Szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/Cas12a

Moje badania koncentrują się na chorobach układu oddechowego i infekcjach. Zajmę się aktualnymi technologiami rozwijającymi się w tej dziedzinie oraz lukami badawczymi w całym obszarze projektu. Kluczowe technologie, o których tutaj mówimy, obejmują sekwencjonowanie nowej generacji, CRISPR, sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek i modele analizy narządów. Mają twarde podejście do diagnostyki standardowych chorób serca i proponują lepsze leczenie. Mój protokół odpowiada na potrzebę szybkiego i specyficznego wykrywania Acinetobacter baumannii, pokonując ograniczenia w obecnych kwestiach diagnostycznych, takich jak czasochłonne i oparte na hodowli techniki.

[Narrator] Na początek zaprojektuj 12 par podkładów, korzystając z narzędzi do projektowania podkładów w oparciu o standardowe zasady projektowania. Zdobądź cztery startery do przodu i trzy startery do tyłu, aby skomponować 12 par starterów. Oceń każdą parę starterów pod kątem swoistości i skuteczności za pomocą narzędzia Primer-BLAST z National Center for Biotechnology Information. Następnie zaprojektuj CRISPR RNA lub przewodnik RNA lub gRNA, używając sekwencji rusztowania LbaCas12a CRISPR RNA jako ustalonej sekwencji. Włączyć segment specyficzny dla celu, upewniając się, że motyw przylegający do protospaceru lub PAM znajduje się na pięciu głównych końcach nici niekomplementarnej. Aby zbudować dodatni rekombinowany plazmid, najpierw amplifikuj segment rDNA Acinetobacter baumannii 16S za pomocą zestawów starterów do przodu i do tyłu. Przygotuj 50-mikrolitrową mieszaninę reakcyjną PCR, jak podano na ekranie. Ustaw warunki cykliczne PCR na maszynie do PCR. Po oczyszczeniu dodatniego produktu PCR sklonuj go do wektora PUC57, który został strawiony enzymami BamHI i SalI. Rozcieńczyć dodatni rekombinowany plazmid szeregowo w dziesięciokrotnych odstępach wysterylizowaną podwójnie destylowaną wodą. Rozcieńczony plazmid należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do dalszych eksperymentów. Następnie wymieszaj ze sobą bezpodkładowy bufor nawadniający, startery do przodu i do tyłu A. baumanniii oraz podwójnie destylowaną wodę do końcowej objętości 465 mikrolitrów. Wirować i krótko odwirować mieszaninę przed przeniesieniem jej do probówek do reakcji enzymatycznych z zestawu RPA. Dokładnie wymieszaj i dodaj 25 mikrolitrów 280-milimolowego octanu magnezu. Następnie odpipetować jeden mikrolitr dodatniego rekombinowanego plazmidu, zawierającego 10⁷ kopii na mikrolitr do roztworu A z różnymi parami starterów. Inkubować roztwór w temperaturze 39 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie oczyść amplifikowane produkty za pomocą zestawu do oczyszczania RPA. Uruchom oczyszczony produkt na 1% żelu agarozowym o napięciu 120 woltów przez 10 minut, aby zidentyfikować parę starterów o najjaśniejszym i najszerszym paśmie. W celu optymalizacji systemu amplifikacji RPA należy utrzymać stałe stężenia wszystkich innych składników reakcji, jednocześnie dostosowując końcową objętość roztworu A do 465 mikrolitrów. Następnie dodaj odpowiednie ilości podwójnie destylowanej wody wolnej od RNA, aby uzyskać końcowe stężenia startera, jak podano i inkubować. Po oczyszczeniu i elektroforezacji produktu RPA należy określić optymalne stężenie startera i czas inkubacji, analizując intensywność i rozkład pasma. Aby przygotować roztwór B, wymieszaj ze sobą jednoniciowy reporter DNA, bufor reakcyjny CAST12a, CRISPR RNA CAST12a i podwójnie destylowaną wodę do końcowej objętości 15 mikrolitrów. Dodać pięć mikrolitrów produktu do amplifikacji polimerazy rekombinazy lub RPA do roztworu B. Dokładnie wymieszać do uzyskania jednorodności. Umieścić próbki w ilościowym przyrządzie do fluorescencji PCR. Do badania swoistości należy uzyskać matryce DNA od różnych gatunków za pomocą referencyjnego zestawu do ekstrakcji DNA lub przez gotowanie bakterii w wodzie. Użyj wody jako kontroli negatywnej. Przenieś 10 nanogramów lub jeden mikrolitr matryc DNA do roztworu A zawierającego startery do przodu i do tyłu. Następnie odpipetować 25 mikrolitrów 280-milimolowego octanu magnezu. Dokładnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze 39 stopni Celsjusza przez 20 minut. Po inkubacji dodać pięć mikrolitrów produktu reakcji do roztworu B i wymieszać. Umieścić próbki w ilościowym przyrządzie do fluorescencji PCR. Ustaw kanał na FAM i czytaj sygnał fluorescencyjny co minutę w temperaturze 39 stopni Celsjusza przez łącznie 60 minut. Do oceny czułości platformy detekcyjnej opartej na RPA-CRISPR CAST12a należy użyć dodatniego rekombinowanego plazmidu rozcieńczonego do stężeń w zakresie od jednej do 10⁷ kopii na mikrolitr jako matrycy do reakcji. Użyj wody jako kontroli negatywnej. Przenieś plazmid do roztworu A, dodaj octan magnezu i inkubuj, jak pokazano wcześniej. Po inkubacji i przeniesieniu do roztworu B odczytać sygnał fluorescencyjny. Para starterów F3-R3 została zidentyfikowana jako najbardziej skuteczna do amplifikacji polimerazy rekombinazy, wykazując najjaśniejsze i najgęstsze pasma w elektroforezie żelu agarozowego. Optymalne stężenie startera do amplifikacji określono na 0,44 mikromola, a optymalny czas reakcji wynosił 20 minut. Intensywność fluorescencji CRISPR RNA1 wzrastała z czasem, podczas gdy CRISPR RNA2 nie, co doprowadziło do wyboru CRISPR RNA1 do wykrywania A. baumannii. Analiza swoistości potwierdziła, że system detektorów A. baumannii wykrył wyłącznie DNA A. baumannii, bez zaobserwowania fluorescencji w przypadku innych próbek DNA bakterii. System może wykryć zaledwie jedną kopię na mikrolitr DNA, co czyni go bardzo czułym. Test z bocznym paskiem przepływu potwierdził wysoką swoistość metody wykrywania, wykazując brak reaktywności krzyżowej z innymi gatunkami bakterii. Test A. baumannii z powodzeniem wykrył DNA w rozcieńczeniach od 10⁷ kopii na mikrolitr do pojedynczej kopii na mikrolitr, potwierdzając jego wytrzymałość w świetle UV.