Name: Szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/Cas12a (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę szybkiego wykrywania Acinetobacter baumannii przy użyciu amplifikacji polimerazy rekombinazy i systemu CRISPR-Cas12a. Protokół oferuje wysoką czułość i swoistość w diagnostyce zakażeń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Projekt Planu Rozwoju Nauki i Technologii prowincji Jilin, Chiny (20240305027YY) oraz Departament Finansów Prowincji Jilin (JLSWSRCZX2023-55, JLSWSRCZX2021-041).

1. Budowa A. baumannii -DETECTR
UWAGA: Budowa A. baumannii-DETECTR to czteroetapowy proces obejmujący projektowanie startera i crRNA, budowę dodatniej konstrukcji rekombinowanego plazmidu, przygotowanie roztworów reakcyjnych, izotermiczną amplifikację DNA przez RPA oraz wizualizację testu RPA-CRISPR/Cas12a. Schemat testu DETECTR jest zilustrowany na rysunku Rysunek 1.
<ol>
	<li>Projektowanie startera i crRNA (patrz plik uzupełniający 1)
	<ol>
		<li>Zaprojektuj 12 par podkładów za pomocą narzędzi projektowych w oparciu o zasady projektowania Primer. Uzyskaj cztery startery do przodu (F0-F3) i trzy startery odwrotne (R1-R3), aby skomponować dwanaście par starterów (F0R1, F0R2, F0R3, F1R1, F1R2, F1R3, F2R1, F2R2, F2R3, F3R1, F3R2, F3R3).
		<ol>
			<li>Upewnij się, że koniec 5' startera zawiera zasady C lub T w pierwszych 3-5 nukleotydach zamiast ciągłego rozciągania G. Dodatkowo upewnij się, że ostatnie trzy nukleotydy na końcu 3' są idealnie zasadami G i C, aby zwiększyć amplifikację.</li>
			<li>Zaprojektuj podkłady bez samouzupełniających się sekwencji, aby uniknąć tworzenia się spinki do włosów i z nie więcej niż czterema komplementarnymi lub homologicznymi zasadami między nimi. Unikaj komplementarności końca 3', aby uniknąć dimeryzacji podkładu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oceń każdą parę starterów pod kątem swoistości za pomocą narzędzia Primer-BLAST National Center for Biotechnology Information (NCBI), aby ocenić skuteczność i swoistość starterów. 
		UWAGA: Primer-BLAST może wykorzystywać bazę danych NCBI do znajdowania sekwencji pasujących do zaprojektowanych starterów, pomagając użytkownikom ocenić skuteczność i swoistość starterów.</li>
		<li>Po przesiewie starterów zaprojektuj CRISPR RNA (crRNA) lub przewodnik RNA (gRNA) przy użyciu sekwencji rusztowania crRNA LbaCas12a (5'-UAAUUUACUAAGUGUAGAU-3') jako ustalonej sekwencji. Włączyć segment specyficzny dla celu (5'-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3'), upewniając się, że motyw PAM znajduje się na końcu 5' nici niekomplementarnej. 
		UWAGA: Sekwencje wszystkich oligonukleotydów i crRNA przedstawiono w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodatnia budowa rekombinowanego plazmidu
	<ol>
		<li>Amplifikuj segment rDNA 16s za pomocą zestawu starterów A. baumannii 16s rDNA-F (starter do przodu) i A. baumannii 16s rDNA-R (starter odwrotny).
		<ol>
			<li>Dodaj 1 μl 10 μM F i 10 μM R, 10 μl 5x buforu FastpFu, 1 μl polimerazy FastpFu, 4 μl 2,5 mM dNTPs, 1 μL 10 ng/μL genomowego DNA A. baumannii i 32 μl wody wolnej od nukleaz do systemu PCR 50 μL.</li>
			<li>Ustawić warunki cykliczne PCR w następujący sposób: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 minut, następnie 33 cykle denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 55°C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę i 20 s. Na koniec wykonaj 10 minut w temperaturze 72°C, aby uzyskać ostateczne przedłużenie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby oczyścić dodatni wynik testu PCR, należy użyć zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie sklonuj oczyszczone DNA do wektora pUC57, który został strawiony enzymami BamHI i SalI. 
		UWAGA: Proces ten spowoduje utworzenie dodatniego rekombinowanego plazmidu zawierającego konserwatywny region.</li>
		<li>Rozcieńczyć dodatni rekombinowany plazmid szeregowo w dziesięciokrotnych odstępach wysterylizowanym ddH2O, aby uzyskać stężenie od jednej kopii/μl do 10-7 kopii/μl. Rozcieńczony plazmid należy przechowywać w temperaturze -20 °C do przeprowadzenia kolejnych doświadczeń.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór A w następujący sposób: do każdej reakcji dodać 29,5 μl buforu do rehydratacji bez podkładu, 2,4 μl 10 μM A. baumannii-F i 10 μM A. baumannii-R oraz 12,2μl ddH2O, aby uzyskać końcową objętość 46,5 μL. Wirować i krótko wirować. Następnie dodaj mieszaninę reakcyjną do probówek do reakcji enzymatycznych z zestawu RPA. Pipeta do mieszania. 
		UWAGA: Startery A. baumannii-F i R są używane w teście ukierunkowanym na gen A. baumannii. Proszę zapoznać się z tabelą 1, aby zapoznać się z sekwencją.</li>
		<li>Przygotuj roztwór B w następujący sposób: dla każdej reakcji dodać 0,24 μl 10 μM reportera ssDNA, 2 μl 10x buforu reakcyjnego Cas12a, 1 μl 1 μM crRNA, 1 μL 1 μM Cas12a i 10,76μL ddH2O, aby uzyskać końcową objętość 15 μL. 
		UWAGA: Sondy (reporter ssDNA) zostały zakupione i składały się z jednoniciowego reportera DNA, który był oznaczony fluoroforem 5-karboksyfluoresceiny (FAM) na końcu 5' i wygaszaczem Black Hole Quencher 1 (BHQ1) na końcu 3'. W przypadku wielu próbek wymagających wykrycia należy przygotować znaczną ilość roztworu B, a następnie podzielić próbki na podwielokrotności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izotermiczna amplifikacja DNA (RPA)
	<ol>
		<li>Dodać 1 μl dodatniego rekombinowanego plazmidu o stężeniu10-7 kopii/μl do roztworu A z różnymi parami starterów; dokładnie wymieszać. Następnie dodaj 2,5 μl 280 mM octanu magnezu (MgOAc) do roztworu i dobrze wymieszaj. 
		UWAGA: Reakcje RPA rozpoczynają się zaraz po dodaniu MgOAc.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 39 °C przez 20 minut. Po 20 minutach oczyść produkty amplifikowane różnymi starterami za pomocą RPA z zestawem do oczyszczania, a następnie uruchom czyste amplikony na 1% żelu agarozowym przy 120 V przez 10 minut, aby wybrać najjaśniejsze i najszersze pasmo jako najlepszą parę starterów. 
		UWAGA: W przypadku małej liczby kopii szablonu, po 4 minutach wyjmij rurkę EP, odwiruj i krótko obróć; Następnie umieść go w urządzeniu grzewczym na kolejne 16 minut. Po amplifikacji lampy należy otwierać ze szczególną ostrożnością, aby uniknąć zanieczyszczenia powierzchni roboczych amplikonami. Ten środek ostrożności zmniejszy ryzyko wywołania wyników fałszywie dodatnich w kolejnych procedurach eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizacja systemu amplifikacji RPA 
	UWAGA: Optymalna para starterów F3R3 wybrana w poprzednim kroku została ustawiona na różne stężenia końcowe dla reakcji amplifikacji RPA, aby odsiać optymalne stężenie i czas startera. NC jest ślepą próbą kontrolną dla odpowiedniego stężenia startera.
	<ol>
		<li>Utrzymać stałe stężenia pozostałych składników i całkowitą objętość 46,5 μl w roztworze A. Odpowiednio dostosować objętość ddH2O wolnego od RNaz, aby osiągnąć końcowe stężenia startera 10 μM F3 i 10 μM R3 przy 0,40 μM (2,0 μL), 0,44 μM (2,2 μL), Odpowiednio 0,48 μM (2,4 μL) i 0,52 μM (2,6 μL).</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 39 °C przez różne czasy: 10 min, 20 min, 30 min.</li>
		<li>Oczyść produkty RPA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA i wykonuj elektroforezę na 1% żelu agarozowym przy 120 V przez 10 minut, aby określić optymalne stężenie startera i czas inkubacji poprzez analizę charakterystyki prążków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wizualizacja testu RPA-CRISPR/Cas12a
	<ol>
		<li>Dodać 5 μl produktu RPA do roztworu B i dokładnie wymieszać do uzyskania jednorodnej konsystencji.</li>
		<li>Umieść próbki w ilościowym przyrządzie do fluorescencji PCR, ustaw kanał FAM i odczytuj wartości co minutę przez 60 minut w temperaturze 37 °C, 60 razy, co daje łącznie 60 minut 
		UWAGA: Zielony sygnał fluorescencji może trwać kilka dni. Aby upewnić się, że system działa skutecznie, lepiej jest wykonać test wolny od DNA i RNazy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocena swoistości platformy detekcyjnej opartej na RPA-CRISPR/Cas12a
UWAGA: Aby przetestować specyficzność A. baumannii-DETECTR, kwasy nukleinowe A. baumannii, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Rickettsia mooseri, Enterobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Chlamydia psittaci, Legionella, Coxiella burnetii, Serratia oraz próbki ludzkie zostały poddane testowi DETECTR.
<ol>
	<li>Użyj matryc DNA uzyskanych od różnych gatunków za pomocą wspomnianego zestawu DNA lub izolując je poprzez gotowanie bakterii w wodzie. Upewnij się, że wszystkie szablony mają równe stężenia. Użyj wody jako kontroli negatywnej.</li>
	<li>Dodać 10 ng lub 1 μl matryc DNA do roztworu A zawierającego startery F3R3. Dodać 2,5 μl MgOAc, dokładnie wymieszać i inkubować mieszaninę w temperaturze 39 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Po 20 minutach dodać 5 μl produktu z poprzedniego etapu do roztworu B i wymieszać.</li>
	<li>Umieścić w ilościowym przyrządzie do fluorescencji PCR, ustawić kanał na FAM i odczytywać wartość raz na minutę w temperaturze 37 °C, w sumie 60 razy przez 60 minut.</li>
</ol>
3. Ocena czułości platformy detekcyjnej opartej na RPA-CRISPR/Cas12a
<ol>
	<li>Jako matrycę do reakcji należy użyć dodatniego rekombinowanego plazmidu, który został przygotowany do stężenia 1-107 kopii/μl. Do kontroli ujemnej należy użyć wody.</li>
	<li>Wykonaj metodę, wykonując kroki 2.2-2.4. 
	UWAGA: Zestaw starterów RPA-F3 i RPA-R3 jest przeznaczony do amplifikacji krótszego fragmentu 174 par zasad z dodatniego rekombinowanego plazmidu.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki pod wpływem światła UV i detekcji LFS
<ol>
	<li>Wyjmij wymaganą liczbę pasków testowych i odpowiednio je oznacz.</li>
	<li>Przenieść 10 μl amplifikowanych produktów z etapów 2 i 3 odpowiednio do oddzielnych probówek PCR. Następnie dodaj 40 μl ddH2O do każdej probówki. 
	UWAGA: W przypadku korzystania z samodzielnie przygotowanego systemu reakcyjnego zaleca się zbadanie optymalnego stosunku rozcieńczenia.</li>
	<li>Wykonaj test.
	<ol>
		<li>Poddaj probówkę PCR zawierającą amplifikowane produkty działaniu transiluminatora w celu oceny obecności fluorescencji.</li>
		<li>Włóż paski testowe do probówek do PCR końcem podkładki do próbki skierowanym w dół.</li>
		<li>Odstaw w temperaturze pokojowej na 5-10 minut, aby odczytać wynik. Po tym czasie upewnij się, że poziom cieczy nie przekracza linii maksymalnej, zanim przejdziesz dalej.</li>
		<li>Zinterpretuj wyniki jako ujemne, jeśli linia T nie pokazuje koloru. Zinterpretuj wyniki jako pozytywne, jeśli linia T jest widoczna gołym okiem, co wskazuje, że sonda kwasu nukleinowego została rozszczepiona przez enzym Cas, a enzym Cas został aktywowany. Uznaj, że wynik jest nieprawidłowy, jeśli ani linia C, ani linia T nie mają koloru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lenie, D., Alexandr, N., Harald, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+increasing+threat+in+hospitals%3A+Multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An increasing threat in hospitals: Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (12), 939-951 (2007).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Acinetobacter+baumannii+and+molecular+epidemiology+of+carbapenem-resistant+A.+baumannii+in+two+comprehensive+hospitals+of+Beijing%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Acinetobacter baumannii and molecular epidemiology of carbapenem-resistant A. baumannii in two comprehensive hospitals of Beijing, China.</a> Front Microbiol. 6, 997(2015).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+diagnostic+test+that+uses+isothermal+amplification+and+lateral+flow+detection+sdaA+can+detect+tuberculosis+in+60+min%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A diagnostic test that uses isothermal amplification and lateral flow detection sdaA can detect tuberculosis in 60 min.</a> J Appl Microbiol. 130 (6), 2102-2110 (2020).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cas12a-based+fluorescent+microfluidic+system+for+rapid+on-site+human+papillomavirus+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A cas12a-based fluorescent microfluidic system for rapid on-site human papillomavirus diagnostics.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 107 (20), 6287-6297 (2023).</li>
<li>Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+detection+using+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA detection using recombination proteins.</a> Plos Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).</li>
<li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), aaf5573(2016).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), eaar6245(2018).</li>
<li>Xiong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+SARS-CoV-2+with+CRISPR-Cas12a%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas12a.</a> PLoS Biol. 18 (12), e3000978(2020).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+with+crispr-Cas13a%2FC2C2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection with crispr-Cas13a/C2C2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li>
<li>Harrington, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+DNA+destruction+by+miniature+CRISPR-Cas14+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes.</a> Science. 362 (6416), 839-842 (2018).</li>
<li>Li, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+has+both+cis-+and+trans-cleavage+activities+on+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA.</a> Cell Res. 28 (4), 491-493 (2018).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas12aVDet%3A+A+CRISPR%2FCas12a-based+platform+for+rapid+and+visual+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection.</a> Anal Chem. 91 (19), 12156-12161 (2019).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-sensitive+and+high-throughput+crispr-p+owered+COVID-19+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Ultra-sensitive and high-throughput crispr-p owered COVID-19 diagnosis.</a> Biosens Bioelectron. 164, 112316(2020).</li>
<li>Zhang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcription+recombinase+polymerase+amplification+coupled+with+CRISPR-Cas12a+for+facile+and+highly+sensitive+colorimetric+SARS-CoV-2+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Reverse transcription recombinase polymerase amplification coupled with CRISPR-Cas12a for facile and highly sensitive colorimetric SARS-CoV-2 detection.</a> Anal Chem. 93 (8), 4126-4133 (2021).</li>
<li>Marraffini Luciano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+immunity+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas immunity in prokaryotes.</a> Nature. 526 (7571), 55-61 (2015).</li>
<li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), aad5147(2016).</li>
<li>Makarova, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+evolutionary+classification+of+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.</a> Nat Rev Microbiol. 13 (11), 722-736 (2015).</li>
<li>Li, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a-assisted+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection.</a> Cell Discovery. 4 (1), 20(2018).</li>
<li>Li, L., Li, S., Wu, N., Wu, J., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holmesv2%3A+A+CRISPR-Cas12b-assisted+platform+for+nucleic+acid+detection+and+DNA+methylation+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Holmesv2: A CRISPR-Cas12b-assisted platform for nucleic acid detection and DNA methylation quantitation.</a> ACS Synth Biol. 8 (10), 2228-2237 (2019).</li>
<li>Liang, M., Li, Z., Wang, W., Liu, J., Zhang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas12a-derived+biosensing+platform+for+the+highly+sensitive+detection+of+diverse+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Communications%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules.</a> Nat Communications. 10 (1), 3672(2019).</li>
<li>Aquino-Jarquin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas14+is+now+part+of+the+artillery+for+gene+editing+and+molecular+diagnostic%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas14 is now part of the artillery for gene editing and molecular diagnostic.</a> Nanomedicine. 18, 428-431 (2019).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li>
<li>Swarts, D. C., John, V. D. O., Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+guide+RNA+processing+and+seed-dependent+DNA+targeting+by+CRISPR-Cas12a%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for guide RNA processing and seed-dependent DNA targeting by CRISPR-Cas12a.</a> Mol Cell. 66 (2), 221-233 (2017).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cpf1+assisted+genome+editing+of+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum.</a> Nat Commun. 8, 15179(2017).</li>
<li>Yan, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a-assisted+recombineering+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a-assisted recombineering in bacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00947-e01017 (2017).</li>
<li>Ashraf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multiplex+pcr+assay+for+simultaneous+detection+of+nine+clinically+significant+bacterial+pathogens+associated+with+bovine+mastitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">A novel multiplex pcr assay for simultaneous detection of nine clinically significant bacterial pathogens associated with bovine mastitis.</a> Mol Cell Probes. 33, 57-64 (2017).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+on-site+visualization+platform+based+on+RPA+coupled+with+CRISPR-Cas12a+for+the+detection+of+genetically+modified+papaya+%27huanong+no.1%27%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A rapid on-site visualization platform based on RPA coupled with CRISPR-Cas12a for the detection of genetically modified papaya 'huanong no.1'.</a> Talanta. 277, 126437(2024).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+developments+in+lateral+flow+immunoassay+for+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Rapid developments in lateral flow immunoassay for nucleic acid detection.</a> Analyst. 146 (5), 1514-1528 (2021).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+clinical+application+of+a+RPA-LFS+assay+for+detection+of+capsulated+and+non-capsulated+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishment and clinical application of a RPA-LFS assay for detection of capsulated and non-capsulated Haemophilus influenzae.</a> Front Cell Infect Microbiol. 12, 878813(2022).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+recombinase+polymerase+amplification+combined+with+lateral+flow+strips+for+detecting+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive recombinase polymerase amplification combined with lateral flow strips for detecting Candida albicans.</a> Anal Biochem. 633, 114428(2021).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+method+for+potential+point-of-care+diagnosis+of+human+papillomavirus+genotypes%3A+Combination+of+isothermal+recombinase+polymerase+amplification+with+lateral+flow+dipstick+and+reverse+dot+blot%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient method for potential point-of-care diagnosis of human papillomavirus genotypes: Combination of isothermal recombinase polymerase amplification with lateral flow dipstick and reverse dot blot.</a> Anal Bioanal Chem. 411 (28), 7451-7460 (2019).</li>
<li>Sun, Y., Yu, L., Liu, C., Ye, S., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-tube+SARS-CoV-2+detection+platform+based+on+RT-RPA+and+CRISPR%2FCas12a%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">One-tube SARS-CoV-2 detection platform based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a.</a> J Transl Med. 19 (1), 74(2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Tradycyjne metody diagnostyczne zakażeń A. baumannii mają różne ograniczenia, które sprawiają, że są one mniej dostępne i mniej wykonalne w przypadku badań przyłóżkowych27. Na przykład PCR ma dobrą czułość i specyficzność, ale wymaga specjalistycznego sprzętu do cykli termicznych i złożonych przepływów pracy, które muszą być obsługiwane przez profesjonalistów. Przedstawiona tu nowatorska metoda, która łączy edycję genomu RPA i CRISPR-LbaCas12a z rekombineracją, znana jako test A. baum...

W mikrobiologii klinicznej wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii stanowi poważne wyzwanie. Ta bakteria Gram-ujemna może powodować infekcje z ciężkimi objawami klinicznymi, nawet przy wysokiej śmiertelności, szczególnie wśród pacjentów z obniżoną odpornością1. Tradycyjne metody wykrywania zakażeń patogenami oparte na kulturach są czasochłonne i mogą nie być czułe, co może opóźnić antybiotykoterapię i pogorszyć wyniki leczenia pacjentów. Szybka i dokładna identyfikacja A. baumannii ma kluczowe znaczenie dla skutecznego leczenia i kontroli ogniska. Aby zaspokoić tę potrzebę, zbadano techniki molekularne wykorzystujące amplifikację kwasów nukleinowych. Jednak podejścia te często wymagają zaawansowanego sprzętu do cykli termicznych i mogą być ograniczone przez dobrze wyszkolonych techników i dobrze ugruntowane laboratoria. Aby sprostać tym wyzwaniom, badania coraz częściej koncentrują się na opracowywaniu metod amplifikacji izotermicznej2,3,4.
Amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA) to metoda opracowana przez Piepenburg et al 5 i używana do amplifikacji DNA, podobnie jak w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), ale bez potrzeby cyklicznych zmian temperatury. Metoda ta obejmuje 50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM octan potasu, 14 mM octan magnezu, 2 mM DTT, 5% PEG20000 (glikol polietylenowy o wysokiej masie cząsteczkowej), 200 μM dNTPs, 3 mM ATP, 50 mM fosfokreatyny, 100 μg/ml kinazy kreatyny, 120 μg/ml UvsX, 30 μg/ml UvsY, 900 μg/ml Gp32, 30 μg/ml Bsu LF, startery 450 nM i matryce DNA. Proces amplifikacji rozpoczyna się od związania białka rekombinazy UvsX ze starterami w obecności 3 mM ATP i 5% PEG20000 tworząc kompleks rekombinaza-starter. Kompleks ten następnie ułatwia łączenie starterów z sekwencjami homologicznymi na dwuniciowym DNA.
Z pomocą UvsY, rekombinaza UvsX ułatwia wymianę między starterem a nicią matrycową, co skutkuje przemieszczeniem jednej nici docelowego DNA. Gp32 pomaga w utrzymaniu jednoniciowej struktury DNA. Wreszcie rekombinaza dysocjuje, a polimeraza DNA (Bsu LF) zdolna do przemieszczania nici DNA wiąże się z końcem 3' startera, wydłużając go w obecności trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP). Proces ten powtarza się cyklicznie, osiągając wykładnicze wzmocnienie. Wszystkie procesy amplifikacji można zakończyć w ciągu 20-40 minut i w stosunkowo stałych temperaturach od 37 °C do 42 °C. Ten zakres temperatur jest w przybliżeniu identyczny z temperaturami fizjologicznymi, co pozwala na przeprowadzanie RPA w minimalistycznym środowisku, dzięki czemu RPA jest wszechstronnym i wydajnym narzędziem do wykrywania i analizy DNA.
Zgrupowany, regularnie rozmieszczony system krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) i białka związanego z CRISPR (CRISPR-Cas) funkcjonuje jako adaptacyjny mechanizm immunologiczny u bakterii i archeonów, obejmujący systemy klasy I i II. Klasa II obejmuje białka takie jak Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) i Cas14, które identyfikują i rozszczepiają docelowe DNA lub RNA kierowane przez CRISPR RNA (crRNA)6,7,8 . LbaCas12a (lub Cpf1) jest endonukleazą DNA sterowaną przez crRNA. CrRNA służy jako przewodni RNA w systemie CRISPR-Cas, gdzie kompleksuje się z białkami Cas. Wykorzystuje swój region dystansowy do parowania się z docelowym DNA, skutecznie kierując kompleks białkowy do docelowych sekwencji. Sekwencja 5'-UAAUUUACUAAGUGUAGAU-3' służy jako konserwatywne powtórzenie crRNA, stały element we wszystkich crRNA LbaCas12a. Po tym powtórzeniu następuje segment specyficzny dla celu, który różni się w zależności od zamierzonego celu DNA. Ta sekwencja celująca ma długość od 18 do 24 nukleotydów.
Sekwencja PAM (Protospacer-Adjacent Motif) (TTTV, gdzie V może być A, C lub G) znajduje się na końcu 5' niekomplementarnej nici celu DNA. Cas12a tnie docelowe dwuniciowe DNA w sekwencji PAM. Następnie aktywowane białka Cas wykonują niespecyficzne trans-rozszczepienie jednoniciowego DNA (ssDNA)9,10,11,12. W ten sposób ssDNA znakowane fluoroforem i wygaszaczem ulega rozszczepieniu, co powoduje emisję sygnału fluorescencyjnego po rozszczepieniu pobocznym8,13. Intensywność fluorescencji można określić ilościowo za pomocą czytnika fluorescencji w celu precyzyjnego wykrywania kwasów nukleinowych14. Warto zauważyć, że Cas12a jest szeroko stosowany do analizy DNA, a jego wiązanie i rozszczepianie sekwencji docelowych zależy od rozpoznania motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM), podczas gdy Cas13a działa niezależnie od takiego wymogu.
CRISPR-Cas systems15,16,17 ułatwiają rozszczepienie w ramach jednej reakcji18,19,20,21. Połączenie powyższych dwóch elementów może stworzyć solidne narzędzie znane jako A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) do wykrywania kwasów nukleinowych22,23,24. Protokół ten demonstruje zastosowanie RPA w połączeniu z aktywnością DNazy Cas12a w celu specyficznego celowania i rozszczepiania sekwencji kierowanej przez crRNA w genie 16s rDNA A. baumannii, umożliwiając w ten sposób czułe i precyzyjne wykrywanie patogenu.
Metoda A. baumannii-DETECTR ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi metodami wykrywania25,26. Po pierwsze, izotermiczna charakterystyka RPA usprawnia procedury operacyjne i obniża koszty dzięki mechanizmowi wzmocnienia niezależnemu od cyklera termicznego5. Po drugie, endonukleaza Cas12a zwiększa swoistość testu za pomocą celowania za pośrednictwem crRNA i parowania zasad Watsona-Cricka7. Wreszcie, zastosowanie metody jednoprobówkowej A. baumannii-DETECTR nie tylko oszczędza czas, ale także znacznie zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia amplikonem19.
Protokół przedstawia kroki ekstrakcji DNA, wyboru docelowych sekwencji DNA, projektowania starterów i crRNA, budowy dodatnich rekombinowanych plazmidów, ustanawiania konfiguracji testu Cas12a-RPA, optymalizacji optymalizacji amplifikacji RPA oraz wizualizacji wyników za pomocą narzędzi do wykrywania fluorescencji, takich jak maszyna do PCR w czasie rzeczywistym, wraz z ocenami wrażliwości i swoistości.
Metoda A. baumannii-DETECTR daje nadzieję na poprawę wyników leczenia pacjentów poprzez ułatwienie szybkiego i skutecznego leczenia, solidną kontrolę infekcji i powstrzymanie rozprzestrzeniania się oporności na antybiotyki. Protokół ten może służyć jako kompleksowa wytyczna do wdrażania technologii Cas12a-RPA, zwiększając jej użyteczność w różnych warunkach opieki zdrowotnej. Należy jednak pamiętać, że każdy krok powinien być zoptymalizowany w oparciu o określone warunki laboratoryjne i różnorodność próbek, aby zapewnić spójne i wiarygodne wyniki.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;-20 &deg; C Zamrażarka</td><td>Haier</td><td>HYCD-290</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Agaroza Basic</td><td>BioFroxx</td><td>1110GR100</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Wszystkie oligonukleotydy i crRNA zostały zsyntetyzowane przez firmę</td><td>www.comatebio.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrat tnący Cas12a - ssDNA - fluorescencyjny typ</td><td>EZassay Biotech. Co., Ltd.</td><td>DNA-FAM-BHQ</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Podłoże do cięcia Cas12a - ssDNA - papier testowy typu</td><td>EZassay Biotech. Co., Ltd.</td><td>DNA-FAM-BIO</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Aparatura do elektroforezy</td><td>BIO-RAD</td><td>POWER</td> PAC1000 <td>USA</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny ilościowy instrument do PCR</td><td>BIO-RAD</td><td>CFX Connect</td><td>USA</td></tr><tr><td>System obrazowania żeli</td><td>BIO-RAD</td><td>Gel Doc 2000</td><td>USA</td></tr><tr><td>https://ezassay.com/rna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://www.ezassay.com/primer&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast</tr><tr><td>Pasek papieru z przepływem bocznym (Biotyna/FAM)</td><td>EZassay Biotech. Co., Ltd.</td><td>HD-FMBO</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>LbaCas12a (Cpf1) wzmocnione białko</td><td>EZassay Biotech. Co., Ltd.</td><td>CAS-12E-001</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Transformator LED</td><td>LABGIC</td><td>BL-20</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Octan magnezu, MgOAc</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td>Wielka Brytania</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>allsheng</td><td>Mini-6k</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Probówki paskowe do</td><td>PCR Probówki paskowe do</td><td>PCR PST-0208-FT-C</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Inkubator do suchej kąpieli TGrade</td><td>Technologia biochemiczna Tiangen&nbsp;</td><td>OSE-DB-01</td><td>Chiny</td></tr><tr><td>Zestaw DNA bakterii Tianamp</td><td>Technologia biochemiczna Tiangen&nbsp;</td><td>DP302-02</td><td>Zestaw</td></tr><tr><td>DNA bakterii China TIANamp&nbsp;</td><td>TIANGEN BIOTECH&nbsp; (PEKIN) CO.; Ltd.</td><td>DP302</td><td>&nbsp; Chiny&nbsp;</td></tr><tr><td>TransStart&nbsp; FastPfu&nbsp; Polimeraza DNA&nbsp;</td><td>TransGen Biotech. Co., Sp. z o.o.</td><td>AP221</td><td>&nbsp; Chiny&nbsp;</td></tr><tr><td>TwistAmp Basic Kit</td><td>TwistDX</td><td>TABAS03KIT</td><td>UK</td></tr><tr><td>Uniwersalny zestaw do oczyszczania DNA</td><td>Technologia biochemiczna Tiangen&nbsp;</td><td>DP214-03</td><td>Chiny</td></tr></tbody></table>

szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/cas12a

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Acinetobacter baumannii, bakteria Gram-ujemna, jest znana z powodowania ciężkich infekcji o wysokiej śmiertelności. Szybkie i dokładne wykrycie A. baumannii ma kluczowe znaczenie dla szybkiego leczenia, skutecznej kontroli zakażeń i ograniczenia oporności na antybiotyki. Nie ma jednak odpowiedniej metody szybkiego i łatwego wykrywania A. baumannii na miejscu. System CRISPR Trans Reporter (DETECTR) ukierunkowany na endonukleazę DNA oferuje szybkie, precyzyjne i czułe podejście do wykrywania A. baumannii poprzez integrację specyficznych dla celu możliwości rozpoznawania Cas12a z wydajnością amplifikacji izotermicznej amplifikacji polimerazy rekombinazy (RPA). Protokół ten szczegółowo opisuje wykrywanie A. baumannii za pomocą RPA w połączeniu z endonukleazą LbaCas12a. W artykule opisano następujące kroki: ekstrakcja DNA, wybór określonej sekwencji DNA, projektowanie startera i CRISPR RNA (crRNA), budowa dodatniego plazmidu rekombinowanego, ustawienie testu Cas12a-RPA, optymalizacja systemu amplifikacji RPA, wizualizacja testu RPA-CRISPR/Cas12a za pomocą narzędzia do wykrywania fluorescencji, takiego jak przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym, oraz ocena wrażliwości i swoistości.

W niniejszym badaniu przedstawiamy nową, przenośną platformę diagnostyczną o nazwie A. baumannii-DETECTR, która integruje wydajność izotermicznej amplifikacji RPA oraz system CRISPR-Cas12a w celu szybkiej i wiarygodnej identyfikacji A. baumannii w warunkach terenowych. Schemat testu DETECTR przedstawiono na Rysunku 1.
Dwanaście par starterów zaprojektowano przy użyciu narzędzi proj...

Aby ułatwić szybkie i precyzyjne wykrywanie Acinetobacter baumannii, przedstawiamy protokół, który wykorzystuje amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) w połączeniu z endonukleazą LbaCas12a do identyfikacji infekcji A. baumannii.

Szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/Cas12a

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of ...

Moje badania koncentrują się na chorobach układu oddechowego i infekcjach. Zajmę się aktualnymi technologiami rozwijającymi się w tej dziedzinie oraz lukami badawczymi w całym obszarze projektu. Kluczowe technologie, o których tutaj mówimy, obejmują sekwencjonowanie nowej generacji, CRISPR, sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek i modele analizy narządów. Mają twarde podejście do diagnostyki standardowych chorób serca i proponują lepsze leczenie. Mój protokół odpowiada na potrzebę szybkiego i specyficznego wykrywania Acinetobacter baumannii, pokonując ograniczenia w obecnych kwestiach diagnostycznych, takich jak czasochłonne i oparte na hodowli techniki.[Narrator] Na początek zaprojektuj 12 par podkładów, korzystając z narzędzi do projektowania podkładów w oparciu o standardowe zasady projektowania. Zdobądź cztery startery do przodu i trzy startery do tyłu, aby skomponować 12 par starterów. Oceń każdą parę starterów pod kątem swoistości i skuteczności za pomocą narzędzia Primer-BLAST z National Center for Biotechnology Information. Następnie zaprojektuj CRISPR RNA lub przewodnik RNA lub gRNA, używając sekwencji rusztowania LbaCas12a CRISPR RNA jako ustalonej sekwencji. Włączyć segment specyficzny dla celu, upewniając się, że motyw przylegający do protospaceru lub PAM znajduje się na pięciu głównych końcach nici niekomplementarnej. Aby zbudować dodatni rekombinowany plazmid, najpierw amplifikuj segment rDNA Acinetobacter baumannii 16S za pomocą zestawów starterów do przodu i do tyłu. Przygotuj 50-mikrolitrową mieszaninę reakcyjną PCR, jak podano na ekranie. Ustaw warunki cykliczne PCR na maszynie do PCR. Po oczyszczeniu dodatniego produktu PCR sklonuj go do wektora PUC57, który został strawiony enzymami BamHI i SalI. Rozcieńczyć dodatni rekombinowany plazmid szeregowo w dziesięciokrotnych odstępach wysterylizowaną podwójnie destylowaną wodą. Rozcieńczony plazmid należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do dalszych eksperymentów. Następnie wymieszaj ze sobą bezpodkładowy bufor nawadniający, startery do przodu i do tyłu A. baumanniii oraz podwójnie destylowaną wodę do końcowej objętości 465 mikrolitrów. Wirować i krótko odwirować mieszaninę przed przeniesieniem jej do probówek do reakcji enzymatycznych z zestawu RPA. Dokładnie wymieszaj i dodaj 25 mikrolitrów 280-milimolowego octanu magnezu. Następnie odpipetować jeden mikrolitr dodatniego rekombinowanego plazmidu, zawierającego 10⁷ kopii na mikrolitr do roztworu A z różnymi parami starterów. Inkubować roztwór w temperaturze 39 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie oczyść amplifikowane produkty za pomocą zestawu do oczyszczania RPA. Uruchom oczyszczony produkt na 1% żelu agarozowym o napięciu 120 woltów przez 10 minut, aby zidentyfikować parę starterów o najjaśniejszym i najszerszym paśmie. W celu optymalizacji systemu amplifikacji RPA należy utrzymać stałe stężenia wszystkich innych składników reakcji, jednocześnie dostosowując końcową objętość roztworu A do 465 mikrolitrów. Następnie dodaj odpowiednie ilości podwójnie destylowanej wody wolnej od RNA, aby uzyskać końcowe stężenia startera, jak podano i inkubować. Po oczyszczeniu i elektroforezacji produktu RPA należy określić optymalne stężenie startera i czas inkubacji, analizując intensywność i rozkład pasma. Aby przygotować roztwór B, wymieszaj ze sobą jednoniciowy reporter DNA, bufor reakcyjny CAST12a, CRISPR RNA CAST12a i podwójnie destylowaną wodę do końcowej objętości 15 mikrolitrów. Dodać pięć mikrolitrów produktu do amplifikacji polimerazy rekombinazy lub RPA do roztworu B. Dokładnie wymieszać do uzyskania jednorodności. Umieścić próbki w ilościowym przyrządzie do fluorescencji PCR. Do badania swoistości należy uzyskać matryce DNA od różnych gatunków za pomocą referencyjnego zestawu do ekstrakcji DNA lub przez gotowanie bakterii w wodzie. Użyj wody jako kontroli negatywnej. Przenieś 10 nanogramów lub jeden mikrolitr matryc DNA do roztworu A zawierającego startery do przodu i do tyłu. Następnie odpipetować 25 mikrolitrów 280-milimolowego octanu magnezu. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 39 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji dodać pięć mikrolitrów produktu reakcji do roztworu B i wymieszać. Umieścić próbki w ilościowym przyrządzie do fluorescencji PCR. Ustaw kanał na FAM i czytaj sygnał fluorescencyjny co minutę w temperaturze 39 stopni Celsjusza przez łącznie 60 minut. Do oceny czułości platformy detekcyjnej opartej na RPA-CRISPR CAST12a należy użyć dodatniego rekombinowanego plazmidu rozcieńczonego do stężeń w zakresie od jednej do 10⁷ kopii na mikrolitr jako matrycy do reakcji. Użyj wody jako kontroli negatywnej. Przenieś plazmid do roztworu A, dodaj octan magnezu i inkubuj, jak pokazano wcześniej. Po inkubacji i przeniesieniu do roztworu B odczytać sygnał fluorescencyjny. Para starterów F3-R3 została zidentyfikowana jako najbardziej skuteczna do amplifikacji polimerazy rekombinazy, wykazując najjaśniejsze i najgęstsze pasma w elektroforezie żelu agarozowego. Optymalne stężenie startera do amplifikacji określono na 0,44 mikromola, a optymalny czas reakcji wynosił 20 minut. Intensywność fluorescencji CRISPR RNA1 wzrastała z czasem, podczas gdy CRISPR RNA2 nie, co doprowadziło do wyboru CRISPR RNA1 do wykrywania A. baumannii. Analiza swoistości potwierdziła, że system detektorów A. baumannii wykrył wyłącznie DNA A. baumannii, bez zaobserwowania fluorescencji w przypadku innych próbek DNA bakterii. System może wykryć zaledwie jedną kopię na mikrolitr DNA, co czyni go bardzo czułym. Test z bocznym paskiem przepływu potwierdził wysoką swoistość metody wykrywania, wykazując brak reaktywności krzyżowej z innymi gatunkami bakterii. Test A. baumannii z powodzeniem wykrył DNA w rozcieńczeniach od 10⁷ kopii na mikrolitr do pojedynczej kopii na mikrolitr, potwierdzając jego wytrzymałość w świetle UV.

rapid-specific-detection-acinetobacter-baumannii-infections-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Ten protokół opisuje, jak zbudować system łańcucha polimerazy o ciągłym przepływie oparty na mikroprzepływowym chipie i jak zbudować system elektroforezy kapilarnej w laboratorium. Przedstawiono w nim prostą metodę analizy kwasów nukleinowych w laboratorium.

Amplifikacja Escherichia coli w chipie mikroprzepływowym Continuous-Flow-PCR i jego wykrywanie za pomocą systemu elektroforezy kapilarnej

W tej pracy opracowano szybką, czułą i przenośną metodę wykrywania Candidatus Liberibacter asiaticus, opartą na amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a.

Wykrywanie Candidatus Liberibacter asiaticus do stosowania w terenie za pomocą amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a

Prezentujemy protokół, który łączy amplifikację polimerazy rekombinazy z systemem CRISPR/Cas12a do wykrywania śladów wirusów DNA i tworzy przenośną mikroskopię smartfonów z klasyfikacją wspomaganą sztuczną inteligencją do wykrywania wirusów DNA w miejscu opieki nad pacjentem.

System detekcji wirusów DNA oparty na RPA-CRISPR/Cas12a-SPM i głębokim uczeniu

Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.

Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Tutaj prezentujemy krok po kroku przygotowanie premiksowanej, liofilizowanej amplifikacji izotermicznej opartej na rekombinazie i reakcji opartych na Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), które mogą być wykorzystane do wykrywania biomarkerów kwasów nukleinowych patogenów chorób zakaźnych lub innych markerów genetycznych.

Diagnostyka oparta na CRISPR w miejscu opieki nad pacjentem z wstępnie zmieszanymi i liofilizowanymi odczynnikami

W tym protokole ilustrowano test amplifikacji polimerazy rekombinazowej CRISPR/Cas12a do wykrywania inwazyjnego patogenu roślinnego, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

Połączony test amplifikacji polimerazy rekombinazy CRISPR/Cas12a do wykrywania Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Tutaj opisujemy prostą i szybką procedurę wykrywania DNA z patogenów pszczół, takich jak Lotmaria passim i Nosema ceranae, przy użyciu lizy komórek gotowej do amplifikacji, amplifikacji polimerazy rekombinazy i testów CRISPR/Cas12a.

Wykrywanie DNA pasożytów trypanosomatydów i Nosema ceranae na miejscu poprzez alkaliczną lizę sprzężoną z systemem RPA/CRISPR/Cas12a

Poznaj metodę szybkiego wykrywania Acinetobacter baumannii przy użyciu amplifikacji polimerazy rekombinazy i systemu CRISPR-Cas12a. Protokół oferuje wysoką czułość i swoistość w diagnostyce zakażeń.

Szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/Cas12a (Wideo) | JoVE Journal

Szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/Cas12a

Przeglądaj więcej filmów