Izolacja oparta na cytometrii przepływowej i ocena terapeutyczna limfocytów naciekających nowotwór w mysim modelu raka trzustki

Koncentrujemy się na opracowaniu metody izolacji i adoptywnego transferu limfocytów naciekających nowotwór, TIL, w modelu raka trzustki. Próbujemy odpowiedzieć na pytanie, czy podzbiory TIL mogą skutecznie celować i zabijać guzy trzustki in vivo oraz jak można zoptymalizować limfocyty T pod kątem przyszłych badań klinicznych. Ostatnie osiągnięcia w adoptywnej terapii komórkowej, w tym ulepszanie technik izolacji i ekspresji TIL, delikatne modyfikowanie TIL w celu poprawy ich celowania oraz łączenie terapii TIL z innymi immunoterapiami, takimi jak inhibitory punktów kontrolnych lub terapie celowane w celu zwiększenia skuteczności przeciwnowotworowej.

Opracowaliśmy solidną metodę izolowania i namnażania reaktywnych na nowotwór TIL z mysiego modelu raka trzustki. Wykazaliśmy zwiększoną skuteczność przeciwnowotworową adoptywnie przenoszonych limfocytów T reagujących na nowotwór. Nasz protokół oferuje bardziej ukierunkowane podejście do adoptywnej terapii komórkowej, umożliwiając izolację i selekcję TIL specyficznych dla nowotworu w porównaniu z innymi, mniej specyficznymi metodami.

Wykorzystuje się go również za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego do nieinwazyjnego monitorowania guza. Nasze odkrycia przyczynią się do rozwoju tej dziedziny, dostarczając ustandaryzowany model przedkliniczny do oceny skuteczności terapii TIL i optymalizacji parametrów leczenia podzbiorów limfocytów T w raku trzustki. Aby przygotować zawiesinę komórek KPC-lucyferazy do indukcji ortotopowego guza trzustki u myszy, trypsynizuj linię komórkową KPC-Lucyferazy przez jedną minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po trypsynizacji dodać PBS, przenieść komórki, a następnie odwirować zawiesinę komórkową. Policz komórki i ponownie zawieś je w stężeniu 1 razy 10 do potęgi 6 komórek na mililitr w PBS zawierającym 30% macierzy błony podstawnej. Umieść znieczuloną mysz na platformie operacyjnej.

Po wykonaniu 0,5 do 1 centymetrowego nacięcia lewej części brzucha należy przytrzymać śledzionę za pomocą kleszczy i odsłonić trzustkę. Po przygotowaniu mieszanki komórek KPC-Lucyferazy i macierzy błony podstawnej, wstrzyknąć 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej zawierającej 50 000 komórek do trzustki za pomocą igły o rozmiarze 29. Wróć trzustkę do jamy brzusznej.

Sekwencyjnie zszyj otrzewną i skórę. Pozwól myszy zregenerować się na ciepłej podkładce, aż do całkowitego obudzenia. Po siedmiu dniach wstrzyknij dootrzewnowo myszy 60 mikrolitrów roztworu soli potasowej D-Lucyferyny do obrazowania na żywo.

Po znieczuleniu umieść mysz w systemie obrazowania in vivo w celu wykrycia bioluminescencji. Po zobrazowaniu wyjmij mysz z systemu i pozwól jej naturalnie zregenerować się po znieczuleniu. Aby rozpocząć, umieść mysz poddaną eutanazji dawcy na platformie operacyjnej.

Wysterylizuj całe ciało 75% etanolem. W sterylnym kapturze użyj nożyczek i kleszczy, aby otworzyć jamę brzuszną. Usuń guz i umieść go w PBS na lodzie.

Zmierz rozmiar guza za pomocą kalibru noniusza. Następnie oblicz objętość guza, korzystając ze wzoru wyświetlanego na ekranie. Po przygotowaniu roztworu do wytrawiania 1X przy użyciu kolagenazy, Dyspasy II i DNAzy I w RPMI 1640, dodaj od jednego do dwóch mililitrów roztworu na studzienkę na 12-dołkową płytkę.

Zmiel guzy na małe kawałki za pomocą nożyczek. Przenieś kawałki guza do każdej studzienki 12-dołkowej płytki i traw je w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając z prędkością 70 obr./min przez 30 minut. Aby zakończyć trawienie, dodać jeden do dwóch mililitrów 10% płodowej surowicy bydlęcej i przenieść zawiesinę komórkową do probówki zbiorczej.

Umyj studzienki 12-dołkowej płytki dwukrotnie PBS, aby zebrać wszelkie pozostałe komórki. Przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko o średnicy 70 mikrometrów, zmielić i zmiażdżyć fragmenty tkanki, aby uwolnić pojedyncze komórki za pomocą płaskiego końca tłoka strzykawki. Odwirować filtrat o stężeniu 400 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad w 5% albuminie surowicy bydlęcej do barwienia metodą cytometrii przepływowej.

Na początek umieść komórki wyizolowane od myszy z guzem wraz ze śledzioną lub komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej od myszy nienoszącej nowotworu na platformie roboczej. Wybarwić komórki blokerami FC i przeciwciałami przepływowymi w rozcieńczeniu od 1 do 100. Inkubuj probówki na lodzie w ciemności przez 30 minut.

Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie w PBS przez odwirowanie przed ponownym zawieszeniem ich w 1% albuminie surowicy bydlęcej w PBS. Na cytometrze przepływowym, aby posortować komórki CD45 + CD3 +, bramki na żywo oparte na FSC-A i SSC-A w celu utworzenia bramki P1. Następnie bramkują pojedyncze komórki z P1 w oparciu o FSC-A i FSC-H, aby utworzyć bramkę P2. Sortuj komórki CD45 + CD3 + z P2 za pomocą bramkowania CD45 i CD3. Zbierz posortowane komórki do probówek zbiorczych.

Odwirować posortowane komórki CD45 + CD3 w temperaturze 400 G przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza. Ponownie zawiesić komórki w surowicy myszy w stężeniu 1 razy 10 do mocy 6 komórek na mililitr i umieścić je na lodzie. Umieść mysz biorcy wywołaną nowotworem na platformie operacyjnej.

Za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 29 i średnicy 1/2 cala wstrzyknąć dootrzewnowo posortowane komórki odpornościowe. Następnie podawaj interleukinę-2 dootrzewnowo przez trzy kolejne dni.