedynczej cząsteczki, wcześniej opublikowaliśmy obszerny opis analizy danych wygenerowanych za pomocą tego testu48.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Imaging the Motion of Fully Reconstituted Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG)

<ol><li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li>
<li>Burnham, D. R., Kose, H. B., Hoyle, R. B., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+DNA+unwinding+by+the+eukaryotic+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanism of DNA unwinding by the eukaryotic replicative helicase.</a> Nat Commun. 10 (1), 1-14 (2019).</li>
<li>Ticau, S., Friedman, L. J., Ivica, N. A., Gelles, J., Bell, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+origin+licensing+reveal+mechanisms+ensuring+bidirectional+helicase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of origin licensing reveal mechanisms ensuring bidirectional helicase loading.</a> Cell. 161 (3), 513-525 (2015).</li>
<li>Ticau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+timing+of+Mcm2-7+ring+closure+during+DNA+replication+origin+licensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Str+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism and timing of Mcm2-7 ring closure during DNA replication origin licensing.</a> Nat Str Mol Biol. 24 (3), 309-315 (2017).</li>
<li>Gupta, S., Friedman, L. J., Gelles, J., Bell, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helicase-++tethered+ORC+flip+enables+bidirectional+helicase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A helicase- tethered ORC flip enables bidirectional helicase loading.</a> eLife. 10, e74282(2021).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+visualization+of+Saccharomyces+cerevisiae+leading-strand+synthesis+reveals+dynamic+interaction+between+MTC+and+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule visualization of Saccharomyces cerevisiae leading-strand synthesis reveals dynamic interaction between MTC and the replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), 10630-10635 (2017).</li>
<li>Dulin, D., Berghuis, B. A., Depken, M., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+reaction+pathways+through+modern+approaches+to+high-throughput+single-molecule+force-spectroscopy+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Untangling reaction pathways through modern approaches to high-throughput single-molecule force-spectroscopy experiments.</a> Curr Opinion Str Biol. 34, 116-122 (2015).</li>
<li>Lewis, J. S., van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+heterogeneity%3A+Challenging+the+paradigm+of+replisomes+as+deterministic+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Embracing heterogeneity: Challenging the paradigm of replisomes as deterministic machines.</a> Chem Rev. 123 (23), 13419-13440 (2023).</li>
<li>Abbondanzieri, E. A., Greenleaf, W. J., Shaevitz, J. W., Landick, R., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+base-pair+stepping+by+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of base-pair stepping by RNA polymerase.</a> Nature. 438 (7067), 460-465 (2005).</li>
<li>Yeeles, J. T. P., Deegan, T. D., Janska, A., Early, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+eukaryotic+DNA+replication+origin+firing+with+purified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated eukaryotic DNA replication origin firing with purified proteins.</a> Nature. 519 (7544), 431-435 (2015).</li>
<li>Douglas, M. E., Ali, F. A., Costa, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+CMG+helicase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation.</a> Nature. 555 (7695), 265-268 (2018).</li>
<li>Remus, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+loading+of+Mcm2-7+double+hexamers+around+DNA+during+DNA+replication+origin+licensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Concerted loading of Mcm2-7 double hexamers around DNA during DNA replication origin licensing.</a> Cell. 139 (4), 719-730 (2009).</li>
<li>Frigola, J., Remus, D., Mehanna, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATPase-dependent+quality+control+of+DNA+replication+origin+licensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATPase-dependent quality control of DNA replication origin licensing.</a> Nature. 495 (7441), 339-343 (2013).</li>
<li>Coster, G., Frigola, J., Beuron, F., Morris, E. P., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+licensing+requires+ATP+binding+and+hydrolysis+by+the+MCM+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Origin licensing requires ATP binding and hydrolysis by the MCM replicative helicase.</a> Mol Cell. 55 (5), 666-677 (2014).</li>
<li>Coster, G., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+eukaryotic+DNA+replication+is+established+by+quasi-symmetrical+helicase+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional eukaryotic DNA replication is established by quasi-symmetrical helicase loading.</a> Science. 357 (6348), 314-318 (2017).</li>
<li>Miller, T. C. R., Locke, J., Greiwe, J. F., Diffley, J. F. X., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+head-to-head+MCM+double-hexamer+formation+revealed+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of head-to-head MCM double-hexamer formation revealed by cryo-EM.</a> Nature. 575 (7784), 704-710 (2019).</li>
<li>Abid Ali, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+a+licensed+DNA+replication+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of a licensed DNA replication origin.</a> Nat Commun. 8 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Sánchez, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origins+retain+mobile+licensing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">DNA replication origins retain mobile licensing proteins.</a> Nat Commun. 12 (1), 1908(2021).</li>
<li>Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+MCM2-7+helicase+by+association+with+Cdc45+and+GINS+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins.</a> Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).</li>
<li>Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Cdc45%2FMcm2-7%2FGINS+%28CMG%29+complex%2C+a+candidate+for+the+eukaryotic+DNA+replication+fork+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).</li>
<li>Langston, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMG+helicase+and+DNA+polymerase+%CE%B5+form+a+functional+15-subunit+holoenzyme+for+eukaryotic+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">CMG helicase and DNA polymerase ε form a functional 15-subunit holoenzyme for eukaryotic leading-strand DNA replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (43), 15390-15395 (2014).</li>
<li>Sheu, Y. J., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc7-Dbf4+phosphorylates+MCM+proteins+via+a+docking+site-mediated+mechanism+to+promote+S+phase+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc7-Dbf4 phosphorylates MCM proteins via a docking site-mediated mechanism to promote S phase progression.</a> Mol Cell. 24 (1), 101-113 (2006).</li>
<li>Sheu, Y. J., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dbf4-Cdc7+kinase+promotes+S+phase+by+alleviating+an+inhibitory+activity+in+Mcm4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Dbf4-Cdc7 kinase promotes S phase by alleviating an inhibitory activity in Mcm4.</a> Nature. 463 (7277), 113-117 (2010).</li>
<li>Randell, J. C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mec1+is+one+of+multiple+kinases+that+prime+the+Mcm2-7+helicase+for+phosphorylation+by+Cdc7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mec1 is one of multiple kinases that prime the Mcm2-7 helicase for phosphorylation by Cdc7.</a> Mol Cell. 40 (3), 353-363 (2010).</li>
<li>Greiwe, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+for+the+selective+phosphorylation+of+DNA-loaded+MCM+double+hexamers+by+the+Dbf4-dependent+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Str+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism for the selective phosphorylation of DNA-loaded MCM double hexamers by the Dbf4-dependent kinase.</a> Nat Str Mol Biol. 29 (1), 10-20 (2021).</li>
<li>de Jesús-Kim, L., Friedman, L. J., Ramsoomair, C., Gelles, J., Bell, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDK+regulates+replication+initiation+by+controlling+the+multiplicity+of+Cdc45-GINS+binding+to+Mcm2-7%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">DDK regulates replication initiation by controlling the multiplicity of Cdc45-GINS binding to Mcm2-7.</a> eLife. 10, 65471(2021).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+replication+origin+melting+nucleated+by+CMG+helicase+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly.</a> Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).</li>
<li>Ramírez Montero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+binding+halts+diffusion+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+during+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nucleotide binding halts diffusion of the eukaryotic replicative helicase during activation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2082(2023).</li>
<li>Kose, H. B., Larsen, N. B., Duxin, J. P., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+at+lagging-strand+protein+barriers+support+the+steric+exclusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the eukaryotic replicative helicase at lagging-strand protein barriers support the steric exclusion model.</a> Cell Rep. 26 (8), 2113-2125 (2019).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+visualization+of+Saccharomyces+cerevisiae+leading-strand+synthesis+reveals+dynamic+interaction+between+MTC+and+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule visualization of Saccharomyces cerevisiae leading-strand synthesis reveals dynamic interaction between MTC and the replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (40), 10630-10635 (2017).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77, 1-9 (2020).</li>
<li>Schauer, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+bypass+of+a+protein-based+R-loop+block+by+Pif1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replisome bypass of a protein-based R-loop block by Pif1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (48), 30354-30361 (2020).</li>
<li>Wasserman, M. R., Schauer, G. D., O'Donnell, M. E., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+activation+is+enabled+by+a+single-stranded+DNA+gate+in+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication fork activation is enabled by a single-stranded DNA gate in CMG helicase.</a> Cell. 178 (3), 600-611 (2019).</li>
<li>Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+DNA+engagement+and+RPA+oppositely+regulate+the+DNA-unwinding+rate+of+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase.</a> Nat Commun. 11 (1), 1-15 (2020).</li>
<li>White, D. S., Smith, M. A., Chanda, B., Goldsmith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+overcoming+the+single-molecule+concentration+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Meas+Sci+Au%22%5BJournal%5D)">Strategies for overcoming the single-molecule concentration barrier.</a> ACS Meas Sci Au. 3 (4), 239-257 (2023).</li>
<li>Liachko, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+genome-wide+map+of+autonomously+replicating+sequences+in+a+naive+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A comprehensive genome-wide map of autonomously replicating sequences in a naive genome.</a> PLoS Genet. 6 (5), 22(2010).</li>
<li>Kapadia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processive+activity+of+replicative+DNA+polymerases+in+the+replisome+of+live+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Processive activity of replicative DNA polymerases in the replisome of live eukaryotic cells.</a> Mol Cell. 80 (1), 114-126 (2020).</li>
<li>Claussin, C., Vazquez, J., Whitehouse, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mapping+of+replisome+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mapping of replisome progression.</a> Mol Cell. 82 (7), 1372-1382 (2022).</li>
<li>Polo Rivera, C., Deegan, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicon-seq%3A+seeing+is+believing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Replicon-seq: seeing is believing.</a> Trends Genet. 38 (10), 987-988 (2022).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CMG+helicase+bypasses+DNA-protein+cross-links+to+facilitate+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair.</a> Cell. 176 (1-2), 167-181 (2019).</li>
<li>Vrtis, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+DNA+breaks+cause+replisome+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-strand DNA breaks cause replisome disassembly.</a> Mol Cell. 81 (6), 1309-1318 (2021).</li>
<li>Low, E., Chistol, G., Zaher, M. S., Kochenova, O. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+replication+fork+suppresses+CMG+unloading+from+chromatin+before+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The DNA replication fork suppresses CMG unloading from chromatin before termination.</a> Genes Dev. 34 (21), 1534-1545 (2020).</li>
<li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+disordered+elements+controls+DNA+replication+through+initiator+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A new class of disordered elements controls DNA replication through initiator self-assembly.</a> eLife. 8, 1-35 (2019).</li>
<li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+Uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Anal Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
<li>Candelli, A., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+optical+trapping%2C+fluorescence+microscopy+and+micro-fluidics+for+single+molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Phys Chem Chem Phys. 13 (16), 7263-7272 (2011).</li>
<li>Candelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+quantification+of+nascent+RAD51+filament+formation+at+single-monomer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualization and quantification of nascent RAD51 filament formation at single-monomer resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15090-15095 (2014).</li>
<li>Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+elasticity+of+lambda-phage+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Entropic elasticity of lambda-phage DNA.</a> Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biophysics+toolbox+for+reliable+data+acquisition+and+processing+in+integrated+force-confocal+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">A biophysics toolbox for reliable data acquisition and processing in integrated force-confocal fluorescence microscopy.</a> ACS Photonics. 11 (4), 1592-1603 (2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytyczne etapy i ważne kontrole jakości odczynników W tym miejscu podkreślono krytyczne etapy i kontrole jakości odczynników biologicznych w teście. Po pierwsze, czystość użytych białek jest ważna, ponieważ degradacja DNA spowodowana nawet małymi zanieczyszczeniami nukleazami w próbkach białek niekorzystnie wpłynie na dane. Dzieje się tak dlatego, że tylko nienaruszone (lub częściowo nacięte) cząsteczki DNA mogą zostać uwięzione w pęsetie optycznej o podwójnej wiązce. Co ważniejsze, nacięcia na DNA spowodują dysocjację CMG41, komplikując obserwację ruchu CMG na dalekim zasięgu. Zdecydowanie zalecamy testowanie każdego oczyszczonego białka pod kątem aktywności nukleazy, a także ciągłe monitorowanie integralności wyjściowego substratu plazmidowego, aby upewnić się, że nacinanie jest zredukowane do minimum. Drugim ważnym krokiem jest staranne usunięcie kulek magnetycznych po elucji kompleksów DNA:CMG. Usuwanie sklarowanego osadu na tym etapie powinno odbywać się powoli, aby nie zaburzyć zebranych kulek. Jeśli w próbce wpuszczonej do pęsety optycznej pozostaną kulki magnetyczne, często uderzą one w optycznie uwięzione kulki polistyrenowe, powodując ich ucieczkę z pułapki optycznej i komplikując pozyskiwanie danych. Wreszcie, z kompleksami DNA:CMG należy obchodzić się ostrożnie w pęsetach optycznych. W tym celu zalecamy, aby nie zwiększać napięcia DNA powyżej 10 pN, ponieważ zastosowanie siły może oddzielić CMG od DNA. Ponadto przemieszczanie się między kanałami w mikroprzepływowej komórce przepływowej powinno odbywać się tak wolno, jak to możliwe (~ 0,2 mm/s), aby zapobiec dysocjacji CMG od DNA przez powstałe siły oporu.
Modyfikacje metody Istnieje kilka etapów testu, które można zmodyfikować. Na przykład wykazaliśmy, że czas elucji można skrócić z 60 minut do 30 minut bez znaczącego wpływu na wydajność elucji. Ponadto zalecamy uzupełnienie buforu elucyjnego o niskie (poniżej 1 mM) stężenie ATP lub ATPγS, aby zapobiec dyfuzji CMG z końców DNA, a także ogólnie ustabilizować CMG28. Co więcej, chociaż składy i stężenia białek, które tutaj podajemy, są oparte na tych zastosowanych we wcześniejszych pracach biochemicznych i jednocząsteczkowych11,18, opisany przez nas test jest w pełni kompatybilny z innymi protokołami składania CMG26,27. W związku z tym wszelkie postępy biochemiczne zgłaszane w celu zwiększenia wydajności montażu lub aktywacji CMG mogą i powinny być wdrażane w masowej części testu w celu zwiększenia wydajności. Wreszcie, wydłużenie czasu między klatkami wydłuża całkowity czas, w którym CMG może być zobrazowany, ułatwiając obserwację ruchu CMG na duże odległości przed bieleniem fluoroforowym.
Ograniczenia metody Opisana przez nas metoda hybrydowa jest ograniczona tym, że można obrazować CMG dopiero po jego aktywacji masowo. Konieczne będą dalsze prace, aby obserwować aktywację CMG w czasie rzeczywistym. Innym ważnym ograniczeniem jest to, że chociaż spodziewamy się, że CMG zostanie złożony w pary 17,26,27, całkowita liczba kompleksów CMG na DNA, które obserwujemy, wynosi w większości jeden 28, co sugeruje, że CMG, a przynajmniej Cdc45 dysocjuje od DNA podczas obchodzenia się z wrażliwymi kompleksami DNA:CMG. Zmniejszenie liczby etapów obsługi przed obrazowaniem pojedynczych cząsteczek, a także opracowanie lepszych strategii pasywacji dla plastikowych rurek i szkła mikroprzepływowej komory przepływowej mogą zwiększyć tę wydajność.
Znaczenie metody Badania ruchu pojedynczej cząsteczki CMG wykorzystywały do tej pory wstępnie aktywowany CMG oczyszczony jako kompleks z komórek. Chociaż jest to stosunkowo prostsze, to wstępnie aktywowane podejście CMG jest ograniczone, ponieważ pomija którykolwiek z etapów prowadzących do aktywacji CMG, a także dwukierunkową naturę CMG i ruch replikowy. Z drugiej strony, pełne odtworzenie montażu i aktywacji CMG ma potencjał do zbadania wszelkich etapów przed aktywacją, a także do badania ruchu CMG w sposób dwukierunkowy. Niemniej jednak podejście to jest trudniejsze do przełożenia z masowego poziomu biochemicznego na poziom pojedynczej cząsteczki, ponieważ obejmuje znacznie więcej oczyszczonych czynników i etapów białkowych. Test, który tutaj opisujemy, pomógł przezwyciężyć te wyzwania, umożliwiając nam zobrazowanie ruchu w pełni zrekonstruowanego CMG na poziomie pojedynczej cząsteczki, co pozwoliło nam uzyskać dostęp do niektórych wcześniej pominiętych dynamik przed aktywacją28. Dodatkowo, chociaż najczęściej widzimy jeden CMG na DNA, byliśmy w stanie zaobserwować kilka przypadków dwóch kompleksów CMG poruszających się w przeciwnych kierunkach, a nawet mogliśmy uchwycić początkową separację siostrzanych CMG od siebie28, dostarczając pewnych informacji na temat ustanowienia replikacji dwukierunkowej.
Kolejną zaletą tego testu w porównaniu z poprzednim ruchem CMG jest w pełni dwuniciowy charakter stosowanego przez nas substratu DNA (ryc. 1A). W poprzednich pracach nad wstępnie aktywowanym CMG najczęstszym sposobem wiązania CMG z substratem DNA jest płat 3' ssDNA. Powoduje to powstanie konstruktu DNA, który nie może być łatwo ograniczony skrętnie, a tym samym uniemożliwia badanie roli superzwijania w progresji zwrotnej. Z drugiej strony, nowe podejście, które tutaj opisujemy, może mieć potencjał do zaadaptowania do badania roli momentu obrotowego w tym procesie, ponieważ zastosowany substrat DNA jest całkowicie dwuniciowy.
Szersze zastosowania metody Opisany test hybrydowy utoruje drogę do pełnej rekonstrukcji kompletnego replikomu eukariotycznego, umożliwiając nam i innym obserwację i ilościowe określenie ważnej dynamiki, która pozwala replikosomowi odnieść sukces we wszystkich swoich różnych zadaniach. Pomijając replikację DNA, test, który opisujemy, stanowi ważny postęp w translacji skomplikowanej reakcji biochemicznej z poziomu biochemicznego na poziom pojedynczej cząsteczki. Przewidujemy, że test ten można łatwo zmodyfikować w celu zbadania podobnie złożonych interakcji DNA:białko zaangażowanych w różne mechanizmy przetwarzania DNA.

Replikacja DNA u eukariontów jest przeprowadzana przez dynamiczny kompleks białkowy znany jako replisome1. Kluczowym składnikiem tego kompleksu jest eukariotyczna helikaza replikacyjna Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG), która napędza i centralnie organizuje replikosom, wiodąc prym na czele widełek replikacyjnych1,2. Uzyskanie głębokiego ilościowego zrozumienia dynamiki CMG ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamiki repliksomu. Takie zrozumienie można uzyskać za pomocą technik jednocząsteczkowych, które są wyjątkowo przystosowane do badania silników molekularnych, takich jak CMG, ze względu na ich niezrównaną rozdzielczość przestrzenną i czasową, i mogą zapewnić nam niezrównane ilościowe zrozumienie ich funkcji, stochastyczności i dynamiki2,3,4,5,6,7,8,9.
In vivo, CMG jest ładowany i aktywowany w sposób oddzielony czasowo, aby zapewnić, że replikacja występuje tylko raz na cykl komórkowy1,10,11. Po pierwsze, w fazie G1 cyklu komórkowego, zestaw białek znanych jako czynniki ładowania ładuje pierwszy składnik CMG, kompleks heksameryczny Mcm2-7, do dsDNA12,13,14,15,16 w postaci podwójnych heksamerów z konfiguracją head-to-head15,17,18. W konkretnym przypadku drożdży, ten początkowy proces zachodzi w określonych sekwencjach DNA znanych jako początki replikacji1. Chociaż Mcm2-7 jest rdzeniem motorycznym helikazy replikacyjnej, sam w sobie nie jest w stanie rozwinąć DNA19 bez dwóch czynników aktywujących helikazę Cdc45 i GINS, które muszą zostać zrekrutowane do załadowanego Mcm2-7, aby dać początek w pełni aktywnemu CMG11,19,20,21. Proces aktywacji helikazy zachodzi w fazie S cyklu komórkowego i rozpoczyna się od selektywnej fosforylacji podwójnych heksamerów Mcm2-7 przez kinazę regulowaną cyklem komórkowym DDK22,23,24. Te zdarzenia fosforylacji ułatwiają rekrutację Cdc45 i GINS do podwójnych heksamerów Mcm2-710,22,23,24,25,26 przez drugi zestaw białek znanych jako czynniki wyzwalające10,11,26. Wiązanie Cdc45 i GINS daje początek dwóm siostrzanym helikazom CMG, które początkowo obejmują obie nici rodzicielskiego DNA i nadal znajdują się w konfiguracji head-to-head11,27. W końcowym etapie aktywacji czynnik wypalający Mcm10 katalizuje zależną od hydrolizy ekstruzję ATP jednej nici DNA z każdej siostrzanej klasy CMG11. Po wytłaczaniu nici siostrzane helikazy CMG omijają i oddzielają się od siebie poprzez translokację wzdłuż ssDNA w sposób zależny od hydrolizy ATP11,20,21,28, odwijając DNA poprzez steryczne wykluczenie nici nietranslokacyjnej29. Cały ten proces został w pełni odtworzony in vitro z minimalnego zestawu 36 oczyszczonych polipeptydów S. cerevisiae10,11.
Pomimo znakomitej regulacji in vivo składania i aktywacji CMG opisanej powyżej, badania ruchu pojedynczej cząsteczki CMGvitro class="xref">2,30,31,32,33,34 do tej pory polegały na wstępnie aktywowanym CMG oczyszczonym jako kompleks z komórek20,21, pomijając wszystkie kroki przed aktywacją i dwukierunkowy charakter jego ruchu. To wstępnie aktywowane podejście CMG stało się złotym standardem w dziedzinie pojedynczych cząsteczek, częściowo ze względu na biochemiczną złożoność w pełni odtworzonej reakcji składania CMG10,11. Ta reakcja biochemiczna była trudna do przełożenia z poziomu biochemicznego masy na poziom pojedynczej cząsteczki z kilku powodów. Po pierwsze, aby zmaksymalizować wydajność reakcji, czynniki obciążenia i zapłonu potrzebne do montażu i aktywacji CMG są wymagane przy stężeniach w zakresie 10-200 nM10,11,27. Te zakresy stężeń odpowiadają górnemu poziomowi, który może tolerować większość technik jednocząsteczkowych, zwłaszcza w przypadku stosowania składników znakowanych fluorescencyjnie35. Wreszcie, CMG ewoluowało, aby przechodzić przez tysiące par zasad w komórce36,37,38,39. Dlatego, aby zbadać jego ruch w biologicznie istotnej skali przestrzennej, potrzebne są długie substraty DNA (zazwyczaj o długości rzędu dziesiątek kilozasad)30,31,34,40,41,42. Zastosowanie tak długich substratów DNA stanowi dodatkowe wyzwanie polegające na tym, że im dłuższy jest substrat DNA, tym więcej ma potencjalnych niespecyficznych miejsc wiązania białek i agregatów białkowych. W przypadku CMG ten ostatni punkt jest szczególnie ważny, ponieważ kilka czynników obciążających i wyzwalających związanych z montażem i aktywacją CMG zawiera wewnętrznie nieuporządkowane regiony43 i są podatne na agregację.
Tutaj opisujemy test hybrydowy i jednocząsteczkowy, który pozwolił na obserwację i kwantyfikację ruchu CMG po pełnym odtworzeniu jego złożenia i aktywacji z 36 oczyszczonych polipeptydów S. cerevisiae28. Test ten opiera się na podwójnej funkcjonalizacji obu końców substratu DNA z dwoma ortogonalnymi ugrupowaniami przyłączającymi: destiobiotyną i digoksygeniną2 (<silna klasa="xfig">Figura 1A). Pierwsza grupa, destiobiotyna, służy do odwracalnego wiązania substratu DNA z kulkami magnetycznymi pokrytymi streptawidyną44 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Następnie znakowany fluorescencyjnie CMG jest składany i aktywowany na DNA związanym z kulkami, a stojak magnetyczny jest używany do oczyszczania i mycia powstałych magnetycznych kompleksów DNA:CMG związanych z kulkami magnetycznymi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). W ten sposób usuwany jest nadmiar białka, które w przeciwnym razie gromadziłoby się na podłożu DNA; zapewnia to praktycznie wolne od agregacji kompleksy DNA:CMG. Nienaruszone kompleksy są następnie eluowane z kulek magnetycznych przez dodanie molowego nadmiaru wolnej biotyny, która może konkurować z oddziaływaniem destiobiotyna-streptawidyna (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D). Poszczególne kompleksy DNA:CMG są następnie wiązane między dwoma optycznie uwięzionymi kulkami polistyrenowymi pokrytymi przeciwciałem anty-digoksygeninowym (anty-Dig); na tym etapie stosuje się drugą cząstkę DNA, digoksygeninę, ponieważ może wiązać się z anty-Dig nawet w roztworze buforowym zawierającym nadmiar wolnej biotyny (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E). Gdy kompleks DNA:CMG jest utrzymywany na miejscu w pułapce optycznej, ruch znakowanego fluorescencyjnie CMG jest obrazowany za pomocą konfokalnego lasera skanującego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F). Przewidujemy, że test ten można łatwo zaadaptować do badania na poziomie pojedynczej cząsteczki podobnie złożonych interakcji DNA:białko.

<table><tbody><tr><td>AflII&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0520L</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki polistyrenowe powlekane antydigoksygeniną&nbsp;</td><td>Spheroteck</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór ATP</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0441</td><td></td></tr><tr><td>ATP&gamma; S</td><td>Roche</td><td>11162306001</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>C-Trap</td><td>Lumicks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>Wyposażony w AflII</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Promega</td><td>U122B</td><td></td></tr><tr><td>D-Desthiobiotin-7-dATP</td><td>Jena Bioscience&nbsp;</td><td>NU-835-Desthiobio</td><td></td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>10218014</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-DIGXL</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptawidyna Koraliki magnetyczne</td><td>Invitrogen</td><td>11205D</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'&rarr; 5' egzo-)&nbsp;</td><td>Kolumny wirujące NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>Microspin S-400 HR&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer2 NEB</td><td></td><td>B7002S</td> Wyposażony w Nonidet <td>Klenow Fragment</td></tr><tr><td>&nbsp; P 40 Zamiennik</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr></tbody></table>

zestaw hybrydowy i test jednocząsteczkowy do obrazowania ruchu w pełni odtworzonego cmg

Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG

Eukarionty mają jedną helikazę replikacyjną znaną jako CMG, która centralnie organizuje i kieruje replikosomem, a także przoduje w widełkach replikacyjnych. Uzyskanie głębokiego, mechanistycznego zrozumienia dynamiki CMG ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia, w jaki sposób komórki wykonują ogromne zadanie, jakim jest wydajna i dokładna replikacja całego genomu raz na cykl komórkowy. Techniki jednocząsteczkowe są wyjątkowo odpowiednie do ilościowego określania dynamiki CMG ze względu na ich niezrównaną rozdzielczość czasową i przestrzenną. Niemniej jednak badania ruchu CMG nad pojedynczymi cząsteczkami do tej pory opierały się na wstępnie uformowanym CMG oczyszczonym z komórek w postaci kompleksu, co wyklucza badanie etapów prowadzących do jego aktywacji. W tym miejscu opisujemy hybrydowy test zespołowy i jednocząsteczkowy, który umożliwił obrazowanie na poziomie pojedynczej cząsteczki ruchu znakowanego fluorescencyjnie CMG po pełnym odtworzeniu jego złożenia i aktywacji z 36 różnych oczyszczonych polipeptydów S. cerevisiae. Test ten opiera się na podwójnej funkcjonalizacji końców liniowego substratu DNA z dwoma ortogonalnymi ugrupowaniami przyłączeniowymi i może być przystosowany do badania podobnie złożonych mechanizmów przetwarzania DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki.

Przy prawidłowym wykonaniu opisany tutaj protokół powinien pozwolić na uzyskanie kompleksów DNA:CMG praktycznie wolnych od agregatów. Reakcja bez agregacji nie powinna zapchać żadnego z kanałów w mikrofluidycznej komorze przepływowej, a uwięzione cząsteczki DNA powinny dać się rozciągnąć do wydłużenia krańcowego wynoszącego w granicach 10% ich długości konturowej bez powodowania pękania DNA. I odwrotnie, jeśli w reakcji występuje agregacja, cząsteczki DNA mogą zostać skondensowane przez agregaty, co często prowadzi do pękania DNA podczas rozciągania. Dobrym sposobem rozpoznawania agregatów białkowych jest analiza skanów 2D DNA. W reakcji bez agregacji CMG pojawia się jako dyskretne, symetryczne plamki ograniczone dyfrakcyjnie, rzadko rozmieszczone wzdłuż DNA, takie jak te widoczne na skanach przedstawionych na Rysunku 2A. Z kolei agregaty to mniej dyskretne, niekiedy asymetryczne skupiska zajmujące większy odcinek&#160;DNA, podobne do tych widocznych na skanach przedstawionych na Rysunku 2B. Ponadto, jeśli test zostanie przeprowadzony pomyślnie i osiągnie się wysoką czystość oczyszczonych białek, widoczny będzie dalekosiężny ruch CMG w obecności ATP, co zaobserwowano na kymografie przedstawionym na Rysunku 2C.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67076/67076fig01v2.jpg" /> 
Rycina 1: Schematyczny opis hybrydowego podejścia zespołowego i testu pojedynczych cząsteczek służącego do obrazowania i kwantyfikacji ruchu w pełni zrekonstytuowanego kompleksu CMG. (A)&#160;Liniowy DNA o długości 23,6 kb zawierający naturalnie występującą sekwencję początku replikacji ARS1 jest funkcjonalizowany na obu końcach za pomocą grup desthiobiotyny i digoksigeniny. (B) Podwójnie funkcjonalizowany DNA wiąże się z koralkami magnetycznymi powlekanymi streptawidyną poprzez grupy desthiobiotyny. (C) Kompleks CMG jest stopniowo składany i aktywowany na&#160;DNA związanym z koralakami magnetycznymi, z uwzględnieniem etapów płukania w celu usunięcia nadmiaru niezwiązanego białka i agregatów białkowych. (D) Nienaruszone kompleksy DNA:CMG są następnie eluowane z koralek magnetycznych poprzez dodanie nadmiaru wolnej biotyny, która wypiera oddziaływanie desthiobiotyna-streptawidyna. (E)&#160;Pojedyncze kompleksy DNA:CMG są wiązane pomiędzy dwoma polistyrenowymi koralkami chwytanymi optycznie i powlekanymi przeciwciałami anty-digoksigeninowymi przy użyciu mikrofluidycznej komory przepływowej. Należy zauważyć, że oddziaływanie Dig-anty-Dig jest ortogonalne względem oddziaływań biotyna-awidyna, zatem nie jest ono zakłócane przez obecność wolnej biotyny. (F) Po unieruchomieniu za pomocą pęsety optycznej, kompleksy DNA:CMG są przenoszone do różnych warunków buforowych, w których płaszczyzna DNA jest skanowana konfokalnym laserem skaningowym w celu obrazowania ruchu CMG wzdłuż DNA w czasie. (G) Górny panel przedstawia schemat kompleksu DNA:CMG unieruchomionego pomiędzy dwoma powlekanymi anty-Dig koralkami polistyrenowymi w pułapkach optycznych, skanowanego konfokalnym laserem skaningowym. Dolny panel przedstawia przykład skanu 2D CMG związanego z DNA unieruchomionym w pułapce optycznej. DNA w tych eksperymentach nie jest znakowane, lecz można je traktować jako poziomą linię przebiegającą przez środek obrazu. Rycina została zmodyfikowana na podstawie źródła28. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67076/67076fig01largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67076/67076fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Przykłady danych z udanego i nieudanego eksperymentu. (A) Przykładowe skany 2D DNA zawierającego CMG w próbce wolnej od agregatów. Na obu skanach CMG tworzy symetryczne i dyskretne punkty ograniczone dyfrakcyjnie, rzadko rozmieszczone wzdłuż DNA. (B)&#160;Przykładowe skany 2D DNA zawierającego CMG w próbce zawierającej agregaty. Na obu skanach CMG tworzy mniej symetryczne plamy zagęszczone wokół DNA. (C)&#160;Kymograf pokazujący w czasie pozycję punktów ograniczonych dyfrakcyjnie CMG na DNA w obecności ATP, wykazujący dalekozasięgowy ruch kompleksów CMG. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67076/67076fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Zgłaszamy test hybrydowy i jednocząsteczkowy, aby bezpośrednio zobrazować i określić ilościowo ruch fluorescencyjnie znakowanej, w pełni zrekonstytuowanej helikazy Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) na liniowych cząsteczkach DNA utrzymywanych w miejscu w pułapce optycznej.

Zestaw hybrydowy i test jednocząsteczkowy do obrazowania ruchu w pełni odtworzonego CMG

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication ...

Badamy dynamikę ruchu różnych składników replikomu eukariotycznego na poziomie pojedynczej cząsteczki, aby uzyskać dogłębne ilościowe zrozumienie, w jaki sposób komórki mogą powielać całe swoje genomy w każdym cyklu komórkowym. Przełomowym odkryciem w 2015 roku było to, że replikacja eukariotycznego DNA została w pełni odtworzona in vitro z oczyszczonych składników białkowych, co dało nam dużą kontrolę nad systemem. Od tego czasu jest szeroko stosowany do odpowiadania na pytania dotyczące różnych etapów replikacji DNA z rosnącą rozdzielczością czasową i przestrzenną.Dokonano tego przy użyciu uzupełniających się podejść, takich jak krio-EM i biofizyka pojedynczych molekuł. W dziedzinie pojedynczych cząsteczek jednym z największych wyzwań związanych z tym systemem jest liczba zaangażowanych białek, a także stężenia, przy których te składniki są wymagane, aby zmaksymalizować wydajność całej reakcji, ponieważ może to skomplikować obrazowanie pojedynczej cząsteczki. Opisany tutaj protokół wprowadza podejście hybrydowe, w którym kompleks białkowy jest najpierw składany w efektywny sposób przy użyciu biochemii zespołowej, a następnie wprowadzany i badany w warunkach pojedynczej cząsteczki.Pozwala to uniknąć wprowadzania zbyt wysokich stężeń białek na poziomie pojedynczej cząsteczki. Ilustrujemy to podejście do badania zachowania replikacyjnej helikazy CMG na DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki po jej złożeniu za pośrednictwem szlaku opartego na pochodzeniu. Ale to podejście może być również wykorzystane do badania dynamiki wielu innych typów kompleksów białkowych wiążących DNA.Przystąp do przeprowadzenia reakcji po funkcjonalizacji obu końców liniowego substratu DNA. Najpierw weź kolumny wirujące S400 i wiruj je przez co najmniej 30 sekund, aby ponownie zawiesić żywicę. Następnie odwirować je przez jedną minutę w temperaturze 735 G w celu usunięcia buforu magazynującego.Przenieś kolumny do czystych probówek o pojemności 1,5 mililitra. Natychmiast dodaj 100 mikrolitrów podwójnie funkcjonalizowanego liniowego roztworu DNA do każdej kolumny. Wirować kolumny przez dwie minuty w temperaturze 735 G, aby przepuścić DNA przez kolumnę, zachowując nieinkorporowane nukleotydy.Po zebraniu przepływu zawierającego DNA z czterech kolumn, zmierz objętość za pomocą pipety. Następnie wiruj kulki magnetyczne pokryte streptawidyną M280 przez 30 sekund, aby je ponownie zawiesić. Przenieś cztery miligramy zawieszonych kulek magnetycznych do czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby zebrać koraliki przed wyjęciem bufora do przechowywania. Ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze buforu A, wirując przez pięć sekund, a następnie inkubując kulki w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Zbierz koraliki, umieszczając rurkę w uchwycie magnetycznym na jedną minutę.Po usunięciu buforu A ponownie zawiesić kulki w 400 mikrolitrach 2x buforu A przez pipetowanie. Następnie dodaj 400 mikrolitrów funkcjonalizowanego roztworu DNA do kulek i delikatnie wymieszaj pipetując. Inkubuj mieszaninę koralików-DNA przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z obrotem od końca do końca.Następnego dnia użyj stojaka magnetycznego, aby usunąć supernatant przed obliczeniem całkowitej ilości DNA związanego z kulkami magnetycznymi. Następnie przemyj kulki sekwencyjnie buforem B i buforem C. Ponownie zawieś kulki w 300 mikrolitrach buforu C i wykonaj cztery porcje po 75 mikrolitrów. Na początek weź jedną 75-mikrolitrową porcję zawierającą jeden miligram kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną związaną z DNA i usuń supernatant za pomocą stojaka magnetycznego.Umyj koraliki 200 mikrolitrami bufora ładującego. Następnie ponownie zanurz kulki w 75 mikrolitrach bufora ładującego i delikatnie wymieszaj pipetując. Następnie dodaj kompleks rozpoznawania pochodzenia o końcowym stężeniu 37,5 nanomola do DNA związanego z kulkami i inkubuj reakcję przez pięć minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza z mieszaniem 800 obrotów na minutę.Dodać Cdc6 o końcowym stężeniu 50 nanomolowych i inkubować reakcję, jak pokazano wcześniej. Następnie dodać Mcm2-7/Cdt1 w końcowym stężeniu 100 nanomolowych i inkubować reakcję przez 20 minut, jak pokazano wcześniej. Następnie dodaj Ddk w końcowym stężeniu 100 nanomolowych i inkubuj podobnie przez 30 minut.Po usunięciu supernatantu przemyj DNA związane z kulkami zawierające fosforylowane heksamery Mcm2-7 za pomocą 200 mikrolitrów buforu do płukania o wysokiej zawartości soli. Miesza się przez pipetowanie, upewniając się, że kulki są całkowicie zawieszone. Następnie usuń bufor i umyj kulki raz 200 mikrolitrami buforu CMG.Aby złożyć i aktywować znakowany fluorescencyjnie CMG na DNA związanym z kulkami, usuń bufor CMG i ponownie zawieś kulki związane z DNA w 50 mikrolitrach buforu CMG uzupełnionego pięciomilimolowym ATP. Następnie wymieszaj wszystkie składniki wymienione na ekranie w jednej tubce i umieść ją na lodzie. Natychmiast dodaj zawieszone DNA związane z kulkami do mieszanki białek.Inkubować reakcję przez 15 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza z mieszaniem 800 obr./min. Płukać koraliki sekwencyjnie buforem HSW i buforem CMG. Po usunięciu buforu ponownie zawiesić CMG zawierające kulki magnetyczne związane z DNA w 200 mikrolitrach buforu elucyjnego.Następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę z mieszaniem 800 obr./min. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i pozwól na zebranie koralików przez pięć minut. Ostrożnie zebrać supernatant zawierający eluowane kompleksy DNA-CMG bez przerywania osiadłych kulek i przenieść go do nowej probówki.Aby upewnić się, że w roztworze nie pozostały żadne kulki, należy ponownie umieścić zebrany supernatant w stojaku magnetycznym i przechowywać przez kolejne pięć minut. Ostrożnie zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki. Dodać 1 400 mikrolitrów buforu CMG do 200 mikrolitrów supernatantu.Próbka jest teraz gotowa do obrazowania pojedynczej cząsteczki. Wykonaj obrazowanie pojedynczej cząsteczki w komercyjnym zestawie łączącym pęsetę optyczną z podwójną wiązką z mikroskopią konfokalną. Użyj kanału pierwszego do wstrzykiwania do wychwytywania kulek, kanału drugiego do wiązania kompleksu białek DNA, kanału trzeciego do sprawdzania obecności CMG, a kanałów czwartego i piątego jako rezerwuarów białka i miejsc wymiany.Wszystkie roztwory należy wlać do komory przepływowej pod stałym ciśnieniem 0,5 bara w króćcu wtryskowym. Następnie wyłącz przepływ w kanałach czwartym i piątym. Po wstępnym przepłynięciu wszystkich roztworów zmniejszyć ciśnienie do 0,2 bara.Przesuwaj lasery pułapkujące tak, aby kierowały jeden, aż jedna koralik zostanie złapana w każdą pułapkę optyczną. Przesuń uwięzione koraliki do kanału drugiego, przesuwając joystick podczas naciskania spustu. Używając joysticka bez naciskania spustu, wyłowić kompleks DNA-CMG, przesuwając prawy koralik w kierunku i od lewego koralika, aż zostanie uwięziona więź DNA.Przesuń koraliki do kanału trzeciego i natychmiast zatrzymaj przepływ we wszystkich kanałach. Dostosuj moc lasera 561 nm do czterech mikrowatów w panelu lasera wzbudzenia, a następnie wykonaj jednoklatkowy skan testowy DNA w kanale trzecim. Jeśli jest obecny, CMG pojawi się jako dwuwymiarowe punkty ograniczone dyfrakcją.W takim przypadku przenieś linkę DNA na kanał czwarty lub piąty w celu obrazowania. W przeciwnym razie ponownie włącz przepływ, wyrzuć koraliki i powtórz kroki. W kanałach czwartym lub piątym wprowadź dwa piconewtony w panelu spektroskopii sił i kliknij przycisk włączania, aby uruchomić zacisk siły.Gdy początkowe napięcie osiągnie dwa pikonewtony, wyłącz zacisk siły przed obrazowaniem, klikając ponownie przycisk włączania w panelu spektroskopii sił. Kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie w panelu skanowania obrazu. Obraz fluorescencyjnego CMG co pięć sekund za pomocą lasera o długości 561 nm o mocy czterech mikrowatów, mierzonej na obiektywie.W reakcji wolnej od agregacji, CMG pojawiło się jako dyskretne, symetryczne plamki ograniczone dyfrakcją, z trudem zagęszczające DNA. Wręcz przeciwnie, agregaty są mniej dyskretne, czasami asymetryczne plamy tłoczą się na większej długości DNA. Jeśli test został pomyślnie przeprowadzony i osiągnięto wysoką czystość oczyszczonych białek, można było zaobserwować ruch CMG na duże odległości w obecności ATP.

hybrid-ensemble-single-molecule-assay-to-image-motion-fully

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskiwania trójkolorowych danych smFRET i ich analizy za pomocą 3D zespołowego modelu Ukrytego Markowa. Dzięki takiemu podejściu naukowcy mogą wyodrębnić informacje kinetyczne ze złożonych systemów białkowych, w tym kooperatywność lub skorelowane interakcje.

Wykorzystanie trójkolorowego jednocząsteczkowego FRET do badania korelacji oddziaływań białek

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

Prezentowany tutaj jest protokół do wykonywania transferu energii rezonansu Förstera dla pojedynczej cząsteczki w celu zbadania rozdzielczości HJ. Dwukolorowe wzbudzenie przemienne służy do wyznaczania stałych dysocjacji. Jednokolorowy smFRET poklatkowy jest następnie stosowany w testach rozszczepienia w czasie rzeczywistym w celu uzyskania rozkładu czasu przebywania przed rozdzielczością HJ.

Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Przedstawiono tutaj procedurę ekspresji i oczyszczania miozyny 5a, po której następuje dyskusja na temat jej charakterystyki, przy użyciu testów opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro zarówno zespołowych, jak i pojedynczych, oraz jak te metody mogą być modyfikowane do charakterystyki niemięśniowej miozyny 2b.

Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro

Tutaj znajduje się szczegółowy opis protokołu wdrożonego w laboratorium do akwizycji i analizy profili dyspersji relaksacyjnej 15N za pomocą spektroskopii NMR roztworu.

15N Dyspersja relaksacyjna CPMG do badania dynamiki konformacyjnej białek w skali czasowej μs-ms

Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Poznaj hybrydowy zestaw do badania dynamiki ruchu helikazy CMG na DNA z wykorzystaniem biochemii zespołowej i obrazowania jednocząsteczkowego. Ta metoda umożliwia ilościową analizę mechanizmów replikacji DNA.

Zestaw hybrydowy i test jednocząsteczkowy do obrazowania ruchu w pełni odtworzonego CMG

Przeglądaj więcej filmów