Name: Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj tworzenie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z guzami mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego. Ta metoda umożliwia badanie zachowania nowotworów i odpowiedzi na leczenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują pacjentom, klinicystom i badaczom z Sydney Children's Hospital Network, Sydney Children's Tumour Bank Network oraz Zero Childhood Cancer Program za hojne dostarczenie próbek niezbędnych do ustalenia tej metodologii. Children's Cancer Institute Australia jest powiązany z Uniwersytetem Nowej Południowej Walii w Sydney i Siecią Szpitali Dziecięcych w Sydney. Protokół ten wynika z wysiłków badawczych wspieranych przez granty Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (Synergy Grant #2019056, Leadership Grant APP2017898 dla DZ) oraz Cancer Institute New South Wales Program Grant (TPG2037 dla DZ i MT), a także wsparcie z Levi's Project, The Kids Cancer Project, The Cure Starts Now, DIPG Collaborative, Cure Brain Cancer Foundation, Fundacja Roberta Connora Dawesa i Fundacja Benny'ego Willsa.

<ol><li>Mueller, S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+brain+tumors%3A+current+treatment+strategies+and+future+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Pediatric brain tumors: current treatment strategies and future therapeutic approaches.</a> Neurotherapeutics. 6 (3), 570-586 (2009).</li>
<li>Packer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumors+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Brain tumors in children.</a> Arch Neurol. 56 (4), 421-425 (1999).</li>
<li>Paugh, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+molecular+genetic+profiling+of+pediatric+high-grade+gliomas+reveals+key+differences+with+the+adult+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Integrated molecular genetic profiling of pediatric high-grade gliomas reveals key differences with the adult disease.</a> J Clin Oncol. 28 (18), 3061-3068 (2010).</li>
<li>MacDonald, T. J., Aguilera, D., Kramm, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+high-grade+glioma+in+children+and+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Treatment of high-grade glioma in children and adolescents.</a> Neuro Oncol. 13 (10), 1049-1058 (2011).</li>
<li>Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+brain+tumours+in+children+%3A+Present+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Neurosurg+Soc%22%5BJournal%5D)">Malignant brain tumours in children : Present and future perspectives.</a> J Korean Neurosurg Soc. 61 (3), 402-406 (2018).</li>
<li>Cho, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+analysis+of+medulloblastoma+identifies+a+molecular+subgroup+that+drives+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic analysis of medulloblastoma identifies a molecular subgroup that drives poor clinical outcome.</a> J Clin Oncol. 29 (11), 1424-1430 (2011).</li>
<li>Thomas, A., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma%3A+optimizing+care+with+a+multidisciplinary+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Multidiscip+Healthc%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma: optimizing care with a multidisciplinary approach.</a> J Multidiscip Healthc. 12, 335-347 (2019).</li>
<li>Pajtler, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+classification+of+ependymal+tumors+across+all+CNS+compartments%2C+histopathological+grades%2C+and+age+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular classification of ependymal tumors across all CNS compartments, histopathological grades, and age groups.</a> Cancer Cell. 27 (5), 728-743 (2015).</li>
<li>Thorp, N., Gandola, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+ependymoma+in+children%2C+adolescents+and+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Management of ependymoma in children, adolescents and young adults.</a> Clin Oncol. 31 (3), 162-170 (2019).</li>
<li>Upton, D. H., Ziegler, D. S., Tsoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+orthotopic+patient-derived+xenograft+models+of+pediatric+intracranial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of orthotopic patient-derived xenograft models of pediatric intracranial tumors.</a> Methods Mol Biol. 2806, 75-90 (2024).</li>
<li>Smith, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+orthotopic+xenografts+of+pediatric+brain+tumors%3A+a+St.+Jude+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived orthotopic xenografts of pediatric brain tumors: a St. Jude resource.</a> Acta Neuropathol. 140 (2), 209-225 (2020).</li>
<li>Akter, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+tumor+models+of+primary+brain+tumors%3A+Challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical tumor models of primary brain tumors: Challenges and opportunities.</a> Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1875 (1), 188458(2021).</li>
<li>Stribbling, S. M., Ryan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-line-derived+subcutaneous+tumor+model+in+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The cell-line-derived subcutaneous tumor model in preclinical cancer research.</a> Nat Protoc. 17 (9), 2108-2128 (2022).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+models+recapitulate+heterogeneity+of+molecular+signatures+and+drug+response+in+pediatric+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma.</a> Nat Commun. 12 (1), 4089(2021).</li>
<li>Tsoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+experience+in+the+development+of+patient-derived+xenograft+models+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">International experience in the development of patient-derived xenograft models of diffuse intrinsic pontine glioma.</a> J Neurooncol. 141 (2), 253-263 (2019).</li>
<li>Brabetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biobank+of+patient-derived+pediatric+brain+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models.</a> Nat Med. 24 (11), 1752-1761 (2018).</li>
<li>Khan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+polyamine+synthesis+and+uptake+in+diffuse+intrinsic+pontine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of polyamine synthesis and uptake in diffuse intrinsic pontine gliomas.</a> Nat Commun. 12 (1), 971(2021).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+protein+synthesis+inhibitor+omacetaxine+in+pediatric+brainstem+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neurooncol+Adv%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of protein synthesis inhibitor omacetaxine in pediatric brainstem gliomas.</a> Neurooncol Adv. 6 (1), vdae029(2024).</li>
<li>Ung, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin-loaded+gold+nanoarchitectures+as+a+therapeutic+strategy+against+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin-loaded gold nanoarchitectures as a therapeutic strategy against diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Cancers (Basel). 13 (6), 1278(2021).</li>
<li>Ehteda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+the+epigenome+via+FACT+complex+and+histone+deacetylase+is+a+potent+treatment+strategy+for+DIPG%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of the epigenome via FACT complex and histone deacetylase is a potent treatment strategy for DIPG.</a> Cell Rep. 35 (2), 108994(2021).</li>
<li>Mayoh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+drug+screening+of+primary+tumor+cells+identifies+therapeutic+strategies+for+treating+children+with+high-risk+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput drug screening of primary tumor cells identifies therapeutic strategies for treating children with high-risk cancer.</a> Cancer Res. 83 (16), 2716-2732 (2023).</li>
<li>Lin, G. L., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+rapid+post-mortem+cell+culture+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+%28DIPG%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Protocol for rapid post-mortem cell culture of diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG).</a> J Vis Exp. (121), e55360(2017).</li>
<li>Whitehouse, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+loss+of+tumorigenicity+in+a+patient-derived+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+ependymoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">In vivo loss of tumorigenicity in a patient-derived orthotopic xenograft mouse model of ependymoma.</a> Front Oncol. 13, 1123492(2023).</li>
<li>Hermans, E., Hulleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+orthotopic+xenograft+models+of+pediatric+brain+tumors%3A+In+a+mature+phase+or+still+in+its+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived orthotopic xenograft models of pediatric brain tumors: In a mature phase or still in its infancy.</a> Front Oncol. 9, 1418(2019).</li>
<li>Kim, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1670-1680 (2009).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22Paxinos+and+Franklin%27s+the+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 5th edn, Academic Press. (2019).</li>
<li>Tsoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genomics%2C+high+throughput+drug+screening%2C+and+personalized+xenograft+models+as+a+novel+precision+medicine+paradigm+for+high+risk+pediatric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Integration of genomics, high throughput drug screening, and personalized xenograft models as a novel precision medicine paradigm for high risk pediatric cancer.</a> Cancer Biol Ther. 19 (12), 1078-1087 (2018).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+and+interactions+of+tumor+microenvironment+components+in+medulloblastoma+with+implications+for+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Roles and interactions of tumor microenvironment components in medulloblastoma with implications for novel therapeutics.</a> Genes Chromosomes Cancer. 63 (4), e23233(2024).</li>
<li>Kondapaneni, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+mechanobiology+at+multiple+length+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Adv%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma mechanobiology at multiple length scales.</a> Biomater Adv. 160, 213860(2024).</li>
<li>Mahmoudian, E., Jahani-Asl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+brain+tumor+stem+cell+culture+from+patient+brain+tumors+and+imaging+analysis+of+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishing brain tumor stem cell culture from patient brain tumors and imaging analysis of patient-derived xenografts.</a> Methods Mol Biol. 2736, 177-192 (2024).</li>
<li>Oudin, A., Moreno-Sanchez, P. M., Baus, V., Niclou, S. P., Golebiewska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging-guided+intracranial+resection+of+glioblastoma+tumors+in+patient-derived+orthotopic+xenografts+leads+to+clinically+relevant+tumor+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging-guided intracranial resection of glioblastoma tumors in patient-derived orthotopic xenografts leads to clinically relevant tumor recurrence.</a> BMC Cancer. 24 (1), 3(2024).</li>
<li>Bauer, S., Wiest, R., Nolte, L. P., Reyes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+MRI-based+medical+image+analysis+for+brain+tumor+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">A survey of MRI-based medical image analysis for brain tumor studies.</a> Phys Med Biol. 58 (13), R97-R129 (2013).</li>
<li>Lasocki, A., Gaillard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-contrast-enhancing+tumor%3A+A+new+frontier+in+glioblastoma+research%5BTitle%5D)+AND+%22AJNR+Am+J+Neuroradiol%22%5BJournal%5D)">Non-contrast-enhancing tumor: A new frontier in glioblastoma research.</a> AJNR Am J Neuroradiol. 40 (5), 758-765 (2019).</li>
<li>Nichelli, L., Zaiss, M., Casagranda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APT+weighted+imaging+in+diffuse+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22BJR+Open%22%5BJournal%5D)">APT weighted imaging in diffuse gliomas.</a> BJR Open. 5 (1), 20230025(2023).</li>
<li>Genovesi, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+orthotopic+xenograft+models+of+medulloblastoma+lack+a+functional+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived orthotopic xenograft models of medulloblastoma lack a functional blood-brain barrier.</a> Neuro Oncol. 23 (5), 732-742 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż technika iniekcji wewnątrzczaszkowej opisana w tym badaniu zapewnia solidną metodę tworzenia ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) dla guzów mózgu u dzieci, kilka obszarów wymaga poprawy. Jednym z podejść do ulepszenia tej techniki jest optymalizacja procesu przygotowania komórek nowotworowych. Obejmuje to udoskonalanie materiałów używanych do implantacji komórek nowotworowych. Podczas gdy hydrożel ECM jest uważany za złoty standard, stosowanie hydrożeli składających się ze składników, które bardziej przypominają te z mózgu lub guza, ECM może zwiększyć przeżywalność i wszczepianie komórek BT. Takie podejście jest szczególnie korzystne w przypadku typów nowotworów z dłuższymi okresami wszczepienia, takich jak rdzeniaki zarodkowe i wyściółczaki. Na przykład wykazano, że kolagen odgrywa kluczową rolę we wzroście rdzeniaka zarodkowego grupy 3, podczas gdy laminina wspiera typ rdzeniaka zarodkowegoSHH 28. Dodatkowo sztywność ECM może również wpływać na wzrost guza. Na przykład glejaki wielopostaciowy o wysokim stopniu złośliwości wykazuje większą sztywność rdzenia w porównaniu z normalną tkanką mózgową, co może wspierać wzrost guza i przeżycie29. Dostosowując skład i sztywność ECM do specyficznych wymagań różnych typów nowotworów, wszczepianie i wzrost modeli PDX może być znacznie poprawione.
Kilka ostatnich badań dostarczyło cennych informacji na temat obchodzenia się z próbkami guzów u pacjentów i opracowywania modeli PDX. Tsoli i wsp. podkreślili, że bezpośrednia implantacja tkanki DMG zazwyczaj skutkuje wyższymi wskaźnikami wszczepienia niż hodowle pierwotne15. Smith i wsp. ustanowili 37 modeli PDX poprzez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie biopsji guza mózgu lub próbek autopsyjnych, zgłaszając ogólny wskaźnik sukcesu na poziomie 43%, przy czym HGG wykazały najwyższy wskaźnik wszczepienia (100%), a następnie rdzeniaki zarodkowe (45%) i wyściółczaki (25%). Latencja guza była bardzo zróżnicowana, od 1 do 11 miesięcy, przy czym bardziej agresywne guzy wszczepiały się szybciej11. W przeciwieństwie do tego, Brabetz i wsp. zgłosili niższy ogólny wskaźnik sukcesu wynoszący 30%, przy czym HGG wykazywały 31% wskaźnik wszczepienia i niższe wskaźniki rdzeniaków zarodkowych (37%) i wyściółczaków (17%)16. Pomimo tych różnic, ostatnie dwa badania przeprowadzone przez Smitha i wsp. oraz Brabetza i wsp. potwierdziły, że modele PDX na ogół rekapitulowały guzy pacjenta na poziomie immunohistochemicznym i molekularnym, chociaż zaobserwowano niewielkie rozbieżności genomowe między oryginalnymi próbkami guza a ustalonymi modelami. Odkrycia te podkreślają wyzwania związane z opracowaniem reprezentatywnych modeli PDX i podkreślają zmienność w powodzeniu przeszczepu w różnych typach nowotworów11,16.
Jednym z istotnych ograniczeń podejścia ortotopowego jest niemożność dokładnego zmierzenia wielkości guza, chyba że stosuje się system obrazowania, taki jak obrazowanie ksenogenowe, jeśli komórki nowotworowe są znakowane lucyferazy lub rezonansem magnetycznym (MRI). Znakowanie komórek nowotworowych lucyferazyą może zapewnić rozwiązanie, umożliwiając obrazowanie bioluminescencyjne w celu potwierdzenia wszczepienia i nieinwazyjnego monitorowania progresji guza. Metoda ta zwiększyłaby zdolność do dynamicznego śledzenia odpowiedzi na leczenie, oferując w ten sposób bardziej precyzyjną ocenę skuteczności terapeutycznej17,30. Alternatywna metoda polega na wykorzystaniu technologii MRI; Jednak wykrywalność guzów zależy od ich wielkości. Większe guzy są łatwiejsze do zidentyfikowania, co często jest punktem końcowym eksperymentu, a wykrywanie może się również różnić w zależności od podtypu guza, przy czym GBM jest łatwiejszy do wykrycia niż rozlane glejaki27,31. Szczególnie w przypadku rozlanych glejaków obecność nienaruszonej bariery krew-mózg (BBB) prowadzi do braku wzmocnienia kontrastu. Jednak w GBM nieszczelne unaczynienie i obecność obrzęku mogą wzmacniać kontrast między tkanką nowotworową a otaczającą ją zdrową tkanką mózgową, potencjalnie pomagając w procesie wykrywania. Ogólnie rzecz biorąc, środki kontrastujące są potrzebne do poprawy wykrywalności 30,31,32. Alternatywne techniki obrazowania, takie jak obrazowanie dyfuzyjne (DWI) i odzyskiwanie inwersji atenuowanej płynem (FLAIR), są czasami stosowane w celu poprawy wykrywania niewzmacniających się regionów guza. Jednak metody te mają również swoje ograniczenia i nie zawsze mogą zapewnić precyzyjne wyznaczenie granic guza33. Obrazowanie z transferem protonów amidowych (APTw) to nieinwazyjna technika MRI, która wykrywa rozlane glejaki poprzez śledzenie wymiany protonów białko-woda, pomagając w klasyfikacji guza. Choć jest obiecująca, stoi przed wyzwaniami, takimi jak podatność na artefakty, i nie została jeszcze przystosowana do obrazowania małych zwierząt, co ogranicza jej szersze zastosowanie34.
Innym kluczowym aspektem, który należy wziąć pod uwagę przy wykorzystaniu ortotopowych modeli BT PDX do badań skuteczności leków, jest integralność BBB w zastosowanych modelach PDX. Przepuszczalność bariery krew-mózg znacząco wpływa na dostarczanie leków i skuteczność w leczeniu guza mózgu. Na przykład utrzymanie integralności bariery krew-mózg w glejakach pnia mózgu często skutkuje słabą penetracją leków, co ogranicza skuteczność terapii ogólnoustrojowych17. Z drugiej strony, w rdzeniakach zarodkowych grupy 3 zaobserwowano, że integralność BBB jest niejednorodna w obrazowaniu MRI i podobnie stwierdzono, że jest nieszczelna w modelach ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX)35. W związku z tym scharakteryzowanie statusu BBB – niezależnie od tego, czy jest on nienaruszony, czy nieszczelny – w każdym modelu PDX jest niezbędne do zaprojektowania odpowiednich strategii terapeutycznych i dokładnej interpretacji wyników badań skuteczności leków.
Ogólnie rzecz biorąc, opisana procedura wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego oferuje solidne podejście do ustanawiania modeli BT PDX i przeprowadzania badań skuteczności środków terapeutycznych. Ciągłe udoskonalenia, w połączeniu z kompleksowym zrozumieniem tych modeli, zwiększą ich użyteczność i ułatwią opracowanie interwencji terapeutycznych dla pediatrycznych pacjentów z BT.

Guzy ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u dzieci są najczęstszymi guzami litymi u dzieci, stanowiącymi około 20%-25% pierwotnych guzów dziecięcych, o odmiennych cechach od guzów dorosłych pod względem częstości występowania i odpowiedzi na leczenie 1,2. Glejaki o wysokim stopniu złośliwości (HGG), takie jak glejak wielopostaciowy (GBM) i rozlany glejak mostu/rozlany glejak linii środkowej (DIPG/DMG), są szczególnie agresywne, z ponurymi rokowaniami i pomimo postępów w metodach leczenia, wskaźniki przeżycia pozostają niskie 3,4,5. Rdzeniaki, stanowiące prawie 20% nowotworów OUN u dzieci, osiągnęły wysoki wskaźnik 5-letniego przeżycia przy standardowej terapii, jednak niektóre podtypy stanowią wyzwanie, zwłaszcza w scenariuszach nawrotów 6,7. Wyściółczaki, stanowiące około 10% guzów ośrodkowego układu nerwowego u dzieci, wykazują zróżnicowane rokowanie w zależności od cech molekularnych i lokalizacji guza, a nawroty stanowią poważne wyzwanie kliniczne 8,9. Zrozumienie krajobrazu molekularnego i opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu (BT) daje nadzieję na opracowanie skutecznych terapii w celu poprawy wyników leczenia pacjentów pediatrycznych.
Opracowanie klinicznie istotnych modeli BT ma zasadnicze znaczenie dla postępu w badaniach neuroonkologicznych i odkryć terapeutycznych. Iniekcje ortotopowe przy użyciu urządzenia stereotaktycznego mają kluczowe znaczenie w tym podejściu, ponieważ pozwalają na precyzyjne umieszczenie komórek nowotworowych w mózgu, ściśle naśladując naturalne środowisko guzów mózgu10. Metoda ta zwiększa wiarygodność i odtwarzalność modeli nowotworów, ułatwiając dokładniejsze badania biologii guza i kluczowych cech, takich jak inwazja i angiogeneza, a także ocenę interwencji terapeutycznych11. Zdolność urządzenia stereotaktycznego do kontrolowania dokładnej lokalizacji i głębokości wstrzyknięć komórek zapewnia, że komórki nowotworowe są konsekwentnie umieszczane w zamierzonych obszarach mózgu, poprawiając w ten sposób wiarygodność wyników eksperymentalnych10. Modele podskórne stanowią bardziej dostępną i opłacalną opcję wstępnych badań przesiewowych środków terapeutycznych. W tych modelach komórki nowotworowe są wszczepiane pod skórę, co umożliwia proste monitorowanie wzrostu guza i reakcji na leczenie12. Chociaż brakuje im zdolności do replikowania złożonego mikrośrodowiska mózgu, modele podskórne pozostają bardzo cenne dla wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i wstępnych ocen skuteczności12,13.
Wiele badań wykazało pomyślny rozwój ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów (PDX) pochodzących od pacjentów z próbek guza mózgu, w tym bezpośredniej implantacji tkanek z próbek z autopsji lub biopsji oraz hodowli pierwotnego guza mózgu 11,14,15. Jednak ważne jest, aby przyznać, że wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie zdysocjowanej tkanki lub komórek nowotworowych nie zawsze gwarantuje wszczepienie, a przyczyny niepowodzenia nie są w pełni zrozumiałe15. Co ciekawe, próbki z biopsji HGG wykazują zwykle wyższy wskaźnik sukcesu w porównaniu z innymi podtypami guzów mózgu. Na przykład He i wsp. wykazali 56% wskaźnik sukcesu dla modeli ortotopowych HGG, podczas gdy badanie Brabetz i wsp. wykazało niższe wskaźniki wszczepienia, takie jak odpowiednio 43% i 30%, dla innych próbek guzów mózgu u dzieci, takich jak wyściółczak i rdzeniak zarodkowy 11,14,16. Warto zauważyć, że modele PDX guza mózgu wykazują szeroki zakres okresów utajenia, od 1 miesiąca do 11 miesięcy, przy czym późniejsze przeszczepy wykazują zmniejszoną użyteczność przedkliniczną. Pomimo ich zdolności do rekapitulacji choroby na poziomie molekularnym, zaobserwowano pewne rozbieżności genomiczne między biopsjami a ustalonymi modelami14,16.
Modele PDX służą jako niezbędne narzędzia w poszukiwaniu nowych strategii terapeutycznych przeciwko BT u dzieci. Są one uważane za złoty standard w przeprowadzaniu badań skuteczności leków, ponieważ modele wiernie odwzorowują ludzką chorobę pod względem wzrostu guza, objawów i farmakokinetyki leku ze względu na obecność bariery krew-mózg (BBB). Badania wykazały w dziedzinie glejaka pnia mózgu u dzieci, że zachowana integralność BBB i brak penetracji leków jest cechą, która prowadzi do zmniejszenia skuteczności terapeutycznej tych nowotworów 17,18,19. Jednak skuteczność można zaobserwować w wybranych terapiach, które wykazują odpowiednią penetrację leku, takich jak inhibitory epigenetyczne i metaboliczne17,20.
W badaniu przedstawiono metodę wykonywania wewnątrzczaszkowych wstrzyknięć komórek guza mózgu u zwierząt z obniżoną odpornością, mającą na celu ocenę wszczepienia w celu opracowania PDX i/lub oceny skuteczności terapeutycznej leku. Dostępne są również kompleksowe narzędzia do monitorowania progresji nowotworu aż do osiągnięcia etycznego eksperymentalnego punktu końcowego.

<table><tbody><tr><td>Środek znieczulający (np. izofluran)</td><td>Merck</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Merck</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>NIE</td><td>NIE</td><td>Zrób 70% etanolu ze 100% etanolu, rozcieńczając go sterylną wodą</td></tr><tr><td>80% etanolu</td><td>NIE</td><td>NIE</td><td>Zrób 80% etanolu ze 100% etanolu, rozcieńczając go sterylną wodą</td></tr><tr><td>Samoprzylepne szkiełka mikroskopowe</td><td>Merck</td><td>Z681156</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwbólowe (buprenorfina 0,3 mg/ml)</td><td>Jurox powiedział:</td><td>NIE</td><td></td></tr><tr><td>Kanister z filtrem węglowym</td><td>Wyposażenie weterynarza</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 15 ml (Falcon)</td><td>Fisher Naukowy</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml (Falcon)</td><td>Fisher Naukowy</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Nakładki na uszy</td><td>Kopf powiedział:</td><td>1921</td><td></td></tr><tr><td>Hydrożel ECM (Matrigel, Corning)</td><td>Merck</td><td>E1270 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu (Poly Visc)</td><td>ChemikBezpośredni&nbsp;</td><td>719986</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Merck</td><td>F0926 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>szklana mikrostrzykawka</td><td>Hamilton</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki z izopropanolu</td><td>Medisa</td><td>SUL_LWMS-1</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało KI67</td><td>Księga Abcam</td><td>ab209897 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>211-2130</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło do mikrowiertła&nbsp; 0,028"</td><td>Kopf powiedział:</td><td>8170</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka mikroiniekcyjna</td><td>Kopf powiedział:</td><td>5004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Merck</td><td>Zobacz materiał P4474</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 10 ml</td><td>Corning</td><td>CLS4488</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 1mL&nbsp;</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 200uL</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 20uL</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td>3123000098</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 25 ml</td><td>Corning</td><td>CLS4489</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet 1 ml</td><td>Corning</td><td>CLS4868</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet 200uL</td><td>Corning</td><td>CLS4860</td><td></td></tr><tr><td>Detergent do polisorbatu 20 (F10SC)</td><td>Zdrowie i higiena</td><td>Klasa G3070</td><td></td></tr><tr><td>Pulsoksymetr (MouseSTAT)</td><td>Naukowy Kent</td><td>SPO2-MSE</td><td></td></tr><tr><td>Jod (powidon-jod)</td><td>Merck</td><td>Y0000466</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel (jednorazowy)</td><td>Medisa</td><td>SUL_SCALPEL</td><td></td></tr><tr><td>Klej do skóry Vetbond</td><td>Medisa</td><td>3M_1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd stereotaktyczny Small Animal z cyfrowym wyświetlaczem konsola&nbsp;</td><td>Kopf powiedział:</td><td>940</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka stereotaktyczna&nbsp;</td><td>Kopf powiedział:</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>System monitorowania temperatury&nbsp;</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>55-7020</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Merck</td><td>93595</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

Opracowanie klinicznie istotnych i wiarygodnych modeli nowotworów ośrodkowego układu nerwowego (OUN) miało kluczowe znaczenie dla postępu w dziedzinie neuroonkologii. Jedną z najczęściej stosowanych technik jest ortotopowe wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe, metoda, która umożliwia badanie wzrostu, inwazji i rozprzestrzeniania się guza w kontrolowanych warunkach. Technika ta polega na przeszczepieniu komórek nowotworowych z określonego regionu pacjenta do odpowiedniego miejsca anatomicznego u zwierzęcia. W ten sposób te ortotopowe modele guzów mózgu oferują wyjątkową przewagę, ponieważ dokładniej odwzorowują biologiczne zachowanie raka i jego interakcje ze środowiskiem mózgu obserwowane u ludzi. To sprawia, że są one szczególnie cenne w przedklinicznych testach terapeutycznych, w których bliskie podobieństwo do scenariusza klinicznego ma zasadnicze znaczenie dla oceny potencjalnych metod leczenia. Protokół ten dzieli się doświadczeniami w opracowywaniu modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) dla guzów mózgu u dzieci, w tym rozlanego glejaka linii środkowej (DMG), glejaka (GBM), rdzeniaka zarodkowego i wyściółczaka. Metoda ta określa procedurę przeprowadzania wewnątrzczaszkowych wstrzyknięć stereotaktycznych u myszy, zapewniając prawidłowe ukierunkowanie miejsca wstrzyknięcia w mózgu. Dodatkowo opisujemy system monitorowania pozabiegowego stosowany do wykrywania oznak udanego wszczepienia guza. Po wstrzyknięciu guza wdrażany jest rygorystyczny system monitorowania w celu obserwacji zwierząt pod kątem wszelkich oznak upośledzenia neurologicznego, zmian behawioralnych i / lub utraty wagi, które są częstymi wskaźnikami progresji guza. System ten pozwala na szybką interwencję i dostarcza krytycznych danych dotyczących dynamiki wzrostu guza. Udoskonalając te modele i protokoły, dążymy do zwiększenia wiarygodności i potencjału translacyjnego badań przedklinicznych, przyczyniając się do opracowania skuteczniejszych metod leczenia nowotworów OUN u dzieci.

Iniekcje ortotopowe za pomocą urządzenia stereotaktycznego stały się niezbędne do opracowania modeli guza mózgu. Technika ta pozwala na precyzyjne i powtarzalne umieszczanie komórek nowotworowych, co ma kluczowe znaczenie dla generowania spójnych i wiarygodnych danych w badaniach neuroonkologicznych. Pomyślne wdrożenie zastrzyków ortotopowych zależy w dużej mierze od dokładnej konfiguracji sprzętu stereotaktycznego, który zazwyczaj obejmuje ramę stereotaktyczną, cyfrowy mikromanipulator do precyzyjnych ruchów, strzykawkę do wstrzykiwań i system znieczulenia do unieruchamiania zwierzęcia (ryc. 1A, B). Użycie szklanej mikrostrzykawki umożliwia wstrzykiwanie wewnątrzczaszkowe małych objętości, zwykle od 2 do 5 μl. Właściwa konserwacja i częste mycie są niezbędne, aby zapobiec gromadzeniu się materiału biologicznego, który może blokować wstrzyknięcie (ryc. 1C).
Procedura wewnątrzczaszkowego wstrzykiwania komórek guza mózgu za pomocą sprzętu stereotaktycznego u myszy obejmuje kilka kluczowych etapów. Po pierwsze, mysz jest znieczulana, aby pozostać nieruchomo i komfortowo przez cały zabieg. Typowe sygnały wskazujące, że zwierzę jest znieczulone, obejmują brak ruchu i odruchy po szczypnięciu palców, a także obecność regularnego wzorca oddychania. Następnie mysz umieszcza się w ramce stereotaktycznej, zabezpieczając jej głowę w ustalonej pozycji (Rysunek 2A). Za pomocą punktów orientacyjnych na czaszce, takich jak bregma i lambda, określa się dokładne współrzędne do wstrzyknięcia. W skórze głowy wykonuje się małe nacięcie, a w czaszce wierci się otwór na zadzior w wybranych współrzędnych (ryc. 2B). Igła do mikroiniekcji przymocowana do ramienia stereotaktycznego jest wprowadzana przez otwór w zadziorach, aby dostarczyć komórki nowotworowe do pożądanego obszaru mózgu (kory, móżdżku lub pnia mózgu; Rysunek 2C). Staranne monitorowanie i regulacja pozycji igły zapewniają dokładne celowanie. Po wstrzyknięciu igła jest powoli wycofywana, a nacięcie jest zamykane (ryc. 2D). Oczekuje się, że zapieczętowana rana zagoi się w ciągu dwóch tygodni po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym.
Po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym zwierzęta wymagają starannego monitorowania ogólnego samopoczucia i rozwoju objawów neurologicznych, które często wskazują na progresję guza (Tabela uzupełniająca 1). Zazwyczaj zwierzęta mogą doświadczyć niewielkiej utraty masy ciała w ciągu 1. tygodnia po wstrzyknięciu (do 10% ich najwyższej masy), która zwykle stabilizuje się, gdy miejsca wstrzyknięcia zostaną w pełni uszczelnione pod koniec 2. tygodnia. Ogólnie rzecz biorąc, zwierzęta wykazują stały wzrost masy ciała i utrzymują dobry ogólny stan zdrowia, dopóki nie nastąpi progresja guza. Manifestacja objawów neurologicznych różni się w zależności od takich czynników, jak rodzaj guza mózgu, miejsce wstrzyknięcia i szczep zwierzęcy. Na przykład glejaki korowe lub wyściółczaki mogą wykazywać postępującą utratę masy ciała i potencjalne powiększenie przodomózgowia, podczas gdy glejaki pnia mózgu i rdzeniak zarodkowy mogą wykazywać objawy, takie jak ataksja i przechylanie głowy, szczególnie u zwierząt z obniżoną odpornością (ryc. 3A). Dodatkowo, zachowanie krążenia można zaobserwować u zwierząt z guzami pnia mózgu, zwłaszcza w szczepach NSG lub NOD/SCID. Postęp objawów neurologicznych często zbiega się ze stopniową utratą wagi. Odpowiednie środki pielęgnacyjne, takie jak zapewnienie butelek z wodą z długimi dyszami lub oferowanie miękkiego pokarmu (papkowatego granulatu żywności) lub nasion, są niezbędne do wspierania dobrostanu zwierząt. Po osiągnięciu eksperymentalnego punktu końcowego i następującej po nim humanitarnej eutanazji zwierząt, mogą stać się widoczne potencjalne zmiany w mózgu, w tym powiększenie w miejscu wstrzyknięcia i/lub obecność obszarów krwotocznych (ryc. 3B).
Wykresy Kaplana-Meiera są powszechnie stosowane do przedstawiania wyników przeżycia modeli zwierzęcych guzów mózgu. Oferują one wizualne przedstawienie prawdopodobieństwa przeżycia w czasie po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym lub leczeniu przeciwnowotworowym. Wykresy te służą jako kluczowe narzędzia do analizy i prezentacji danych dotyczących przeżycia w warunkach badań przedklinicznych15,27. Wykonaliśmy iniekcje wewnątrzczaszkowe hodowli komórkowej rdzeniaka zarodkowego D425 o różnej gęstości komórek w móżdżku. U wszystkich zwierząt, którym wstrzyknięto wewnątrzczaszkowo, rozwinęły się nowotwory. Nasze wyniki wskazały, że wyższe gęstości komórek, w szczególności 50 000 i 100 000 komórek na mysz, wszczepiały się szybciej niż 10 000 komórek na mysz (ryc. 4). Ponadto wstrzyknęliśmy doczaszkowo komórki glejaka o wysokim stopniu złośliwości (HGG) pochodzące od pacjenta do kory mózgowej i pnia mózgu, aby porównać całkowite przeżycie i wzorzec wzrostu guza, a także cechy immunohistochemiczne w tych różnych lokalizacjach. Niezależnie od lokalizacji, wszystkim zwierzętom wstrzyknięto guzy rozwijające się wewnątrzczaszkowo. Posiew komórek HGG przeprowadzono zgodnie z protokołem szczegółowo opisanym w krokach od 1.1 do 1.10. Przygotowanie komórek do wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego przeprowadzono zgodnie z opisem w krokach 2.1 do 2.6, podczas gdy procedura iniekcji wewnątrzczaszkowej przebiegała zgodnie z metodą opisaną w krokach 4.1 do 4.1627. Po wstrzyknięciu do kory mózgowej komórki HGG wykazywały medianę przeżycia wynoszącą około 25 dni po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym (ryc. 5A). Zwierzęta były monitorowane w sposób opisany w krokach od 5.1 do 5.4. Zwierzęta te nie wykazywały żadnych objawów neurologicznych, ale wykazywały postępującą utratę wagi. Zwierzęta zostały humanitarnie poddane eutanazji po osiągnięciu humanitarnego punktu końcowego opisanego w kroku 5.5. Mózgi pobrano zgodnie z protokołem opisanym w krokach od 6.1 do 6.5 i wysłano do dalszej analizy27. Analiza immunohistochemiczna ujawniła dużą, silnie jądrzastą masę guza z dowodami na zwiększone unaczynienie (Figura 5B) i wiele proliferacyjnych komórek Ki67 (Figura 5C). Po wstrzyknięciu do pnia mózgu komórki HGG wykazywały medianę przeżycia wynoszącą około 26 dni po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym (ryc. 5D). Analiza immunohistochemiczna wykazała dużą masę guza w 4. komorze / górnym obszarze mostu, a także naciek opon mózgowo-rdzeniowych do komory bocznej (ryc. 5E). Dalsza analiza immunohistochemiczna wykazała wiele komórek proliferacyjnych w pniu mózgu i innych naciekanych obszarach (ryc. 5F). Eksperyment ten podkreśla, że wstrzykiwanie tych samych komórek nowotworowych w różne miejsca anatomiczne nie wpływa na tempo wzrostu guza, chociaż obserwuje się pewne różnice we wzorcu wzrostu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig1.jpg"> 
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy układu stereotaktycznego do wewnątrzczaszkowego wstrzykiwania komórek guza mózgu. (A) Aparat anestezjologiczny jest zwykle umieszczony obok kaptura BSC, co wymaga podwójnego podania znieczulenia zarówno do komory indukcyjnej, jak i aparatu stereotaktycznego. (B) Szklana stacja do mycia mikrostrzykawek i uchwyt stereotaktyczny; Strzykawka wymaga przepłukania solą fizjologiczną, etanolem, a następnie wodą po każdym wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym. (C) Konfiguracja stereotaktyczna wewnątrz okapu BSC, ilustrująca komorę anestezjologiczną, wiertarkę, urządzenie stereotaktyczne, konsolę współrzędnych stereotaktycznych, końcówki bawełniane, skalpel, pęsetę, pipetę i końcówki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig2.jpg"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego wykonywanego na myszy z obniżoną odpornością. (A) Znieczulone zwierzę umieszczone w stożku znieczulającym. (B) Nacięcie skóry, a następnie zabezpieczenie skóry z każdej strony za pomocą nauszników. (C) Szklana mikrostrzykawka umieszczona na wywierconym otworze do wstrzykiwań. (D) Po sklejeniu skóra tworzy styl irokeza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig3.jpg"> 
Rycina 3: Potencjalne objawy neurologiczne obserwowane po wszczepieniu komórek guza mózgu. (A) Zwierzę wykazujące pochylenie głowy po wewnątrzczaszkowym wstrzyknięciu komórek DMG do pnia mózgu. (B) Powiększenie prawej półkuli korowej po stronie iniekcyjnej ujawniające tworzenie się guza. Zwierzęciu wstrzyknięto komórki wyściółczaka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig4.jpg"> 
Rycina 4: Wszczepienie hodowli rdzeniaka zarodkowego D425 o różnej gęstości komórek. Komórki rdzeniaka wielopostaciowego wstrzykiwano doczaszkowo za pomocą sprzętu stereotaktycznego o gęstości 10 000 komórek w 2 μl hydrożelu ECM, 50 000 komórek i 100 000 komórek. Zwierzęta były monitorowane pod kątem postępującej utraty masy ciała i były humanitarnie poddawane eutanazji, gdy osiągnęły 20% poniżej najwyższej zarejestrowanej wagi. Mediana przeżycia dla zwierząt, którym wstrzyknięto 10 000 komórek, wynosiła 29 dni, podczas gdy mediana przeżycia dla zwierząt, którym wstrzyknięto komórki o większej gęstości wynoszącej 50 000 i 100 000 komórek, wynosiła odpowiednio 17,5 dnia i 15 dni. U wszystkich zwierząt, którym wstrzyknięto implant w tym badaniu, pomyślnie rozwinęły się nowotwory. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67349/67349fig5v2.jpg"> 
Rycina 5: Reprezentatywne krzywe przeżycia i analiza histologiczna zwierząt NSG, którym wstrzyknięto doczaszkowo komórki HGG w korze mózgowej i pniu mózgu. Około 100 000 komórek HGG (przejście 3) wstrzyknięto do 2 μl hydrożelu ECM przy użyciu sprzętu stereotaktycznego. Zwierzęta były monitorowane pod kątem postępującej utraty wagi i humanitarnie poddawane eutanazji, gdy osiągnęły 20% poniżej najwyższej zarejestrowanej wagi. Nie zaobserwowano żadnych objawów neurologicznych dla tego podtypu guza mózgu. (A) Mediana przeżycia zwierząt z komórkami HGG wstrzykniętymi do kory wynosi około 25 dni po wstrzyknięciu (N = 2). (B) Zabarwienie kory H&amp;E wykazuje silnie jądrzasty obszar ze zwiększonym unaczynieniem, na co wskazuje obecność czerwonych krwinek. (C) Obszar wszczepiony przez guz w korze wykazuje wysoki poziom komórek proliferacyjnych, jak pokazuje barwienie KI67. (D) Mediana przeżycia zwierząt z komórkami HGG wstrzykniętymi do pnia mózgu wynosi około 26 dni po wstrzyknięciu (N = 2). U wszystkich zwierząt, którym wstrzyknięto implant w tym badaniu, pomyślnie rozwinęły się nowotwory. (E) Barwienie pnia mózgu metodą H&amp;E wskazuje na silnie jądrzasty obszar z naciekiem guza obserwowanym w oponach mózgowych w komorze bocznej. (F) Obszar wszczepiony guzem w pniu mózgu wykazuje wysoki poziom komórek proliferacyjnych, jak pokazuje barwienie KI67. pasek skali na głównych obrazach wskazuje 2 mm, podczas gdy wstawione obrazy w powiększeniu wskazują 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/67349fig5v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Formularz monitorujący stosowany do kontroli wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych zwierząt i potencjalnego leczenia środkami przeciwnowotworowymi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67349/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of ...

W moich badaniach skupiamy się na opracowywaniu nowych metod leczenia agresywnych nowotworów mózgu u dzieci, takich jak rozlane glejaki linii środkowej, glejaki o wysokim stopniu złośliwości, wyściółczaki i ameloblastomaki. Naszym celem jest znalezienie nowych celów terapeutycznych i opracowanie terapii, które mogą mieć wpływ na pacjentów, jednocześnie badając, w jaki sposób te nowotwory mogą wpływać na otaczające środowisko mózgu. W badaniach nad guzami mózgu u dzieci opracowaliśmy modele ksenoprzeszczepów pochodzące od pacjenta przy użyciu iniekcji wewnątrzczaszkowych, zaawansowanego obrazowania i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków.Techniki takie jak transkryptomika jednokomórkowa i specjalna transkryptomika pomagają nam zrozumieć, w jaki sposób guz wpływa na środowisko mózgu i efekty leczenia, co pozwala nam badać nowe terapie. Nasza grupa zajmująca się nowotworami mózgu w Children's Cancer Institute opracowała wiele modeli pediatrycznych guzów mózgu u dzieci w ramach programu medycyny spersonalizowanej Zero Childhood Cancer. Odkryliśmy, że rozlane glejaki linii środkowej są oporne na leczenie farmakologiczne ze względu na nienaruszoną barierę krew-mózg.Obiecujące terapie ukierunkowane na szlaki epigenetyczne i onkogenne poprawiły przeżywalność dzieci i są obecnie w fazie rozwoju klinicznego. Korzystając z ortotopowych modeli guzów mózgu, chcielibyśmy zrozumieć, w jaki sposób guzy wpływają na unaczynienie mózgu. Stosując techniki, takie jak specjalna transkryptomika, chcielibyśmy zidentyfikować szlaki, na które wpływają guzy mózgu.Wiedza ta pomoże nam zidentyfikować modulatory bariery krew-mózg, które mogą poluzować barierę, umożliwiając skuteczniejsze przenikanie leków farmakologicznych. Na początek rozmrozić hodowane komórki guza mózgu tworzące neurosferę. W komorze bezpieczeństwa biologicznego ostrożnie odpipetować wyhodowane komórki i pożywkę z kolby do hodowli tkankowych do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów za pomocą pipety serologicznej.Odwirować stożkową probówkę o sile 300 G przez maksymalnie pięć minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą pipety o pojemności 25 mililitrów odessać pożywkę nad granulką, pozostawiając około 0,5 mililitra w probówce. Delikatnie pipetuj komórki w górę iw dół 10 razy za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, aby oddzielić osad komórkowy.Dodaj błękit trypanowy do zawiesiny komórek i policz za pomocą hemocytometru. Podwielokrotna zawiesina komórek zawierająca dwa miliony komórek do świeżej probówki. Dodaj 0,5 mililitra PBS do zawiesiny komórek.Następnie odwirować w temperaturze 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie umyć. Po ostatnim praniu odessać jak najwięcej PBS.Następnie umieść osad komórkowy i 50 mikrolitrów hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej na lodzie. Niezwłocznie wymieszaj osad komórkowy z hydrożelem macierzy zewnątrzkomórkowej, aby przygotować się do wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego. Aby rozpocząć, zamontuj znieczuloną mysz na urządzeniu stereotaktycznym.Upewnij się, że przednie zęby są zamocowane w listwie siekaczowej, a stożek nosowy zabezpiecza zwierzę na miejscu. Zdezynfekuj głowę myszy bawełnianą końcówką nasączoną jodem, a następnie chusteczką izopropanolową. Następnie nałóż maść rogówkową na oko na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.Wykonaj nacięcie u podstawy móżdżku i rozciągnij je w poprzek czaszki do punktu środkowego, aby utworzyć jednocentymetrowe cięcie wzdłuż górnej części czaszki. Zaciśnij skórę między uszami, aby odsłonić czaszkę, a następnie zaciśnij paski douszne, aby zabezpieczyć głowę. Oczyść powierzchnię czaszki i dokładnie osusz ją wacikiem.Przymocuj wiertło do ramy stereotaktycznej i zlokalizuj strukturę bregma lub lambdoid za pomocą wiertła. Po ustaleniu współrzędnych ostrożnie wywierć mały otwór w kości w wyznaczonym miejscu. Ponownie zawiesić przygotowaną zawiesinę komórek iniekcyjnych guza mózgu wiele razy za pomocą pipety, upewniając się, że unika się pęcherzyków powietrza.Narysuj dwa mikrolitry mieszaniny komórek do wstępnie umytej mikrostrzykawki z zimnego szkła i przymocuj strzykawkę do ramy stereotaktycznej. Przymocować igłę do czubka czaszki, aby przygotować się do wstrzyknięcia. W ciągu 30 sekund wstrzyknij komórki do wywierconego obszaru.Podczas wstrzyknięcia należy zetrzeć zawiesinę komórek refluksowych chusteczką z izopropanolem. Pozostawić strzykawkę na miejscu na jedną minutę, aby zapobiec przepływowi wstecznemu i pozwolić hydrożelowi macierzy zewnątrzkomórkowej osiąść. Następnie wyjąć strzykawkę i oczyścić ranę chusteczką z izopropanolem.W razie potrzeby uszczelnij nacięcie klejem do skóry lub klipsami do ran. Umieść mysz w pozycji leżącej w czystej klatce regeneracyjnej z lampą grzewczą lub poduszką grzewczą, aby utrzymać ciepło. Monitoruj zwierzę w sposób ciągły, aż zacznie poruszać się samodzielnie i normalnie.Po wstrzyknięciu wewnątrzczaszkowym monitoruj myszy pięć dni w tygodniu, aby ocenić ich ogólne samopoczucie. Rejestruj parametry, takie jak utrata wagi, poziom aktywności, postawa, oznaki odwodnienia i stan sierści na wyznaczonym arkuszu monitorowania. Zwierzęta wykazywały wyraźne objawy w zależności od rodzaju guza i miejsca wstrzyknięcia, takie jak przechylanie głowy w guzach pnia mózgu i powiększenie przodomózgowia w przypadku glejaków korowych lub wyściółczaków.Wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcia komórek rdzeniaka zarodkowego D425 o różnej gęstości wykazały bezpośrednią korelację między gęstością komórek a szybkością wszczepienia guza ze 100 000 komórek, co doprowadziło do najkrótszej mediany przeżycia wynoszącej 15 dni. Komórki glejaka o wysokim stopniu złośliwości wstrzyknięte do kory spowodowały medianę przeżycia wynoszącą około 25,5 dnia, a analiza immunohistochemiczna ujawniła dużą, silnie jądrzastą masę guza i zwiększone unaczynienie, a także liczne komórki proliferacyjne Ki-67 dodatnie. Wstrzyknięcia do pnia mózgu komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości spowodowały medianę przeżycia wynoszącą około 26 dni z analizą immunohistochemiczną wskazującą na masę guza w górnym moście i naciek opon mózgowo-rdzeniowych, a także proliferacyjne komórki Ki-67 dodatnie w obszarach naciekanych.

establishment-orthotopic-patient-derived-xenograft-models-for-brain

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ksenoprzeszczepy ludzkich guzów mózgu zmodyfikowane lucyferazą mogą być tworzone wewnątrzczaszkowo u myszy atymicznych, z późniejszym monitorowaniem wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W połączeniu z analizą przeżywalności, monitorowanie bioluminescencyjne stanowi niezbędne narzędzie badawcze w badaniach przedklinicznych terapii rozważanych w leczeniu guzów mózgu.

Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Celem niniejszego artykułu jest opis zastosowania ortotopowego modelu glejaka wielopostaciowego w badaniach nad chemoradioterapią. Artykuł ten obejmuje procesy przetwarzania komórek, implantację oraz radioterapię myszy z wykorzystaniem modelu wewnątrzczaszkowego.

Radioterapia skojarzona w ortotopowym modelu guza mózgu u myszy

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Ten film demonstruje wszczepianie komórek nowotworowych do mózgu myszy poprzez wykonanie iniekcji wewnątrzczaszkowej.

Wewnątrzczaszkowy model ortotopowy: procedura wszczepienia komórek rakowych do mózgu myszy

Złośliwe glejaki stanowią niejednorodną grupę wysoce naciekających nowotworów glejowych o wyraźnych cechach klinicznych i molekularnych. Pierwszorzędowe ksenoprzeszczepy ortotopowe podsumowują histopopatologiczne i molekularne cechy podtypów glejaka złośliwego w przedklinicznych modelach zwierzęcych.

Pierwotne ksenoprzeszczepy glejaka ortotopowego podsumowują wzrost naciekowy i mutację dehydrogenazy izocytrynianowej I

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Mózg to unikalne miejsce o cechach, które nie są dobrze reprezentowane przez analizy in vitro lub ektopowe. Ortotopowe modele myszy z powtarzalną lokalizacją i charakterystyką wzrostu można niezawodnie tworzyć za pomocą wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych przy użyciu stereotaktycznego przyrządu do fiksacji i niskociśnieniowej pompy strzykawkowej.

Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Modele PDX z przerzutami do ośrodkowego układu nerwowego reprezentują fenotypowe i molekularne cechy ludzkich przerzutów, co czyni je doskonałymi modelami do badań przedklinicznych. Poniżej opisano, jak ustalić modele PDX i drogi inokulacji, które najlepiej wykorzystać w badaniach przedklinicznych.

Opracowanie i wykorzystanie modeli ksenoprzeszczepów do ośrodkowego układu nerwowego pochodzących od pacjentów

Tutaj opisujemy przedkliniczny ortotopowy model myszy dla GBM, stworzony przez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych guzów myszy. Model ten wykazuje cechy charakterystyczne dla GBM u ludzi. W przypadku badań translacyjnych guz mózgu myszy jest śledzony za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i histopatologii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Poznaj tworzenie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z guzami mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego. Ta metoda umożliwia badanie zachowania nowotworów i odpowiedzi na leczenie.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Przeglądaj więcej filmów