Immunokompetentny mysi model do laserowej śródmiąższowej terapii termicznej glejaka
15 listopada 2024
Glejak jest wyniszczającą formą pierwotnego raka mózgu, a laserowa śródmiąższowa terapia termiczna staje się obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej chirurgicznej resekcji nieoperacyjnego glejaka. Protokół ten opisuje zoptymalizowany przedkliniczny model myszy, który można wykorzystać do badania efektów leczenia lub leczenia uzupełniającego i skojarzonego.
Nasze badania koncentrują się na guzach mózgu u dorosłych. Obejmuje to glejaka wielopostaciowego, glejaka pierwotnego, a także przerzuty do mózgu. Opracowaliśmy mysie modele guza mózgu, aby zidentyfikować skuteczniejsze metody leczenia pacjentów z tymi śmiertelnymi schorzeniami.
Glejak wielopostaciowy jest najcięższym i najczęstszym pierwotnym nowotworem mózgu. U ponad 20% pacjentów z glejakiem tego guza mózgu nie można usunąć chirurgicznie. W takich przypadkach laserowa śródmiąższowa terapia termiczna, w skrócie LITT, jest stosowana klinicznie w celu ukierunkowania na te agresywne guzy mózgu.
LITT to technologia termicznej ablacji tkanek, która jest klinicznie stosowana w przypadku chirurgicznie niedostępnych guzów mózgu. Nasze badania z wykorzystaniem mysich modeli LITT dostarczą ważnych informacji na temat reakcji tkanek i komórek na obróbkę cieplną w guzie i otaczającej tkance mózgowej. Lepsze zrozumienie zmian molekularnych i komórkowych spowodowanych przez LITT w mózgu umożliwi nam skuteczniejsze wykorzystanie LITT w celu poprawy wyników leczenia pacjentów z guzem mózgu.
Najważniejszym wyzwaniem eksperymentalnym jest dokładne ukierunkowanie i leczenie guza. W przeciwieństwie do chirurgii LITT, stosowanej klinicznie u ludzi, większość modeli nie ma obrazowania MRI w czasie rzeczywistym, co utrudnia celowanie w guz bez żadnej pomocy wizualnej. Na początek zapisz wagę znieczulonej myszy, aby obliczyć prawidłowe dawkowanie leku.
Ostrożnie ogol obszar operacyjny, omijając oczy, uszy i wąsy. Umieść siekacze myszy w otworze pręta gryzowego i wyreguluj stożek nosowy ramy stereotaktycznej, aż będzie dobrze dopasowany, a następnie dokręć mocującą, aby zamocować ją na miejscu. Sprawdź głębokość znieczulenia, wykonując obustronne szczypanie palców kończyn tylnych.
Gdy mysz zostanie odpowiednio znieczulona, zabezpiecz czaszkę za pomocą szpilek do uszu i ustaw głowę w neutralnej pozycji płaszczyzny poziomu. Nałóż obficie maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Za pomocą półcalowej strzykawki o rozmiarze 28 wstrzyknąć meloksykam podskórnie jako lek przeciwbólowy.
Zmniejsz szybkość znieczulenia, aby utrzymać docelową częstość oddechów. Następnie aseptyczne ułożenie myszy. Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika nałóż roztwór dezynfekujący chlorheksydyny, zaczynając przyśrodkowo i kierując się na zewnątrz.
Następnie za pomocą świeżego sterylnego wacika nałóż 70% etanol w ten sam sposób. Ponownie sprawdź głębokość znieczulenia, monitorując częstość oddechów. Następnie za pomocą skalpela z ostrzem 15 wykonaj nacięcie strzałkowe o długości od 1,0 do 1,5 centymetra, zaczynając nieco za oczami w kierunku rozpieszczania.
Teraz, za pomocą sterylnego bawełnianego wacika, odbij krawędzie rany, aby uwidocznić czaszkę. Delikatnie zetrzyj tkankę łączną z tego obszaru. W razie potrzeby użyj sterylnego bawełnianego wacika nasączonego nadtlenkiem wodoru, aby odsłonić powierzchnię czaszki i uwidocznić szwy lambda.
Zlokalizuj bregmę w miejscu, w którym lewy i prawy szew rogówkowy stykają się ze szwem strzałkowym. Opcjonalnie, aby ułatwić przenoszenie bregmy podczas operacji LITT, użyj nietoksycznej kolorowej żywicy akrylowej i sterylnej drewnianej wykałaczki i zrób mały znak na bregmie. Z mikrolitrową strzykawką w ramce, wyzeruj współrzędne stereotaktyczne z końcówką dotykającą bregmy.
Współrzędna X odnosi się do ruchu w przyśrodkowej płaszczyźnie bocznej, współrzędna Y do przedniego ruchu tylnego, a współrzędna Z do grzbietowej płaszczyzny brzusznej. Upewnij się, że lambda znajduje się w tej samej grzbietowej płaszczyźnie brzusznej co bregma, gdzie Z jest równe zero w obu punktach orientacyjnych. Jeśli konieczna jest regulacja, upewnij się, że czaszka jest nadal bezpiecznie zamocowana, delikatnie uciskając sterylnym wacikiem.
Umieść końcówkę igły nad obszarem docelowym we współrzędnych plus 2.0 milimetra media z boku i plus 0.5 milimetra przednio-tylnie od bregma. Ostrożnie opuść końcówkę wiertła, aż zetknie się z czaszką. Lekko podnieś końcówkę igły i zrób małą kropkę w miejscu otworu na zadzior za pomocą sterylnego markera chirurgicznego.
Następnie lekko podnieś igłę, aby nie przeszkadzała i wywierć otwór w zaznaczonym miejscu, uważając, aby przebić tylko czaszkę, nie uszkadzając opon mózgowych pod spodem. Utwórz drugi otwór zadziorowy na wysokości plus 3,0 milimetra przyśrodkowego bocznego i plus 0,5 milimetra przednio-tylnego lub przedłuż oryginalny otwór do tej współrzędnej, aby pomieścić termoparę podczas procedury LITT. Następnie wyjmij probówkę z mikrowirówką zawierającą komórki glejaka myszy CT2A z lodu i delikatnie przesuń probówkę opuszkiem palca, aby ponownie zawiesić komórki.
Za pomocą strzykawki o pojemności 5 lub 10 mikrolitrów delikatnie pobrać około dwóch mikrolitrów zawiesiny komórek. Odciągnij 0,5 mikrolitra ze strzykawki, aby usunąć powietrze. Przetrzyj trzonek igły wacikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć wszelkie pozostałości płynu lub komórek.
Powoli opuść igłę na głębokość w punkcie Z równym minus trzy milimetry i zatrzymaj się na jedną minutę. Następnie powoli cofnij igłę o 0,5 milimetra i wstrzyknij komórki z prędkością 0,5 mikrolitra na minutę. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać dwie minuty, a następnie powoli wyjmować strzykawkę przez trzy do czterech minut.
Zatrzymanie się na maksymalnie minutę po pierwszych kilku odstępach od 100 do 250 mikrometrów pomoże zapobiec przemieszczeniu komórek. Aby zamknąć nacięcie rany, ponownie przybliż krawędzie nacięcia. Używając trzech przerwanych szwów z szwem 50, zamknij ranę, lekko odcinając krawędzie rany, aby upewnić się, że znajdująca się pod spodem skóra właściwa dotyka się.
Nałóż roztwór jodu powidonu na zamkniętą ranę i przenieś mysz do wyłożonej papierem klatki regeneracyjnej na podkładce rozgrzewającej ustawionej na 37 stopni Celsjusza. Gdy zwierzę odzyska leżącą mostek, może zostać przeniesione z powrotem do klatki domowej. Dziewięć dni po wstrzyknięciu zawiesiny komórek glejaka myszy CT2A zabezpiecz znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej.
Odtwórz nacięcie w linii środkowej i użyj sterylnego wacika z bawełnianą końcówką, aby oczyścić czaszkę, aby usunąć wszelkie tkanki zasłaniające bregmę. Z laserową śródmiąższową terapią termiczną lub nasadką LITT umieszczoną na ramie stereotaktycznej, wyzeruj współrzędne w bregma dla końcówki światłowodu laserowego. Następnie lekko podnieś końcówkę światłowodu laserowego i przejdź do pożądanych współrzędnych przyśrodkowych bocznych i przednich tylnych.
Następnie powoli opuść sondę do docelowej współrzędnej grzbietowo-brzusznej, aby dotrzeć do celu. Ustaw parametry leczenia LITT na tryb ciągły i zasilaj jeden. Następnie przełącz laser z trybu czuwania na aktywny i włącz laser na 60 sekund za pomocą pedału nożnego.
Jeśli temperatura wzrośnie powyżej 46 stopni Celsjusza, zatrzymaj się na chwilę, a następnie włącz ponownie, dążąc do utrzymania temperatury bliskiej 46 stopni Celsjusza. Na koniec powoli wycofaj zespół lasera. Delikatnie wytrzyj włókno lasera i termoparę do czysta wacikiem nasączonym alkoholem.
Obróć zespół na bok, upewniając się, że sondy nie stykają się z ramą. Obrazy rezonansu magnetycznego rogówki ważone T2 wykazały udaną implantację guza z prawie 100% wskaźnikami przyjmowania i konsekwentnym tworzeniem guza sferycznego. Leczenie LITT skutkowało konsekwentnymi ablacjami z określonymi hiperintensywnymi czarnymi obszarami, wskazującymi na martwicę tkanek w centralnym rdzeniu i otaczający hiperintensywny biały obszar wskazujący na obrzęk okołooperacyjny.
Przegląd
Glioblastoma to ciężka postać pierwotnego nowotworu mózgu, którego często nie można usunąć chirurgicznie. Laserowa terapia termiczna tkanek (LITT) staje się obiecującą metodą leczenia przypadków nieoperacyjnych. W niniejszym artykule omówiono opracowanie zoptymalizowanych przedklinicznych modeli mysich w celu zbadania efektów leczenia.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Onkologia
- Techniki terapeutyczne
Wprowadzenie
- Glioblastoma jest najczęstszym i najbardziej agresywnym pierwotnym nowotworem mózgu.
- Ponad 20% pacjentów z glejakiem wielopostaciowym ma guzy nieoperacyjne.
- LITT jest techniką kliniczną stosowaną do celowania w te guzy.
- Modele mysie są niezbędne do testowania nowych strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Opracowanie modelu mysiego do badań nad glejakem wielopostaciowym.
- Ocena skuteczności LITT oraz innych metod leczenia.
- Pogłębienie wiedzy na temat odpowiedzi na leczenie w przypadku glejaka wielopostaciowego.
Zastosowane metody
- Tworzenie zoptymalizowanych przedklinicznych modeli mysich.
- Zastosowanie laserowej przerwania termicznej (Laser Interstitial Thermal Therapy).
- Ocena wpływu leczenia na wzrost guza.
- Badanie terapii adjuwantowych i skojarzonych.
Główne wyniki
- Wykazano wykonalność procedury LITT w modelach mysich.
- Zidentyfikowano potencjalne terapie adjuwantowe w leczeniu glejaka wielopostaciowego.
- Wskazano na znaczenie modeli przedklinicznych w ocenie skuteczności leczenia.
- Uzyskano nową wiedzę na temat biologicznego zachowania glejaka wielopostaciowego.
Wnioski
- Zoptymalizowane modele mysie mają kluczowe znaczenie dla badań nad glejakem wielopostaciowym.
- LITT wykazuje potencjał jako metoda leczenia guzów nieoperacyjnych.
- Konieczne są dalsze badania w celu zbadania terapii skojarzonych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustanowienie immunokompetentnego modelu mysiego do laserowej termoterapii śródmiąższowej (LITT) w glejaku pozwala na rygorystyczną ocenę przedkliniczną efektów ablacji w klinicznie istotnym mikrośrodowisku nowotworu. Model ten zwiększa pewność prognostyczną w badaniach translacyjnych poprzez odzwierciedlenie parametrów choroby i leczenia występujących u ludzi, bezpośrednio wpływając na wczesne etapy odkryć oraz punkty decyzyjne w fazie przedklinicznej. Platforma ta wypełnia krytyczną lukę w zakresie mechanistycznego ograniczania ryzyka i walidacji celów w rozwoju terapii guzów mózgu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących odpowiedzi guza i mikrośrodowiska indukowanych przez LITT.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie interakcji między immunokompetentnym gospodarzem a guzem po ablacji.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla interwencji opartych na ablacji w glejakach wielopostaciowych.
- Stanowi podstawę do zwiększenia pewności predykcyjnej w kolejnych badaniach translacyjnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane, powtarzalne systemy in vivo do oceny parametrów ablacji oraz terapii skojarzonych.
- Standaryzuje procesy implantacji guza i ablacji w celu uzyskania spójnych wyników ilościowych.
- Umożliwia rzetelną ocenę efektów leczenia, wspierając dalsze przesiewowe badania substancji wspomagających.
- Poprawia gotowość testów do oceny punktów końcowych odpornościowych i molekularnych po zabiegu LITT.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie modeli przedklinicznych do klinicznych systemów LITT w celu odkrywania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po przedkliniczną walidację strategii ablacji.
- Pozwala na rozwój koncepcji terapeutycznych opartych na LITT z uwzględnieniem analizy ryzyka.
- dostarcza wiedzy o mechanizmach odpowiedzi guza i tkanek, istotnych dla translacji klinicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model LITT u immunokompetentnych myszy stanowi pomost między wczesnym etapem odkryć a walidacją przedkliniczną, umożliwiając badania mechanistyczne i ilościową ocenę efektów ablacji w systemie istotnym dla przebiegu choroby.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących zmian molekularnych i komórkowych w glejaku wywołanych przez LITT.
- Przesiew: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki ablacji guza oraz efektów okołoguzowych.
- Analityka: Dostarcza pomiary oparte na MRI i badaniach histologicznych do analizy porównawczej warunków leczenia.
- Badania translacyjne: Dostosowuje przedkliniczne punkty końcowe do klinicznych parametrów obrazowania i terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną, ustandaryzowaną platformę do oceny nowych strategii ablacji i terapii skojarzonych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w opracowywaniu terapii opartych na ablacji.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność przedklinicznych badań nad glejakiem wielopostaciowym.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz alokację kapitału dla programów LITT i terapii wspomagających.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów onkologicznych opartych na ablacji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w chirurgii stereotaktycznej oraz w znieczulaniu małych zwierząt.
- Wymaga dostępu do obrazowania MRI oraz aparatury laserowej Nd:YAG do leczenia i oceny.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów implantacji i ablacji guzów pomiędzy zespołami.
- Możlijna jest konieczność adaptacji metody dla różnych linii komórkowych glejaków lub różnych tło immunologicznych.
- Ograniczenia obejmują brak prowadzenia obrazem MRI w czasie rzeczywistym podczas ablacji, co wpływa na precyzję celowania.
