Ekstrakcja i wykrywanie geosminy i 2-metyloizoborneolu w wodzie i rybach przy użyciu sond do ekstrakcji sorpcyjnej o dużej pojemności i GC-MS

[Narrator] W tym filmie zademonstrujemy proces ekstrakcji i wykrywania geosminy i 2-metyloizoborneolu zarówno z próbek wody, jak i ryb przy użyciu sond do ekstrakcji sorpcyjnej o dużej pojemności i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas lub GC-MS. Geosmina i 2-metyloizoborneol to lotne związki organiczne pochodzenia mikrobiologicznego, które występują w strumieniach, stawach, studniach, a nawet recyrkulacyjnych systemach akwakultury. Te związki zapachowe mogą nadawać nieprzyjemne zapachy i smaki wodzie i hodowanym w niej rybom nawet w bardzo niskich stężeniach. Widzimy tu naukowca zbierającego wodę z recyrkulacyjnego systemu akwakultury. Próbki wody z geosminą i 2-metyloizoborneolem zbiera się w fiolkach z brązowego szkła przeznaczonych do zawierania lotnych związków organicznych, gdy w fiolce nie pozostaje powietrze. W tym celu zanurz fiolkę i zakryj ją pod wodą, aby nie pozostały pęcherzyki powietrza. Zaczynamy od przygotowania wzorców kalibracyjnych i wewnętrznych. Najpierw przygotuj roztwór podstawowy oznaczony jako C1, dodając 10 mikrolitrów roztworu geosminy i 2-metyloizoborneolu w stężeniu 100 mikrogramów na litr do 100-mililitrowej kolby miarowej. Napełnić kolbę do oznaczenia objętości metanolem klasy LC/MS. W ten sposób powstaje roztwór zawierający każdy analit w stężeniu 10 mikrogramów na litr. Następnie przygotowuje się wzorce kalibracyjne poprzez dodanie określonych objętości roztworu podstawowego C1 do 100-mililitrowych kolb miarowych i napełnienie do objętości wodą dejonizowaną. Ważne jest, aby codziennie przygotowywać nowe wzorce kalibracyjne, ponieważ roztwory te są bardzo łatwo psujące się. Dla wzorców wewnętrznych należy utworzyć roztwór podstawowy I1, dodając 10 mikrolitrów 2-izopropylo-3-metoksypirazyny, znanej również jako IPMP, do jednolitrowej kolby miarowej wypełnionej metanolem klasy LC / MS, tworząc 10 miligramów na litr roztworu podstawowego. Następnie przygotuj drugi roztwór I2, dodając sto mikrolitrów roztworu podstawowego I1 do stumililitrowej kolby miarowej i napełniając wodą dejonizowaną do uzyskania stężenia 10 mikrogramów na litr. Rozpocznij od umieszczenia jednej 20-mililitrowej próbki wody w fiolce w tacce na próbki. Odważyć 2,5 grama chlorku sodu i dodać go do każdej fiolki z próbką. Dodanie soli usprawnia przenoszenie geosminy i MIB z wody do przestrzeni nad głową. Dodać pięć mililitrów próbki wody do każdej fiolki i dodać do niej 50 mikrolitrów roztworu wzorca wewnętrznego I2. Każdą fiolkę należy zakryć i uszczelnić natychmiast po przygotowaniu, aby zminimalizować straty analitu. Kolejnym krokiem jest ekstrakcja analitu. Umieść tacę na próbki w uchwycie tacy automatycznego podajnika próbek i przygotuj metodę instrumentu z następującymi kluczowymi ustawieniami: Czas mieszania przed pobraniem próbki po 10 minutach. Parametry pobierania próbek: Inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut z prędkością mieszania 400 obr./min. Upewnij się, że opcja sondy Wash HiSorb jest włączona, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu między próbkami. Desorpcja sondy: Ustaw na 15 minut w temperaturze 270 stopni Celsjusza. Ustawienia pułapki: Temperatura obciążenia pułapki wynosi 25 stopni Celsjusza, a natężenie przepływu przy podziale wynosi osiem mililitrów na minutę. Po wprowadzeniu tych ustawień uruchom automatyczny podajnik próbek w połączeniu z metodą GC-MS do analizy próbki wody. W celu analizy tkanek ryb umieść jedną 20-mililitrową fiolkę na próbkę ryby na tacy. Homogenizować tkankę ryby za pomocą robota kuchennego i zważyć jeden gram homogenizowanej tkanki do każdej fiolki. Dodać pięć mililitrów nasyconego roztworu chlorku sodu i dodać do każdej próbki 100 mikrolitrów roztworu wzorca wewnętrznego I2. Natychmiast zamknąć i zamknąć każdą fiolkę. Metoda ekstrakcji próbek ryb jest podobna do metody ekstrakcji wody, ale z kluczowymi różnicami wynikającymi z bogatego w lipidy charakteru tkanki rybnej. Różnice te obejmują czas mieszania przed pobraniem próbki: ustawiony na 20 minut. Temperatura inkubacji pobierania próbek: 80 stopni Celsjusza przez 30 minut przy prędkości mieszania 400 obr./min. Upewnij się, że funkcja sondy Wash HiSorb jest włączona. Po wykonaniu tych czynności uruchom automatyczny podajnik próbek w połączeniu z metodą GC-MS do analizy próbek ryb, Te same parametry GC-MS mają zastosowanie zarówno do metod wodnych, jak i tkanek rybnych. GC jest wyposażony w pięć kolumn MS o wymiarach 30 metrów na 0,25 milimetra na 0,25 mikrona. Jako gaz nośny używany jest ultraczysty hel o natężeniu przepływu dwóch mililitrów na minutę. Program piekarnika rozpoczyna się od początkowej temperatury 60 stopni Celsjusza utrzymywanej przez trzy minuty, po której następuje wzrost temperatury od 10 stopni Celsjusza na minutę do 100 stopni Celsjusza, następnie od 20 stopni Celsjusza na minutę do 190 stopni Celsjusza i od 30 stopni Celsjusza na minutę do 280 stopni Celsjusza z końcowym czasem podtrzymania wynoszącym dwie minuty. Całkowity czas działania wynosi około 16,5 minuty. Dla linii przesyłowej między GC a MS ustaw temperaturę na 280 stopni Celsjusza ze źródłem jonów na 250 stopni Celsjusza i poczwórną na 200 stopni Celsjusza. W trybie MS for scan użyj zakresu od 50 do 350 stosunek masy do ładunku. Do monitorowania wybranych jonów (SIM) należy użyć następujących jonów do oceny ilościowej i potwierdzenia: IPMP, stosunek masy do ładunku 152 i 137. MIB, stosunek masy do ładunku od 95 do 107. I geosmin, stosunek masy do ładunku 112 i 55. Na koniec, zawsze ręcznie przeglądaj wybrane piki w oprogramowaniu chromatograficznym, aby uniknąć błędów. Protokół ten określa etapy wykrywania geosminy i 2-metyloizoborneolu w próbkach wody i ryb przy użyciu sond do ekstrakcji sorpcyjnej o dużej pojemności i GC-MS. Uważnie postępując zgodnie z tymi instrukcjami, naukowcy mogą zapewnić dokładne i wiarygodne wyniki analizy obecności tych związków. Rysunek pierwszy przedstawia wpływ temperatury desorpcji sondy na przeniesienie. Wzorzec laboratoryjny zawierający geosminę i 2-metyloizoborneol w ilości 20 nanogramów na litr analizowano w trzech różnych temperaturach desorpcji sondy. Panel A zawiera średnie obszary pików dla geosmin i MIB. Każda sonda została następnie zdesorbowana jeszcze dwukrotnie w tej samej temperaturze początkowej, aby ocenić przeniesienie. Wyniki dla geosmin i MIB są pokazane odpowiednio w panelach B i C. Przeniesienie jest wyrażone jako powierzchnia piku jako procent początkowej powierzchni piku. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe dla trzech powtórzeń. Wyniki wskazują, że wyższa temperatura desorpcji minimalizuje przenoszenie bez uszczerbku dla czułości. Rysunek drugi przedstawia porównanie skorygowanego i nieskorygowanego odzyskiwania danych dla wzorców analitycznych przy 15 i 40 nanogramach na litr przy użyciu sond PDMS do ekstrakcji. Próbki skorygowano przy użyciu 2-izopropylo-3-metoksypirazyny (IPMP) jako wzorca wewnętrznego. Bez korekty odzysk był znacznie niższy, z korektami na poziomie około 60% znanych kwot skokowych. Po skorygowaniu odzysk był bliski 100%, co pokazuje, jak ważne jest stosowanie wewnętrznych wzorców do dokładnej kwantyfikacji. Rysunek trzeci porównuje dane dotyczące odzyskiwania geosminy po lewej stronie i 2-metyloizoborneolu po prawej przy 15 nanogramach na litr przy użyciu dwóch typów sond: tylko PDMS i sond trójfazowych, które obejmują PDMS, diwinylobenzen i szeroki zakres węgla. Oba typy sond wykazują dobrą wydajność, chociaż sondy tylko PDMS miały nieco lepsze wskaźniki odzyskiwania. Biorąc pod uwagę ten wynik i oszczędności kosztów, przyszłe analizy przeprowadzono za pomocą sond opartych wyłącznie na PDMS. Rysunek czwarty przedstawia regresję liniową krzywych kalibracyjnych dla geosmin i MIB. Pełny zakres reprezentuje geosminę o wartości R-kwadrat równej 0,9999, a linia przerywana reprezentuje MIB, również z wartością R-kwadrat równą 0,9999. Obie krzywe wykazują doskonałą liniowość przy minimalnym błędzie, co potwierdza dokładność ilościową metody w badanym zakresie stężeń. Rysunek piąty ilustruje stężenia geosminy i 2-metyloizoborneolu w próbkach wody pobranych z siedmiu różnych systemów akwakultury. Panel A przedstawia stężenia geosminy, a panel B pokazuje stężenia MIB. Każdy system miał co najmniej trzy powtórzenia, a w większości przypadków stężenia tych związków przekraczały limity wykrywalności metody. Jeden z systemów, oznaczony jako system pierwszy, przekroczył próg zapachu ludzkiego dla geosminy, podkreślając potencjalny problem z jakością wody w tym systemie. Rysunek szósty przedstawia dane z dwóch próbek ryb, oznaczonych jako F1 i F2, które zostały wzbogacone geosminą i 2-metyloizoborneolem. Oba związki analizowano w trzech egzemplarzach w celu określenia odzysku i precyzji. Stężenia geosminy i MIB oraz próbki ryb z kolcami są wykreślane, co demonstruje zdolność metody do dokładnego wykrywania tych związków nawet w tkankach ryb bogatych w lipidy. Przedstawione dziś metody zapewniają solidne ramy dla czułego wykrywania geosminy i 2-metyloizoborneolu. Dzięki integracji sorpcyjnych sond ekstrakcyjnych o dużej pojemności i precyzyjnej analizie GC-MS zademonstrowaliśmy technikę, która znacznie zwiększa nasze możliwości wykrywania. Ten postęp metodologiczny nie tylko poprawia przepustowość, ale także zmniejsza ryzyko błędu ludzkiego i zwiększa powtarzalność wyników. W miarę udoskonalania tych technik bez wątpienia staną się one niezbędnymi narzędziami w dziedzinie monitorowania środowiska i oceny jakości żywności.