Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

Przedstawiamy protokół generowania organoidu ludzkiego mózgu zawierającego rezydentny mikroglej i neurony poprzez włączenie indukowanych pluripotencjalnych komórek progenowych hematopoetycznych pochodzących z komórek macierzystych do procesu indukcji i rozwoju organoidów neuronalnych. Metoda ta stanowi model do badania interakcji między mikroglejem a neuronami podczas rozwoju ludzkiego mózgu. Organoidy mózgowe 3D to mini mózgi generowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub iPSC.

Jako alternatywa dla zwierząt i ludzi, są szeroko stosowane w naśladowaniu ludzkich mózgów w badaniach nad rozwojem mózgu i zaburzeniami neurologicznymi. Są one doskonałymi narzędziami do rozwoju badań nad zdrowiem człowieka. Konwencjonalne protokoły dla organoidów 3D ludzkiego mózgu rzadko generują mikroglej, rezydującą komórkę odpornościową ludzkiego mózgu, ponieważ komórki te pochodzą z innej linii embrionalnej niż neurony.

Chociaż mikroglej można dodać do organoidów mózgowych na późniejszym etapie różnicowania, potrzebna jest metoda lepszego naśladowania rozwoju ludzkiego mózgu. Większość innych protokołów dodaje HPC lub mikroglej pod koniec generacji organoidów mózgowych. Wytwarzamy ciała embrionoidalne z mieszanych iPSC i HPC przed indukcją neuronalną.

Może to lepiej naśladować rozwój ludzkiego mózgu, ponieważ prekursory mikrogleju migrują do mózgu na bardzo wczesnym etapie rozwoju. Ponadto zastosowanie HPC pozwala zaoszczędzić całkowity czas różnicowania, ponieważ protokoły różnicowania mikrogleju często trwają ponad 30 dni. Dlatego nasz protokół może zaoszczędzić czas i koszty odczynników.

Na początek wyhodowano zdysocjowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste lub iPSC na 12-dołkowej płytce zawierającej jeden mililitr pożywki E8 Flex, a następnie inkubowano komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny. Następnego dnia sprawdź kolonie pod mikroskopem i policz liczbę kolonii, skanując wszystkie pola w studni. Zastąp pożywkę jednym mililitrem pożywki A z zestawu krwiotwórczego.

Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na 48 godzin. Trzeciego dnia zastąp 500 mikrolitrów zużytej pożywki 500 mikrolitrami świeżej pożywki A i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia obserwuj wzrost i różnicowanie komórek z kolonii iPSC.

Zastąp pożywkę jednym mililitrem pożywki B. Monitoruj różnicowanie komórek pod mikroskopem i wykonuj zmianę połowy pożywki z 500 mikrolitrami pożywki B co drugi dzień przez sześć do siedmiu dni. W dniu 10 obserwuj obecność jasnych, pojedynczych okrągłych komórek o morfologii normalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych lub HPC, unoszących się lub luźno połączonych z komórką warstwy płaskiej z kilkoma luźnymi agregatami. Następnie zbierz wszystkie zróżnicowane HPC, pipetując trzykrotnie w górę i w dół za pomocą jednomililitrowej końcówki do pipety.

Przenieś komórki do 15-mililitrowej probówki. Odwirować zawiesinę komórek o sile 300 G przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki B. Dodać 20 mikrolitrów zawiesiny komórek do komory zliczania komórek i policzyć komórki za pomocą miernika komórkowego. Dostosuj stężenie komórek do 1 miliona komórek na mililitr za pomocą pożywki B. Technika hodowli seryjnego rozcieńczania pozwoliła uzyskać odpowiednią liczbę i rozmiary kolonii iPSC, przy czym kolonie wykazywały znaczące zmiany morfologiczne pod koniec hodowli w pożywce A. Po trzech dniach w pożywce B zaobserwowano różnicowanie HPC z pojawieniem się jednorodnych okrągłych komórek.

W dniu 10 HPC utworzyły głównie klastry przypominające kolonie bez znaczących szczątków. Po zebraniu HPC różniących się od ludzkich iPSC sprawdź, czy kultura iPSC osiągnęła 80% konfluaturę. Dodaj 500 mikrolitrów roztworu do płukania zapobiegającego przywieraniu do jednego dołka płytki mikrodołkowej, minimalizując tworzenie się pęcherzyków.

Obracaj płytkę z prędkością 2 000 G przez pięć minut w wahadłowym wirniku kubełkowym wyposażonym w uchwyty na talerze. Całkowicie usunąć roztwór płuczący i umyć studzienki dwukrotnie jednym mililitrem DPBS, a następnie jednym mililitrem DMEM/F-12 bez wytwarzania pęcherzyków. Potraktuj iPSC jednym mililitrem roztworu ACCUTASE, aby zainicjować dysocjację komórek.

Obserwuj komórki pod mikroskopem, zauważając oznaki separacji komórek, podczas gdy komórki pozostają przyczepione do dna. Zastąp roztwór ACCUTASE jednym mililitrem pożywki DMEM/F-12, a następnie wymieszaj w górę iw dół, aby zdysocjować komórki na pojedyncze komórki. Przenieś zdysocjowane komórki do 15-mililitrowej probówki i dodaj pożywkę DMEM/F-12, aby osiągnąć końcową objętość pięciu mililitrów.

Odwiruj komórki w temperaturze 300G przez pięć minut i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki E8 Flex. Policz komórki, aby dostosować stężenie komórek do 1 miliona komórek na mililitr w pożywce E8 Flex. Następnie wymieszać iPSC z HPC w stosunku dwa do jednego do jednego w studzience płytki do hodowli mikrostudzienki.

Dodać jeden mikrolitr roztworu podstawowego inhibitora ROCK Y-27632 na jeden mililitr pożywki do supernatantu i wstrząsnąć płytką na boki. Obracaj płytkę w temperaturze 300G przez pięć minut i obserwuj pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki osiadły w mikrostudzienkach. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Po 48 godzinach obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem tworzenia się ciał zarodkowych lub EB. Następnie potraktuj 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej 500 mikrolitrami buforu do płukania zapobiegającego przywieraniu przez 15 minut, aby utworzyć niską płytkę mocującą. Umyj studzienki dwukrotnie jednym mililitrem DPBS i dodaj jeden mililitr pożywki E8 Flex do każdej studzienki.

Używając końcówki pipety z otworem o szerokości jednego mililitra, ponownie zawieś EB na płytce do hodowli mikrostudzienek. Następnie, do każdego dołka 24-dołkowej płytki o niskim przyleganiu, dodaj 100 mikrolitrów pożywki zawierającej EBs. Inkubuj płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin.

Na początek rozmrażaj podwielokrotności matrycy błony podstawnej na lodzie przez 30 minut. Drugiego dnia po utworzeniu EB, używając wstępnie schłodzonej końcówki pipety o pojemności 20 mikrolitrów, dodaj 15 mikrolitrów lodowatej matrycy membrany podstawnej w małych kroplach na wierzch pożywki, aby pokryć EB. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla na 48 godzin.

Czwartego dnia po utworzeniu EB ostrożnie usunąć 500 mikrolitrów pożywki bez naruszania EB i powtórzyć powlekanie macierzy błony podstawnej, jak pokazano wcześniej. Następnie dodaj 500 mikrolitrów pluripotencjalnego podłoża do indukcji neuronów komórek macierzystych na wierzch komórek. Umieść płytkę w inkubatorze z komórkami o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

W szóstym i ósmym dniu wykonaj zmianę połowy pożywki, ostrożnie zastępując 500 mikrolitrów pożywki 500 mikrolitrami świeżej pożywki do indukcji neuronalnej. Po inkubacji w dniach 10, 12 i 14 wykonaj zmianę połowy pożywki za pomocą pożywki z nerwowymi komórkami macierzystymi. W dniu 15 przenieś dobrze zawierające kulki wraz z podłożem na nową 12-dołkową płytkę potraktowaną roztworem do płukania zapobiegającego przywieraniu.

Dodaj 500 mikrolitrów pożywki do dojrzewania neuronów na wierzch kultury. Na etapie dojrzewania należy monitorować podłoże pod kątem oznak wyczerpania składników odżywczych, takich jak zmiana koloru. Jeśli zaobserwuje się wyczerpanie składników odżywczych, przenieś organoid na płytkę sześciodołkową.

W dniu 17 należy uzupełniać pożywkę dojrzewającą cytokinami przez sześć dni, aby ułatwić dojrzewanie mikrogleju. Wreszcie, w 23 dniu, zbierz powstałe organoidy nerwowe w celu scharakteryzowania. Wysokiej jakości mieszaniny HPC i iPSC utworzyły EB w ciągu 24 godzin, wykazując ciągły wzrost i minimalną ilość zanieczyszczeń.

Po przeniesieniu na nową płytkę, EBS kontynuował wzrost, aż osiągnął plateau w pożywce do dojrzewania.