Name: Immunokompetentny mysi model do laserowej śródmiąższowej terapii termicznej glejaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj zastosowanie laserowej śródmiąższowej terapii termicznej w immunokompetentnym modelu mysim glejaka. Ta metoda umożliwia badanie odpowiedzi tkanek na leczenie termiczne i ocenę skuteczności terapii w nowotworach mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Źródła finansowania tego projektu to m.in. Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC)-Alliance, Mitacs-Accelerate, Research Manitoba-IPOC, Canadian Institutes for Health Research (CIHR) CGS-M oraz University of Manitoba Graduate Fellowship. Linia komórkowa glejaka CT2A hojnie podarowana przez dr Petera Fecci z Duke University, Durham, NC. Chcielibyśmy również podziękować Laboratorium Usług Histologicznych oraz Ośrodku Obrazowania Małych Zwierząt i Materiałów na Uniwersytecie Manitoba za ich doskonałą pomoc techniczną w tym projekcie.

<ol><li>Canadian Cancer Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cancer+Statistics+2023%22">Cancer Statistics 2023</a>. , Canadian Cancer Statistics Advisory Committee in collaboration with the Canadian Cancer Society, Statistics Canada and the Public Health Agency of Canada. Toronto, ON. http://cancer.ca/Canadian-Cancer-Statistics-2023-EN (2023).</li>
<li>Glioblastoma Research Organization. Glioblastoma Research Organization. , 
 <a target="_blank" href="https://www.gbmresearch.org">https://www.gbmresearch.org</a> (2024).</li>
<li>Carpentier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+thermal+therapy%3A+Real-time+MRI-guided+and+computer-controlled+procedures+for+metastatic+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg+Med%22%5BJournal%5D)">Laser thermal therapy: Real-time MRI-guided and computer-controlled procedures for metastatic brain tumors.</a> Lasers Surg Med. 43 (10), 943-950 (2011).</li>
<li>Haddad, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+glioblastoma+for+the+evaluation+of+novel+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurooncol+Adv%22%5BJournal%5D)">Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies.</a> Neurooncol Adv. 3 (1), vdab100(2021).</li>
<li>Chokshi, C. R., Savage, N., Venugopal, C., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+patient-derived+xenograft+model+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A patient-derived xenograft model of glioblastoma.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100179(2020).</li>
<li>Alcaniz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+glioblastoma+patient-derived+xenograft+models+to+guide+drug+development+and+identify+molecular+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant glioblastoma patient-derived xenograft models to guide drug development and identify molecular signatures.</a> Front Oncol. 13, 1129627(2023).</li>
<li>Muir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+interstitial+thermal+therapy+for+newly+diagnosed+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser interstitial thermal therapy for newly diagnosed glioblastoma.</a> Lasers Med Sci. 37 (3), 1811-1820 (2022).</li>
<li>Muir, M., Traylor, J. I., Gadot, R., Patel, R., Prabhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+laser+interstitial+thermal+therapy+for+recurrent+primary+and+metastatic+intracranial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Neurol+Int%22%5BJournal%5D)">Repeat laser interstitial thermal therapy for recurrent primary and metastatic intracranial tumors.</a> Surg Neurol Int. 13, 311(2022).</li>
<li>De Groot, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+laser+interstitial+thermal+therapy+%28LITT%29+for+newly+diagnosed+and+recurrent+IDH+wild-type+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurooncol+Adv%22%5BJournal%5D)">Efficacy of laser interstitial thermal therapy (LITT) for newly diagnosed and recurrent IDH wild-type glioblastoma.</a> Neurooncol Adv. 4 (1), vdac040(2022).</li>
<li>Holste, K. G., Orringer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+interstitial+thermal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurooncol+Adv%22%5BJournal%5D)">Laser interstitial thermal therapy.</a> Neurooncol Adv. 2 (1), vdz035(2020).</li>
<li>Leuthardt, E. C., Voigt, J., Kim, A. H., Sylvester, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-center+cost+analysis+of+treating+primary+and+metastatic+brain+cancers+with+either+brain+laser+interstitial+thermal+therapy+%28LITT%29+or+craniotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacoecon+Open%22%5BJournal%5D)">A single-center cost analysis of treating primary and metastatic brain cancers with either brain laser interstitial thermal therapy (LITT) or craniotomy.</a> Pharmacoecon Open. 1 (1), 53-63 (2017).</li>
<li>Bastos, D. C. D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+local+control+of+brain+metastasis+treated+with+laser+interstitial+thermal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Predictors of local control of brain metastasis treated with laser interstitial thermal therapy.</a> Neurosurgery. 87 (1), 112-122 (2020).</li>
<li>Darbinyan, A., Leelatian, N., Fomchenko, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+changes+associated+with+laser+interstitial+thermal+therapy+for+radiation+necrosis%3A+illustrative+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg+Case+Lessons%22%5BJournal%5D)">Histological changes associated with laser interstitial thermal therapy for radiation necrosis: illustrative cases.</a> J Neurosurg Case Lessons. 4 (1), CASE21373(2022).</li>
<li>Grant, G. A., Porter, B. E., Li, D., Barros Guinle, M. I., Kaur, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach%2C+complications%2C+and+outcomes+for+37+consecutive+pediatric+patients+undergoing+laser+ablation+for+medically+refractory+epilepsy+at+Stanford+Children%27s+Health%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Approach, complications, and outcomes for 37 consecutive pediatric patients undergoing laser ablation for medically refractory epilepsy at Stanford Children's Health.</a> J Neurosurg Pediatr. 33 (1), 1-11 (2023).</li>
<li>Ogasawara, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+interstitial+thermal+therapy+for+cerebral+cavernous+malformations%3A+A+systematic+review+of+indications%2C+safety%2C+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Laser interstitial thermal therapy for cerebral cavernous malformations: A systematic review of indications, safety, and outcomes.</a> World Neurosurg. 166, 279-287.e1 (2022).</li>
<li>Satzer, D., Mahavadi, A., Lacy, M., Grant, J. E., Warnke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+laser+anterior+capsulotomy+for+obsessive-compulsive+disorder%3A+lesion+size+and+tractography+correlate+with+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Interstitial laser anterior capsulotomy for obsessive-compulsive disorder: lesion size and tractography correlate with outcome.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 93 (3), 317-323 (2022).</li>
<li>Salehi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+enhancement+of+blood-brain+and+blood-tumor+barriers+permeability+by+laser+interstitial+thermal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurooncol+Adv%22%5BJournal%5D)">Therapeutic enhancement of blood-brain and blood-tumor barriers permeability by laser interstitial thermal therapy.</a> Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa071(2020).</li>
<li>Navarro, K. L., Huss, M., Smith, J. C., Sharp, P., Marx, J. O., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+anesthesia%3A+The+art+and+science%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Mouse anesthesia: The art and science.</a> ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).</li>
</ol>

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony Monteris Medical, w tym za darowiznę rzeczową w postaci sprzętu laserowego.

Istnieje szybko rozwijająca się literatura dotycząca LITT; Jednak przede wszystkim ogranicza się do klinicznych studiów przypadków lub serii przypadków u ludzi. Rzeczywiście, wykazano kilka potencjalnych korzyści dla LITT, w tym niższe wskaźniki powikłań pooperacyjnych i koszty przy jednoczesnym zapewnieniu porównywalnego przeżycia wolnego od progresji 7,8,9,10,11. Obserwuje się również zmniejszenie liczby nawrotów miejscowych przy większym sukcesie ogólnoustrojowego leczenia farmakologicznego, chociaż przyczyny nie są jeszcze dobrze poznane12. Ponadto obiecujące wyniki do zastosowań klinicznych poza Wielką Brytanią obejmują leczenie przerzutów i innych typów nowotworów 3,12, martwicy popromiennej13, padaczki opornej na leczenie14, malformacji naczyniowych15, a nawet zaburzeń obsesyjno-kompulsywnych16. I odwrotnie, badania z wykorzystaniem modelu mysiego są jak dotąd bardzo ograniczone, z kilkoma godnymi uwagi wyjątkami, które mogą być trudne do powtórzenia. Na przykład w niedawnym badaniu dotyczącym zmian przepuszczalności bariery krew-mózg po leczeniu LITT wykorzystano generator laserowy sprzedawany w Europie do użytku klinicznego, ale instrument ten nie został zatwierdzony w Ameryce Północnej17. Chociaż taki system wydaje się dobrze pasować do ich badań, uzyskanie urządzenia jest prawdopodobnie zbyt kosztowne dla większości badaczy, a wszelkie zastrzeżone lub wysoce zaawansowane technologicznie funkcje są trudne do odtworzenia. W związku z tym szczegółowy protokół dostępnego i zoptymalizowanego przedklinicznego modelu zwierzęcego zapewni cenne możliwości badawcze.
Kluczowe kroki w protokole obejmują dokładną identyfikację szczepionki Bregma w celu powtarzalnego celowania zarówno podczas przeszczepu allogenicznego, jak i późniejszej operacji ablacji LITT. Dodatkowo, zwrócenie szczególnej uwagi na etapy iniekcji w stosunku do szybkości podawania i przerw ma kluczowe znaczenie dla udanych przeszczepów komórek nowotworowych, a niewykonanie tego znacznie zwiększa ryzyko wzrostu guza pozaczaszkowego i większej zmienności guza. Ważne jest również, aby podkreślić, że operacja LITT powinna być zaplanowana, gdy guz jest jeszcze stosunkowo mały (tj. ~1,5-2,0 mm średnicy). Z naszego doświadczenia wynika, że guzy CT2A często stają się bardziej zmienne w kształcie, gdy są duże, a bardzo duże guzy również zwiększają trudność ekstrakcji mózgu, zwłaszcza jeśli guz wyrósł przez powierzchnię kory mózgowej. Należy również zauważyć, że zaledwie 24 godziny, takie jak między rezonansem magnetycznym przed leczeniem a operacją LITT, to wystarczający czas na znaczny wzrost glejaka CT2A.
W protokole można łatwo wprowadzić kilka modyfikacji, aby dostosować go do innych projektów eksperymentalnych. W szczególności protokół ten koncentruje się na krokach technicznych niezbędnych do udanej implantacji ortotopowej i operacji LITT w syngenicznym modelu myszy C57BL/6 CT2A. Jednak opisany model można łatwo zastąpić, aby dostosować go do różnych celów eksperymentalnych. Mniej agresywne syngeniczne linie komórkowe raka, takie jak K1491, mogą być wykorzystywane do przeprowadzania eksperymentów wymagających dłuższych punktów czasowych, takich jak te obejmujące wrodzoną i nabytą odpowiedź immunologiczną. Alternatywnie, w przypadku eksperymentów, które nie koncentrują się na adaptacyjnych odpowiedziach guza-gospodarza, linie komórkowe pochodzące od pacjenta lub inne modele ksenoprzeszczepów w modelach myszy z obniżoną odpornością są inną realną opcją. Dla zainteresowanego czytelnika Haddad i in. (2021) zapewniają kompleksowy przegląd mocnych stron i ograniczeń kilku powszechnych modeli myszy z przeszczepem allogenicznym i ksenoprzeszczepem4. Inną prostą modyfikacją, w zależności od dostępności instytucjonalnej i wytycznych, jest zastąpienie wziewnego środka znieczulającego alternatywami do wstrzykiwań, takimi jak połączenie ketaminy i ksylazyny ± acepromazyny. Jednakże, gdy dostępne są środki wziewne i wymagany sprzęt (np. nosek stereotaktyczny), zalecamy ich stosowanie z kilku powodów. Po pierwsze, uważamy, że wziewne środki znieczulające są bezpieczniejszą alternatywą, ponieważ nie wymagają wstrzyknięcia dootrzewnowego, nie wymagają wielokrotnego dawkowania w przypadku dłuższych lub trudniejszych operacji i można je łatwo miareczkować z dużym marginesem bezpieczeństwa18. Ponadto znieczulenie wziewne nie wymaga stosowania substancji kontrolowanych i zapewnia szybkie wybudzenie i powrót do zdrowia po zabiegu.
Rozwiązywanie problemów związanych z tym protokołem powinno być minimalne, a większość problemów wynika ze złej techniki wstrzykiwania, co skutkuje nieregularnym tworzeniem się guza lub wzrostem pozaczaszkowym. Problemy z celowaniem LITT można rozwiązać dzięki właściwej identyfikacji punktów orientacyjnych, odpowiedniej stabilizacji światłowodu laserowego i uważnej obserwacji włókna laserowego podczas wprowadzania, aby upewnić się, że nie uderza on w bok otworu w zadziorach i nie zostaje zepchnięty z kursu.
Ograniczenia metody obejmują średni i zaawansowany poziom umiejętności chirurgicznych i technicznych wymaganych do wykonywania zabiegów, dostęp do specjalistycznego sprzętu, takiego jak aparat do rezonansu magnetycznego małych zwierząt, oraz długi protokół implantacji ortotopowej, który ogranicza liczbę zastrzyków, które można wykonać w ciągu jednego dnia. Ponieważ protokół ten ma być przedklinicznym modelem glejaka o wysokim stopniu złośliwości, istnieją również nieodłączne ograniczenia związane z bardziej agresywnym charakterem niektórych linii komórkowych glejaka, takich jak CT2A. Szczepienia o niskiej liczbie komórek, głębokie miejsce wstrzyknięcia w prążkowiu, ostrożna technika wstrzykiwania i wczesne leczenie pomogą złagodzić te problemy, ale sporadyczny pozaczaszkowy lub nieregularny wzrost guza może nadal występować, a krótkie projekty eksperymentalne są uzasadnione. Jak wspomniano, modyfikacja tego protokołu za pomocą mniej agresywnej linii komórkowej jest również łatwa do osiągnięcia.
Ponieważ protokół ten jest, według naszej wiedzy, jedynym szczegółowym opisem przedklinicznego modelu mysiego dla LITT of GB, jest to znaczący krok w kierunku zapewnienia dobrze ugruntowanego modelu dla przyszłych badań z zakresu nauk podstawowych.

Rak jest główną przyczyną zgonów w Kanadzie. Glejak wielopostaciowy (GB), najczęstsza forma agresywnego guza mózgu, stanowi od 48% do 60% wszystkich pierwotnych guzów mózgu o wysokim stopniu złośliwości u dorosłych1. Rokowanie dla GB jest szczególnie ponure, z 5-letnim przeżyciem netto wynoszącym 4,8% przy konwencjonalnym leczeniu, w tym resekcji chirurgicznej, chemio- i radioterapii1,2.
Laserowa Śródmiąższowa Terapia Termiczna (LITT) to zatwierdzona przez FDA procedura wykorzystująca laser do hipertermicznej ablacji guzów in-situ u pacjentów z nieoperacyjnymi guzami mózgu i stanowi atrakcyjną alternatywę terapeutyczną dla konwencjonalnej resekcji chirurgicznej3. Brakuje jednak szczegółowego i dobrze scharakteryzowanego mysiego modelu leczenia LITT GB, co utrudnia badania przedkliniczne.
Ten protokół ma na celu zaprezentowanie zoptymalizowanego przedklinicznego modelu mysiego do leczenia GB za pomocą LITT. Zdecydowaliśmy się użyć myszy C57BL / 6 i linii komórkowej glejaka syngenicznego CT2A do tego modelu, przede wszystkim dlatego, że CT2A ściśle rekapituluje ludzką GB o wysokim stopniu złośliwości o podobnych cechach histologicznych, inwazyjności, oporności na chemo- i radioterapię oraz cechach podobnych do łodygi z samoodnawianiem i ponownym ustanawianiem nowotworów4. Cechy te stanowią doskonałą platformę dla różnorodnych badań obejmujących odpowiedzi immunologiczne lub nowatorskie strategie terapeutyczne. Co więcej, techniczne aspekty tego protokołu LITT można również łatwo dostosować do innych modeli mysich allo- i ksenoprzeszczepów4,5,6, które zostaną omówione dalej.
Zalety tego protokołu obejmują spójne wyniki z prostym, ale skutecznym paradygmatem leczenia LITT. Zastosowany laser z granatu itrowo-glinowego (Nd:YAG) o długości fali 1064 nm jest taki sam, jak stosowany klinicznie w jednym z dwóch obecnie zatwierdzonych przez FDA systemów, co pozwala na eksperymenty, które są ściśle równoległe do klinicznego zastosowania LITT w leczeniu glejaka o wysokim stopniu złośliwości. Podstawową wadą tego protokołu jest wyjątkowa ostrożność, którą należy zachować zarówno podczas implantacji komórek nowotworowych, jak i leczenia LITT, aby osiągnąć powtarzalne wyniki. Dodatkowo, ze względu na agresywny charakter linii komórkowej CT2A, protokół jest bardzo wrażliwy na czas. Większość eksperymentów będzie musiała zostać zakończona w ciągu maksymalnie 20 dni, co może ograniczyć badania niektórych adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych lub innych mechanizmów komórkowych i molekularnych zachodzących w dłuższym okresie czasu.

<table><tbody><tr><td>Włócznie absorpcyjne</td><td>FST</td><td>18105-01</td><td>Gąbki hemostatyczne.</td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek Adson</td><td>FST</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 myszy</td><td>Jackson Laboratories</td><td>Strain #000664</td><td>6 do 12 tygodni męskie i żeńskie</td></tr><tr><td>aplikatory z bawełnianą końcówką (6 ")</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>Linia</td><td></td><td></td> komórkowa glejaka CT2A <td>Hojnie podarowana od dr Petera Fecci, Duke University.</td></tr><tr><td>Ekstrakt z błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu Cultrex, PathClear</td><td>Biotechne, R& Systemy D</td><td>3433-010-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice dwukomorowe&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1450003</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf Safe-Lock 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodny alkohol etylowy</td><td>Greenfield Global</td><td>P016EAAN</td><td>Rozcieńczony do 70% z ddH2O</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, Kanada</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Glad Press-n-Seal</td><td>folia</td> plastikowa Amazon.ca <td></td><td></td>12587704417</tr><tr><td>Wiertarka szybkoobrotowa</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 1474</td><td></td></tr><tr><td>K & J Termopara miernik temperatury</td><td>Omega</td><td>HH509R</td><td></td></tr><tr><td>Metacam (meloksykam)</td> <td>WDDC</td><td>114424</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa do mikroiniekcji</td><td>WPI</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka mikrolitrowa (seria 700)</td> <td>Hamilton</td><td>87908</td><td>Dostępne są niestandardowe igły. Stromy skos igły pomaga w precyzyjnym podawaniu, a krótsza długość igły pomaga w stabilności.</td></tr><tr><td>Sterownik igły/uchwyt igły</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td>Cienka końcówka jest najbardziej odpowiednia ze względu na ograniczoną przestrzeń roboczą, ale wiele stylów jest odpowiednich w zależności od preferencji uchwytu.</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna Opixcare Plus</td><td>WDDC</td><td>135941</td><td></td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanem (10x)</td><td>Odczynniki Fisher</td><td>BP399-4</td><td>Rozcieńczyć do 1x z ddH2O</td></tr><tr><td>Powidon-jod</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3955-16</td><td>Aliquat do mniejszych tubek do stosowania z aplikatorami z bawełnianą końcówką.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna (normalna)</td> <td>Skalpel WDDC</td><td>126588</td><td></td></tr><tr><td>, jednorazowego użytku (#15 Ostrze)</td><td>Nożyczki</td> z <td>piór Feather NO15</td><td></td></tr><tr><td>, drobne chirurgiczne</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td>Cienkie nożyczki studenckie, Iris lub Bonn są odpowiednie.</td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 940</td><td>Z cyfrowym wyświetlaczem, konsolą i stożkiem myszy oraz nausznikami.</td></tr><tr><td>Stereotaktyczny uchwyt na strzykawkę</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 1772-F</td><td>Jeśli nie używasz pompy wtryskowej.</td></tr><tr><td>Nici (5-0 monofilament)</td><td>Ethicon</td><td>MCP463G</td><td>Monocryl fioletowa żyłka z odwróconą końcówką tnącą</td></tr><tr><td>Strzykawka, 28 G&nbsp; (0,5 ml)&nbsp;</td><td>BD</td><td>BD 329461</td><td>Strzykawki insulinowe BD Lo-Dose U-100</td></tr><tr><td>TC20 Automatyczny licznik komórek</td><td>BIO-RAD</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Sonda termopary, drobna średnica (Typ K)</td><td>Omega</td><td>TJM-CA316-IM025G-150</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond firmy 3M, klej do tkanek weterynaryjnych&nbsp;</td><td>WDDC</td><td>126125</td><td></td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia orzechów ziemnych Wahl</td><td>WDDC/Wahl</td><td>100963</td><td>Dostępny również bezpośrednio od producenta.</td></tr><tr><td>Podkładka rozgrzewająca</td><td>Bensen Medical</td><td>70308/121873</td><td>Można użyć dowolnego podobnego przedmiotu.</td></tr><tr><td>Webcol Alcohol preps</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71005-20</td><td>Chusteczka nasączona alkoholem, 2-warstwowa, średniej wielkości.</td></tr></tbody></table>

immunokompetentny mysi model do laserowej śródmiąższowej terapii termicznej glejaka

An Immunocompetent Murine Model for Laser Interstitial Thermal Therapy of Glioblastoma

Glejak (GB), najbardziej agresywna forma pierwotnego raka mózgu, stanowi około połowy wszystkich pierwotnych guzów mózgu wysokiego stopnia u dorosłych i nie ma na nią lekarstwa. Laserowa śródmiąższowa terapia termiczna (LITT) jest zatwierdzoną przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) metodą leczenia GB i jest stosowana u pacjentów, którzy mogą nie być kandydatami do konwencjonalnej resekcji chirurgicznej. Chociaż skuteczność kliniczna LITT została ustalona, badania wykraczające poza kliniczne studia przypadków i serie przypadków są ograniczone i utrudnione przez brak ustalonego modelu zwierzęcego. Protokół ten wykorzystuje myszy C57BL / 6 i syngeniczną linię komórkową raka glejaka CT2A do dokładnego odtworzenia ludzkiego GB, przy użyciu lasera 1064 nm z granatu itrowo-aluminiowego domieszkowanego neodymem (Nd: YAG), takiego jak stosowany w jednym z dwóch zatwierdzonych przez FDA systemów LITT, zapewniających doskonałe znaczenie przedkliniczne. Pomyślne opracowanie tego mysiego modelu LITT będzie stanowić cenną platformę do badania unikalnych cech ablacji LITT i jej wpływu na mikrośrodowisko guza, potencjalnie prowadząc do ulepszenia strategii terapeutycznych.

Pomyślną implantację guza CT2A oraz zabiegi LITT można scharakteryzować za pomocą MRI ważonego w czasie T2, co przedstawiono na Rysunku 4, Rysunku 5 oraz Rysunku 6. Obrazy MR uzyskano przy użyciu beztlenowego nadprzewodzącego magnesu 7T z otworem o średnicy 17 cm i kwadraturową cewką do głowy myszy, stosując parametry sekwencji określone w powyższym protokole. Ścisłe przestrzeganie tej metody powinno skutkować wskaźnikiem przyjęcia przeszczepu zbliżonym do 100%, spójną lokalizacją guza oraz formowaniem się guzów o kształcie zbliżonym do sferycznego, co zademonstrowano na Rysunku 4. Cechy te stanowią optymalną podstawę do późniejszych zabiegów LITT i dalszych analiz. Podobnie, jak widać na Rysunku 5, ablacje LITT powinny być spójne zarówno pod względem wielkości, jak i lokalizacji. Centralny rdzeń ablbowanej tkanki będzie składać się z martwicy koagulacyjnej i rozpływczej i będzie łatwo widoczny jako obszar hipointensywny (tzn. czarny) w MRI ważonym w czasie T2. W dniach bezpośrednio następujących po zabiegu LITT, w zależności od przeprowadzonej procedury, typowe jest również wystąpienie obszaru hiperintensywnego (tzn. białego) w obrębie i wokół zmiany, co odpowiada obrzękowi okołozabiegowemu. Rysunek 6 przedstawia nieprawidłowy wynik i zwraca uwagę na niektóre potencjalne pułapki podczas wykonywania tego protokołu.
<img alt="Sekwencja obrazów MRI mózgu podkreślająca wzrost guza, etapy analizy obrazowania diagnostycznego A-C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67381/67381fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obrazy MR w płaszczyźnie czołowej, ważone T2, przedstawiające prawidłowy wzrost guza CT2A. Reprezentatywne obrazy tworzenia się guza u trzech myszy C57BL/6 (A, B, C) w 12. dniu po implantacji. Białe strzałki wskazują granicę guza. Zwróć uwagę na spójną lokalizację guza i jego w przybliżeniu sferyczny kształt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67381/67381fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Skanowanie MRI mózgu pokazuje progresję guza w trzech etapach; schemat zaznacza obszary guza strzałkami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67381/67381fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Koronalne obrazy MR ważone T2 po idealnej ablacji LITT (1 dzień po LITT). Reprezentatywne obrazy ablacji guza metodą LITT u trzech myszy C57BL/6 (A, B, C) w 13. dniu po implantacji. Zwróć uwagę na spójny rozmiar i lokalizację rdzenia zmiany martwiczej. Wykonanie badań MRI przed LITT oraz samych ablacji LITT nieco wcześniej zapewniłoby lepszą równowagę między optymalnym rozmiarem guza do celowania laserowego a możliwością uzyskania późniejszych punktów końcowych po leczeniu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67381/67381fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przekroje mózgu MRI z guzem; widok strzałkowy; analiza obrazowania medycznego; narzędzie diagnostyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67381/67381fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Koronalne obrazy MR ważone T2 w ramach zabiegów LITT przed optymalizacją. Obrazy z trzech myszy C57BL/6 (A, B, C) leczonych przy użyciu identycznych parametrów laserowych i celów stereotaktycznych przed optymalizacją protokołu, jako przykład nieidealnego wyniku. Białe strzałki wskazują granicę guza. Obramowane obszary pokazują region obrzęku. Widoczna jest znaczna zmienność, w tym mniej jednolity wzrost guza oraz niedokładne celowanie ablacją laserową, co skutkuje niespójnym uszkodzeniem tkanki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67381/67381fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Glejak jest wyniszczającą formą pierwotnego raka mózgu, a laserowa śródmiąższowa terapia termiczna staje się obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej chirurgicznej resekcji nieoperacyjnego glejaka. Protokół ten opisuje zoptymalizowany przedkliniczny model myszy, który można wykorzystać do badania efektów leczenia lub leczenia uzupełniającego i skojarzonego.

Immunokompetentny mysi model do laserowej śródmiąższowej terapii termicznej glejaka

Glioblastoma (GB), the most aggressive form of primary brain cancer, accounts for approximately half of all high-grade primary brain tumors in adults and ...

Nasze badania koncentrują się na guzach mózgu u dorosłych. Obejmuje to glejaka wielopostaciowego, glejaka pierwotnego, a także przerzuty do mózgu. Opracowaliśmy mysie modele guza mózgu, aby zidentyfikować skuteczniejsze metody leczenia pacjentów z tymi śmiertelnymi schorzeniami.Glejak wielopostaciowy jest najcięższym i najczęstszym pierwotnym nowotworem mózgu. U ponad 20% pacjentów z glejakiem tego guza mózgu nie można usunąć chirurgicznie. W takich przypadkach laserowa śródmiąższowa terapia termiczna, w skrócie LITT, jest stosowana klinicznie w celu ukierunkowania na te agresywne guzy mózgu.LITT to technologia termicznej ablacji tkanek, która jest klinicznie stosowana w przypadku chirurgicznie niedostępnych guzów mózgu. Nasze badania z wykorzystaniem mysich modeli LITT dostarczą ważnych informacji na temat reakcji tkanek i komórek na obróbkę cieplną w guzie i otaczającej tkance mózgowej. Lepsze zrozumienie zmian molekularnych i komórkowych spowodowanych przez LITT w mózgu umożliwi nam skuteczniejsze wykorzystanie LITT w celu poprawy wyników leczenia pacjentów z guzem mózgu.Najważniejszym wyzwaniem eksperymentalnym jest dokładne ukierunkowanie i leczenie guza. W przeciwieństwie do chirurgii LITT, stosowanej klinicznie u ludzi, większość modeli nie ma obrazowania MRI w czasie rzeczywistym, co utrudnia celowanie w guz bez żadnej pomocy wizualnej. Na początek zapisz wagę znieczulonej myszy, aby obliczyć prawidłowe dawkowanie leku.Ostrożnie ogol obszar operacyjny, omijając oczy, uszy i wąsy. Umieść siekacze myszy w otworze pręta gryzowego i wyreguluj stożek nosowy ramy stereotaktycznej, aż będzie dobrze dopasowany, a następnie dokręć mocującą, aby zamocować ją na miejscu. Sprawdź głębokość znieczulenia, wykonując obustronne szczypanie palców kończyn tylnych.Gdy mysz zostanie odpowiednio znieczulona, zabezpiecz czaszkę za pomocą szpilek do uszu i ustaw głowę w neutralnej pozycji płaszczyzny poziomu. Nałóż obficie maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Za pomocą półcalowej strzykawki o rozmiarze 28 wstrzyknąć meloksykam podskórnie jako lek przeciwbólowy.Zmniejsz szybkość znieczulenia, aby utrzymać docelową częstość oddechów. Następnie aseptyczne ułożenie myszy. Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika nałóż roztwór dezynfekujący chlorheksydyny, zaczynając przyśrodkowo i kierując się na zewnątrz.Następnie za pomocą świeżego sterylnego wacika nałóż 70% etanol w ten sam sposób. Ponownie sprawdź głębokość znieczulenia, monitorując częstość oddechów. Następnie za pomocą skalpela z ostrzem 15 wykonaj nacięcie strzałkowe o długości od 1,0 do 1,5 centymetra, zaczynając nieco za oczami w kierunku rozpieszczania.Teraz, za pomocą sterylnego bawełnianego wacika, odbij krawędzie rany, aby uwidocznić czaszkę. Delikatnie zetrzyj tkankę łączną z tego obszaru. W razie potrzeby użyj sterylnego bawełnianego wacika nasączonego nadtlenkiem wodoru, aby odsłonić powierzchnię czaszki i uwidocznić szwy lambda.Zlokalizuj bregmę w miejscu, w którym lewy i prawy szew rogówkowy stykają się ze szwem strzałkowym. Opcjonalnie, aby ułatwić przenoszenie bregmy podczas operacji LITT, użyj nietoksycznej kolorowej żywicy akrylowej i sterylnej drewnianej wykałaczki i zrób mały znak na bregmie. Z mikrolitrową strzykawką w ramce, wyzeruj współrzędne stereotaktyczne z końcówką dotykającą bregmy.Współrzędna X odnosi się do ruchu w przyśrodkowej płaszczyźnie bocznej, współrzędna Y do przedniego ruchu tylnego, a współrzędna Z do grzbietowej płaszczyzny brzusznej. Upewnij się, że lambda znajduje się w tej samej grzbietowej płaszczyźnie brzusznej co bregma, gdzie Z jest równe zero w obu punktach orientacyjnych. Jeśli konieczna jest regulacja, upewnij się, że czaszka jest nadal bezpiecznie zamocowana, delikatnie uciskając sterylnym wacikiem.Umieść końcówkę igły nad obszarem docelowym we współrzędnych plus 2.0 milimetra media z boku i plus 0.5 milimetra przednio-tylnie od bregma. Ostrożnie opuść końcówkę wiertła, aż zetknie się z czaszką. Lekko podnieś końcówkę igły i zrób małą kropkę w miejscu otworu na zadzior za pomocą sterylnego markera chirurgicznego.Następnie lekko podnieś igłę, aby nie przeszkadzała i wywierć otwór w zaznaczonym miejscu, uważając, aby przebić tylko czaszkę, nie uszkadzając opon mózgowych pod spodem. Utwórz drugi otwór zadziorowy na wysokości plus 3,0 milimetra przyśrodkowego bocznego i plus 0,5 milimetra przednio-tylnego lub przedłuż oryginalny otwór do tej współrzędnej, aby pomieścić termoparę podczas procedury LITT. Następnie wyjmij probówkę z mikrowirówką zawierającą komórki glejaka myszy CT2A z lodu i delikatnie przesuń probówkę opuszkiem palca, aby ponownie zawiesić komórki.Za pomocą strzykawki o pojemności 5 lub 10 mikrolitrów delikatnie pobrać około dwóch mikrolitrów zawiesiny komórek. Odciągnij 0,5 mikrolitra ze strzykawki, aby usunąć powietrze. Przetrzyj trzonek igły wacikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć wszelkie pozostałości płynu lub komórek.Powoli opuść igłę na głębokość w punkcie Z równym minus trzy milimetry i zatrzymaj się na jedną minutę. Następnie powoli cofnij igłę o 0,5 milimetra i wstrzyknij komórki z prędkością 0,5 mikrolitra na minutę. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać dwie minuty, a następnie powoli wyjmować strzykawkę przez trzy do czterech minut.Zatrzymanie się na maksymalnie minutę po pierwszych kilku odstępach od 100 do 250 mikrometrów pomoże zapobiec przemieszczeniu komórek. Aby zamknąć nacięcie rany, ponownie przybliż krawędzie nacięcia. Używając trzech przerwanych szwów z szwem 50, zamknij ranę, lekko odcinając krawędzie rany, aby upewnić się, że znajdująca się pod spodem skóra właściwa dotyka się.Nałóż roztwór jodu powidonu na zamkniętą ranę i przenieś mysz do wyłożonej papierem klatki regeneracyjnej na podkładce rozgrzewającej ustawionej na 37 stopni Celsjusza. Gdy zwierzę odzyska leżącą mostek, może zostać przeniesione z powrotem do klatki domowej. Dziewięć dni po wstrzyknięciu zawiesiny komórek glejaka myszy CT2A zabezpiecz znieczuloną mysz w ramce stereotaktycznej.Odtwórz nacięcie w linii środkowej i użyj sterylnego wacika z bawełnianą końcówką, aby oczyścić czaszkę, aby usunąć wszelkie tkanki zasłaniające bregmę. Z laserową śródmiąższową terapią termiczną lub nasadką LITT umieszczoną na ramie stereotaktycznej, wyzeruj współrzędne w bregma dla końcówki światłowodu laserowego. Następnie lekko podnieś końcówkę światłowodu laserowego i przejdź do pożądanych współrzędnych przyśrodkowych bocznych i przednich tylnych.Następnie powoli opuść sondę do docelowej współrzędnej grzbietowo-brzusznej, aby dotrzeć do celu. Ustaw parametry leczenia LITT na tryb ciągły i zasilaj jeden. Następnie przełącz laser z trybu czuwania na aktywny i włącz laser na 60 sekund za pomocą pedału nożnego.Jeśli temperatura wzrośnie powyżej 46 stopni Celsjusza, zatrzymaj się na chwilę, a następnie włącz ponownie, dążąc do utrzymania temperatury bliskiej 46 stopni Celsjusza. Na koniec powoli wycofaj zespół lasera. Delikatnie wytrzyj włókno lasera i termoparę do czysta wacikiem nasączonym alkoholem.Obróć zespół na bok, upewniając się, że sondy nie stykają się z ramą. Obrazy rezonansu magnetycznego rogówki ważone T2 wykazały udaną implantację guza z prawie 100% wskaźnikami przyjmowania i konsekwentnym tworzeniem guza sferycznego. Leczenie LITT skutkowało konsekwentnymi ablacjami z określonymi hiperintensywnymi czarnymi obszarami, wskazującymi na martwicę tkanek w centralnym rdzeniu i otaczający hiperintensywny biały obszar wskazujący na obrzęk okołooperacyjny.

an-immunocompetent-murine-model-for-laser-interstitial-thermal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Zacznij od mysiego modelu glejaka, inwazyjnego guza mózgu.Na obrzeżach guza bariera krew-mózg (BBB) pozostaje nienaruszona, a komórki śródbłonka tworzą ścisłe połączenia, które regulują wejście molekularne.Mysz jest wyposażona w światłowód montowany na głowie, który dostarcza światło laserowe.Podaj laser na podczerwień o niskiej intensywności, który przenika przez skórę i czaszkę, aby dotrzeć do mózgu.Laser wzbudza tlen cząsteczkowy w komórkach mózgowych, wytwarzając reaktywne formy tlenu (ROS).

Indukowane laserowo przerwanie bariery krew-mózg w celu dostarczania liposomów do mysiego modelu glejaka

Źródło: Clark, A.J., et al. Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie bioluminescencyjne w celu śledzenia progresji glejaka w immunokompetentnym modelu myszy, przy użyciu komórek nowotworowych eksprymujących lucyferazy i lucyferyny do nieinwazyjnego ilościowego określenia wzrostu guza.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego mysiego modelu glejaka

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Komórki glejaka GL261 dostarczają użytecznego immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwych technik monitorowania wzrostu guza wewnątrzczaszkowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz zweryfikowanie użyteczności komórek GL261 zmodyfikowanych lucyferazą do badania immunologii guza i podejść immunoterapeutycznych w leczeniu glejaka.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Tutaj opisujemy przedkliniczny ortotopowy model myszy dla GBM, stworzony przez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych guzów myszy. Model ten wykazuje cechy charakterystyczne dla GBM u ludzi. W przypadku badań translacyjnych guz mózgu myszy jest śledzony za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i histopatologii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

W protokole tym przedstawiono techniki i metodologię niezbędne do celowanej terapii hipertermicznej w modelach guzów litych. Podejście to wykorzystuje fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni przez wstrzykiwane domięśniowo złote nanopręty w celu wywołania miejscowego ogrzewania w mikrośrodowisku guza.

Indukowanie ukierunkowanej łagodnej hipertermii w mysich modelach nowotworów poprzez fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni za pomocą wewnątrznowotworowych nanoprętów złota

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Poznaj zastosowanie laserowej śródmiąższowej terapii termicznej w immunokompetentnym modelu mysim glejaka. Ta metoda umożliwia badanie odpowiedzi tkanek na leczenie termiczne i ocenę skuteczności terapii w nowotworach mózgu.

Immunokompetentny mysi model do laserowej śródmiąższowej terapii termicznej glejaka

Przeglądaj więcej filmów