Hodowla według projektu funkcjonalnego ryżu z technologiami edycji genomu

Pracujemy nad hodowlą ryżu funkcjonalnego z technologiami edycji genomu. Nasze badania nie polegają tylko na zastosowaniu narzędzia do edycji genów, ale skupiają się na integracji wielu aspektów, od selekcji genów i optymalizacji narzędzi do edycji, po szczegółową analizę cech fenotypowych i agronomicznych. Wyszliśmy poza zwykłe zademonstrowanie wykonalności edycji genu SBE2b w ryżu.

Nasza praca pozwoli kompleksowo ocenić wpływ tego edytora na materiał chemiczny i cechy agronomiczne edytowanych roślin ryżu. Nasze laboratorium skupi się w przyszłości na kilku kluczowych pytaniach badawczych, mając na celu przesunięcie granic technologii edycji genetycznej i hodowli roślin. W szczególności jesteśmy zaangażowani w dostarczanie szerokiej gamy odmian z grup funkcjonalnych, które nie tylko charakteryzują się wysokimi plonami i wyjątkową jakością, ale także wykazują wysoką tolerancję na stres.

Aby rozpocząć, przejdź do strony NCBI, aby pobrać wymagany gen z odmiany ryżu Japonica. Pobierz i uzyskaj dostęp do genomu referencyjnego w oprogramowaniu SnapGene. Przeanalizuj insercje lub delecje i polimorfizmy pojedynczego nukleotydu w sekwencji eksonu OSSBE2b z odmiany X134, porównując ją z genomem referencyjnym.

Korzystając z narzędzia NCBI Primer-BLAST, zaprojektuj startery otaczające regiony eksonów. Aby zwalidować sekwencję eksonów genu OSSBE2b w X134 za pomocą sekwencjonowania Sangera, przygotuj reakcję i uruchom program PCR z odpowiednimi ustawieniami. Zaprojektuj pojedynczy przewodnik RNA lub sgRNA na sekwencji eksonu OSSBE2b X134, zgodnie z protokołem Sachera-Paluglu, i upewnij się, że sekwencja motywu przylegającego do protospaceru to TTN.

Dodaj oligonukleotydy ACAC na pięciu głównych końcach startera do przodu i oligonukleotydów GGCC na pięciu pierwszych końcach startera odwrotnego. Po rozpuszczeniu starterów wymieszaj jeden mikrolitr każdego startera z ośmioma mikrolitrami buforu do wyżarzania. Umieść mieszaninę w maszynie do PCR i uruchom program wyżarzania.

Złóż sgRNA w wektorze edycji genomu i uruchom program do składania PCR. Przekształć otrzymany wektor w komórki Escherichia coli i wykonaj amplifikację PCR na poszczególnych koloniach w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem udanych insercji w celu potwierdzenia udanego klonowania przy użyciu sekwencjonowania Sangera. Na początek uzyskaj sgRNA i przekształć agrobacterium w plazmidowe DNA.

Przeszczep rośliny transgeniczne do doniczek i hoduj je przez miesiąc w szklarni. Aby określić typ mutacji, należy zebrać od dwóch do trzech miligramów świeżych liści z każdego krzewu pojedynczej sadzonki jako pojedynczą próbkę, stosując ustalone protokoły. Wyodrębnij genomowe DNA z pobranych próbek liści.

Zaprojektuj startery PCR do amplifikacji regionu genu SBE2b otaczającego miejsce docelowe pojedynczego przewodnika RNA w celu uzyskania amplifikowanego fragmentu o długości 493 par zasad. Sekwencjonuj fragmenty PCR bezpośrednio przy użyciu metody Sangera w celu identyfikacji mutacji. Wybierz linie E0 wykazujące homozygotyczne mutacje przesunięcia ramki i posadź je w szklarni, aby uzyskać nasiona.

Następnie zbierz liście z dwutygodniowych sadzonek i wyekstrahuj genomowe DNA roślin. Wykonaj genomowy PCR przy użyciu odpowiedniego programu w celu wykrycia obecności higromycyny, UBI i kasety Cas w genomie rośliny. Analizuj produkty PCR za pomocą elektroforezy żelowej, aby zidentyfikować linie, które nie wykazują prążków, co wskazuje, że są to linie E1 wolne od transgenów.

Zbierz nasiona z tych wybranych linii. Zmutowane rośliny wykazywały całkowicie nieprzezroczysty woskowaty wygląd swoich ziaren, w przeciwieństwie do półprzezroczystego wyglądu ziaren typu dzikiego. Nie zaobserwowano istotnych różnic między mutantami SBE2B a roślinami typu dzikiego pod względem szybkości zawiązywania nasion, ilości ziaren na wiechę i plonu na roślinę.

Na początek zbierz nasiona zmutowanych roślin i X134 i pozwól im naturalnie wyschnąć w temperaturze pokojowej, aż zawartość wilgoci osiągnie około 13 do 15%Po aktywacji obieraczki wprowadź 10 gramów ziaren ryżu do podajnika, aby skutecznie usunąć skorupę kleju. Przenieś obrane nasiona ryżu do młynka do ryżu i uruchom maszynę na 60 sekund, aby usunąć warstwę aleuronu, uzyskując polerowany ryż. Następnie umieść wypolerowany ryż w młynku do chusteczek.

Dostosuj częstotliwość mielenia do 60 Hz i uruchom młynek na 15 sekund przez dwa cykle, aby wytworzyć proszek ryżowy. Umieść zmielony ryż w proszku na szalce Petriego i wstaw do nagrzanego piekarnika nagrzanego do 37 stopni Celsjusza na 12 godzin. Następnie dodaj 100 miligramów proszku ryżowego do dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej i delikatnie postukaj w probówkę.

Dodać 180 mikrolitrów oczyszczonej wody do probówki i gotować próbkę w łaźni wodnej przez 20 minut. Po ostygnięciu próbki wprowadzić do probówki cztery mililitry AMG zawierającej alfa-amylazę trzustkową. Następnie wymieszaj zawartość na oscylatorze wirowym i inkubuj rurkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin z ciągłym mieszaniem.

Teraz dodaj cztery mililitry etanolu i wymieszaj próbkę za pomocą wiru. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 1 500 G przez 10 minut. Po dekantacji supernatantu dodaj dwa mililitry 50% etanolu, a następnie sześć mililitrów 50% IMS do probówki i wymieszaj.

Po odwirowaniu probówki ostrożnie odlej supernatant i odwróć probówkę, aby spuścić nadmiar płynu. Umieszczając probówkę w łaźni lodowej, dodaj do niej dwa mililitry dwumolowego wodorotlenku potasu i mieszaj próbkę przez 20 minut w celu ponownego zawieszenia kłaczka i rozpuszczenia skrobi opornej. Dodaj do probówki osiem mililitrów 1,2-molowego buforu octanu sodu, dostosowanego do pH 3,8 i wymieszaj za pomocą mieszadła magnetycznego.

Następnie natychmiast wprowadź 0,1 mililitra AMG do mieszanki i dokładnie wymieszaj. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 50 stopni Celsjusza w łaźni wodnej z przerywanym mieszaniem za pomocą wiru. Po inkubacji odwirować probówkę o stężeniu 1 500 G przez 10 minut.

Teraz przenieś 0,1 mililitra supernatantu do świeżej szklanej probówki. Dodać trzy mililitry odczynnika oksydazy glukozowej/peroksydazy i inkubować próbkę w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 20 minut. Ostrożnie odpipetować 200 mikrolitrów każdego roztworu próbki ślepej i roztworu wzorcowego do płytki 96-dołkowej.

Zmierzyć absorbancję każdej próbki w odległości 510 nanometrów w stosunku do roztworu próby ślepej i obliczyć zawartość skrobi opornej, korzystając ze wzoru. Na koniec zaprezentuj uczestnikom 50 gramów przygotowanego ryżu z 200 mililitrami wody. Po posiłku pobierz próbki krwi żylnej w różnych punktach czasowych, aby wykonać analizę stężenia glukozy we krwi.

Zawartość skrobi opornej była istotnie wyższa w mutancie SBE2B i wyniosła 5,2% w porównaniu z typem dzikim. Spożycie przygotowanego ryżu doprowadziło do wolniejszej i zmniejszonej odpowiedzi glukozy po 15 i 30 minutach, ze zmniejszeniem odpowiednio o 9,7% i 3,7%.