Name: Walidacja koniugacji środka terapeutycznego z wyrobami medycznymi powlekanymi alkoholem winylowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Poznaj metodę koniugacji terapeutyków białkowych z membranami PVA w celu lokalnego uwalniania leków z wyrobów medycznych. Technika ta zmniejsza dawkowanie i ryzyko działań niepożądanych przy niższych kosztach leczenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez R. Keitha White'a, MD, za pośrednictwem Department of Surgery John C. McDonald Chair Fund, W. Reid Grimes, MD za pośrednictwem Department of Surgery Whitney Boggs Endowed Professorship Fund, oraz LSU LIFT2 grant, HSCS-2022-LIFT-002.

UWAGA: Sekcje 1 i 2 są ukończone w tym samym czasie. Powlekanie PVA i sieciowanie membrany PVA powinno być wykonane w tym samym czasie zarówno dla tulei rozprężnych, jak i płytki 24-dołkowej. Dzięki temu mogą być w tym samym czasie gotowi do stworzenia krzywej wzorcowej z 24-dołkową płytką, aby wykorzystać absorbancję do obliczenia stężenia GLP-2 w każdej osłonie.
1. Tworzenie urządzeń IES i VES z powłoką GLP-2
<ol>
	<li>Przygotuj 5% roztwór PVA, dodając 5 g PVA do 100 ml wody dejonizowanej. Aby pomóc się rozpuścić, rozważ wymieszanie na płycie grzejnej. Następnie przygotuj 1 mg/ml roztworu GLP-2, dodając 1 mg GLP-2 do 1 ml wody dejonizowanej.</li>
	<li>Rękawy rozprężne jelitowe i rękawy rozprężne dopochwowe przed zawarciem na szklanej pipecie, stabilizując końce plastikowymi pipetami przyciętymi tak, aby ściśle przylegały do szklanej pipety wokół wstępnie zaciśniętych rękawów.</li>
	<li>Pomaluj wstępnie zakontraktowane rękawy wstępnie przygotowanym 5% PVA za pomocą małego pędzla. Po pomalowaniu warstwy PVA pozostaw rękawy do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut, a następnie pomaluj kolejną warstwę, co daje łącznie 5 warstw PVA na każdym rękawie.</li>
	<li>Po wyschnięciu 5. warstwy umieść wstępnie skurczone rękawy w eksykatorze pod kapturem bezpieczeństwa chemicznego, aby umożliwić ich sieciowanie w temperaturze pokojowej. Zainicjuj sieciowanie, dodając 3 ml 25% aldehydu glutarowego i 3 ml 94%-98% kwasu siarkowego, aby oddzielić otwarte zlewki w eksykatorze, aby opary zareagowały i usieciowały membrany PVA na tulejach.</li>
	<li>Po usieciowaniu tulei w komorze przez 48 godzin, należy wyjąć je z komory i pozostawić aldehyd glutarowy do odparowania z tulei przez 15 min.</li>
	<li>Następnie dodać 50 μl roztworu GLP-2 o stężeniu 1 mg/ml, ostrożnie pipetując na każdy rękaw. Pozostawić do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej przed zdjęciem wstępnie zaciśniętych rękawów ze szklanej pipety i dodaniem każdej tulei do odpowiedniego dołka na płytce 24-dołkowej.</li>
</ol>
2. Tworzenie płytki 24-dołkowej pokrytej GLP-2
<ol>
	<li>Aby związać krzywą wzorcową GLP-2 z PVA, należy odpipetować 50 μl 5% PVA na dno 18 przeznaczonych do użycia studzienek na płytce 24-dołkowej. Pozostaw 6 studzienek pustych, aby pomieścić urządzenia IES i VES (po 3 dla każdego typu urządzenia).</li>
	<li>Pozostawić warstwę PVA do wyschnięcia na 24-dołkowej płytce przez noc w suszarce w temperaturze 120 °C.</li>
	<li>Umieść 24-dołkową płytkę w eksykatorze pod osłoną bezpieczeństwa chemicznego, aby umożliwić PVA sieciowanie przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Rozpocznij sieciowanie, dodając 3 ml 25% aldehydu glutarowego i 3 ml 94%-98% kwasu siarkowego w celu oddzielenia otwartych zlewek, aby opary mogły reagować wewnątrz komory i sieciować PVA na płytce 24-dołkowej.</li>
	<li>Po sieciowaniu przez 48 godzin wyjąć płytkę 24-dołkową z komory i pozostawić aldehyd glutarowy do odparowania z płytki przez 15 minut.</li>
	<li>Następnie wykonaj gradient stężeń, dodając 250 μl, 100 μl, 50 μl, 25 μl i 0 μl 1 mg/ml roztworu GLP-2 do ich oznakowanych studzienek, tworząc 24-dołkową płytkę z 3 dołkami dla każdego stężenia GLP-2 (250 μg, 100 μg, 50 μg, 25 μg, i 0 μg) oraz 3 dołki dla każdego rodzaju tulei (IES i VES).</li>
</ol>
3. Tworzenie krzywej standardowej i rozróżnianie stężenia GLP-2 w tulei
<ol>
	<li>Po dodaniu odpowiednich rozcieńczeń GLP-2 do studzienek i dodaniu do studzienek rękawów pokrytych lekiem, należy schłodzić płytkę przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić wiązanie leku.</li>
	<li>Następnego dnia dodaj 2 ml 1 mg/ml mleka w proszku w dejonizowanym roztworze blokującym wodę do każdej studzienki przez 1 godzinę. Po zablokowaniu umyj każdą studzienkę 3 razy PBS przez 5 minut każde mycie.</li>
	<li>Przygotować roztwór przeciwciała królika anty-GLP-2, dodając 40 μl króliczego przeciwciała anty-GLP-2 do 50 ml wody dejonizowanej. Następnie dodać 2 ml roztworu przeciwciała GLP-2 królika do każdego dołka na 24-dołkowej płytce i wstawić do lodówki na noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyj każdą studzienkę kolejne 3x PBS przez 5 minut każde płukanie. Wytwarzać fosfatazę alkaliczną anty-króliczą IgG w roztworze przeciwciał drugorzędowych kóz, dodając 20 ml przeciwciała drugorzędowego do 40 ml wody dejonizowanej. Następnie dodaj 2 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki i pozostaw na 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała wtórnego i przemyć każdą studzienkę kolejnym 3x PBS płukaniem przez 5 minut każde. Następnie dodaj niebieski substrat mikrostudzienki fosfatazy alkalicznej do każdej studzienki.</li>
	<li>Pozwolić, aby fosfataza alkaliczna sprzężona z przeciwciałem drugorzędowym reagowała z substratem przez 20 minut w temperaturze pokojowej. W miarę postępu reakcji obserwuj, czy kolor roztworu zmieni się z żółtego na niebieski.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję, pipetując 200 μl roztworu z każdej studzienki i umieść ją w 96-dołkowej płytce oznaczonej tak samo jak płytka 24-dołkowa. Po usunięciu odczynnika z płytki 24-dołkowej z membraną PVA sprzężoną z enzymem fosfatazy alkalicznej, reakcja zostanie zatrzymana, a kolor nie ulegnie zmianie.</li>
	<li>Odczytać 96-dołkową płytkę za pomocą czytnika mikropłytek absorbancji o długości fali 620 nm, aby wygenerować krzywą wzorcową i obliczyć stężenie GLP-2 na tulejach pokrytych PVA.</li>
</ol>

Localized Delivery of GLP-2 via PVA-Coated Medical Devices for Therapeutic Use

<ol><li>Conner, K. P., Devanaboyina, S. C., Thomas, V. A., Rock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biodistribution+of+therapeutic+proteins%3A+Mechanism%2C+implications+for+pharmacokinetics%2C+and+methods+of+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">The biodistribution of therapeutic proteins: Mechanism, implications for pharmacokinetics, and methods of evaluation.</a> Pharmacol Ther. 212, 107574(2020).</li>
<li>Ebrahimi, S. B., Samanta, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein-based+therapeutics+through+structural+and+chemical+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering protein-based therapeutics through structural and chemical design.</a> Nat Commun. 14 (1), 2411(2023).</li>
<li>Senst, B., Goyal, A., Basit, H., Borger, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSenst%2C+B+%22Drug+Eluting+Stent+Compounds%22">Drug Eluting Stent Compounds</a>. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2024).</li>
<li>Shan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+drug+delivery+via+biodegradable+ureteral+stent+for+the+treatment+of+upper+tract+urothelial+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Advances in drug delivery via biodegradable ureteral stent for the treatment of upper tract urothelial carcinoma.</a> Front Pharmacol. 11, 224(2020).</li>
<li>Zhu, C., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+overview+of+glucagon-like+peptide-2+analog+trophic+therapy+for+short+bowel+syndrome+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Int+Med+Res%22%5BJournal%5D)">An updated overview of glucagon-like peptide-2 analog trophic therapy for short bowel syndrome in adults.</a> J Int Med Res. 50 (3), 3000605221086145(2022).</li>
<li>Clayton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-expanding+intestinal+expansion+sleeves+%28IES%29+for+short+gut+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Surg+Int%22%5BJournal%5D)">Self-expanding intestinal expansion sleeves (IES) for short gut syndrome.</a> Pediatr Surg Int. 38 (1), 75-81 (2022).</li>
<li>Rosete, B. E., Wendel, D., Horslen, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teduglutide+for+pediatric+short+bowel+syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Teduglutide for pediatric short bowel syndrome patients.</a> Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (7), 727-733 (2021).</li>
<li>Novel Intestinal Expansion Sleeve (IES): promoting distraction enterogenesis in a live animal model. Colvin, J. C., et al. 39th Southern Biomedical Engineering Conference, , (2023).</li>
<li>Kim, K. J., Lee, S. B., Han, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+crosslinking+reaction+of+PVA+membrane+with+glutaraldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Chem+Eng%22%5BJournal%5D)">Kinetics of crosslinking reaction of PVA membrane with glutaraldehyde.</a> Korean J Chem Eng. 11 (1), 41-47 (1994).</li>
<li>Hamidi, M., Azadi, A., Rafiei, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+nanoparticles+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogel nanoparticles in drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 60 (15), 1638-1649 (2008).</li>
<li>Chong, S. F., Smith, A. A., Zelikin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured%2C+functional+PVA+hydrogels+through+bioconjugation+with+oligopeptides+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Microstructured, functional PVA hydrogels through bioconjugation with oligopeptides under physiological conditions.</a> Small. 9 (6), 942-950 (2013).</li>
<li>Jensen, B. E., Dávila, I., Zelikin, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28vinyl+alcohol%29+physical+hydrogels%3A+Matrix-mediated+drug+delivery+using+spontaneously+eroding+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Poly(vinyl alcohol) physical hydrogels: Matrix-mediated drug delivery using spontaneously eroding substrate.</a> J Phys Chem B. 120 (26), 5916-5926 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teduglutide+for+short+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Aust+Prescr%22%5BJournal%5D)">Teduglutide for short bowel syndrome.</a> Aust Prescr. 43 (2), 72-73 (2020).</li>
</ol>

Jonathan Steven Alexander i Christen J. Boyer posiadają patent US10537659B2, drukowane w 3D urządzenia medyczne z polialkoholu winylowego i metody aktywacji (2017). Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy tutaj metodologię wiązania leków opartych na białkach, takich jak GLP-2, z wyrobami medycznymi pokrytymi PVA i usieciowanymi. Stężenie związanego GLP-2 określono przez utworzenie standardowej krzywej stężenia GLP-2 na 24-dołkowych płytkach pokrytych PVA przez dodanie króliczego przeciwciała anty-GLP-2, koziej fosfatazy alkalicznej anty-króliczej IgG i niebieskiego substratu mikrostudzienki fosfatazy alkalicznej. Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z enzymem fosfatazy alkalicznej pozwoliło na dodanie substratu mikrodołka z niebieskiej fosfatazy alkalicznej, który zaczyna się od żółtego, a gdy fosfataza alkaliczna związana z przeciwciałem GLP-2 reaguje z substratem, zmienia kolor na niebieski. Ta zmiana koloru jest odczytywana przy absorbancji 620 nm w celu utworzenia krzywej wzorcowej na rysunku 2 i obliczenia harmonijności urządzeń IES i VES związanych z GLP-2 przy użyciu ich absorpcji. Po dodaniu 50 μg GLP-2 do tych urządzeń pokrytych PVA, 45% dodanego leku zostało związane z urządzeniem.
W tym protokole krytycznym krokiem jest etap sieciowania. Wyroby medyczne powlekane PVA wymagają ponad 48 godzin w hermetycznej komorze, aby umożliwić usieciowanie PVA przez 25% par aldehydu glutarowego i 94%-98% kwasu siarkowego na urządzeniach. To sieciowanie pozwala błonie PVA z grupami reaktywnymi być stabilną powierzchnią bioreaktywną, która wiąże terapie oparte na białkach w celu celowanego dostarczania leków. Użycie 5 warstw zostało określone empirycznie, ponieważ 1-2 warstwy powodowały ponowne rozprężenie przez 1 godzinę, 3 warstwy po 24 godzinach, a chcieliśmy, aby urządzenie potrzebowało kilku dni, aby ponownie się rozprężyć, aby zapewnić siłę rozpraszającą w czasie do rozszerzania się jelit i pochwy. Dzięki powierzchni 9,425cm2 urządzenia IES i VES mają potencjał do biokoniugacji dużej ilości środków terapeutycznych w porównaniu z ich niewielkimi rozmiarami. Jeśli etap sieciowania nie powiedzie się, stabilność membrany PVA jest zmniejszona, a zdolność do zatrzymywania biosprzężonych środków terapeutycznych jest obniżona, jak widać na IES 2 na rysunku 3.
Kowalencyjne wiązanie środków terapeutycznych opartych na białkach z wyrobami medycznymi pokrytymi PVA pozwala na miejscowe i skoncentrowane dostarczanie tych środków do miejsc zainteresowania, jednocześnie unikając podawania ogólnoustrojowego i związanych z tym kosztów i skutków niedocelowych. Obecnie typowa dawka teduglutydu dla wszystkich pacjentów wynosi 50 μg/kg mc. na dobę13. Ponieważ każdy rękaw przenosi 22 μg/cm2, jest to około 44% dawki ogólnoustrojowej w jednym urządzeniu. Dzięki powierzchni zewnętrznej 9,425cm2 tuleje te są w stanie miejscowo dostarczyć 213,85 μg GLP-2. Jest to dawka 4,3 razy większa niż dawka ogólnoustrojowa i jest zlokalizowana w obszarze zainteresowania. Celowalność pozwala na użycie mniejszej ilości leku poprzez ominięcie konieczności podawania ogólnoustrojowego. Obecnie roczna terapia teduglutydem kosztuje 295 000 USD za dawkę 50 μg/kg dziennie5. Poprzez koniuglutyd z rękawem należy zmniejszyć wymaganą dawkę leku i zminimalizować ogólnoustrojowe działania niepożądane. Do częstych działań niepożądanych teduglutydu należą: ból brzucha (28%), reakcja w miejscu wstrzyknięcia (26%), nudności (26%), wzdęcia brzucha (17%), ból głowy (16%) i wymioty (14%)13.
Ograniczeniem tego badania jest farmakodynamika i farmakokinetyka uwalniania GLP-2 w czasie z biosprzężonego wyrobu medycznego pokrytego PVA. Obecne badanie udokumentowało, że GLP-2 może być związany z usieciowanymi urządzeniami PVA, ale nie mamy jeszcze informacji na temat tego, jak długo lek pozostaje związany przed uwolnieniem z membrany PVA i jaki jest zakres całkowitego uwalniania GLP-2 z miejsca implantacji. Wiemy, że po kilku etapach prania GLP-2 pozostaje przyłączony do urządzenia, ale zakres koniugacji z urządzeniem i jak wpłynie to na uwalnianie, nie jest znany. W przyszłych badaniach będziemy mogli zmierzyć uwalnianie w supernatantach z IES i VES przechowywanych w biopłynach, aby modelować uwalnianie in vivo lub odzyskać te urządzenia w różnym czasie po implantacji in vivo , aby zmierzyć pozostały GLP-2. Dodatkowo planujemy zmierzyć, czy jakiekolwiek czynniki, takie jak pH, temperatura i wilgotność, wpływają na stabilność i szybkość uwalniania leku z urządzenia. Przyszłe eksperymenty pozwolą to ustalić poprzez wszczepienie biosprzężonej tulei PVA i zmierzenie stężenia leku wokół rękawa w różnych momentach po wdrożeniu i w różnych warunkach. Nie znając farmakodynamiki rękawa pokrytego PVA, nie jesteśmy w stanie określić, jak miejscowe dawkowanie GLP-2 porównałoby się z typowym dawkowaniem ogólnoustrojowym. Również maksymalna zdolność wiązania tulei pokrytych PVA jest nadal nieznana. Po dodaniu 50 μg stwierdzono, że 45% dodanego leku pozostało związane z rękawem. Może to oznaczać, że przekroczyliśmy już maksymalną zdolność wiązania. Przyszłe badania dodające różne stężenia GLP-2 do każdego rękawa są uzasadnione w celu określenia prawdziwej maksymalnej zdolności wiązania tych urządzeń i szybkości uwalniania przy różnych dawkach.
W tym miejscu weryfikujemy zdolność koniugacji terapeutycznej z naszymi wyrobami medycznymi pokrytymi PVA. Wyniki pokazują, że 44% dodanego GLP-2 było kowalencyjnie związane z urządzeniami IES i VES, co pozwoliło na wysoce skoncentrowane i miejscowe dostarczanie terapii opartych na białkach, takich jak GLP-2. Miejmy nadzieję, że miejscowe dostarczanie leków pomoże obniżyć koszty leczenia, zwiększyć dostępność i zmniejszyć skutki uboczne. Metodologia ta może być stosowana w setkach obecnie stosowanych terapii opartych na białkach w celu zwiększenia miejscowego dostarczania leków i poprawy wyników leczenia.

Wykazano, że terapie oparte na białkach, takie jak enzymy, przeciwciała, cytokiny, hormony i czynniki wzrostu, są bardzo skuteczne w leczeniu wielu chorób1. Jeśli poprawimy naszą wiedzę na temat tego, jak dostarczać te środki terapeutyczne, możemy znacznie posunąć naprzód biotechnologię stosowania tych substancji jako leków/zabiegów medycznych1. Skuteczność terapii białkowych jest ograniczona przez ich biodystrybucję, koszt i efekty niezamierzone. Podjęto kilka prób poprawy farmakokinetyki i farmakodynamiki terapii białkowych, w tym pegylacji, glikozylacji, lipidacji i fuzji innych białek2. "Celowalność" jest kolejnym problemem, ponieważ większość obecnych terapii białkowych ma wiele miejsc działania, co skutkuje efektami niezamierzonymi. W szczególności, ukierunkowanie tych leków na pożądane miejsca może obniżyć wymaganą dawkę terapeutyczną i zmniejszyć skutki uboczne2. Gdyby udało się ograniczyć dostarczanie leków do zamierzonego miejsca działania, możliwe byłoby radykalne ulepszenie leczenia, przy jednoczesnym ograniczeniu niepożądanych skutków ubocznych tych leków.
Obecnie używanych jest wiele urządzeń medycznych, które zawierają środki terapeutyczne, takie jak stenty uwalniające leki z antyproliferacyjną powłoką zawierającą klopidogrel, winkrystynę i winblastynę, aby zapobiec restenozy i potrzebie powtórnej rewaskularyzacji po cewnikowaniu serca3. Dodatkowo, biodegradowalne stenty moczowodowe uwalniające leki zawierające paklitaksel, doksorubicynę, gemcytabinę i inne środki antyproliferacyjne zostały stworzone, aby pomóc w leczeniu raka urotelialnego górnych dróg moczowych4. W miarę degradacji tych stentów, leki przeciwnowotworowe są uwalniane miejscowo w kontrolowany sposób, przedłużając dostarczanie leku bez konieczności dodatkowego dawkowania4. Metodologia ta pozwala na długoterminowe działanie leków przeciwnowotworowych w zamierzonym miejscu działania, jednocześnie zapobiegając potrzebie ekspozycji ogólnoustrojowej, ograniczając działanie leku na komórki nienowotworowe i zmniejszając toksyczność leków. Ponadto biodegradowalny charakter stentu może również zapobiec konieczności procedury usuwania stentu4.
Zespół krótkiego jelita (SBS) to kolejny stan, w którym stosowanie terapii opartych na białkach wykazało znaczną poprawę u pacjentów5. ZKJ może występować poprzez różne mechanizmy, ale skutkuje niewystarczającą długością jelit, powodując złe wchłanianie i niedożywienie. Terapie, takie jak analogi glukagonopodobnego peptydu 2 (GLP-2), mogą być stosowane przed przejściem do chirurgicznego leczenia tego schorzenia5. Ludzki GLP-2, ogólnoustrojowy hormon peptydowy składników odżywczych, jest wytwarzany w dystalnym jelicie cienkim i okrężnicy przez komórki endokrynne typu L. GLP-2 indukuje proliferację komórek kryptowych jelit, wspomaga naprawę uszkodzonej błony śluzowej, hamuje apoptozę komórek nabłonka jelitowego i poprawia ukrwienie jelit5. Analogi GLP-2, takie jak teduglutyd, zostały zatwierdzone do leczenia ZKJ u pacjentów w wieku 1 roku lub starszych, aby wspomóc naturalną adaptację jelitową6. Naturalnie, adaptacja jelit może trwać latami i powoduje opóźnione opróżnianie żołądka w celu wydłużenia czasu wchłaniania i zwiększenia średnicy przez rozszerzenie jelit w celu zwiększenia powierzchni wchłaniania7. Analogi GLP-2 mają taką samą aktywność farmakologiczną jak naturalny GLP-2, a jednocześnie mają bardziej stabilną strukturę, co pozwala na dłuższy okres półtrwania i silniejsze powinowactwo do celów5. Obecnie roczny koszt teduglutydu wynosi 295 000 USD, a dawka dla pacjenta wynosi 0,05 mg/kg dziennie5. Skutki uboczne teduglutydu obejmują nudności, wymioty, biegunkę, ból brzucha, utratę masy ciała, polipy żołądkowo-jelitowe i zwiększony wzrost istniejących guzów5.
Poprzednio nasze laboratorium wykazało, że zastosowanie rękawa rozszerzającego jelito (IES) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) było w stanie spowodować natychmiastowe wydłużenie jelita cienkiego ex vivo o 36,2% i wydłużenie jelita cienkiego o 30,2% po miesięcznym wdrożeniu in vivo6,8. To urządzenie może stać się terapią dla pacjentów z ZKJ, która może skrócić zależność od żywienia pozajelitowego. Możliwość biokoniugacji środków terapeutycznych z urządzeniem IES może jeszcze bardziej poprawić zdolność enterogenezy rozpraszającej poprzez dodanie do urządzenia agonisty wzrostu błony śluzowej jelit GLP-2. Membrany z alkoholu poliwinylowego (PVA) to hydrofilowe polimery, które można wytworzyć poprzez rozpuszczenie PVA w wodzie, odlewanie go na podłożu strukturalnym, a następnie sieciowanie aldehydem glutarowym przy użyciu kwasu siarkowego jako katalizatora9. Wykazano, że te nanocząsteczki hydrożelu mają potencjał jako systemy dostarczania leków poprzez dyfuzję leków, pęcznienie matrycy hydrożelowej i reaktywność chemiczną leku/matrycy10. PVA został zatwierdzony przez FDA do użytku klinicznego u ludzi ze względu na doskonałą biokompatybilność i bezpieczeństwo11. Polimeryzacja PVA prowadzi do powstania grup końcowych, które pozwalają na biokoniugację12.
Urządzenia IES/VES mają 3 cm długości i powierzchnię zewnętrzną 9,425cm2, które można odlewać z membranami PVA. Te membrany PVA mogą być biosprzężone z GLP-2, aby umożliwić miejscowe i skoncentrowane dostarczanie środków terapeutycznych. Obniżenie wymaganej dawki leku i ominięcie konieczności podawania ogólnoustrojowego, unikanie negatywnych skutków leczenia poza miejscem leczenia. Może to pomóc w obniżeniu kosztów tych drogich leków, wymagając mniejszej dawki, a opóźnione uwalnianie leku może zmniejszyć częstotliwość dawkowania, co jeszcze bardziej obniża koszty. Pokrycie urządzenia IES GLP-2 może obniżyć wymagane dawki, zaoszczędzić pieniądze pacjentów, uniknąć podawania ogólnoustrojowego, zapobiec negatywnym skutkom leczenia i utrzymać ciągłe dostarczanie leku do miejsca docelowego. Niniejszy raport ocenia stopień, w jakim białko terapeutyczne, takie jak GLP-2, może być kowalencyjnie wiązane z wyrobami medycznymi, takimi jak urządzenia IES/VES, w fizjologicznie znaczących ilościach, aby zapewnić lokalne korzyści płynące z tych leków, unikając jednocześnie skutków niedocelowych.

<table><tbody><tr><td>Anti-Rabbit IgG (cała cząsteczka)&ndash; Przeciwciało peroksydazy wytwarzane w kozie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0545-1ML</td><td></td></tr><tr><td>BluePhos Microwell Substrate Kit</td><td>Sera Care</td><td>5120-0059</td><td></td></tr><tr><td>GenClone 25-107, 24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych Studzienki z płaskim dnem, poddane działaniu TC, 100 płytek/jednostkę</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>GLP-2 Rekombinowane królicze przeciwciało monoklonalne (3K3P5)</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>MA5-42869</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd podobny do glukagonu-2 (GLP-2) (1-33), szczur</td><td>Echelon Biosciences</td><td>195262-56-7</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy, 25% roztwór wodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator polipropylenowy Nalgene z kranem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5310-0250</td><td></td></tr><tr><td>Poli(alkohol winylowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-89-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (klasa metali śladowych), Fisher Chemical</td><td>Fischer Scientific</td><td>A510-P212</td><td></td></tr></tbody></table>

walidacja koniugacji środka terapeutycznego z wyrobami medycznymi powlekanymi alkoholem winylowym

Validation of Therapeutic Agent Conjugation to Polyvinyl Alcohol-Coated Medical Devices

Terapie oparte na białkach są często ograniczone przez drogę podania i niemożność ograniczenia ich do miejsca działania. Jednym z opracowanych przez nas innowacyjnych podejść jest kowalencyjne wiązanie leków białkowych z wyrobami medycznymi, co pozwala na bardziej miejscowe i wysoce skoncentrowane dostarczanie tych środków do zamierzonego miejsca działania. Badanie to ma na celu ocenę, czy glukagonopodobny peptyd-2 (GLP-2) może być kowalencyjnie związany z urządzeniami do rozszerzania pochwy (VES) i rękawa rozszerzającego jelita (IES) w klinicznie istotnych i mierzalnych ilościach.
Tuleje rozprężne zostały pokryte alkoholem poliwinylowym (PVA) i usieciowane parami aldehydu glutarowego/kwasu siarkowego, aby stworzyć chemicznie aktywną powierzchnię zdolną do wiązania środków terapeutycznych zawierających aminy, takich jak GLP-2. Krzywa standardowa została utworzona przez związanie 250 μg, 100 μg, 50 μg, 25 μg i 0 μg GLP-2 z dołkami pokrytymi PVA na płytce 24-dołkowej. Wzorzec ELISA stworzono przy użyciu króliczego przeciwciała anty-GLP-2, a następnie koziego przeciwciała drugorzędowego anty-króliczej fosfatazy alkalicznej IgG oraz substratu mikrostudzienki niebieskiej fosfatazy alkalicznej. Kolorymetria (od żółtej do niebieskiej przy 620 nm) była proporcjonalna do stężenia przeciwciał związanych z GLP-2, co umożliwiło obliczenie związanego stężenia GLP-2 na tulejach pokrytych PVA. Dodanie 50 μg GLP-2 do urządzeń IES/VES wiązało średnio 22,69 ± 9,32 μg/cm2 GLP-2 z zewnętrzną powierzchnią IES/VES (9,425 cm2), co wskazuje, że 44% dodanego GLP-2 zostało unieruchomione na tulejach IES/VES pokrytych PVA.
Obecna dawka GLP-2 dla ludzi wynosi 50 μg/kg. Ponieważ każdy rękaw przenosi 22 μg, stanowi to około 44% dawki ogólnoustrojowej w jednym urządzeniu. Metodologia ta umożliwia dodawanie znacznie niższych dawek środków terapeutycznych, aby uzyskać taki sam efekt jak przy ogólnoustrojowym podawaniu leku GLP-2, przy jednoczesnym uniknięciu skutków ogólnoustrojowych.

Niniejszy protokół opisuje powlekanie i sieciowanie urządzeń IES oraz VES polimerem PVA w celu umożliwienia koniugacji GLP-2. Rysunek 2 przedstawia krzywą wzorcową wygenerowaną w celu określenia stężenia GLP-2 na każdym urządzeniu. Rysunek 3 przedstawia stężenie GLP-2 w każdym urządzeniu IES i VES oraz stężenie w dołkach wykorzystanych do stworzenia krzywej wzorcowej. Osłonki miały średnie stężenie GLP-2 wynoszące 22,69 ± 9,32 µg/cm2, co odpowiadało dołkom z 50 µg na płytce 24-dołkowej, w których stężenie GLP-2 wynosiło 23,7 µg/cm2. Wykazuje to, że dodanie 50 µg GLP-2 skutkuje związaniem 45% dodanego leku do urządzenia medycznego powleczonego PVA.
<img alt="Schemat enterogenezy jelita cienkiego szczura; metoda IES w celu wydłużenia jelita, proces chirurgiczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67358/67358fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Zastosowanie IES.Grafika przedstawia zastosowanie in vivo rękawa ekspansyjnego jelita w modelu szczura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67358/67358fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres krzywej wzorcowej stężenia GLP-2 względem absorbancji, przedstawiający rozcieńczenia i analizę liniowości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67358/67358fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Krzywa wzorcowa. Na obrazie przedstawiono krzywą wzorcową wygenerowaną za pomocą wykresu liniowego z następującymi wartościami: Y = mx + b, Y = absorbancja przy 620 nm, x = stężenie, m = 0.0118, B = 0.0734, R2 = 0.966. Płytka 24-dołkowa miała powierzchnię 1.93 cm2, co daje stężenia GLP-2 wynoszące odpowiednio 125.95 µg/cm2, 66.38 µg/cm2, 23.77 µg/cm2, 14.58 µg/cm2 oraz 0.00 µg/cm2 dla dołków zawierających 250 µg, 100 µg, 50 µg, 25 µg i 0 µg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67358/67358fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy stężenia GLP-2; porównanie danych; jednostki μg/cm²; wyniki eksperymentalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67358/67358fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Stężenie GLP-2 dla urządzeń i odpowiednich dołków. Wykres przedstawia stężenia określone dla każdego urządzenia IES i VES oraz dla dołków płytki 24-dołkowej użytej do sporządzenia krzywej wzorcowej. Po dodaniu 50 µg GLP-2 do każdej tulei (zewnętrzna powierzchnia 9,425 cm2), ilość GLP-2 związana z urządzeniem wyniosła 22,69 ± 9,32 µg/cm2. Odpowiada to wartości 23,7 µg/cm2 dla dołka 50 µg na krzywej wzorcowej. Poprzez dodanie 50 µg GLP-2 do tych tulei, 45% dodanego leku związało się z urządzeniem po wielokrotnym przemyciu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67358/67358fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół derywatyzacji wyrobów medycznych za pomocą terapii białkowych poprzez sprzężenie terapii białkowej z membraną z polialkoholu winylowego odlewaną na urządzeniach medycznych. Koniugacja terapii opartych na białkach pozwala na miejscowe i skoncentrowane dostarczanie i jest opłacalnym podejściem, które wymaga znacznie niższych ilości leków do dawkowania, przy jednoczesnej minimalizacji skutków niedocelowych.

Walidacja koniugacji środka terapeutycznego z wyrobami medycznymi powlekanymi alkoholem winylowym

Protein-based therapeutics are often limited by their route of administration and inability to confine them to their site of action. One innovative ...

Nasze badania koncentrują się na naszych rękawach rozszerzających jelita i rękawach rozszerzających pochwę, które zapewniają rozproszoną siłę, która, jak wykazano, znacznie wydłuża kanały jelitowe i pochwowe. Mamy nadzieję, że uda nam się zoptymalizować nasze urządzenia poprzez dodanie terapii opartych na białkach, aby zminimalizować miejscowy stan zapalny i zwłóknienie po wdrożeniu tych urządzeń. Wiążąc te środki terapeutyczne bezpośrednio z naszymi urządzeniami, możemy ominąć potrzebę podawania ogólnoustrojowego bezpośrednio ukierunkowanego na nasze obszary zainteresowania za pomocą dawki miejscowej.Taka lokalizacja pozwoli na niższe dawkowanie leków, zmniejszenie ryzyka wystąpienia ogólnoustrojowych działań niepożądanych, a także obniżenie kosztów leczenia. W przyszłości chcemy określić szybkość uwalniania tych leków opartych na białkach, które są powiązane z naszymi urządzeniami pokrytymi PVA, co będzie niezbędne do określania dawek leków dla różnych rodzajów leczenia. Na początek przygotuj 5% roztwór alkoholu poliwinylowego lub PVA, dodając pięć gramów PVA do 100 mililitrów wody dejonizowanej.Wymieszaj mieszaninę na gorącym talerzu, aby ułatwić rozpuszczenie. Następnie przygotuj jeden miligram na mililitr roztworu glukagonopodobnego peptydu 2 lub GLP-2, dodając jeden miligram GLP-2 do jednego mililitra wody dejonizowanej. Wstępnie nacisnąć rękawy rozprężne jelita i rękawy rozprężne dopochwowe na szklaną pipetę, stabilizując końce za pomocą pociętych plastikowych pipet ściśle przylegających do szklanej pipety i rękawów.Pomaluj wstępnie zakontraktowane tuleje roztworem 5% PVA za pomocą małego pędzla. Pozostaw rękawy do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 10 minut między każdą warstwą. Po wyschnięciu piątej warstwy umieść wstępnie skurczone rękawy w osuszaczu pod kapturem chroniącym przed chemikaliami.Dodaj trzy mililitry 25% aldehydu glutarowego i trzy mililitry 94 do 98% kwasu siarkowego do oddzielnych otwartych zlewek w eksykatorze, aby umożliwić reakcję parową i usieciować membrany PVA na tulejach. Po usieciowaniu przez 48 godzin wyjmij tuleje z komory i pozwól aldehydowi glutarowemu odparować przez 15 minut. Odpipetować 50 mikrolitrów roztworu GLP-2 na każdą usieciowaną tuleję do późniejszego użycia.Aby standardowa krzywa GLP-2 była związana z PVA, należy odpipetować 50 mikrolitrów 5% PVA na dno 18 dołków płytki 24-dołkowej. Pozostaw sześć studzienek pustych, aby pomieścić rękawy rozszerzające jelita i rękawy rozprężne pochwy z trzema dołkami dla każdego typu urządzenia. Pozostaw warstwę PVA do wyschnięcia przez noc w piekarniku w temperaturze 120 stopni Celsjusza.Następnego dnia umieść 24-dołkową płytkę w osuszaczu pod kapturem bezpieczeństwa chemicznego. Dodaj trzy mililitry 25% aldehydu glutarowego i trzy mililitry 94 do 98% kwasu siarkowego do oddzielnych otwartych zlewek wewnątrz eksykatora, aby umożliwić reakcję parową i usieciować membrany PVA na płytce 24-dołkowej. Po 48 godzinach sieciowania wyjąć 24-dołkową płytkę z eksykatora i pozostawić aldehyd glutarowy do odparowania przez 15 minut.Następnie utwórz gradient stężeń, dodając 250, 150, 25 i zero mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu GLP-2 do odpowiednich oznaczonych studzienek. Następnie umieść pokryte lekiem rękawy rozszerzające jelita i pochwy w odpowiednich dołkach. Po dodaniu do studzienek odpowiednich stężeń GLP-2 i powlekanych lekiem rękawów rozprężnych jelit i rękawów rozprężnych pochwy, należy schłodzić płytkę 24-dołkową przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić wiązanie leku.Następnego dnia dodaj dwa mililitry jednego miligrama na mililitr mleka w proszku w roztworze blokującym wodę dejonizowaną do każdej studzienki przez jedną godzinę. Po zablokowaniu umyj każdą studzienkę trzy razy PBS przez pięć minut na pranie. Przygotuj króliczy roztwór przeciwciała anty GLP-2, dodając 40 mikrolitrów króliczego przeciwciała anty GLP-2 do 50 mililitrów wody dejonizowanej.Następnie dodaj dwa mililitry roztworu przeciwciał do każdego dołka płytki. Wstaw płytkę do lodówki na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia umyj każdą studzienkę trzy razy PBS przez pięć minut na mycie.Przygotuj roztwór przeciwciała drugorzędowego fosfatazy alkalicznej IgG przeciwko królicowi, dodając 20 mililitrów przeciwciała do 40 mililitrów wody dejonizowanej. Dodaj dwa mililitry roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Po umyciu studzienek PBS dodaj dwa mililitry niebieskiego substratu mikrostudzienkowego fosfatazy alkalicznej do każdej studzienki i inkubuj przez 20 minut.Podczas inkubacji monitoruj reakcję, gdy roztwór zmienia kolor z żółtego na niebieski. Zatrzymać reakcję, pipetując 200 mikrolitrów roztworu z każdej studzienki do oznakowanej płytki 96-dołkowej. Odczytaj 96-dołkową płytkę za pomocą czytnika mikropłytek absorbancyjnych o długości fali 620 nanometrów.Wygeneruj krzywą wzorcową i oblicz stężenie GLP-2 na tulejach pokrytych PVA. Stężenie GLP-2 w rękawach rozszerzających jelita i rękawach rozszerzających pochwę wynosi średnio 22,69 mikrogramów na centymetr kwadratowy, podobnie jak stężenie w dołkach 50 mikrogramów na płytce 24-dołkowej z 23,7 mikrogramami na centymetr kwadratowy.

validation-therapeutic-agent-conjugation-to-polyvinyl-alcohol-coated

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisujemy produkcję i charakterystykę nanocząsteczek i mikrocząsteczek składających się z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) przy użyciu witaminy E-TPGS jako emulgatora. Dzięki różnicowaniu parametrów formulacji, takich jak stężenie emulgatora, możliwe jest wytworzenie nanocząstek o średnich średnicach w zakresie od 220 nm do 1,98 μm.

Nanocząstki PLGA utworzone przez pojedynczą lub podwójną emulsję z witaminą E-TPGS

Te badania donoszą o odwracalnym przyczepianiu wektorów genów adenowirusa do bezpowłokowych metalowych powierzchni stentów i modelowych dysków siatkowych. Przedłużone uwalnianie cząstek wirusa kompetentnych do transdukcji, uzależnione od hydrolizy środków sieciujących stosowanych do immobilizacji wektorów, skutkuje trwałą, specyficzną dla miejsca ekspresją transgenu w komórkach naczyniowych i stentowanych tętnicach.

Naczyniowy transfer genów z metalowych powierzchni stentów przy użyciu wektorów adenowirusowych połączonych przez hydrolizowalne środki sieciujące

Ten artykuł skupi się na rozwijaniu powierzchni pokrytych polimerem do długotrwałej, stabilnej hodowli ludzkich hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Stabilizacja fenotypu wątrobowokomórkowego przy użyciu zoptymalizowanych powierzchni syntetycznych

Kontakt krwi z polimerowymi kanałami krwionośnymi inicjuje reakcję ciała obcego, która jest związana z klinicznymi powikłaniami. Tutaj opisano Aparat Pętli Chandlera, eksperymentalne narzędzie naśladujące perfuzję krwi przez te przewody. Wyrostek rekombinowanego CD47 powoduje zmniejszenie dowodów reakcji ciała obcego na tych przewodach.

Zastosowanie aparatury pętlowej Chandlera ex vivo do oceny biokompatybilności zmodyfikowanych polimerowych przewodów krwiopochodnych

Dwu- i trójwymiarowe superhydrofobowe materiały polimerowe są przygotowywane przez elektroprzędzenie lub elektronatryskiwanie biodegradowalnych polimerów zmieszanych z polimerem o niższej energii powierzchniowej o podobnym składzie.

Wytwarzanie superhydrofobowych materiałów polimerowych do zastosowań biomedycznych

Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.

Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej

Adhezyjna komórka jest kluczem do wielu podejść w badaniach nad biomateriałami i inżynierii tkankowej. Przedstawiono technikę krok po kroku wykorzystującą chemię mokrą do modyfikacji powierzchni ważnego polimeru PTFE za pomocą peptydów.

Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek

Opisano wysokoprzepustową metodę mikromatrycową do identyfikacji polimerów, które redukują wiązanie powierzchni bakteryjnej na urządzeniach medycznych.

Wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych

Przedstawiamy protokół syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako urządzeń do dostarczania komórek i leków. Procedura polega na katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) pomiędzy modyfikowanym alkinami kwasem poliakrylowym (PAA) a pochodną azydku RGD. Hydrożele powstają w procesie polikondensacji wspomaganej mikrofalami i badane są ich właściwości fizykochemiczne.

Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

Opisano metody wytwarzania powierzchni do wzorzystego osadzania pędzli o grubości nanometrów lub usieciowanych warstw o grubości mikronów kopolimeru blokowego azlactonu. Omówiono krytyczne etapy eksperymentalne, reprezentatywne wyniki i ograniczenia każdej metody. Metody te są przydatne do tworzenia funkcjonalnych interfejsów z dostosowanymi cechami fizycznymi i przestrajalną reaktywnością powierzchni.

Wytwarzanie powierzchni reaktywnych za pomocą pędzlowych i usieciowanych warstw kopolimerów blokowych funkcjonalizowanych azlaktonem

Ten artykuł opisuje protokoły używane do stworzenia nowatorskiej platformy dostarczania szczepionek, "polybubbles", która umożliwia opóźnione uwalnianie serii. Poliestry, w tym poli(kwas mlekowo-ko-glikolowy) i polikaprolakton, zostały użyte do utworzenia polipęcherzyków, a małe cząsteczki i antygen zostały użyte jako ładunek.

Produkcja czułej na bliską podczerwień platformy do dostarczania szczepionek typu core-shell

Poznaj metodę koniugacji terapeutyków białkowych z membranami PVA w celu lokalnego uwalniania leków z wyrobów medycznych. Technika ta zmniejsza dawkowanie i ryzyko działań niepożądanych przy niższych kosztach leczenia.

Walidacja koniugacji środka terapeutycznego z wyrobami medycznymi powlekanymi alkoholem winylowym

Przeglądaj więcej filmów