Name: Hodowla według projektu funkcjonalnego ryżu z technologiami edycji genomu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj hodowlę funkcjonalnych odmian ryżu z wykorzystaniem technologii edycji genomu. Protokół obejmuje edycję genu SBE2b, optymalizację narzędzi i analizę cech fenotypowych oraz agronomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez fundusze z Biological Breeding-Major Projects (2023ZD04074).

Badanie zostało przeprowadzone w Bellagen Biotechnology Co. Ltd w Chinach zgodnie z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach. Przed wzięciem udziału w badaniu, protokół badania został dokładnie wyjaśniony uczestnikom, którzy wyrazili świadomą zgodę.
1. Projektowanie sgRNA i wektora budowy (czas 5-7 dni)
UWAGA: Wektor binarny został użyty do wyrażenia systemu CRISPR/Cas-SF0121. Nie mogą mieć mniej niż 3 nukleotydy (nt) niezgodności z potencjalnym miejscem poza celem dla sgRNA. Adapter sgRNA musi uzupełniać lepki koniec, który jest generowany przez trawienie enzymatyczne Bsa I wektora edycyjnego. Wybór oprogramowania został oparty na zgłaszanej wysokiej wydajności i specyficzności oprogramowania w rice14, a także na jego łatwości obsługi i dostępności dla grupy badawczej.
<ol>
	<li>Przejdź do strony internetowej NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), aby pobrać gen OsSBEIIb (LOC4329532) w Japonica. Pobierz i uzyskaj dostęp do genomu referencyjnego w oprogramowaniu SnapGene.</li>
	<li>Przeanalizuj insercje/delecje (InDel) i polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) w sekwencji eksonu OsSBEIIb z odmiany X134, porównując ją z genomem referencyjnym. Wykorzystaj NCBI Primer Blast22 do zaprojektowania starterów flankujących regiony eksonów (Tabela uzupełniająca 1).</li>
	<li>Aby zwalidować sekwencję eksonów genu OsSBEIIb w X134 za pomocą sekwencjonowania Sangera, należy przygotować reakcję w następujący sposób: 10 μl buforu mieszaniny polimerazy z 1 μl startera do przodu, 1 μl startera odwrotnego, 1 μl gDNA z tkanek X134 i 7 μl wody destylowanej. Uruchom program PCR w następujący sposób: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) z 35 cyklami i 72 °C, 5 min.</li>
	<li>Zaprojektuj sgRNA na sekwencji eksonów OsSBEIIb X134, przestrzegając protokołu Tsakirpaloglou et al.14i upewniając się, że sekwencja PAM to TTN.</li>
	<li>Zmodyfikuj sekwencję sgRNA, dodając -ACAC- oligonukleotydy na końcu 5' startera do przodu i dodając -GGCC- oligokleotydaże na końcu 5' startera odwrotnego. Komercyjnie syntetyzować startery do przodu/do tyłu (dla sgRNA).</li>
	<li>Rozpuścić startery do przodu i do tyłu do stężenia 10 μmol/l, pobrać 1 μl każdego z nich i dodać do 8 μl buforu do wyżarzania (bufor Tris-EDTA + 50 mM NaCl) i wymieszać pipetując. Umieścić w maszynie do PCR i uruchomić program wyżarzania w następujący sposób na maszynie do PCR: powolny proces schładzania 95 °C do 16 °C przy 0,1 °C/s.</li>
	<li>Złóż sgRNA w wektor edycji genomu. Przygotować reakcję w następujący sposób: 20 μl buforu mieszającego z 0,5 μl ligazy DNA T4, 1 μl Bsa I, 2 μl 10x buforu restrykcyjnego, 2 μl 10x buforu ligazy DNA T4, 2 μl starterów wyżarzających, 2,5 μl wektora (jego objętość jest dostosowana do proporcji) i 10 μl wody destylowanej. We wszystkich przypadkach należy stosować stosunek wkładki do wektora 2:1, aby osiągnąć wydajność montażu. Uruchom program montażu PCR jako (37 °C, 2 min; 16 °C, 3 min) z 30 cyklami i 55 °C, 30 min.</li>
	<li>Przekształć wynikowy wektor w komórki E. coli zgodnie z opisem23.</li>
	<li>Zaprojektuj startery flankujące miejsce insercji gRNA w plazmidzie. Używając tych starterów, wykonaj amplifikację PCR na poszczególnych koloniach, aby przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem udanych insercji. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera produktów PCR, aby potwierdzić pomyślne klonowanie i wyizolować plazmid24.</li>
</ol>
2. Przemiana Agrobacterium (czas 4 dni)
<ol>
	<li>Rozmrozić EHA105 Kompetentna komórka Agrobacterium na lodzie. Dodaj 1-2 μl plazmidowego DNA (zawierającego ~100-200 ng DNA) do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj.</li>
	<li>Transformację szoku cieplnego przeprowadzić poprzez umieszczenie probówki na lodzie na 5 minut, ciekłym azocie na 5 minut, szoku cieplnego w temperaturze 37 °C na 5 minut, a następnie w łaźni lodowej na 5 minut.</li>
	<li>Dodaj 700 μl pożywki z ekstraktem drożdżowym (YEP), bez antybiotyku, do probówki i delikatnie wymieszaj. Odzyskać komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 28 °C, 200-250 obr./min, przez 2-3 godziny.</li>
	<li>Odwirować kulturę przy 2 800 x g przez 1 minutę. Wyrzucić większość supernatantu, pozostawiając około 100 μl, i ponownie zawiesić komórki. Rozprowadzić komórki na płytkach agarowych YEP zawierających 1% antybiotyków (Kanamycyna i Ryfampicyna) w celu selekcji plazmidu. Inkubować płytkę w temperaturze 28 °C przez 24-48 godzin.</li>
	<li>Przesmaruj płytkę YEP (z opornością na antybiotyki) końcówką pipety zawierającą pojedynczą kolonię Agrobacterium zawierającą CRISPR/Cas i przenieś komórki do 5 ml płynnej pożywki YEP z odpowiednimi antybiotykami. Inkubować ciecz w temperaturze 28 °C przez 3 dni.</li>
	<li>Przekształcone szczepy Agrobacterium należy przechowywać w postaci zapasów glicerolu w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.</li>
</ol>
3. Transformacja ryżu przez Agrobacterium (czas 3 miesiące)
UWAGA: Opisano kilka metod transformacji roślin dla dostarczania i ekspresji obcej sekwencji DNA w komórce roślinnej25. Biorąc pod uwagę integrację pojedynczej kopii i niską częstotliwość DSB w genomie, transformacja za pośrednictwem Agrobacterium jest metodą z wyboru do integracji fragmentu ekspresji DNA z chromosomami ryżu.
<ol>
	<li>Wykonaj transformację ryżu za pośrednictwem Agrobacterium zgodnie z protokołem in25. Aktywnie rosnące kalusy (żółtawobiałe, stosunkowo suche o średnicy 1-3 mm) są kluczowym punktem dla efektywnej transformacji. Wyrzuć nasiona z rozwojem siewki lub brązowym kalusem przed zakażeniem kalusa Agrobacterium.</li>
</ol>
4. Genotypowanie roślin transgenicznych i zbiór nasion (czas 8 miesięcy)
UWAGA: Dwa pokolenia ryżu będą uprawiane w celu uzyskania homozygotycznej mutacji i obcych linii wolnych od DNA.
<ol>
	<li>Pobieranie próbek tkanki siewki: Przeszczep rośliny transgeniczne do doniczek i hoduj je przez 1 miesiąc w szklarni. Aby określić typ mutacji, zbierz 2-3 mg świeżych liści z każdego krzewu pojedynczej sadzonki i połącz je w jedną próbkę.</li>
	<li>Ekstrakcja genomowego DNA: Postępuj zgodnie z ustalonym protokołem ekstrakcji DNA genomu roślinnego26.</li>
	<li>Projektowanie starterów mutacji (Tabela uzupełniająca 1): Zaprojektuj startery PCR do amplifikacji regionu genu SBEIIb otaczającego miejsce docelowe sgRNA14. Wzmocniony fragment ma długość 493 pz.</li>
	<li>Genotypowanie mutacji: Sekwencjonuj fragmenty PCR bezpośrednio lub sklonuj je do wektora klonu T i sekwencjonuj przy użyciu metody Sangera w celu identyfikacji mutacji14.</li>
	<li>Zbiór nasion: Wybierz linie E0 wykazujące homozygotyczne mutacje przesunięcia ramki i posadź je w szklarni, aby uzyskać nasiona.</li>
	<li>Projektowanie starterów do identyfikacji T-DNA: Zaprojektuj trzy specyficzne startery dla kasety higromycyny, kasety UBI i kasety Cas konstruktu w celu identyfikacji obcych linii wolnych od DNA wśród mutacji (Tabela uzupełniająca 1).</li>
	<li>Potwierdzenie obcych linii wolnych od T-DNA: Zbierz liście z 2-tygodniowych siewek i wyekstrahuj DNA genomu rośliny, jak opisano w kroku 4.2. Przeprowadzić genomiczny PCR za pomocą następującego programu: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) z 35 cyklami i 72 °C, 5 min. Pozwala to na wykrycie kasety higromycyny, UBI i Cas w genomie rośliny.</li>
	<li>Przeanalizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej i wybierz linie, które nie wykazują prążków, co oznacza, że są to linie E1 wolne od transgenów. Zbierz nasiona z tych wybranych linii.</li>
</ol>
5. Pomiar zawartości skrobi opornej (czas 4 dni)
<ol>
	<li>Zbierz nasiona zmutowanych roślin i X134 i pozwól im naturalnie wyschnąć w temperaturze pokojowej, utrzymując wilgotność około 13%-15%. Oznaczyć zawartość skrobi opornej za pomocą procedury α-amylozy/amyloozydazy trzustkowej (AMG) opisanej poniżej.</li>
	<li>Aktywuj obieraczkę i wprowadź 10 g ziaren ryżu do podajnika, aby skutecznie usunąć łupinę ryżu, w wyniku czego uzyskasz przetworzone nasiona ryżu.</li>
	<li>Przenieś obrane nasiona ryżu do młynka do ryżu i pracuj przez 60 sekund, aby wyeliminować warstwę aleuronu, uzyskując polerowany ryż.</li>
	<li>Umieść wypolerowany ryż w młynku do tkanek, dostosowując częstotliwość mielenia do 60 Hz. Uruchom młynek na 15 sekund, powtarzając cykl 2x, aby uzyskać proszek ryżowy.</li>
	<li>Umieść zmielony ryż w proszku na szalce Petriego i umieść go w nagrzanym piekarniku. Ustaw temperaturę na 37 °C i pozostaw do wyschnięcia na 12 godzin.</li>
	<li>Dokładnie zważyć 100 mg ± 5 mg próbek i przelać bezpośrednio do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml. Delikatnie postukaj w probówkę, aby upewnić się, że próbka osiada na dnie.</li>
	<li>Dodać 180 μl oczyszczonej wody do probówki i gotować próbki przez 20 minut w łaźni wodnej.</li>
	<li>Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie wprowadzić 4 ml AMG (3 U/ml) zawierającego α-amylazę trzustkową (10 mg/ml) do każdej probówki.</li>
	<li>Bezpiecznie zakryć probówki, wymieszać je na oscylatorze wirowym i inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z ciągłym mieszaniem.</li>
	<li>Dodaj 4 ml etanolu i wymieszaj za pomocą wiru. Odwirować probówkę o masie 1 500 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Zdekantować supernatant, dodać 2 ml 50% etanolu, a następnie 6 ml 50% IMS i wymieszać za pomocą wirówki i wirówki.</li>
	<li>Ostrożnie wylać supernatant i odwrócić probówkę, aby spuścić nadmiar płynu. Umieścić probówki w łaźni lodowej, dodać 2 ml 2 M KOH do każdej probówki i mieszać próbki przez 20 minut w celu ponownego zawieszenia kłaczków i rozpuszczenia skrobi opornej.</li>
	<li>Dodaj 8 ml 1,2 M buforu octanu sodu (pH 3,8) do każdej probówki i wymieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
	<li>Natychmiast wprowadzić 0,1 ml AMG (3300 U/ml), dokładnie wymieszać i inkubować przez 30 minut w łaźni wodnej w temperaturze 50 °C z przerywanym mieszaniem za pomocą wiru. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 1 500 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieść 0,1 ml supernatantu do szklanej probówki, dodać 3 ml odczynnika oksydazy glukozowej/peroksydazy (GOPOD) i inkubować w temperaturze 50 °C przez 20 minut. Przygotować ślepą próbę odczynnika, mieszając 0,1 ml 100 mM buforu octanu sodu i 3 ml odczynnika GOPOD. Przygotuj wzorce, mieszając 0,1 ml D-glukozy z 3 ml odczynnika GOPOD.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować 200 μl każdego roztworu próby ślepej, roztworu, który ma być badany, oraz roztworu wzorcowego na płytkę 96-dołkową.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję każdej próbki przy długości fali 510 nm w stosunku do roztworu próby ślepej i obliczyć zawartość skrobi opornej, korzystając z podanego wzoru. 
	Skrobia oporna (g/100 g) = ΔA × F/W ×9,27 
	Gdzie ΔA = absorbancja odczytana w stosunku do ślepej próby odczynnika; F = przeliczenie z absorbancji na mikrogramy (określa się absorbancję otrzymaną dla 100 μg D-glukozy w reakcji GOPOD); W = sucha masa analizowanej próbki.</li>
</ol>
6. Poposiłkowa odpowiedź na stężenie glukozy we krwi (czas 5 dni)
<ol>
	<li>Zastosuj następujące kryteria włączenia uczestników: zdrowi dorośli Chińczycy pochodzenia azjatyckiego w wieku od 18 do 60 lat, osoby niepalące, wskaźnik masy ciała (BMI) między 18,5 a 25 kg/m2 oraz prawidłowe ciśnienie krwi (< 140/90 mm. Hg). Stosuj następujące kryteria wykluczenia: choroby metaboliczne (takie jak cukrzyca, nadciśnienie itp.), zaburzenia żołądkowo-jelitowe, nieprawidłowości układu hormonalnego lub choroby psychiczne. W sumie 10 uczestników zostało przebadanych i zrekrutowanych.</li>
	<li>Procedura sesji testowej (obejmująca dwa kolejne dni)
	<ol>
		<li>Dzień 0 (Dzień Przygotowania): Poproś uczestników, aby utrzymywali regularne wzorce snu i normalną dietę przez pierwsze 3 dni poprzedzające test. Wieczorem przed testem (po godzinie 20:00) poproś uczestników o powstrzymanie się od posiłków bogatych w błonnik i cukier. Energiczne ćwiczenia są odradzane rano pierwszego dnia.</li>
		<li>Dzień 1 (Dzień testu): Przygotuj biały ryż, mieląc nasiona ryżu, a następnie opłucz biały ryż 2x. Napełnij garnek 1,5 części wody na 1 część białego ryżu. Gotuj ryż, aż woda całkowicie się wchłonie. Wyłącz ogień, przykryj garnek i odstaw na 10 minut.</li>
		<li>Losowo przydziel 10 uczestników do dwóch równych grup: jednej grupy testowej karmionej białym ryżem opornym na skrobię i jednej grupy kontrolnej karmionej białym ryżem X134. Poproś uczestników, aby odpoczęli przez 10 minut przed rozpoczęciem testu.</li>
		<li>Sterylizuj opuszki palców 75% alkoholem medycznym. Delikatnie dociśnij lancet do opuszka palca i zwolnij sprężynę, aby nakłuć skórę. Delikatnie ściśnij palec, aby wytworzyć małą kropelkę krwi i przyłóż tę kroplę do absorbującego krew końca paska testowego w glukometrze. Glukometr automatycznie pobiera krew i rozpoczyna proces badania. Poczekaj na wyświetlenie odczytu stężenia glukozy we krwi.</li>
		<li>Spożycie ryżu i pobieranie próbek krwi: Przedstaw uczestnikom 50 g przygotowanego ryżu z 200 ml wody i poproś ich, aby zjedli to w wygodnym tempie w ciągu 5-10 minut. Po posiłku należy pobrać próbki krwi żylnej w następujących punktach czasowych: 15 min, 30 min, 60 min, 90 min i 120 min od rozpoczęcia posiłku. Wykonaj analizę stężenia glukozy we krwi jak w kroku 6.2.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

CRISPR-Based Efficient Genome Editing for Resistant Starch in Rice Breeding

<ol><li>Huang, X., Huang, S., Han, B., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+integrated+genomics+of+crop+domestication+and+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The integrated genomics of crop domestication and breeding.</a> Cell. 185 (15), 2828-2839 (2022).</li>
<li>Labroo, M. R., Studer, A. J., Rutkoski, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosis+and+hybrid+crop+breeding%3A+A+multidisciplinary+review%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Heterosis and hybrid crop breeding: A multidisciplinary review.</a> Front Genet. 12, 643761(2021).</li>
<li>Khalil, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+editing+revolution%3A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The genome editing revolution: review.</a> J Genet Eng Biotechnol. 18 (1), 68(2020).</li>
<li>Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Soria, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervening+sequences+of+regularly+spaced+prokaryotic+repeats+derive+from+foreign+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements.</a> J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).</li>
<li>Rath, D., Amlinger, L., Rath, A., Lundgren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR-Cas+immune+system%3A+biology%2C+mechanisms+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications.</a> Biochimie. 117, 119-128 (2015).</li>
<li>Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+plant+genomes+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Editing plant genomes with CRISPR/Cas9.</a> Curr Opin Biotechnol. 32, 76-84 (2015).</li>
<li>Koonin, E. V., Makarova, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+Genetic+Elements+and+evolution+of+CRISPR-Cas+systems%3A+All+the+way+there+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Mobile Genetic Elements and evolution of CRISPR-Cas systems: All the way there and back.</a> Genome Biol Evol. 9 (10), 2812-2825 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+functions+of+TaGW2+homoeologs+in+wheat+grain+weight+and+protein+content+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of the functions of TaGW2 homoeologs in wheat grain weight and protein content traits.</a> Plant J. 94 (5), 857-866 (2018).</li>
<li>Svitashev, S., Schwartz, C., Lenderts, B., Young, J. K., Mark Cigan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+maize+directed+by+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Nature Comm. 7, 13274(2016).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-guide+RNA+directed+genome+editing+in+Soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physio%22%5BJournal%5D)">Cas9-guide RNA directed genome editing in Soybean.</a> Plant Physio. 169 (2), 960-970 (2015).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessment+of+the+four+yield-related+genes+Gn1a%2C+DEP1%2C+GS3%2C+and+IPA1+in+rice+using+a+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Reassessment of the four yield-related genes Gn1a, DEP1, GS3, and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system.</a> Front Plant Sci. 7, 377(2016).</li>
<li>Karlson, C. K. S., Mohd-Noor, S. N., Nolte, N., Tan, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FdCas9-based+systems%3A+Mechanisms+and+applications+in+plant+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">CRISPR/dCas9-based systems: Mechanisms and applications in plant sciences.</a> Plants. 10 (10), 2055(2021).</li>
<li>Hua, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+the+application+of+genome-editing+technologies+in+crop+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Perspectives on the application of genome-editing technologies in crop breeding.</a> Mol Plant. 12 (8), 1047-1059 (2019).</li>
<li>Tsakirpaloglou, N., Septiningsih, E. M., Thomson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+performing+CRISPR%2FCas9+genome+editing+for+gene+validation+and+trait+improvement+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Guidelines for performing CRISPR/Cas9 genome editing for gene validation and trait improvement in crops.</a> Plants. 12 (20), 3564(2023).</li>
<li>Jeon, J. S., Ryoo, N., Hahn, T. R., Walia, H., Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+biosynthesis+in+cereal+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physio+Biochem%22%5BJournal%5D)">Starch biosynthesis in cereal endosperm.</a> Plant Physio Biochem. 48 (6), 383-392 (2010).</li>
<li>Crofts, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylopectin+biosynthetic+enzymes+from+developing+rice+seed+form+enzymatically+active+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Amylopectin biosynthetic enzymes from developing rice seed form enzymatically active protein complexes.</a> J Exp Bot. 66 (15), 4469-4482 (2015).</li>
<li>Butardo, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+down-regulation+of+starch+branching+enzyme+IIb+in+rice+by+artificial+microRNA-+and+hairpin+RNA-mediated+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Impact of down-regulation of starch branching enzyme IIb in rice by artificial microRNA- and hairpin RNA-mediated RNA silencing.</a> J Exp Bot. 62 (14), 4927-4941 (2011).</li>
<li>Baysal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+rice+starch+branching+enzyme+IIb+triggers+broad+and+unexpected+changes+in+metabolism+by+transcriptional+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Inactivation of rice starch branching enzyme IIb triggers broad and unexpected changes in metabolism by transcriptional reprogramming.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117 (42), 26503-26512 (2020).</li>
<li>Keenan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+resistant+starch+in+improving+gut+health%2C+adiposity%2C+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Nutr%22%5BJournal%5D)">Role of resistant starch in improving gut health, adiposity, and insulin resistance.</a> Adv Nutr. 6 (2), 198-205 (2015).</li>
<li>Shen, L., Li, J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistant+starch+formation+in+rice%3A+Genetic+regulation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Comm%22%5BJournal%5D)">Resistant starch formation in rice: Genetic regulation and beyond.</a> Plant Comm. 3 (3), 100329(2022).</li>
<li>Duan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+Cas12i+nuclease+that+is+an+efficient+genome+editing+tool+in+animals+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Innovation+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">An engineered Cas12i nuclease that is an efficient genome editing tool in animals and plants.</a> Innovation (Camb). 5 (2), 100564(2024).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinform. 13, 134(2012).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Ehrt, S., Schnappinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+plasmids+from+E.+coli+by+alkaline+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of plasmids from E. coli by alkaline lysis.</a> Meth Mol Biol. 235, 75-78 (2003).</li>
<li>Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+Agrobacterium-mediated+transformation+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2796-2802 (2006).</li>
<li>Aboul-Maaty, N. A. F., Oraby, H. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+high-quality+genomic+DNA+from+different+plant+orders+applying+a+modified+CTAB-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Natl+Res+Cent%22%5BJournal%5D)">Extraction of high-quality genomic DNA from different plant orders applying a modified CTAB-based method.</a> Bull Natl Res Cent. 43, 25(2019).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+their+molecular+functions+determining+seed+structure%2C+components%2C+and+quality+of+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Rice%22%5BJournal%5D)">Genes and their molecular functions determining seed structure, components, and quality of rice.</a> Rice. 15 (1), 18(2022).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+two+metal-ion+catalysis+of+DNA+cleavage+by+Cas12i2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Structural basis for two metal-ion catalysis of DNA cleavage by Cas12i2.</a> Nat Commun. 11 (1), 5241(2020).</li>
<li>Lv, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+rice+using+CRISPR%2FCas12i3%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Genome editing in rice using CRISPR/Cas12i3.</a> Plant Biotechnol J. 22 (2), 379-385 (2024).</li>
<li>Čermák, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multipurpose+toolkit+to+enable+advanced+genome+engineering+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Multipurpose toolkit to enable advanced genome engineering in plants.</a> Plant Cell. 29 (6), 1196-1217 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W procesie konstruowania wektorów knockdown opartych na CRISPR/Cas-SF01 kluczowa jest skrupulatna selekcja jednoprzewodnikowych RNA (sgRNA). Wymaga to przyjęcia sekwencji, które wykazują wysoką wydajność edycji przy minimalnych efektach niedocelowych. Dodatkowo, synteza starterów celujących obejmuje krótkie oligonukleotydy adapterowe pasujące do miejsc łączenia wektora, zapewniając bezproblemową integrację. Warto zauważyć, że w przeciwieństwie do poprzednich metodologii, które wymagały sekwencyjnego trawienia enzymatyczn...

Tradycyjna hodowla polega na wprowadzaniu cech do upraw lub wytwarzaniu populacji roślin o wystarczającej różnorodności, co wymaga długoterminowej obserwacji terenowej1,2. Ze względu na ograniczenia tradycyjnej hodowli opracowano technologię edycji genów, która może precyzyjnie modyfikować genom roślin uprawnych w celu uzyskania pożądanych cech populacji roślin3. Najczęściej stosowanym systemem edycji genów u roślin jest CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), który opiera się na programowalnej endonukleazie sterowanej RNA w celu tworzenia ukierunkowanych pęknięć dwuniciowych (DSB) w klasie DNA<sup='xref'>4,5. Te DSB są następnie naprawiane przez naturalne mechanizmy naprawy DNA komórki6,7, często powodując wprowadzenie pożądanych zmian genetycznych. Chociaż technologia ta została wdrożona w różnych uprawach, w tym w pszenica8, kukurydza9, soybeans10 i ryż11, jest ona używana głównie do ujawniania problemów biologicznych. W porównaniu z jego szerokim zastosowaniem w wyjaśnianiu funkcji genów roślin, badania nad zastosowaniem technologii edycji genów w hodowli roślin pozostają stosunkowo rzadkie12.
Proces edycji genów w uprawach zazwyczaj przebiega według dobrze zdefiniowanego przepływu pracy, który obejmuje kilka kluczowych kroków13. Pierwszym krokiem jest zidentyfikowanie konkretnego genu lub regionu genetycznego, który należy zmodyfikować, aby osiągnąć pożądaną cechę. Po drugie, projektowana jest strategia edycji genów, obejmująca wybór odpowiedniego systemu edycji genów (np. CRISPR-Cas9 lub CRISPR-Cas12) oraz projektowanie specyficznych przewodników RNA, które kierują endonukleazę do miejsca docelowego. Po trzecie, system edycji genów jest następnie włączany do wektora dostarczania, który jest używany do wprowadzania maszynerii edycyjnej do komórek roślinnych. Wektory te mogą być kompleksami DNA, RNA lub rybonukleoproteinami (RNP). Następnie wektory edycji genów są dostarczane do komórek roślinnych przy użyciu różnych metod, w tym transformacji za pośrednictwem Agrobacterium, bombardowania cząstkami lub elektroporacji. Natychmiast przekształcone komórki roślinne są hodowane w odpowiednich warunkach w celu wytworzenia genetycznie edytowanego kalusa lub tkanek embrionalnych. Tkanki te są następnie regenerowane w całe rośliny za pomocą technik hodowli tkankowych. Zregenerowane rośliny poddawane są rygorystycznej charakterystyce molekularnej, która ma potwierdzić obecność pożądanych zmian genetycznych. 
Poprzedni artykuł autorstwa Tsakirpaloglou et al.14 dostarcza szerokiego przeglądu procesu edycji genów, od projektowania wektorów do generowania edytowanych siewek, ale nie zagłębia się w szczegółową analizę specyficznych cech związanych z docelowym genem, ani późniejszą ocenę wydajności agronomicznej lub funkcjonalnej walidacji edytowanych upraw. Wyszliśmy poza zwykłe zademonstrowanie wykonalności edycji genu w ryżu. Nasza praca kompleksowo ocenia wpływ tej edycji na cechy biochemiczne, molekularne i agronomiczne edytowanych linii ryżu. Obejmuje to ocenę składu skrobi, kluczowego czynnika wpływającego na jakość ziarna i wartość odżywczą, który nie został szeroko zbadany w poprzednich badaniach nad edycją genów. 
Skrobia ryżowa zazwyczaj składa się z ~20% amylozy i ~80% amylopektyny15. SBEIIb jest enzymem niezbędnym do syntezy amylopektyny i ulega ekspresji w endospermie<klasa sup='xref'>16. Knockdown OsSBEIIb przez ekspresję RNA spinki do włosów (RNAi) i mikroRNA zwiększył zawartość skrobi opornej17,18. Skrobia oporna to skrobia substratowa, która nie może być trawiona i wchłaniana w jelicie cienkim, ale może być rozkładana na krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe i gazy przez niektóre bakterie trawienne w jelitach. Ponieważ nie można jej szybko rozłożyć, ma niższy indeks glikemiczny w porównaniu z innymi skrobiami i nie powoduje szybkiego wzrostu poziomu cukru we krwi w krótkim czasie po jedzeniu, co może w pewnym stopniu złagodzić cukrzycę w Diet19. Ponadto skrobia oporna pełni bardziej fizjologiczne funkcje, takie jak zmniejszanie odpowiedzi insulinowej, regulacja funkcji jelit, zapobieganie gromadzeniu się tłuszczu, ułatwianie kontroli masy ciała i promowanie wchłaniania jonów mineralnych. Dlatego jest szeroko stosowany jako nowy rodzaj błonnika pokarmowego20. 
Aby sprostać tym wyzwaniom i skutecznie wykorzystać technologie edycji genów do hodowli funkcjonalnych odmian ryżu, udoskonaliliśmy i zoptymalizowaliśmy protokoły operacyjne w ryżu. Skupiliśmy się na skrupulatnej analizie projektu docelowych loci genów, starannym doborze najbardziej odpowiednich narzędzi do edycji genów i przeprowadzeniu rygorystycznej analizy fenotypowej w całym procesie hodowli. Jako świadectwo mocy i skuteczności tych technologii przedstawiamy studium przypadku prezentujące szybki rozwój funkcjonalnej odmiany ryżu wzbogaconej o skrobię o wysokiej odporności. Przykład ten podkreśla potencjał edycji genów w przyspieszaniu hodowli funkcjonalnego ryżu, rozwiązując obecny niedostatek badań w tej dziedzinie.

<table><tbody><tr><td>2 x Taq Plus Master Mix II</td><td>Vazyme Biotech Co., Ltd</td><td>P213</td><td>&nbsp; Wykrywanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) genów</td></tr><tr><td>Kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy (2,4-D) Solutio</td><td>Phyto Technology</td><td>D309</td><td></td></tr><tr><td>AAM</td><td>medium Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd</td><td>M9051C</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF</td><td>New england biolabs</td><td>R3535</td><td>Bsa I trawienie enzymatyczne wektora edytującego</td></tr><tr><td>antybiotyki karbenicylinowe</td><td>Applygen</td><td>APC8250-5</td><td>Wybór&nbsp; pożywka, pożywka regeneracyjna</td></tr><tr><td></td><td>BBI-Life SciencesCorporation</td><td>A603060-0500</td><td>Pożywka do indukcji kalusa, pożywka do wspólnej uprawy, pożywka selekcyjna, pożywka regeneracyjna</td></tr><tr><td>DH5 i alfa; Chemicznie kompetentna komórka</td><td>Weidi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>DL1001</td><td>E. coli kompetentne komórki</td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>BBI-Life SciencesCorporation</td><td>A610491-0500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, sól disodowa, dihydrat</td><td>Diament</td><td>A100105-0500</td><td>CTAB bufor</td></tr><tr><td>EHA105 Chemicznie kompetentna komórka</td><td>Weidi Biotechnology Co., Ltd.</td><td>AC1010</td><td>Agrobacterium kompetentne komórki</td></tr><tr><td>FastPure Plasmid Mini Kit</td><td>Vazyme Biotech Co., Ltd</td><td>REC01-100</td><td>Plazmid izolowany</td></tr><tr><td>antybiotyki higromycynowe</td><td>Yeasen</td><td>60224ES</td><td>podłoże do wspólnej uprawy, podłoże selekcyjne, podłoże regeneracyjne i podłoże korzeniowe</td></tr><tr><td>Antybiotyki Kanamycyna</td><td>Yeasen</td><td>60206ES10</td><td>Selekcja agrobacterium</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Macklin</td><td>P766798</td><td>CTAB bufor</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Phyto Technology</td><td>G229</td><td>Pożywka do indukcji kalusa, pożywka do wspólnej uprawy, pożywka selekcyjna, pożywka regeneracyjna</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Phyto Technology</td><td>P698</td><td>Pożywka do indukcji kalusa, pożywka do wspólnej uprawy, pożywka selekcyjna, pożywka regeneracyjna</td></tr><tr><td>Suche nasiona ryżu Mautre (Xiushui134)</td> <td>-</td><td></td> <td>odmiany Japonica do hodowla RS</td></tr><tr><td>ryż Młyn ryżowy mechine</td><td>MARUMASU</td><td>MHR1500A</td><td>Do produkcji białego ryżu</td></tr><tr><td>Murashige Skoog</td><td>Phyto Technology</td><td>M519</td><td>Pożywka korzeniowa, pożywka regeneracyjna</td></tr><tr><td></td><td>Fitotechnologia</td><td>I703</td><td>Pożywka regeneracyjna</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Macklin</td><td>S805275</td><td>Dla&nbsp; Pożywka YEP</td></tr><tr><td>NB Basal Medium</td><td>Phyto Technology</td><td>N492</td><td>Pożywka do indukcji kalusa, pożywka do wspólnej uprawy, pożywka selekcyjna, pożywka regeneracyjna</td></tr><tr><td>Pepton&nbsp;</td><td>Solarbio</td><td>LA8800</td><td>dla&nbsp; YEP media</td></tr><tr><td>Fitożel</td><td>Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd</td><td>S24793</td><td></td></tr><tr><td>Pot&nbsp;</td><td>Grupa Midea Co.</td><td>MB-5E86</td><td>Do gotowania ryżu</td></tr><tr><td>Lodówka</td><td>Haier</td><td>BCD-170</td><td>Przechowywanie podłoża</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania skrobi opornej</td><td>Megazyme</td><td>K-RSTAR</td><td>Pomiar i analiza skrobi opornej</td></tr><tr><td>Antybiotyki ryfampicyny</td><td>Sigma</td><td>R3501-250MG</td><td>Selekcja agrobacterium</td></tr><tr><td>Roztwór podchlorynu sodu</td><td>Macklin</td><td>S817439</td><td>Do sterylizacji nasion</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd</td><td>B21647</td><td>Pożywka do indukcji kalusa, pożywka do wspólnej uprawy, pożywka selekcyjna, pożywka regeneracyjna</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>Nowa anglia biolabs</td><td>M0202</td><td>Łączenie sgRNA z wektorem CEISPRY/Cas-SF01</td></tr><tr><td>Monitor glukozy</td><td>Sprzęt medyczny i Supply Co., Ltd</td><td>Xuetang 582</td><td>Wykrywanie glukozy we krwi</td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Macklin</td><td>T766494</td><td>bufor CTAB</td></tr><tr><td>Agar drożdżowy</td><td>Solarbio</td><td>LA1370</td><td>dla&nbsp; YEP media</td></tr><tr><td>YEP media</td><td>-</td><td>-</td><td>Uprawa Agrobacterium</td></tr></tbody></table>

hodowla według projektu funkcjonalnego ryżu z technologiami edycji genomu

Breeding by Design for Functional Rice with Genome Editing Technologies

Konwencjonalne podejścia do hodowli roślin, które opierają się głównie na czasochłonnych i pracochłonnych metodach, takich jak tradycyjna hybrydyzacja i hodowla mutacyjna, stoją przed wyzwaniami w efektywnym wprowadzaniu docelowych cech i generowaniu zróżnicowanych populacji roślin. Z drugiej strony, pojawienie się technologii edycji genomu zapoczątkowało zmianę paradygmatu, umożliwiając precyzyjną i przyspieszoną manipulację genomami roślin w celu celowego wprowadzenia pożądanych cech. Jednym z najbardziej rozpowszechnionych narzędzi edycyjnych jest system CRISPR/Cas, który był używany przez naukowców do badania ważnych problemów związanych z biologią. Jednak precyzyjny i efektywny proces edycji genomu nie został dobrze zdefiniowany w hodowli roślin. W tym badaniu pokazaliśmy cały proces hodowli odmian ryżu wzbogaconych o wysoki poziom skrobi opornej (RS), cechy funkcjonalnej, która odgrywa kluczową rolę w zapobieganiu chorobom takim jak cukrzyca i otyłość. Przebieg pracy obejmował kilka kluczowych etapów, takich jak wybór funkcjonalnego genu SBEIIb, zaprojektowanie jednoprzewodnikowego RNA (sgRNA), wybór odpowiedniego wektora edycji genomu, określenie metody dostarczania wektora, przeprowadzenie hodowli tkanek roślinnych, genotypowanie mutacji i analiza fenotypowa. Dodatkowo w przejrzysty sposób zostały przedstawione ramy czasowe niezbędne dla każdego etapu procesu. Protokół ten nie tylko usprawnia proces hodowli, ale także zwiększa dokładność i efektywność wprowadzania cech, przyspieszając w ten sposób rozwój funkcjonalnych odmian ryżu.

W niniejszym badaniu zaprezentowano pełne procedury hodowli funkcjonalnego ryżu z wykorzystaniem edycji genomu w celu uzyskania stabilnych odmian ryżu o wysokiej zawartości skrobi opornej. Zintegrowano sgRNA celujące w SBEIIb z CRISPR/Cas-SF01 (Supplementary Figure 1), przeprowadzono infiltrację ryżu poprzez transformację Agrobacterium, a następnie uzyskano rośliny pokolenia E0 po etapach selekcji i ukorzeniania. Wyselekcjonowano rośliny z utratą funkcji genu, a po zbiorze nasion określ...

Protokół opisuje hodowlę odpornych odmian ryżu skrobiowego za pomocą technologii edycji genomu w precyzyjny, wydajny i technicznie prosty sposób.

Hodowla według projektu funkcjonalnego ryżu z technologiami edycji genomu

The conventional approaches to crop breeding, which rely predominantly on time-consuming and labor-intensive methods such as traditional hybridization and ...

Pracujemy nad hodowlą ryżu funkcjonalnego z technologiami edycji genomu. Nasze badania nie polegają tylko na zastosowaniu narzędzia do edycji genów, ale skupiają się na integracji wielu aspektów, od selekcji genów i optymalizacji narzędzi do edycji, po szczegółową analizę cech fenotypowych i agronomicznych. Wyszliśmy poza zwykłe zademonstrowanie wykonalności edycji genu SBE2b w ryżu.Nasza praca pozwoli kompleksowo ocenić wpływ tego edytora na materiał chemiczny i cechy agronomiczne edytowanych roślin ryżu. Nasze laboratorium skupi się w przyszłości na kilku kluczowych pytaniach badawczych, mając na celu przesunięcie granic technologii edycji genetycznej i hodowli roślin. W szczególności jesteśmy zaangażowani w dostarczanie szerokiej gamy odmian z grup funkcjonalnych, które nie tylko charakteryzują się wysokimi plonami i wyjątkową jakością, ale także wykazują wysoką tolerancję na stres.Aby rozpocząć, przejdź do strony NCBI, aby pobrać wymagany gen z odmiany ryżu Japonica. Pobierz i uzyskaj dostęp do genomu referencyjnego w oprogramowaniu SnapGene. Przeanalizuj insercje lub delecje i polimorfizmy pojedynczego nukleotydu w sekwencji eksonu OSSBE2b z odmiany X134, porównując ją z genomem referencyjnym.Korzystając z narzędzia NCBI Primer-BLAST, zaprojektuj startery otaczające regiony eksonów. Aby zwalidować sekwencję eksonów genu OSSBE2b w X134 za pomocą sekwencjonowania Sangera, przygotuj reakcję i uruchom program PCR z odpowiednimi ustawieniami. Zaprojektuj pojedynczy przewodnik RNA lub sgRNA na sekwencji eksonu OSSBE2b X134, zgodnie z protokołem Sachera-Paluglu, i upewnij się, że sekwencja motywu przylegającego do protospaceru to TTN.Dodaj oligonukleotydy ACAC na pięciu głównych końcach startera do przodu i oligonukleotydów GGCC na pięciu pierwszych końcach startera odwrotnego. Po rozpuszczeniu starterów wymieszaj jeden mikrolitr każdego startera z ośmioma mikrolitrami buforu do wyżarzania. Umieść mieszaninę w maszynie do PCR i uruchom program wyżarzania.Złóż sgRNA w wektorze edycji genomu i uruchom program do składania PCR. Przekształć otrzymany wektor w komórki Escherichia coli i wykonaj amplifikację PCR na poszczególnych koloniach w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem udanych insercji w celu potwierdzenia udanego klonowania przy użyciu sekwencjonowania Sangera. Na początek uzyskaj sgRNA i przekształć agrobacterium w plazmidowe DNA.Przeszczep rośliny transgeniczne do doniczek i hoduj je przez miesiąc w szklarni. Aby określić typ mutacji, należy zebrać od dwóch do trzech miligramów świeżych liści z każdego krzewu pojedynczej sadzonki jako pojedynczą próbkę, stosując ustalone protokoły. Wyodrębnij genomowe DNA z pobranych próbek liści.Zaprojektuj startery PCR do amplifikacji regionu genu SBE2b otaczającego miejsce docelowe pojedynczego przewodnika RNA w celu uzyskania amplifikowanego fragmentu o długości 493 par zasad. Sekwencjonuj fragmenty PCR bezpośrednio przy użyciu metody Sangera w celu identyfikacji mutacji. Wybierz linie E0 wykazujące homozygotyczne mutacje przesunięcia ramki i posadź je w szklarni, aby uzyskać nasiona.Następnie zbierz liście z dwutygodniowych sadzonek i wyekstrahuj genomowe DNA roślin. Wykonaj genomowy PCR przy użyciu odpowiedniego programu w celu wykrycia obecności higromycyny, UBI i kasety Cas w genomie rośliny. Analizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej, aby zidentyfikować linie, które nie wykazują prążków, co wskazuje, że są to linie E1 wolne od transgenów.Zbierz nasiona z tych wybranych linii. Zmutowane rośliny wykazywały całkowicie nieprzezroczysty woskowaty wygląd swoich ziaren, w przeciwieństwie do półprzezroczystego wyglądu ziaren typu dzikiego. Nie zaobserwowano istotnych różnic między mutantami SBE2B a roślinami typu dzikiego pod względem szybkości zawiązywania nasion, ilości ziaren na wiechę i plonu na roślinę.Na początek zbierz nasiona zmutowanych roślin i X134 i pozwól im naturalnie wyschnąć w temperaturze pokojowej, aż zawartość wilgoci osiągnie około 13 do 15%Po aktywacji obieraczki wprowadź 10 gramów ziaren ryżu do podajnika, aby skutecznie usunąć skorupę kleju. Przenieś obrane nasiona ryżu do młynka do ryżu i uruchom maszynę na 60 sekund, aby usunąć warstwę aleuronu, uzyskując polerowany ryż. Następnie umieść wypolerowany ryż w młynku do chusteczek.Dostosuj częstotliwość mielenia do 60 Hz i uruchom młynek na 15 sekund przez dwa cykle, aby wytworzyć proszek ryżowy. Umieść zmielony ryż w proszku na szalce Petriego i wstaw do nagrzanego piekarnika nagrzanego do 37 stopni Celsjusza na 12 godzin. Następnie dodaj 100 miligramów proszku ryżowego do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej i delikatnie postukaj w probówkę.Dodać 180 mikrolitrów oczyszczonej wody do probówki i gotować próbkę w łaźni wodnej przez 20 minut. Po ostygnięciu próbki wprowadzić do probówki cztery mililitry AMG zawierającej alfa-amylazę trzustkową. Następnie wymieszaj zawartość na oscylatorze wirowym i inkubuj rurkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin z ciągłym mieszaniem.Teraz dodaj cztery mililitry etanolu i wymieszaj próbkę za pomocą wiru. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 1 500 G przez 10 minut. Po dekantacji supernatantu dodaj dwa mililitry 50% etanolu, a następnie sześć mililitrów 50% IMS do probówki i wymieszaj.Po odwirowaniu probówki ostrożnie odlej supernatant i odwróć probówkę, aby spuścić nadmiar płynu. Umieszczając probówkę w łaźni lodowej, dodaj do niej dwa mililitry dwumolowego wodorotlenku potasu i mieszaj próbkę przez 20 minut w celu ponownego zawieszenia kłaczka i rozpuszczenia skrobi opornej. Dodaj do probówki osiem mililitrów 1,2-molowego buforu octanu sodu, dostosowanego do pH 3,8 i wymieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego.Następnie natychmiast wprowadź 0,1 mililitra AMG do mieszanki i dokładnie wymieszaj. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza w łaźni wodnej z przerywanym mieszaniem za pomocą wiru. Po inkubacji odwirować probówkę o stężeniu 1 500 G przez 10 minut.Teraz przenieś 0,1 mililitra supernatantu do świeżej szklanej probówki. Dodać trzy mililitry odczynnika oksydazy glukozowej/peroksydazy i inkubować próbkę w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 20 minut. Ostrożnie odpipetować 200 mikrolitrów każdego roztworu próbki ślepej i roztworu wzorcowego do płytki 96-dołkowej.Zmierzyć absorbancję każdej próbki w odległości 510 nanometrów w stosunku do roztworu próby ślepej i obliczyć zawartość skrobi opornej, korzystając ze wzoru. Na koniec zaprezentuj uczestnikom 50 gramów przygotowanego ryżu z 200 mililitrami wody. Po posiłku pobierz próbki krwi żylnej w różnych punktach czasowych, aby wykonać analizę stężenia glukozy we krwi.Zawartość skrobi opornej była istotnie wyższa w mutancie SBE2B i wyniosła 5,2% w porównaniu z typem dzikim. Spożycie przygotowanego ryżu doprowadziło do wolniejszej i zmniejszonej odpowiedzi glukozy po 15 i 30 minutach, ze zmniejszeniem odpowiednio o 9,7% i 3,7%.

breeding-design-for-functional-rice-with-genome-editing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie pokazujemy genetyczną transformację genomu ryżu za pomocą wektora binarnego Agrobacterium tumefaciens. Bakteria ta ułatwia przenoszenie obcego plazmidu DNA za pomocą białek wirulencji Agrobacterium.

Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium: metoda genetycznej transformacji genomu ryżu za pomocą genetycznie modyfikowanych Agrobacterium tumefaciens

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Opisany jest protokół rozwoju populacji Indukowanych Miejscowych Zmian Chorobowych (TILLING) w małych uprawach zbóż z użyciem metanosulfonianu etylu (EMS) jako mutagenu. Podano również protokół wykrywania mutacji za pomocą testu Cel-1.

Opracowanie ukierunkowanych populacji indukowanych miejscowymi zmianami chorobowymi w genomach (TILLING) w małych uprawach zbóż metodą mutagenezy metanosulfonianu etylu

W tym artykule prezentujemy protokół, który jest opisany jako analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) oparta na docelowych lokalnych zmianach w genomach (TILLING). Metoda ta wykorzystuje zmiany fluorescencji podczas topnienia dupleksu DNA i nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych zarówno insercji/delecji (Indel), jak i substytucji pojedynczej zasady (SBS).

Identyfikacja mutacji poprzez topnienie w wysokiej rozdzielczości w populacji ryżu uprawianej metodą TILLING

Przedstawiono metodę profilowania transkryptomu zbóż. Profilowanie ekspresji genów w oparciu o mikromacierze rozpoczyna się od wyizolowania wysokiej jakości całkowitego RNA z ziaren zbóż i jest kontynuowane wraz z generowaniem cDNA. Po znakowaniu cRNA i hybrydyzacji mikromacierzy podawane są zalecenia dotyczące wykrywania sygnału i kontroli jakości.

Uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów

Ta praca opisuje użycie technologii edycji genomu CRISPR-Cas9 do wyeliminowania endogennego genu OsABCG15, a następnie zmodyfikowanego protokołu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium w celu wytworzenia stabilnej męsko-sterylnej linii w ryżu.

Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium, produkcja transgeniczna i jej zastosowanie w badaniach nad rozwojem rozrodczym mężczyzn w ryżu

W tym badaniu, w bambusie opracowano nowatorską metodę ekspresji genów planta i edycji genów, w której pośredniczy Agrobacterium. Metoda ta znacznie poprawiła skuteczność walidacji funkcji genów w bambusie, co ma znaczące implikacje dla przyspieszenia procesu hodowli bambusa.

W Planta Ekspresja genów i edycja genów w liściach bambusa Moso

W wielu sytuacjach biologicznych i klinicznych korzystne jest badanie procesów komórkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. W niniejszym materiale opisujemy montaż i zastosowanie niedrogiego mikroskopu światłowodowego, który umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym w hodowlach komórkowych, badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów.

Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Poznaj hodowlę funkcjonalnych odmian ryżu z wykorzystaniem technologii edycji genomu. Protokół obejmuje edycję genu SBE2b, optymalizację narzędzi i analizę cech fenotypowych oraz agronomicznych.

Hodowla według projektu funkcjonalnego ryżu z technologiami edycji genomu

Przeglądaj więcej filmów