Name: Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Naucz się kriosekcji i barwienia immunologicznego siatkówki myszy w celu badania fotoreceptorów. Ta metoda zapewnia zachowanie morfologii tkanek i wysokiej jakości obrazowanie struktur siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt badawczy był wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82371059 (H.Z.), 82102470 (J.W.)), Sichuan Science and Technology Program (2023JDZH0002 (H.Z.)).

Procedura była zgodna z wytycznymi ustalonymi przez Stowarzyszenie Badań nad Wzrokiem i Okulistyką na temat wykorzystania zwierząt w badaniach. Zgodę uzyskano od Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Szpitala Ludowego Prowincji Syczuan. Do tego protokołu wykorzystano samce myszy C57Bl/6J w wieku od dwóch do trzech miesięcy i o wadze 25-30 g. Pełna lista odczynników i sprzętu wykorzystanego w tym badaniu znajduje się w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>1x bufor PBS
	<ol>
		<li>Odważyć 8 g NaCl, 1,42 g Na2HPO4, 0,42 g KH2PO4 i 0,2 g KCl za pomocą wagi. Przenieść je do zlewki i dodać odpowiednią ilość podwójnie destylowanej wody (ddH2O) w celu rozpuszczenia składników. Wlać roztwór do kolby miarowej o pojemności 1 l i dostosować objętość do 1 l za pomocą ddH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>4% roztwór paraformaldehydu (PFA)
	<ol>
		<li>Dodać 0,4 g proszku PFA i 15 μl 1 M NaOH do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml buforu 1x PBS. Umieść probówkę w łaźni wodnej ustawionej na 60 °C, aby całkowicie rozpuścić proszek PFA. Dostosuj końcową objętość do 10 ml za pomocą 1x PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwiązanie blokujące IHC
	<ol>
		<li>Połącz 1 ml normalnej surowicy osła, 20 μl 20% NaN3, 200 μl 20% Triton X-100 i 18,78 ml 1x buforu PBS. Dokładnie wymieszaj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>30% roztwór sacharozy
	<ol>
		<li>Rozpuścić 15 g sacharozy w 40 ml 1x buforu PBS. Dostosuj objętość do 50 ml za pomocą buforu 1x PBS i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór przeciwciał drugorzędowych IHC
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć kozie przeciwciało anty-królicze Alexa Fluor 488 w stosunku 1:300 i DAPI w stosunku 1:2,000 za pomocą przygotowanego buforu blokującego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kriosekcja gałki ocznej myszy
<ol>
	<li>Rozwarstwianie gałek ocznych
	<ol>
		<li>Znieczulić 3-miesięczną mysz C57Bl/6 (około 25 g) poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 2% tribromoetanolu w dawce 15 μl/g masy ciała. Poświęć mysz za pomocą zwichnięcia szyjki macicy (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami).</li>
		<li>Zaznacz górną stronę gałki ocznej niebieskim markerem na twardówce (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A). Usuń gałki oczne za pomocą nożyczek.</li>
		<li>Jeśli na powierzchni gałki ocznej znajduje się krew, delikatnie zetrzyj ją niestrzępiącą się chusteczką. Pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie usuń mięśnie zewnątrzgałkowe przyczepione do gałek ocznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrwalenie
	<ol>
		<li>Przenieś wypreparowane gałki oczne do 2-mililitrowej probówki do mikrowirówki z okrągłym dnem zawierającej 1 ml 4% PFA. Unieruchamiaj gałki oczne na 10 minut. Następnie przenieś gałki oczne na odwróconą 3- lub 6-centymetrową szalkę Petriego.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj małe nacięcie (około 1-2 mm) na rogówce za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek okulistycznych. Umieść gałki oczne z powrotem w 4% roztworze PFA na dodatkowe 2 godziny utrwalania na lodzie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krioprotekcja
	<ol>
		<li>Usuń utrwalacz i trzykrotnie przemyj gałki oczne 1x roztworem buforowym PBS. Przenieść gałki oczne do okrągłodennej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml 30% roztworu sacharozy do krioprotekcji w temperaturze 4 °C. Pozwól, aby gałki oczne osiadły na dnie probówki lub pozostaw je na noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powlekanie gałki ocznej
	<ol>
		<li>Przenieś gałkę oczną na odwróconą szalkę Petriego stroną rogówki skierowaną do góry. Zetrzyj nadmiar roztworu z rogówki za pomocą niestrzępiącej się chusteczki. Zanurz 2-3 cm odcinek sznurka tenisowego w kleju (złożonym z cyjanoakrylanów) zawartym w probówce do mikrowirówek o pojemności 0,2 ml, a następnie szybko go usuń.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym przymocuj jeden koniec sznurka tenisowego z resztkami super kleju do środka wilgotnej rogówki. Pozostaw klej do zestalenia się na 10-20 s. Chwyć drugi koniec sznurka tenisowego i zanurz gałkę oczną w probówce mikrowirówkowej o pojemności 200 μl wypełnionej super klejem, upewniając się, że twardówka jest całkowicie zanurzona na około 1 s.</li>
		<li>Szybko wyjmij gałkę oczną i zanurz ją w PBS (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Klej na powierzchni twardówki natychmiast się zestala.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunięcie rogówki
	<ol>
		<li>Zetrzyj nadmiar PBS na powierzchni zestalonego kleju za pomocą niestrzępiącej się ściereczki. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń rogówkę nożyczkami okulistycznymi, trzymając dołączoną cięciwę tenisową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie
	<ol>
		<li>Za pomocą kleszczyków ostrożnie wyjmij soczewkę z muszli ocznej. Nadmiar roztworu sacharozy uwięzionego w muszli ocznej należy wchłonąć paskiem niestrzępiącej się chusteczki. Przenieś muszlę oczną do formy do zatapiania wypełnionej związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT).</li>
		<li>Całkowicie napełnij muszlę oczną OCT. Ustaw muszlę oczną tak, aby była skierowana w stronę ściany bocznej formy do zatapiania, upewniając się, że płaszczyzna strzałkowa jest równoległa do dna formy. Użyj niebieskiego znaku na twardówce jako odniesienia. Przenieś formę do zatapiania zawierającą muszlę oczną do zamrażarki o temperaturze -80 °C (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D). Muszla oczna zostanie zamrożona w ciągu pięciu minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriosekcja
	<ol>
		<li>Przenieść zamrożoną muszlę oczną do kriostatu ustawionego na -20 °C i pozostawić do wyrównania w komorze przez 30 minut. Pociąć muszlę oczną na grubość 12 μm. Zamontuj sekcje na dodatnio naładowanych szkiełkach do późniejszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie immunohistochemiczne
<ol>
	<li>Pieczenia
	<ol>
		<li>Zamrożone kawałki ułożyć na szkiełkach i piec w piekarniku o temperaturze 37 °C przez 30-60 minut, aby zapewnić prawidłowe przyleganie chusteczki do szkiełka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mycie
	<ol>
		<li>Za pomocą pisaka PAP narysuj okrąg wokół sekcji na slajdzie. Zanurz szkiełko w słoiku Coplin zawierającym 1x bufor PBS. Umieść słoik Coplin na wolnym wytrząsarce i myj sekcje przez 2 × 10 minut, aby usunąć związek OCT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie i przepuszczalność
	<ol>
		<li>Umieść szkiełko poziomo w komorze wilgotnościowej. Dodaj roztwór blokujący do zakreślonych odcinków i pozostaw do zablokowania i przepuszczalności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych
	<ol>
		<li>Ostrożnie odessać roztwór blokujący ze szkiełka. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczone w roztworze blokującym, do sekcji. Inkubować skrawki w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C przez noc, aby zapewnić optymalne wiązanie przeciwciała z antygenem docelowym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał wtórnych
	<ol>
		<li>Odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć szkiełko dwukrotnie 1x PBS przez 2 × 10 minut. Dodać odpowiednie przeciwciało drugorzędowe, zmieszane z DAPI i rozcieńczone w roztworze blokującym.</li>
		<li>Inkubować skrawki w ciemnej komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby umożliwić wtórne wiązanie przeciwciał i barwienie przeciwstawne za pomocą DAPI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montażu
	<ol>
		<li>Odessać roztwór przeciwciała wtórnego i przepłukać szkiełko 1x PBS przez 2 × 10 minut. Użyj chusteczki Kimwiste, aby usunąć pozostały PBS na szkiełku.</li>
		<li>Nałóż odpowiednią ilość środka montażowego zapobiegającego blaknięciu na sekcje i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Zamontowane próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności, aby zachować fluorescencję i zapobiec fotowybielaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
	<li>Pozyskaj sygnały fluorescencyjne z wybarwionych immunologicznie skrawków siatkówki za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Dostosuj ustawienia, aby uzyskać optymalną rozdzielczość i czułość, aby uchwycić wyraźne i wyraźne sygnały fluorescencyjne.</li>
	<li>Upewnij się, że używane są odpowiednie filtry do wykrywania określonych długości fal fluoroforów użytych w eksperymencie.</li>
</ol>

<ol><li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemistry+on+ultrathin+frozen+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Immunochemistry on ultrathin frozen sections.</a> Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+Revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: Revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Usukura, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryosectioning+technique+for+the+observation+of+intracellular+structures+and+immunocytochemistry+of+tissues+in+atomic+force+microscopy+%28AFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A cryosectioning technique for the observation of intracellular structures and immunocytochemistry of tissues in atomic force microscopy (AFM).</a> Sci Rep. 7 (1), 6462(2017).</li>
<li>Park, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+rhodopsin+in+rod+photoreceptor+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of rhodopsin in rod photoreceptor cell membranes.</a> Pflugers Arch. 473 (9), 1361-1376 (2021).</li>
<li>Boonstra, H., Oosterhuis, J. W., Oosterhuis, A. M., Fleuren, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+tissue+shrinkage+by+formaldehyde+fixation%2C+paraffin+wax+embedding%2C+section+cutting+and+mounting%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch+A+Pathol+Anat+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Cervical tissue shrinkage by formaldehyde fixation, paraffin wax embedding, section cutting and mounting.</a> Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 402 (2), 195-201 (1983).</li>
<li>Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+strategies+for+retinal+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Fixation strategies for retinal immunohistochemistry.</a> Prog Retin Eye Res. 48, 181-202 (2015).</li>
<li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Maxillofac+Pathol%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 16 (3), 400-405 (2012).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+preparation+of+mouse+retinal+cryosections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">An improved method for preparation of mouse retinal cryosections.</a> Eur J Histochem. 64 (3), 3154(2020).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+protocol+for+the+preparation+of+mouse+retinal+cryosections+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">A quick protocol for the preparation of mouse retinal cryosections for immunohistochemistry.</a> Open Biol. 11 (7), 210076(2021).</li>
<li>Szel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+topographic+separation+of+two+spectral+classes+of+cones+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Unique topographic separation of two spectral classes of cones in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 325 (3), 327-342 (1992).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Na jakość skrawków tkanek wpływa szereg czynników, w tym skład roztworu utrwalającego, czas utrwalania i krioprotekcji oraz metody osadzania5. Podczas wyłuszczenia gałki ocznej od myszy konieczne jest usunięcie mięśni zewnątrzgałkowych i innej tkanki łącznej przyczepionej do gałki ocznej. Jeśli nie zostaną prawidłowo usunięte, tkanki te mogą spowodować deformację gałki ocznej podczas ekstrakcji z oczodołu, potencjalnie prowadząc do odwarstwienia siatkówki. Podczas procesu stabilizacji należy wykon...

Kriosekcja i immunohistochemia (IHC) są niezbędnymi technikami w badaniach biomedycznych, szczególnie do badania złożonych struktur biologicznych, takich jak siatkówka1. Te zaawansowane metodologie są integralną częścią zrozumienia skomplikowanego składu komórkowego i organizacji molekularnej siatkówki. Zapewniają one naukowcom możliwość szczegółowego badania funkcjonalności i patologii siatkówki, oferując spostrzeżenia, które mają kluczowe znaczenie dla postępu wiedzy w tej dziedzinie.
Kriosekcja odgrywa istotną rolę w utrzymaniu integralności morfologicznej tkanki siatkówki. Zapewnia, że delikatna struktura siatkówki pozostaje nienaruszona, co pozwala na wykorzystanie skrawków w kolejnych badaniach immunofluorescencyjnych z wysoką dokładnością i wiarygodnością. W porównaniu z innymi metodami, takimi jak zatapianie parafiny, kriosekcja ma znaczące zalety, ponieważ lepiej zachowuje zarówno morfologię tkanki, jak i antygenowość, dzięki czemu jest szczególnie odpowiednia do barwienia immunohistochemicznego2. Technika zamrożonych przekrojów jest szeroko stosowana do badania szeregu złożonych tkanek, a nawet drobnych struktur komórkowych3, umożliwiając precyzyjną analizę ich architektury.
IHC to potężna i wszechstronna technika laboratoryjna, która pozwala na wizualizację lokalizacji określonych białek w tkankach. Technika ta stała się kamieniem węgielnym zarówno w warunkach klinicznych, jak i badawczych, gdzie jest szeroko stosowana w diagnostyce, monitorowaniu chorób i badaniach biologicznych. Powodzenie eksperymentu IHC zależy w dużej mierze od skrupulatnego przygotowania próbki, ostrożnego obchodzenia się z tkanką i precyzyjnej kontroli warunków barwienia immunologicznego. Niewielkie różnice w protokole mogą mieć duży wpływ na jakość wyników, podkreślając znaczenie standaryzacji i optymalizacji1.
W połączeniu, kriosekcja i IHC oferują niezrównane korzyści dla badaczy chcących zbadać rozkład przestrzenny, poziomy ekspresji i interakcje komórkowe różnych białek w siatkówce. Metodologie te pozwalają na szczegółowe badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw rozwoju, funkcji i choroby siatkówki. Takie spostrzeżenia są szczególnie cenne w badaniu zaburzeń siatkówki, w tym zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, retinopatii cukrzycowej i barwnikowego zwyrodnienia siatkówki. Wyjaśniając patofizjologię tych schorzeń, kriosekcja i IHC przyczyniają się do identyfikacji potencjalnych biomarkerów i opracowania nowych strategii terapeutycznych.
Pomimo swojej użyteczności, praca z siatkówkami myszy stanowi wyjątkowe wyzwanie. Myszy są szeroko stosowane jako modele zwierzęce w badaniach okulistycznych ze względu na ich genetyczne podobieństwo do ludzi i dobrze scharakteryzowaną strukturę siatkówki. Jednak uzyskanie wysokiej jakości kriosekcji jest z natury trudne ze względu na mały rozmiar i delikatny charakter tkanki siatkówki myszy. Badanie to przedstawia szczegółową metodologię kriosekcji i wykonywania IHC na siatkówkach myszy, podkreślając krytyczne względy techniczne i oferując strategie optymalizacyjne w celu sprostania tym wyzwaniom. Udoskonalając te techniki, naukowcy mogą osiągnąć spójne i wysokiej jakości wyniki, posuwając naprzód badania nad biologią i patologią siatkówki.

<table><tbody><tr><td>-80 stopni Celsjusza; C zamrażarka</td><td>Haier</td><td>DW-86L626</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopu adhezyjnego</td><td>CITOTEST</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-Goat anti-Rabbit</td><td>Proteintech</td><td>SA00006-2</td><td></td></tr><tr><td>Mysz C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom do kriosekcji</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>LEICA</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4083S</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>ZEISS</td><td>3943030830</td><td></td></tr><tr><td>Serum dla osła</td><td>Solarbio</td><td>S9100</td><td></td></tr><tr><td>Formy do zatapiania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1841</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do precyzyjnego rozwarstwiania</td><td>RWD</td><td>S13001-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze precyzyjne</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td></td></tr><tr><td>Wodne podłoże montażowe Fluoromount</td><td>Inkubator Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Shanghai Yuejin</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1049330500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1048771000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FIS-06666</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy mikroskop konfokalny</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Osłona mikroskopu Szkło</td><td>CITOTEST</td><td>80340-3610</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1091371003</td><td></td></tr><tr><td>Związek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Długopis dla dzieci</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z672548</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-PDE6B</td><td>Proteintech</td><td>22063-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td>SCILOGEX</td><td>8042210200</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>RWD</td><td>S11036-08</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>BioFroxx</td><td>1245GR500</td><td></td></tr><tr><td>Super klej</td><td>Deli</td><td>7147S</td><td></td></tr><tr><td>Sznurek tenisowy (1,24 mm)</td><td>Gosen</td><td>TS761</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>Macklin</td><td>T831042</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>IT9100</td><td></td></tr></tbody></table>

kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Cryosectioning and Immunostaining of Mouse Retina

Sekcja tkanek i immunohistochemia są niezbędnymi technikami w badaniach histologicznych i patologicznych chorób siatkówki przy użyciu modeli zwierzęcych. Metody te umożliwiają szczegółowe badania morfologii tkanek i lokalizacji określonych białek w tkance, co dostarcza cennych informacji na temat procesów i mechanizmów chorobowych. Myszy są najczęściej używanym modelem do tego celu. Ponieważ jednak gałki oczne myszy są małe, a siatkówki myszy są niezwykle delikatnymi tkankami, uzyskanie wysokiej jakości przekrojów siatkówki i obrazów barwiących immunologicznie z gałek ocznych myszy jest zazwyczaj trudne. Badanie to opisuje ulepszony protokół kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania immunohistochemii. Istotnym punktem tego protokołu jest pokrycie gałki ocznej warstwą super kleju, który zapobiega deformacji gałek ocznych podczas procesów usuwania rogówki, ekstrakcji soczewki i osadzania. Ten krok zapewnia dobre zachowanie integralności morfologii siatkówki. Protokół ten podkreśla krytyczne względy techniczne i strategie optymalizacyjne w celu konsekwentnego wytwarzania wysokiej jakości skrawków siatkówki i osiągania doskonałych wyników barwienia immunologicznego.

Zgodnie z opisanym powyżej protokołem, oczy miesięcy myszy typu dzikiego C57Bl/6J utrwalono w 4% PFA. Utrwalone próbki zatopiono w OCT, a następnie wykonano ich kriosekcje. Przekroje poddano immunobarwieniu z użyciem przeciwciała anty-PDE6B oraz barwieniu kontrastowemu DAPI w celu znakowania jąder komórkowych. PDE6B to białko fototransdukcji specyficznie wyrażane w komórkach fotoreceptorów pręcikowych4. W porównaniu z tradycyjnymi protokołami, metoda ta znacząco poprawia zarówno morfologię siatków...

Opisano protokół przygotowania kriosekcji siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego na fotoreceptorach. Artykuł ten umożliwia naukowcom konsekwentne wytwarzanie zamrożonych skrawków siatkówki myszy z dobrze zachowaną morfologią i wysokiej jakości wynikami barwienia immunologicznego.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Tissue sectioning and immunohistochemistry are essential techniques in histological and pathological studies of retinal diseases using animal models. ...

Nasze badania koncentrują się na badaniu chorób siatkówki. Pytanie, na które staramy się odpowiedzieć, to mechanizm molekularny leżący u podstaw zwyrodnienia siatkówki. Barwienie immunologiczne wycinków siatkówki myszy i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości to kluczowe technologie wykorzystywane do rozwoju badań w naszej dziedzinie.Konsekwentne uzyskiwanie wycinków siatkówki z dobrymi morfologami jest jednym z obecnych wyzwań eksperymentalnych wielu badaczy. Znaczące odkrycia, które ustaliliśmy w naszej dziedzinie, w tym identyfikacja PDEdelta jako białka wiążącego prenyl i UNC119 jako białka wiążącego acyl. Aby rozpocząć, umieść poświęconą mysz na stole operacyjnym.Za pomocą niebieskiego markera zaznacz górną stronę gałki ocznej na twardówce. Usuń gałki oczne za pomocą nożyczek okulistycznych. Przenieś wypreparowane gałki oczne do 2-mililitrowej probówki wirówkowej z okrągłym dnem zawierającej jeden mililitr 4% paraformaldehydu na 10 minut.Po utrwaleniu umieść gałki oczne na odwróconej 6-centymetrowej szalce Petriego. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj cienkich kleszczy i nożyczek okulistycznych, aby wykonać małe nacięcie na rogówce. Umieść gałki oczne z powrotem w 4% roztworze paraformaldehydu, aby uzyskać dodatkowe dwie godziny utrwalenia na lodzie.Następnie wyjmij utrwalacz z tubki i trzykrotnie przemyj gałki oczne PBS. Przenieś gałki oczne do 2-mililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr 30% roztworu sacharozy w celu krioprotekcji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przenieś gałkę oczną na odwróconą szalkę Petriego stroną rogówki skierowaną do góry.Zetrzyj nadmiar roztworu z rogówki za pomocą niestrzępiącej się chusteczki. Zanurz dwu- lub trzycentymetrowy odcinek sznurka tenisowego w kleju cyjanoakrylowym zawartym w 0,2-mililitrowej probówce do mikrowirówek i szybko go usuń. Pod mikroskopem preparacyjnym przymocuj jeden koniec sznurka tenisowego z resztkami super kleju do środka wilgotnej rogówki.Pozwól klejowi zastygnąć przez 10 do 20 sekund, a następnie chwyć drugi koniec sznurka tenisowego i zanurz gałkę oczną w 200-mikrolitrowej probówce wirówkowej wypełnionej super klejem na jedną sekundę. Szybko wyjmij gałkę oczną i zanurz ją w PBS. Zetrzyj nadmiar PBS z powierzchni zestalonego kleju za pomocą niestrzępiącej się ściereczki.Pod mikroskopem preparacyjnym usuń rogówkę za pomocą nożyczek okulistycznych, trzymając dołączoną cięciwę tenisową. Za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij soczewkę z muszli ocznej. Przenieś muszlę oczną do formy do zatapiania wypełnionej optymalną temperaturą cięcia lub związkiem OCT.Następnie całkowicie napełnij muszlę oczną związkiem OCT. Ustaw muszlę oczną tak, aby była skierowana w stronę ściany bocznej formy do zatapiania, upewniając się, że płaszczyzna strzałkowa jest równoległa do dna formy, używając niebieskiego znaku na twardówce jako odniesienia. Przenieś formę do zatapiania zawierającą muszlę oczną do zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza na pięć minut.Przenieś zamrożoną muszlę oczną do kriostatu ustawionego na 20 stopni Celsjusza i pozwól mu się zrównoważyć w komorze przez 30 minut. Przeciąć muszlę oczną na grubość 12 mikrometrów. Następnie zamontuj sekcje na dodatnio naładowanym szkiełku szkiełkowym.Na początek piecz zamrożone sekcje gałki ocznej myszy na szkiełku w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 60 minut. Po upieczeniu, za pomocą pisaka PAP, narysuj okrąg wokół sekcji na szkiełku. Zanurz szkiełko w słoiku Coplin zawierającym PBS.Umieść słoik Coplin na powolnej wytrząsarce i umyj części dwa razy po 10 minut każda, aby usunąć związek OCT. Następnie umieść szkiełko poziomo w komorze wilgotnościowej. Dodaj roztwór blokujący do zakreślonych odcinków i pozwól na zablokowanie i przepuszczalność w temperaturze pokojowej przez 30 minut.Po zablokowaniu zastąp roztwór blokujący pierwszorzędowym roztworem przeciwciała. Inkubuj skrawki w komorze wilgotnościowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Odessać roztwór przeciwciała pierwotnego i przemyć szkiełko dwukrotnie PBS przez 10 minut każdy.Następnie dodać przeciwciało drugorzędowe zmieszane z DAPI rozcieńczonym w roztworze blokującym. Inkubuj sekcje w ciemnej komorze wilgotnościowej przez godzinę. Po inkubacji przepłukać szkiełko dwukrotnie PBS.Za pomocą Kimwipe zetrzyj wszelkie pozostałe PBS ze szkiełka. Nałóż odpowiednią ilość środka uszczelniającego antifade na sekcje i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Immunofluorescencyjne obrazy odcinków siatkówki myszy wykazały, że zewnętrzne segmenty fotoreceptora zostały pomyślnie oznaczone anty PDE6B, pokazując wyraźne i morfologicznie nienaruszone segmenty bez odwarstwienia siatkówki.Wewnętrzne segmenty i zewnętrzna warstwa jądrowa zostały zachowane, nie wykazując żadnych uszkodzeń strukturalnych.

cryosectioning-and-immunostaining-of-mouse-retina

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Tutaj prezentujemy protokół adaptacji metody CLARITY tkanek mózgowych do całych siatkówek, aby poprawić jakość standardowego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych.

Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing

Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.

Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół immunohistochemiczny do identyfikacji, walidacji i celowania w funkcjonalnie istotne kaspazy w złożonych tkankach.

Kwantyfikacja immunologicznie barwionej kaspazy-9 w tkance siatkówki

Ten protokół opisuje procedurę izolowania całej siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego w celu oznaczenia wszystkich komórek zwojowych siatkówki (RGC). Po procesie następuje obrazowanie i automatyczne zliczanie RGC za pomocą oprogramowania opartego na sztucznej inteligencji, co zapewnia prostą, szybką i dokładną metodę ilościowego określania RGC w całej siatkówce myszy.

Barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy

Perycyty w unaczynieniu siatkówki zostały zbadane za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego z receptorem czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego β po retro-orbitalnym wstrzyknięciu fluorescencyjnej lektyny pomidorowej. Znakowaną siatkówkę poddano dalszej obróbce metodą oczyszczania tkanek i zamontowano w całości w celu wizualizacji trójwymiarowych widoków perycytów otaczających naczynia krwionośne siatkówki pod mikroskopem konfokalnym.

Wizualizacja 3D perycytów naczyniowych siatkówki myszy za pomocą immunostainingu

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

En face Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Naucz się kriosekcji i barwienia immunologicznego siatkówki myszy w celu badania fotoreceptorów. Ta metoda zapewnia zachowanie morfologii tkanek i wysokiej jakości obrazowanie struktur siatkówki.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne siatkówki myszy

Przeglądaj więcej filmów