Name: Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Poznaj protokół generowania ludzkich organoidów mózgu z mikroglejem i neuronami przy użyciu komórek macierzystych iPSC. Ta metoda umożliwia badanie interakcji mikroglej-neuron podczas rozwoju mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie jest wspierane przez wewnętrzne fundusze badawcze NINDS.

Oryginalne próbki krwi od zdrowych dorosłych dawców zostały pobrane w Banku Krwi Medycyny Transfuzjologicznej NIH, a podpisane formularze świadomej zgody zostały uzyskane zgodnie z Instytucjonalną Komisją Rewizyjną NIH.
1. Wytwarzanie hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC) z ludzkich iPSC
UWAGA: Ludzkie komórki iPSC 510 i 507 zostały użyte do uzyskania reprezentatywnych wyników. Metody generowania i utrzymywania iPSC można znaleźć w poprzedniej publikacji16.
<ol>
	<li>Dzień 0: Pokryj 12-dołkową płytkę komórkową, dodając 500 μl/basenik lodowatego roztworu Matrigel (matryca błony podstawnej [BMM]) rozcieńczonego w pożywce DMEM/F12 i inkubuj przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Całkowicie usunąć supernatant powlekający i zastąpić go 1 ml pożywki E8 Flex na studzienkę.</li>
	<li>Sprawdź hodowlę iPSC na 6-dołkowej płytce pod mikroskopem, aby potwierdzić, że iPSC są wysokiej jakości i nie wykazują oznak różnicowania. Wybierz średniej wielkości kolonię, oznaczając ją markerem pod spodem płytki.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z hodowli iPSC i dodać 500 μl buforu dysocjacyjnego iPSC kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,5 mM EDTA, 0,45 g/l NaCl w DPBS) do studzienki.</li>
	<li>Obserwuj pod mikroskopem oznaki dysocjacji komórek, gdy trzy do czterech rzędów komórek od krawędzi kolonii zaczynają się kurczyć, a między komórkami pojawia się pusta przestrzeń. Zwykle zajmuje to 1-3 minuty.</li>
	<li>Całkowicie odrzucić roztwór EDTA. Usunąć oznaczoną kolonię iPSC, pipetując 1 ml pożywki E8 Flex z dużą siłą i bezpośrednio na nią. Upewnij się, że kolonia całkowicie odczepia się na plastry zawierające 20-50 komórek każda po 1-3 krotnym pipetowaniu.</li>
	<li>Zebrać sklarowany nad osadem zawierający łaty komórkowe i dodać go do pierwszego dołka z powlekanych studzienek na płytce 12-dołkowej.</li>
	<li>Wymieszać studzienkę, pipetując jeden lub dwa razy, a następnie przenieść 1 ml komórek do drugiej studzienki, która zawiera 1 ml pożywki.</li>
	<li>Powtórz krok 1.8 dwukrotnie, aby wykonać seryjnie rozcieńczone kultury iPSC w sumie w czterech studzienkach.</li>
	<li>Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Po 24 godzinach, w dniu 1, sprawdź kolonie pod mikroskopem i policz liczbę kolonii, przechodząc przez wszystkie pola w studni w sposób ciągły. Wybierz jedną studzienkę, która zawiera 10-20 kolonii iPSC.</li>
	<li>Zastąp pożywkę 1 ml pożywki A z zestawu do leczenia układu krwiotwórczego. Włożyć płytkę z powrotem do inkubatora na 48 godzin.</li>
	<li>W dniu 3 usuń 500 μl zużytej pożywki i dodaj 500 μl świeżej pożywki A.</li>
	<li>W 4 dniu obserwuj pod mikroskopem i zauważ znaczny wzrost komórek i różnicowanie się od kolonii iPSC. Zastąp pożywkę 1 ml pożywki B.</li>
	<li>Monitoruj różnicowanie komórek pod mikroskopem i wykonuj zmianę połowy pożywki za pomocą 500 μl pożywki B co drugi dzień. Komórki podobne do HPC pojawiają się w 6-7 dniu.</li>
	<li>W dniu 10 obserwuj pod mikroskopem jasne, pojedyncze okrągłe komórki o morfologii normalnych HPC unoszących się w pożywce lub luźno przyczepionych do pojedynczej dolnej warstwy płaskich komórek, z kilkoma luźnymi agregatami komórek. 
	UWAGA: Zróżnicowane HPC są gotowe do zebrania w celu scharakteryzowania lub dalszych eksperymentów.</li>
	<li>Zebrać wszystkie zróżnicowane HPC, pipetując trzykrotnie w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml w celu rozbicia agregatów komórek i odłączenia HPC od powierzchni płytki.</li>
	<li>Dodać komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml pożywki B.</li>
	<li>Policz komórki i dostosuj stężenie do 1 miliona komórek/ml. Na tym etapie generowanych jest ponad 1 milion HPC. Podczas sprawdzania za pomocą cytometrii przepływowej upewnij się, że czystość wynosi więcej niż 85% komórek z CD34+/CD43+. Upewnij się, że nie zauważono żadnych znaczących martwych komórek (więcej niż 5%).</li>
</ol>
2. Rozwijanie ciał embrionalnych z mieszanych iPSC i HPC
<ol>
	<li>Tego samego dnia zbierania HPC upewnij się, że kultura iPSC osiąga również 80% konfluencji w jednym dołku na płytce 6-dołkowej (lub dwóch studzienkach w płytce 12-dołkowej).</li>
	<li>Potraktuj jedną studzienkę z płytki do hodowli mikrodołka pod kątem tworzenia EB 500 μl roztworu do płukania zapobiegającego przyleganiu, dodając go w celu zminimalizowania pęcherzyków.</li>
	<li>Obracaj płytkę o wymiarach 2000 x g przez 5 minut w obracającym się wirniku kubełkowym wyposażonym w uchwyty na talerze, aby usunąć ewentualne pęcherzyki.</li>
	<li>Całkowicie usunąć roztwór płuczący przez pipetowanie i umyć studzienki dwukrotnie 1 ml DPBS, a następnie 1 ml DMEM/F12 bez wytwarzania pęcherzyków.</li>
	<li>Oddzielić iPSC od płytki, traktując komórki 1 ml roztworu Accutase.</li>
	<li>Obserwuj pod mikroskopem, aż komórki wykazują oznaki separacji, ale nadal są przyczepione do dna. Zwykle dzieje się to w ciągu 1-3 minut od zabiegu Accutase. Nie należy nadmiernie trawić komórek iPSC.</li>
	<li>Całkowicie usunąć roztwór Accutase bez naruszania komórek i dodać 1 ml pożywki DMEM/F12 do studzienek. Następnie rozdziel komórki na pojedyncze komórki, pipetując kilka razy w górę iw dół za pomocą końcówki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml i napełnić ją do 5 ml pożywką DMEM/F12. Wiruj komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant przez pipetowanie i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki E8 Flex. Policz komórki i dostosuj stężenie komórek do 1 miliona komórek na ml w pożywce E8 Flex.</li>
	<li>Wymieszaj iPSC z HPC w stosunku 2:1, dodając do siebie 1 milion iPSC (1 ml) i pół miliona HPC (500 μl). Dodaj wszystkie zmieszane komórki do wcześniej potraktowanego dołka płytki hodowlanej mikrostudzienki.</li>
	<li>Dodać 1 μl roztworu podstawowego inhibitora skał Y27632 (1 mM) na 1 ml pożywki do supernatantu. Potrząśnij płytką kilka razy z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić komórki.</li>
	<li>Obracać płytkę do hodowli mikrodołka o wymiarach 300 x g przez 5 minut w wahadłowym wirniku kubełkowym wyposażonym w uchwyty na płytki. Obserwuj pod mikroskopem, aby zobaczyć, czy komórki osiadły w mikrostudzienkach. (Rysunek uzupełniający 1A).</li>
	<li>Nie naruszając komórek, umieścić płytkę w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C i stężeniu 5%CO2.</li>
	<li>W 2 dniu, 48 godzin później, obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem tworzenia się EB. Gdy EB są wyraźnie uformowane, przejdź do następnego kroku (rysunek uzupełniający 1B).</li>
	<li>Na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej należy potraktować buforem do płukania zapobiegającym przywieraniu (500 μl) przez 15 minut, aby uzyskać niską płytkę mocującą.</li>
	<li>Całkowicie usunąć bufor płuczący i umyć studzienki dwukrotnie 1 ml DPBS, a następnie dodać 1 ml pożywki E8 Flex do studzienek.</li>
	<li>Ponownie zawiesić EB na płytce do hodowli mikrodołków, pipetując je kilka razy końcówką pipety z kryzą o szerokości 1 ml.</li>
	<li>Dla każdego dołka z 24-dołkowymi płytkami o niskiej adherencji zebrać i dodać 100 μl pożywki zawierającej EB. Spowoduje to 10-20 EB na odwiert. Dodaj pożywkę E8 Flex do starej studni zawierającej resztki EB jako kopie zapasowe.</li>
	<li>Inkubować płytkę w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
</ol>
3. 3D indukcja, proliferacja i dojrzewanie organoidów nerwowych
<ol>
	<li>W 2 dniu po utworzeniu EB rozmrażaj porcje BMM na lodzie przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Użyj wstępnie schłodzonej końcówki o pojemności 20 μl i mądrze dodaj 15 μl lodowatej kropli BMM na wierzch podłoża, aby pokryć EB. W ten sposób powstaje film BMM, do którego EB będą się przyczepiać i do którego będą rosły.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C i stężeniu 5%CO2.</li>
	<li>W 4 dniu, po utworzeniu EB, ostrożnie usunąć 500 μl pożywki, nie wyrzucając EB i powtórzyć powlekanie BMM, postępując zgodnie z krokiem 3.2.</li>
	<li>Natychmiast rozpocznij indukcję neuronalną, dodając 500 μl pożywki do indukcji neuronalnej PSC na wierzch komórek.</li>
	<li>W dniach 6 i 8 wykonaj połowę zmiany pożywki, ostrożnie usuwając 500 μl pożywki bez dotykania komórek i dodając 500 μl pożywki do indukcji neuronalnej.</li>
	<li>W dniach 10, 12 i 14 wykonaj połowę zmiany pożywki z pożywką z nerwowych komórek macierzystych (NSC): Knockout DMEM/F12 + 1x suplement Glutamax + 1x Suplement neuronalny + bFGF + EGF.</li>
	<li>W dniu 15 przenieś całą studzienkę kulek z pożywką na nową 12-dołkową płytkę potraktowaną roztworem do płukania zapobiegającym przywieraniu, jak opisano wcześniej. Dodać 500 μl pożywki do dojrzewania neuronów (DMEM/F12 + 1x suplement N2 + 1x suplement B27 + 1x antybiotyki przeciwgrzybicze) na wierzch hodowli.</li>
	<li>Wykonuj zmianę połowy pożywki z pożywką do dojrzewania neuronów co drugi dzień.</li>
	<li>Na etapie dojrzewania, jeśli występują oznaki wyczerpania składników odżywczych, takie jak zmiana koloru pożywki, przenieś organoid do 6 dołków, które mieszczą do 3 ml pożywki na studzienkę.</li>
	<li>Opcjonalnie 17 dni po wytworzeniu EB należy uzupełnić pożywkę dojrzewającą cytokinami (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) przez 6 dni, aby ułatwić dojrzewanie mikrogleju.</li>
	<li>W dniu 23 zbierz powstałe organoidy nerwowe w celu scharakteryzowania lub dalszych eksperymentów.</li>
</ol>
4. Usuwanie i barwienie immunologiczne organoidów nerwowych 3D
<ol>
	<li>Utrwalić do 10 organoidów przez zanurzenie w 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Przenieść organoidy z każdej studzienki na 96-dołkową przezroczystą płytkę denną i przemyć 200 μl DPBS 2 razy przez 1 godzinę za każdym razem, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Organoidy należy przepuszczać, myjąc je raz w 50% metanolu w DPBS, 80% metanolu w wodzie podwójnie destylowanej (dd) i 100% suchym metanolu przez 10 minut każde, w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Organoidy myć seryjnie w 20% DMSO/metanolu, 80% metanolu w wodzie dd, 50% metanolu w DPBS, w 100% DPBS, a następnie w DPBS 0,2% Triton X-100, przez 10 minut każdy w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając. Staraj się całkowicie usunąć resztki buforu po każdym praniu.</li>
	<li>Inkubować w buforze przepuszczalnym (DPBS z 0,2% Triton X100, 0,3 M glicyną i 20% DMSO) z delikatnym wytrząsaniem przez 40 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Blokuj bufor blokujący (DPBS z 0,2% Triton X100, 6% kozią surowicą i 10% DMSO) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z delikatnym wstrząsaniem na wytrząsarce przy 80 obr./min.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami w buforze do rozcieńczania przeciwciał (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-tubulina, 1:1000, 100 μl / basenik w DPBS z 0,2% Tween 20, 100 μg/ml heparyny, 3% surowicy koziej i 5% DMSO) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny lub w chłodni z delikatnym wstrząsaniem przy 80 obr./min przez 3 dni.</li>
	<li>Przemyć DPBS z 0,2% Tween 20, 100 μg/ml heparyny 5 razy, po 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając na wytrząsarce przy 80 obr./min.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (1:200 koza anty-mysz Alexa488) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie RT przez noc, delikatnie wstrząsając wytrząsarką przy 80 obr./min.</li>
	<li>W przypadku barwienia z kontrastem jądrowym należy przeprowadzić barwienie DAPI razem z inkubacją przeciwciał lub w buforze do mycia.</li>
	<li>Umyć organoidy 10 razy w buforze do mycia, za każdym razem 10 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Obserwuj pod mikroskopem. Jeśli tło jest nadal wysokie, umyj je 5 razy.</li>
	<li>Odrzucić supernatant w jak największym stopniu. Dodać 200 μl roztworu do oczyszczania organoidów i inkubować go przez 5 minut przed obserwacją, a następnie wykonać zdjęcia za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>

Generating Human Brain Organoids with Resident Microglia Using iPSC-Derived HPCs

<ol><li>Sabate-Soler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+integration+into+human+midbrain+organoids+leads+to+increased+neuronal+maturation+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia integration into human midbrain organoids leads to increased neuronal maturation and functionality.</a> Glia. 70 (7), 1267-1288 (2022).</li>
<li>Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+diseases+of+tissue-resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Physiology and diseases of tissue-resident macrophages.</a> Nature. 618 (7966), 698-707 (2023).</li>
<li>Wang, T., Liu, B., Zhang, W., Wilson, B., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andrographolide+reduces+inflammation-mediated+dopaminergic+neurodegeneration+in+mesencephalic+neuron-glia+cultures+by+inhibiting+microglial+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Andrographolide reduces inflammation-mediated dopaminergic neurodegeneration in mesencephalic neuron-glia cultures by inhibiting microglial activation.</a> J Pharmacol Exp Ther. 308 (3), 975-983 (2004).</li>
<li>Qian, L., Flood, P. M., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+is+a+key+player+in+Parkinson%27s+disease+and+a+prime+target+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation is a key player in Parkinson's disease and a prime target for therapy.</a> J Neural Transm (Vienna). 117 (8), 971-979 (2010).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Fakıoğlu, D. M., Altun, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+therapeutic+approaches+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Turk+J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">New therapeutic approaches in cystic fibrosis.</a> Turk J Pharm Sci. 17 (6), 686-697 (2020).</li>
<li>Mcmillan, R. E., Wang, E., Carlin, A. F., Coufal, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microglial+models+to+study+host-virus+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human microglial models to study host-virus interactions.</a> Exp Neurol. 363, 114375(2023).</li>
<li>Scopa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jun+upregulation+drives+aberrant+transposable+element+mobilization%2C+associated+innate+immune+response%2C+and+impaired+neurogenesis+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Jun upregulation drives aberrant transposable element mobilization, associated innate immune response, and impaired neurogenesis in Alzheimer's disease.</a> Nat Commun. 14 (1), 8021(2023).</li>
<li>Tamaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+extracts+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+spread+TDP-43+pathology+in+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Spinal cord extracts of amyotrophic lateral sclerosis spread TDP-43 pathology in cerebral organoids.</a> PLoS Genet. 19 (2), e1010606(2023).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+es+and+IPS+cells+by+dual+inhibition+of+smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human es and IPS cells by dual inhibition of smad signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Kim, S. H., Chang, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+human+brain+organoids-opportunities+and+challenges+in+modeling+human+brain+development+and+neurodevelopmental+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of human brain organoids-opportunities and challenges in modeling human brain development and neurodevelopmental diseases.</a> Int J Mol Sci. 24 (15), 12528(2023).</li>
<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Ormel, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+innately+develop+within+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microglia innately develop within cerebral organoids.</a> Nat Commun. 9 (1), 4167(2018).</li>
<li>Abdelmalek, C. M., et al. Building a growing genomic data repository for maternal and fetal health through the ping consortium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbdelmalek%2C+CM+%22medRxiv%22">medRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IPSC-derived+brain+organoids%3A+A+3D+mini-brain+model+for+studying+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human IPSC-derived brain organoids: A 3D mini-brain model for studying HIV infection.</a> Exp Neurol. 364, 114386(2023).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+stem+cell+function+and+neuronal+differentiation+by+HERV-K+via+mTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of stem cell function and neuronal differentiation by HERV-K via mTOR pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (30), 17842-17853 (2020).</li>
<li>Mcquade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+simplified+method+to+generate+human+microglia+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells.</a> Mol Neurodegener. 13 (1), 67(2018).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Fiorenzano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+captures+features+of+human+midbrain+development+and+dopamine+neuron+diversity+in+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids.</a> Nat Commun. 12 (1), 7302(2021).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-region-specific+organoids+using+mini-bioreactors+for+modeling+ZIKV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Park, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPS-cell-derived+microglia+promote+brain+organoid+maturation+via+cholesterol+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer.</a> Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).</li>
<li>Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchafer%2C+ST+%22Cell%22">Cell</a>. 186 (10), 2111-2126.e20 (2023).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół wytwarzania 3D organoidów nerwowych zawierających wrodzony mikroglej z EB pochodzących z mieszanych iPSC i HPC zróżnicowanych iPSC. Jest to stosunkowo krótkie i łatwe podejście, obejmujące jedynie techniki i sprzęt do hodowli komórkowych ogólnie dostępne w większości laboratoriów.
Najważniejszym czynnikiem decydującym o powodzeniu tego protokołu jest jakość zróżnicowania HPC. Przyjęliśmy opublikowaną metodę17 przy użyciu ...

Mikroglej to komórki odpornościowe w mózgu, odgrywające kluczową rolę zarówno w rozwoju mózgu, jak i homeostazie1,2. Aktywacja mikrogleju powoduje produkcję czynników prozapalnych, podwyższoną fagocytozę i reaktywny stres oksydacyjny, który usuwa atakujące patogeny i uszkodzone komórki. Jednak nadmierna aktywacja lub przedłużona aktywacja mikrogleju może z drugiej strony powodować neurodegenerację jako mechanizm patogenezy w wielu zaburzeniach neurologicznych, w tym w chorobie Parkinsona3,4. Ważne jest, aby mikroglej został uwzględniony w odpowiednich modelach do badania zaburzeń neurologicznych człowieka. W ostatnich latach ludzkie komórki macierzyste zostały wykorzystane do opracowania organoidów 3D jako modeli in vitro jako alternatywy dla modeli zwierzęcych i badań z udziałem ludzi5. Idealnie byłoby, gdyby ludzkie organoidy składały się z wielu typów komórek i struktur tkankowych podobnych do odpowiadających im narządów ludzkich, lepiej reprezentujących ludzką fizjologię i patogenezę niż modele zwierzęce, ale bez obaw etycznych związanych bezpośrednio z badaniami na osobach ludzkich. Mogą one stanowić przyszłość modelowania chorób u ludzi w badaniach nad patogenezą i opracowywaniem leków oraz w prowadzeniu zindywidualizowanych terapii6. Na przykład organoidy 3D ludzkiego mózgu pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przeważają w dziedzinie badań neurobiologicznych, modelowania chorób zakaźnych neuronów, w tym ZIKA, SARS-CoV-27, oraz chorób neurodegeneracyjnych, w tym stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) i choroby Alzheimera8,9. Jednak konwencjonalne organoidy neuronalne 3D wykorzystujące hamowanie podwójnego SMAD w celu wywołania różnicowania neuronów10 wytwarzają organoidy mózgowe pozbawione mikrogleju, ponieważ pochodzą one od przodków rekrutowanych z krwi, a nie z linii neuroektodermy, z której pochodzą neurony11,12. Bez obecności mikrogleju organoidy są nieodpowiednie do modelowania infekcji OUN, stanu zapalnego i związanej z tym neurodegeneracji.
Aby rozwiązać ten krytyczny problem, podjęto próby włączenia zróżnicowanego mikrogleju do organoidów mózgowych13 lub indukowania różnicowania mikrogleju w organoidach od początku przy użyciu alternatywnych podejść zamiast hamowania podwójnym SMAD13. Jednak poprzez włączenie zróżnicowanego mikrogleju do organoidów mózgowych, wczesne interakcje między rozwojem neuronów i mikrogleju są pomijane. Może to być ważne w rozwoju OUN lub patogenezie zaburzeń neurozakaźnych ukierunkowanych na rozwój mózgu niemowlęcia, takich jak zakażenie wirusem ZIKA14. Z drugiej strony, różnicowanie wrodzonego mikrogleju w organoidach mózgowych pochodzących z iPSC bez przerywanych etapów wiąże się z długotrwałym procesem i ma większą zmienność w obrębie produktów końcowych15. W tym zgłoszonym protokole włączyliśmy hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC) pochodzące z iPSC do iPSC, aby wytworzyć ciała embrionoidalne (EB), które zostały dalej zróżnicowane w organoidy 3D, w tym zarówno neurony, jak i mikroglej.
Nasz protokół zapewnia łatwe podejście, które można zastosować do badania ludzkiego ośrodkowego układu nerwowego, w tym wczesnych interakcji neuron-mikroglej oraz patogenezy zaburzeń infekcyjnych nerwowych i zapalenia nerwów z aktywacją mikrogleju.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Corning&nbsp;</td><td>#3512</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>SARSTEDT</td><td>#83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Aggrewell 400</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>#34411</td><td>Określane jako płytka do hodowli mikrodołkowej&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie</td><td>Technologie życia</td><td>A11001</td><td>1:400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-królikowe</td><td>Technologie życia</td><td>A11012</td><td>1:400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Allegra X-30R Wirówka z wirnikiem S6069</td><td>Beckman Couler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-adherence&nbsp; Roztwór do płukania</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CD34</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>#60013</td><td>1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD43</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>#60085</td><td>1:100 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-IBA1 rabbbit</td><td>Fujifilm</td><td>019-19741</td><td>2,5 i mikro; g/mL</td></tr><tr><td>anty-TREM2&nbsp; szczur pAb</td><td>RD Systems</td><td>mab17291</td><td>2,5 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>1x</td></tr><tr><td>suplement B27</td><td>Technologie życiowe</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>CD200</td><td>Novoprotein</td><td>C311</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Fiolki CryoTube</td> 100 ng/ml <td>Thermo</td><td>#368632</td><td></td></tr><tr><td>CX3CL1</td><td>Peprotech</td><td>300-31</td><td>&nbsp; 100 ng/ml</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life technologies</td><td>12400-024</td><td>1x</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>#4190136</td><td>1x</td></tr><tr><td>E8 Flex medium kit</td><td>Thermo</td><td>A2858501</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Mediatech</td><td>46-034-Cl&nbsp;</td><td>0,5 mM</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto Microscope</td><td>Mikroskop termofluorescencyjny</td><td></td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>FastStart Uniwersalny SYBR Green PCR master mix</td><td>Roche</td><td>#4913850001</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>#35050079</td><td></td></tr><tr><td>Serum kozie</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>4%</td></tr><tr><td>IL-34</td><td>Peprotech</td><td>200-34</td><td>&nbsp; 100 ng/ml</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro Konfokalne</td><td>urządzenia</td><td></td><td></td>molekularne</tr><tr><td>Knockout DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>#10829018</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>&nbsp; 25 ng / ml</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>#354277</td><td>Macierz membrany podstawnej (BMM)</td></tr><tr><td>Mysz anty-&beta; Przeciwciało III-tubulinowe</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td>rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Mr. Frosty pojemnik</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>Technologie życia</td><td>17502-048</td><td>1x</td></tr><tr><td>Paraformadehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4%</td></tr> <tr><td>PSC Pożywka do indukcji neuronów</td><td>Gibco</td><td>A1647801</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor skały Y27632</td><td>Komórka macierzysta technologie</td><td>#72304</td> 1 <td>mM zapas</td></tr><tr><td>RT LTS 1000 ul końcówki do pipet</td><td>RAININ#</td><td>30389218</td><td>&nbsp; do przenoszenia organoidów</td></tr><tr><td>STEMdiff Cerebral Organoid</td><td>Kit Stem Cell Technologies</td><td>#08570</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Hematopoietic Kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>#5310</td><td>Określany jako zestaw krwiotwórczy</td></tr><tr><td>StemPro Neural Supplement</td><td>Gibco</td><td>A1050801</td><td>Określany jako suplement neuronowy</td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Total RNA Purification Plus</td><td>Kit Norgen</td><td>#48400</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Visikol Histo-Starter Kit</td><td>Visikol</td><td>HSK-1</td><td>Zawiera roztwór do oczyszczania organoidów HISTO-M, bufor myjący</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510-META Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

Derivation of a Human Brain Organoid with Microglia Development

Trójwymiarowe (3D) hodowle organoidów mózgowych pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) stanowią ważną alternatywę dla narzędzia in vitro do badania rozwoju ludzkiego mózgu i patogenezy chorób neurologicznych. Jednak brak włączenia mikrogleju do organoidów ludzkiego mózgu jest nadal główną przeszkodą dla modeli 3D zapalenia nerwów. Obecne podejścia obejmują albo włączenie w pełni zróżnicowanego mikrogleju do dojrzałych organoidów mózgowych, albo indukcję różnicowania mikrogleju od wczesnego stadium ciał zarodkowych (EB) pochodzących z iPSC. W pierwszym podejściu pomija się etap, w którym różnicowanie mikrogleju wchodzi w interakcję z sąsiednim środowiskiem neuronalnym, a drugie podejście jest technicznie trudne, co skutkuje niespójnością między końcowymi organoidami pod względem ilości i jakości mikrogleju. Aby modelować organoidy mózgowe z mikroglejem w celu zbadania wczesnych interakcji między rozwojem mikrogleju i neuronów, wysoce czyste hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC) zróżnicowane od ludzkich iPSC włączono do EB pochodzących z iPSC w celu wytworzenia organoidów mózgowych. Korzystając z analizy barwienia immunologicznego i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (sc-RNA-seq), potwierdziliśmy, że HPC zostały włączone do organoidów 3D, które ostatecznie rozwinęły się w organoidy mózgowe zarówno z mikroglejem, jak i neuronami. W porównaniu z organoidami mózgowymi bez HPC, takie podejście powoduje znaczną inkorporację mikrogleju w organoidach mózgowych. Ten nowatorski model organoidowy 3D, który składa się zarówno z właściwości rozwoju mikrogleju, jak i neuronów, może być wykorzystany do badania wczesnych interakcji między wrodzonym rozwojem układu odpornościowego i nerwowego oraz potencjalnie jako model zapalenia nerwów i zaburzeń neurozakaźnych.

Nasz protokół opiera się na schemacie różnicowania iPSC w HPC, a następnie mieszania HPC z iPSC w celu utworzenia EB, po czym następuje indukcja neuronalna, różnicowanie i dojrzewanie (Rysunek 1). Wysoka jakość różnicowania HPC jest kluczowa dla powodzenia formowania EB i późniejszego różnicowania organoidów. W celu uzyskania odpowiedniej liczby i wielkości kolonii iPSC do rozpoczęcia różnicowania HPC stosowana jest technika hodowli z seryjnymi rozcieńczeniam...

Przedstawiamy protokół generowania organoidu ludzkiego mózgu z rezydującym mikroglejem poprzez włączenie do rozwoju organoidów komórek progenitorowych pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do rozwoju organoidów.

Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

Three-dimensional (3D) brain organoid cultures derived from induced pluripotent stem cells (iPSC) provide an important alternative in vitro tool&#160;for ...

Przedstawiamy protokół generowania organoidu ludzkiego mózgu zawierającego rezydentny mikroglej i neurony poprzez włączenie indukowanych pluripotencjalnych komórek progenowych hematopoetycznych pochodzących z komórek macierzystych do procesu indukcji i rozwoju organoidów neuronalnych. Metoda ta stanowi model do badania interakcji między mikroglejem a neuronami podczas rozwoju ludzkiego mózgu. Organoidy mózgowe 3D to mini mózgi generowane z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub iPSC.Jako alternatywa dla zwierząt i ludzi, są szeroko stosowane w naśladowaniu ludzkich mózgów w badaniach nad rozwojem mózgu i zaburzeniami neurologicznymi. Są one doskonałymi narzędziami do rozwoju badań nad zdrowiem człowieka. Konwencjonalne protokoły dla organoidów 3D ludzkiego mózgu rzadko generują mikroglej, rezydującą komórkę odpornościową ludzkiego mózgu, ponieważ komórki te pochodzą z innej linii embrionalnej niż neurony.Chociaż mikroglej można dodać do organoidów mózgowych na późniejszym etapie różnicowania, potrzebna jest metoda lepszego naśladowania rozwoju ludzkiego mózgu. Większość innych protokołów dodaje HPC lub mikroglej pod koniec generacji organoidów mózgowych. Wytwarza

derivation-of-a-human-brain-organoid-with-microglia-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Film demonstruje metodę generowania organoidów ludzkiego mózgu z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Pokazuje, w jaki sposób neurosfera tworzy warstwę neuroektodermalną, która hamuje tworzenie się innych listków zarodkowych. Neurosfery są osadzone w matrycy żelowej 3D i tworzą zawiązki neuronabłonkowe. Podczas inkubacji z pożywkami organoidowymi te pąki neuroepitelialne różnicują się w określone obszary mózgu, co powoduje tworzenie dojrzałych organoidów mózgowych.

Metoda in vitro do generowania organoidów ludzkiego mózgu

Modelowanie rozwoju ludzkiego mózgu zostało utrudnione z powodu bezprecedensowej złożoności tkanki nabłonka nerwowego. W tym artykule opisano metodę wytwarzania organoidów mózgowych w celu wyznaczenia wczesnych zdarzeń rozwoju ludzkiego mózgu i modelowania małogłowia in vitro.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

Ten protokół opisuje technikę używaną do modelowania infekcji wirusem Zika rozwijającego się ludzkiego mózgu. Korzystając z linii komórek macierzystych typu dzikiego lub zmodyfikowanych, naukowcy mogą wykorzystać tę technikę do odkrycia różnych mechanizmów lub metod leczenia, które mogą wpływać na wczesną infekcję mózgu i wynikającą z niej małogłowie w zarodkach zakażonych wirusem Zika.

Modelowanie zakażenia rozwijającego się ludzkiego mózgu wirusem Zika in vitro przy użyciu organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Organoidy mózgowe reprezentują nowy system modelowy do badania wczesnego rozwoju ludzkiego mózgu in vitro. Niniejszy artykuł zawiera szczegółową metodologię wydajnego generowania jednorodnych organoidów typu grzbietowego przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym krytyczne etapy charakterystyki i walidacji.

Generowanie standaryzowanych i powtarzalnych organoidów mózgowych typu przodomózgowia z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ten protokół jest wydajną, opłacalną i solidną metodą izolowania pierwotnego mikrogleju od żywej, dorosłej, ludzkiej tkanki mózgowej. Wyizolowany pierwotny mikroglej ludzki może służyć jako narzędzie do badania procesów komórkowych w homeostazie i chorobie.

Pozyskiwanie ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów mózgowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Aby uzyskać organoidy mózgowe w dużych ilościach i wysokiej jakości, używamy domowych mini bioreaktorów.

Wytwarzanie organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w domowych mini bioreaktorach

W tym badaniu przedstawiamy szczegółową technikę prostego, ale solidnego systemu hodowli organoidów korowych przy użyciu standardowych kultur hPSC bez karmienia. Jest to szybki, wydajny i powtarzalny protokół generowania organoidów, które modelują aspekty starzenia się mózgu in vitro.

Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro

Mikroglej to unikalne komórki odpornościowe rezydentne w siatkówce, odgrywające kluczową rolę w różnych chorobach zwyrodnieniowych siatkówki. Stworzenie modelu kohodowli organoidów siatkówki z mikroglejem może ułatwić lepsze zrozumienie patogenezy i postępów w rozwoju chorób siatkówki.

Składanie organoidów siatkówki z mikroglejem

Poznaj protokół generowania ludzkich organoidów mózgu z mikroglejem i neuronami przy użyciu komórek macierzystych iPSC. Ta metoda umożliwia badanie interakcji mikroglej-neuron podczas rozwoju mózgu.

Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

Przeglądaj więcej filmów