Name: Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj niegenetyczną fotostymulację w mikrofizjologicznym systemie serca przy użyciu fototransduktorów materiałowych. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę aktywności komórek serca bez modyfikacji genetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Michaelowi Rosnachowi za ilustracje na Rysunku 1 i Rysunku 3 oraz Prof. Williamowi T. Pu za dostarczenie hiPSC. Prace te były wspierane przez NCATS Tissue Chips Consortium (UH3 TR003279) na rzecz KKP, włoskie Ministerstwo Uniwersytetów i Badań Naukowych poprzez projekt PRIN 2022 (ID 2022-NAZ-0595) na Florydzie, projekt PRIN 2020 (ID 2020XBFEMS) na rzecz CB i GL oraz projekt Fondo Italiano per la Scienza (ID FIS00001244) na rzecz GL.

Użyta hodowla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) to linia iPSC typu ludzkiego typu dzikiego, która zawiera indukowany doksycykliną (Dox) system CRISPR/Cas9, stworzony przez wprowadzenie CAGrtTA::TetO-Cas9 do locus AAVS1 (Addgene: #73500). Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Boston Children's Hospital Institutional Review Board. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów przed ich udziałem w badaniu. Wytwarzanie kardiomiocytów pochodzących z hiPSC (hiPSC-CM) zostało wywołane zgodnie z wcześniejszym opisem25,26. Protokół zostanie pokrótce podsumowany w następującej sekcji:
1. Wytwarzanie i przygotowanie ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych
<ol>
	<li>Przemyć hiPSC hodowane w kolbach T75 za pomocą PBS. Odłączyć komórki przez inkubację z czynnikiem chelatującym Versene przez 10-15 minut i wysiać nasiona do naczyń bioreaktora wstępnie potraktowanych 1% roztworem niejonowego środka powierzchniowo czynnego o gęstości 50 milionów IPSC / naczynie w 100 ml pożywki E8 uzupełnionej 10 μM inhibitorem ROCK Y-27632.</li>
	<li>Ustaw następujące parametry bioreaktora: mieszanie 60 obr./min, temperatura 37 °C, pH 7 i gazowanie nakładkowe (O2 iCO2) na poziomie 3 standardowych l/h.</li>
	<li>Po 1 dniu w hodowli potwierdź, że średnica ciała zarodka (EB) osiągnęła 100-300 μm i potraktuj komórki podstawową pożywką RPMI (pożywka RPMI 1640 uzupełniona witaminą B27 minus insulina), zawierającą 7 μM CHIR99021 przez 24 godziny, a następnie zmień pożywkę na RPMI na kolejne 24 godziny. Dodaj podstawową pożywkę RPMI zawierającą 5 μM IWR-1-endo przez kolejne 48 godzin, aby rozpocząć proces różnicowania w kierunku linii serca. Po 48 godzinach zmień medium z powrotem na podstawowe RPMI.</li>
	<li>W 7 dniu różnicowania komórki hodowlane w podstawowej pożywce RPMI uzupełnione insuliną ludzką w proporcji 1:1 000 (v/v). Odświeżaj podłoże co 2 dni lub codziennie z 50% zmianą podłoża, jeśli zużycie tlenu osiąga więcej niż 30%.</li>
	<li>W dniu 15 enzymatycznie dysocjuj komórki bioreaktora przez 3 godziny za pomocą roztworu kolagenazy II zawierającego HBSS, kolagenazę II (200 jednostek/ml), HEPES (10 mM), inhibitor ROCK Y-27632 (10 μM) i N-benzylo-p-toluenosulfonamid (BTS, 30 μM). Aby to zrobić, najpierw przemyj zróżnicowane EB hiPSC-CM 2x wstępnie podgrzanym HBSS i inkubuj je w roztworze kolagenazy II (200 μl objętości EB / 12 ml roztworu kolagenazy II) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , aż pojawią się pojedyncze komórki z pełnej dysocjacji EB.</li>
	<li>Zatrzymać reakcję dysocjacji, dodając równą objętość buforu blokującego (RPMI-1640 bez B27 i DNazy II, z 6 μl DNazy II na ml RPMI-1640) do zawiesiny jednokomórkowej. Policz zróżnicowane hiPSC-CMs, odwiruj (200 × g, 5 min) i przygotuj się do dalszych zastosowań, zamrażając komórki w temperaturze -80 °C w izopropanolu przez 24 godziny i przenosząc je do zbiorników z ciekłym azotem do czasu przeprowadzenia siewu.</li>
</ol>
2. Inżynieria wytwarzania tkanek laminarnych
<ol>
	<li>Przyklej dwie warstwy taśmy laboratoryjnej, jedną białą i jedną niebieską, do przezroczystego, odpornego na zarysowania i promieniowanie UV arkusza akrylowego o grubości 1 mm. Za pomocą grawera laserowego CO2 wytnij arkusz akrylowy w kółka (średnica 20 mm, aby pasował do 12 MW) i wzór chipa (3 x kwadraty 7,5 mm, po trzy na chip) na taśmie, zgodnie z projektem w oprogramowaniu do grafiki wektorowej (np. CorelDraw); parametry cięcia akrylu: moc 100, prędkość 20 i 1 000 PPI; parametry cięcia taśmy: 8 mocy, 6 prędkości i 1 000 PPI. Usuń dwie warstwy taśmy wewnątrz najbardziej wewnętrznej linii za pomocą pęsety, namocz frytki w czystym wybielaczu przez 30 minut do 1 godziny, aby usunąć grube linie i ciemne plamy z cięcia, pozostawiając ostrą linię, a następnie opłucz frytki w zlewce pod bieżącą wodą dejonizowaną (DI) przez noc lub przez co najmniej 3 godziny 
	UWAGA: Nie wybielaj dłużej niż 2 godziny, ponieważ spowoduje to wytrawienie klejów na ściankach bocznych, uniemożliwiając prawidłowe przyleganie żelatyny.</li>
	<li>Sonikować wióry przez 10 minut, a polidimetylosiloksan (PDMS, Sylgard 184) stemplować z cechami rowka liniowego (szerokość grzbietu 25 μm, szerokość rowka 4 μm i głębokość rowka 5 μm) przez 30 minut w czystym 70% etanolu. Przenieś wióry i stemple do czystego miejsca pod maską i pozwól im wyschnąć pod przepływem powietrza przez ~1-2 godziny.</li>
	<li>Odważyć 1 g żelatyny ze skóry świni (moc żelu ~175 g Bloom, Typ A) do probówki o pojemności 50 ml. Dodać 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dokładnie wymieszać, aby zapewnić natychmiastowe rozpuszczenie żelatyny. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C na 30 minut, aby zakończyć proces rozpuszczania. Podobnie zważyć 1 g transglutaminazy mikrobiologicznej (MTG) do oddzielnej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 12,5 ml PBS, dokładnie wymieszać i umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie MTG.</li>
	<li>Sonikować probówkę żelatynową przez 15 minut, a następnie przed użyciem umieścić ją z powrotem w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C. Umieść rurkę MTG w eksykatorze z lekko poluzowaną nakrętką i powoli włączaj próżnię. Obserwuj, jak pęcherzyki są usuwane z roztworu MTG pod próżnią. Po odgazowaniu włóż rurkę MTG z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Monitoruj proces i dostosuj podciśnienie, aby uniknąć energicznego wrzenia.</li>
	<li>Przykryj arkusz siatki czystym parafilmem, umieść wióry na siatce i trzymaj stempel w pobliżu, gotowy do użycia. Dodać 5 ml MTG do 5 ml roztworu żelatyny, ostrożnie pipetując, aby uniknąć pęcherzyków; następnie szybko odpipetuj żelatynę na chip, używając tyle, aby pokryć obszar wióra (około 0,5 ml każdy). Następnie umieść stempel PDMS22 (szerokość linii 25 μm, wysokość 5 μm, odstępy 4 μm) na wierzchu i nałóż odważnik o wadze 200 g, aby upewnić się, że żelatyna jest ułożona równolegle do osi podłużnej tkanki. Gdy wszystkie wióry zostaną uformowane, przykryj je szklanym słoikiem, aby uniknąć zakłóceń środowiskowych i pozwól im usieciować się przez noc. 
	UWAGA: Zużyć zmieszany roztwór żelatyny-MTG w ciągu 5 minut; W przeciwnym razie docelowy wzór zostanie zmieniony z powodu wyższego stanu usieciowania żelatyny.</li>
	<li>Przenieś chip i kanapkę ze stemplem PDMS do nowego naczynia P150 wypełnionego PBS i uwodnij żelatynę przez 30 minut do 1 godziny, aby ułatwić oddzielenie stempla PDMS od chipa. Usuń nadmiar nieformowanej żelatyny wokół chipa i przenieś czysty wiór do nowego naczynia P150 wypełnionego PBS. Przechowuj znaczki PDMS w 70% etanolu.</li>
	<li>Wysterylizuj frytki, mocząc je w etanolu przez 10 minut pod maską. 
	UWAGA: Nie przekraczaj 10 minut w etanolu, ponieważ dłuższa ekspozycja może zdeformować żelatynę.</li>
	<li>Przenieś wiórki do PBS, moczyć przez 10 minut i spłucz 3x. Przygotuj roztwory powlekające, mieszając 20 μg/ml fibronektyny z rozcieńczoną w stosunku 1:100 matrycą błony podstawnej w pożywkach hodowlanych (około 0,5 ml na studzienkę). Powlekać wióry przez 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 lub w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Rozmrozić i zasiać komórki (8 × 105 hiPSC-CM na cm2) w podłożu RPMI z Y-27632 (10 μM), a następnie po 24 godzinach zastąpić go RPMI bez Y-27632.</li>
	<li>Trzy dni po wysianiu komórek usuń białą taśmę za pomocą pęsety.</li>
</ol>
3. Synteza i zastosowanie fotoprzetwornika
UWAGA: Ziapin2 został zsyntetyzowany zgodnie z wcześniej opublikowaną procedurą16,18 i został podany hiPSC-CMs bezpośrednio w pożywce hodowlanej.
<ol>
	<li>Dodać 25 μM Ziapin2 do hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 7 minut.</li>
	<li>Delikatnie zmyj nadmiar cząsteczek i spłucz świeżą pożywką hodowlaną.</li>
</ol>
4. Test żywotności
UWAGA: Alamar Blue to test oparty na resazurynie, który może przenikać do komórek i działać jako wskaźnik redoks do monitorowania żywotności komórek. Rezazuryna rozpuszcza się w fizjologicznych, w wyniku czego powstaje ciemnoniebieski roztwór, który jest dodawany bezpośrednio do komórek w hodowli. Żywe komórki z aktywnym metabolizmem redukują rezyzynę do rezofuryny, która jest różowa i fluorescencyjna.
<ol>
	<li>Komórki płytki na 96-dołkowej płytce pokrytej wcześniej fibronektyną 20 μg/ml i rozcieńczoną w stosunku 1:100 matrycą błony podstawnej w pożywce hodowlanej. Wymieszać przez wstrząsanie, a następnie aseptycznie dodać Alamar Blue do każdej studzienki w ilości równej 10% objętości studzienki.</li>
	<li>Inkubuj kultury z Alamar Blue przez 4 godziny.</li>
	<li>Traktuj komórki za pomocą fotoprzetwornika i nośnika (DMSO), jak opisano wcześniej. Zastosuj stymulację światłem (światło pulsacyjne 1 Hz przez 1 minutę) przez światłowód (cyjan, 470 nm), aby ocenić wpływ internalizacji Ziapin2 i ekspozycji na światło na żywotność hiPSC-CM.</li>
	<li>Odczyt fluorescencji czytnikiem płytek przy wzbudzeniu 560 nm i emisji 590 nm.</li>
</ol>
5. Ocena anizotropii tkanek laminarnych serca
UWAGA: Ten protokół przedstawia systematyczne podejście do oceny anizotropii zmodyfikowanej laminarnej tkanki serca za pomocą barwienia immunologicznego, mikroskopii konfokalnej i analizy jąder27.
<ol>
	<li>Przemyć podłoże PBS kilkakrotnie przed utrwaleniem 4% (v/v) paraformaldehydu zawierającego 0,05% (v/v) Triton X-100 w PBS przez 10 min.</li>
	<li>Zablokuj niespecyficzne wiązanie przez inkubację próbek z 5% (w/v) albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 30 minut.</li>
	<li>Próbki inkubować za pomocą Hoechsta (1:500) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Umyć PBS przed zamontowaniem na szkiełkach mikroskopowych środkiem zapobiegającym blaknięciu. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na noc i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu wykonania obrazu.</li>
	<li>Próbki obrazu za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem przy 20-krotnym powiększeniu. Określ orientację komórek za pomocą wtyczki FiJi OrientationJ Measure28.</li>
</ol>
6. Zapisy mapowania optycznego
UWAGA: Mapowanie optyczne zostało przeprowadzone po 5 dniach w hodowli na hiPSC-CM wysianych na wiórach tkanek formowanych żelatyną.
<ol>
	<li>Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy upewnić się, że aparatura do mapowania optycznego składa się ze zmodyfikowanego mikroskopu z tandemową soczewką wyposażonego w szybką kamerę i źródło światła wzbudzającego, lampę rtęciową o mocy 200 mW. Umieść lustro dichroiczne przed wyznaczoną kamerą obrazującą Ca2+, aby upewnić się, że preparat jest wystawiony na działanie światła wzbudzającego i aby zebrać emitowaną fluorescencję pochodzącą z próbki. </li>
	<li>Inkubować próbkę z 2 μM X-Rhod 1 dodanymi do pożywki przez 30 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Próbkę należy wystawiać na działanie światła tylko podczas akwizycji obrazu, aby uniknąć fotowybielania barwnika.</li>
	<li>Przeprowadzić inkubację fotoprzetwornika zgodnie z wcześniejszym opisem w sekcji 3.</li>
	<li>Umyj świeżą pożywką hodowlaną i przenieś frytki na wolne od czerwieni fenolowej pożywce RPMI 1640 uzupełnionej witaminą B27 minus insulina.</li>
	<li>Umieść chipy tkankowe w naczyniu o kontrolowanej temperaturze i rozpocznij nagrywanie w temperaturze fizjologicznej (37 °C), uzyskując obrazy z szybkością 2,5 klatki/s.</li>
	<li>W przypadku stymulacji optycznej należy zastosować optyczną stymulację punktową na jednym końcu tkanki za pomocą źródła światła LED (465/25 nm) umożliwiającego stymulację Ziapin2. Utrzymuj tempo tkanek z częstotliwością 0,5 lub 1 Hz za pomocą czasowo regulowanego światłowodu umieszczonego w odległości 1 mm od tkanki. W przypadku stymulacji elektrycznej zastosuj stymulację punktową za pomocą bipolarnej elektrody platynowej umieszczonej pośrodku najbardziej dystalnego końca prostokątnej tkanki. Takie umieszczenie zapewnia, że propagacja fali Ca2+ rozpoczyna się od środka szerokości tkanki, który odpowiada krótszemu bokowi prostokąta. Stymulacja powinna być stosowana z częstotliwością 0,5 Hz, o amplitudzie 10 V i czasie trwania impulsu 100 ms.</li>
	<li>Po nagraniach zastosuj filtr przestrzenny o rozmiarze 3 x 3 piksele, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Określ prędkość przewodzenia fali Ca2+ w każdym pikselu dla każdego impulsu, obliczając szybkość zmian zarówno w kierunku x, jak i y. Aby to zrobić, zmierz gradient przestrzenny natężenia sygnału Ca2+ w tych kierunkach i odnieś go do opóźnienia czasowego propagacji sygnału. Łącząc te szybkości zmian kierunkowych, określ ilościowo, jak szybko fala przemieszcza się w polu komórkowym w obu wymiarach.</li>
</ol>
7. Eksport i obsługa danych
<ol>
	<li>Wyodrębnij i przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
	<li>Zastosuj filtr przestrzenny o wymiarach 3 x 3 piksele, aby poprawić stosunek sygnału do szumu.</li>
	<li>Wyodrębnij ślady stanów nieustalonych Ca2+ (CaT) jako średnią z określonego, ręcznie wybranego obszaru zainteresowania (ROI).</li>
	<li>Zmierz parametry CaT w centralnym obszarze zainteresowania (ROI) o wymiarach 50 x 50 pikseli (≈ 25 mm2).</li>
	<li>Dla każdego CaT przeanalizuj amplitudę CaT, czas narastania (szczyt t), czas maksymalnego nachylenia zaniku (maksymalne nachylenie zaniku) i czas do 90% przejściowego zaniku (czas zaniku90).</li>
</ol>
8. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Ocenić normalność rozkładu za pomocą odpowiedniego testu statystycznego, takiego jak test normalności, w celu określenia, czy należy zastosować metody parametryczne czy nieparametryczne.</li>
	<li>Oceń istotność statystyczną między dwoma warunkami za pomocą testu t-Studenta lub testu U-Manna-Whitneya odpowiednio dla danych ciągłych lub kategorycznych. Porównując więcej niż dwie grupy, należy zastosować jednoczynnikową ANOVA lub test Kruskala-Wallisa w zależności od założeń danych, a następnie odpowiednie testy post-hoc w celu zidentyfikowania istotnych różnic parami.</li>
</ol>

<ol><li>Di Maria, F., Lodola, F., Zucchetti, E., Benfenati, F., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+artificial+light+actuators+in+living+systems%3A+from+planar+to+nanostructured+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The evolution of artificial light actuators in living systems: from planar to nanostructured interfaces.</a> Chem Soc Rev. 47 (13), 4757-4780 (2018).</li>
<li>Manfredi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+plasma+membrane+photostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Mater%22%5BJournal%5D)">The physics of plasma membrane photostimulation.</a> APL Mater. 9 (3), 030901(2021).</li>
<li>Bareket-Keren, L., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+interfaces+for+light+directed+neuronal+stimulation%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges.</a> Int J Nanomed. 9 Suppl 1 (Suppl 1), 65-83 (2014).</li>
<li>Ford, S. M., Watanabe, M., Jenkins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+optical+pacing+with+infrared+light%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A review of optical pacing with infrared light.</a> J. Neural Eng. 15 (1), 011001(2018).</li>
<li>Antognazza, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Shedding light on living cells.</a> Adv Mater. 27 (46), 7662-7669 (2015).</li>
<li>Zhang, J., Wang, J., Tian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+orders+from+light%3A+progress+in+photochromic+bio-materials%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Horiz%22%5BJournal%5D)">Taking orders from light: progress in photochromic bio-materials.</a> Mater Horiz. 1 (2), 169-184 (2014).</li>
<li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetics.</a> Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li>
<li>Ambrosi, C. M., Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics%27+promise%3A+pacing+and+cardioversion+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetics' promise: pacing and cardioversion by light.</a> Future Cardiol. 10 (1), 1-4 (2014).</li>
<li>Hopkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactive+organic+substrates+for+cell+stimulation%3A+Progress+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater+Technol%22%5BJournal%5D)">Photoactive organic substrates for cell stimulation: Progress and perspectives.</a> Adv Mater Technol. 4 (5), 1800744(2019).</li>
<li>Vurro, V., Venturino, I., Lanzani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+the+use+of+light+as+a+driving+element+for+bio-hybrid+actuation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">A perspective on the use of light as a driving element for bio-hybrid actuation.</a> Appl Phys Lett. 120 (8), 080502(2022).</li>
<li>Bruno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+and+label-free+stimulation+of+action+potentials+in+neurons+and+cardiomyocytes+by+plasmonic+porous+metamaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">All-optical and label-free stimulation of action potentials in neurons and cardiomyocytes by plasmonic porous metamaterials.</a> Adv Sci. 8 (21), 2100627(2021).</li>
<li>Ronchi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+optical+modulation+of+pluripotent+stem+cells+derived+cardiomyocytes+function+in+the+red+spectral+range%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Nongenetic optical modulation of pluripotent stem cells derived cardiomyocytes function in the red spectral range.</a> Adv Sci. 11 (3), 2304303(2023).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+silicon+for+high+spatiotemporal+translational+photostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Monolithic silicon for high spatiotemporal translational photostimulation.</a> Nature. 626 (8001), 990-998 (2024).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nat Protoc. 14 (5), 1339-1376 (2019).</li>
<li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li>
<li>DiFrancesco, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+firing+modulation+by+a+membrane-targeted+photoswitch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Neuronal firing modulation by a membrane-targeted photoswitch.</a> Nat Nanotechnol. 15 (4), 296-306 (2020).</li>
<li>Paternò, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+environment+enables+ultrafast+isomerization+of+amphiphilic+azobenzene%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane environment enables ultrafast isomerization of amphiphilic azobenzene.</a> Adv Sci. 7 (8), 1903241(2020).</li>
<li>Vurro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+design+of+amphiphilic+plasma+membrane-targeted+azobenzenes+for+nongenetic+optical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mater%22%5BJournal%5D)">Molecular design of amphiphilic plasma membrane-targeted azobenzenes for nongenetic optical stimulation.</a> Front Mater. 7, 631567(2021).</li>
<li>Vurro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+modulation+of+excitation-contraction+coupling+in+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Optical modulation of excitation-contraction coupling in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> iScience. 26 (3), 106121(2023).</li>
<li>Vurro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-triggered+cardiac+microphysiological+model%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Light-triggered cardiac microphysiological model.</a> APL Bioeng. 7 (2), 026108(2023).</li>
<li>Florindi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+stretch-activated+channels+in+light-generated+action+potentials+mediated+by+an+intramembrane+molecular+photoswitch%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of stretch-activated channels in light-generated action potentials mediated by an intramembrane molecular photoswitch.</a> J. Transl. Med. 22 (1), 1068(2024).</li>
<li>McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolded+gelatin+hydrogels+for+extended+culture+of+engineered+cardiac+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues.</a> Biomaterials. 35 (21), 5462-5471 (2014).</li>
<li>Park, S. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+pathogenesis+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+from+engineered+human+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Insights into the pathogenesis of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia from engineered human heart tissue.</a> Circulation. 140 (5), 390-404 (2019).</li>
<li>Lee, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autonomously+swimming+biohybrid+fish+designed+with+human+cardiac+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An autonomously swimming biohybrid fish designed with human cardiac biophysics.</a> Science. 375 (6581), 639-647 (2022).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Prondzynski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+reproducible+generation+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+and+cardiac+organoids+in+stirred+suspension+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems.</a> Nat Commun. 15 (1), 5929(2024).</li>
<li>Pasqualini, F. S., Sheehy, S. P., Agarwal, A., Aratyn-Schaus, Y., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+phenotyping+of+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Structural phenotyping of stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Rep. 4 (3), 340-347 (2015).</li>
<li>Fonck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+elastin+functionality+in+human+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries.</a> Stroke. 40 (7), 2552-2556 (2009).</li>
</ol>

CB, GL i FL są wynalazcami patentu "ZWIĄZKI FOTOCHROMOWE" nr 1. PE 3802491 (02/07/2020).

Podejście to stanowi solidną platformę do rozwoju badań nad sercem, dostarczając wglądu w złożoną dynamikę tkanki serca, otwierając nowe możliwości długoterminowych badań mechanistycznych serca in vitro , które mogą potencjalnie prowadzić do nowych strategii terapeutycznych. Aby zapewnić powodzenie tej metodologii, kluczowe jest odtworzenie środowiska mikrofizjologicznego, które ściśle naśladuje warunki panujące in vivo w ludzkim sercu. Dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na zaprojektowanie i wyrówn...

Wykorzystanie światła do stymulacji żywych komórek i tkanek staje się znaczącym przełomem w badaniach biomedycznych, oferując możliwości stymulacji bezdotykowej z precyzyjną rozdzielczością czasową i przestrzenną1,2,3,4,5,6. Jedną z wiodących technik stosowanych do uwrażliwiania komórek na światło jest optogenetyka, która polega na genetycznej modyfikacji komórek w celu ekspresji wrażliwych na światło kanałów jonowych lub pomp7,8. Podejście to wykazało imponującą skuteczność w regulacji komórek w żywej tkance; Jednak jego zależność od transferu genów wirusa utrudniła jego powszechne zastosowanie w badaniach i zastosowaniach klinicznych.
Aby przezwyciężyć to ograniczenie, materiały organiczne i nieorganiczne zostały użyte jako światłoczułe przetworniki do opracowania niegenetycznych, opartych na materiale technik stymulacji światłem za pośrednictwem światła9,10. Organiczne nanostrukturalne fotoprzetworniki11,12,13,14,15 wykazały ostatnio niezwykłe sukcesy w wywoływaniu odpowiedzi komórkowych w różnych zastosowaniach, w tym w neuronach, kardiomiocytach i komórkach mięśni szkieletowych.
Niniejszym proponujemy Ziapin216,17,18, pochodną azobenzenu, do badania propagacji Ca2+ w zmodyfikowanych laminarnych tkankach serca. Amfifilowa struktura cząsteczki pozwala na precyzyjne celowanie w błonę plazmatyczną komórki, podczas gdy rdzeń azobenzenu umożliwia izomeryzację indukowaną światłem, prowadząc do jej zmiany konformacyjnej16,17,18. W komórkach serca ta izomeryzacja trans-to-cis zmienia grubość błony plazmatycznej, indukując kaskadę efektów, które generują potencjał czynnościowy, który z kolei uruchamia proces wzbudzenia-skurczu19,20,21.
Dodatkowo, opisujemy proces wytwarzania platformy inżynieryjnej do anizotropowego wzrostu tkanki sercowej22 i szczegółowo opisujemy eksperymentalną konfigurację używaną do optycznego wyzwalania i monitorowania jej aktywności, ze szczególnym naciskiem na uzyskanie dynamiki Ca2+ w tkance23,24. Na koniec porównujemy pozyskane sygnały z tymi uzyskanymi za pomocą stymulacji elektrycznej, która jest uważana za wzorzec odniesienia. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten podkreśla zastosowanie nowatorskiego przetwornika reagującego na światło w pogłębianiu naszej wiedzy na temat zachowania komórek serca, zwłaszcza w kontekście tkanek inżynieryjnych.

<table><tbody><tr><td>alamarBlue Odczynnik do żywotności komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>DAL1025</td><td>Test żywotności komórek</td></tr><tr><td>Suplement B-27, bez insuliny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9056-50G</td><td>Do barwienia komórek</td></tr><tr><td>Oprogramowanie BrainVision Analyzer&nbsp;</td><td>Produkty mózgowe</td><td>https://www.brainproducts.com/downloads/analyzer/</td> <td>Eksport i obsługa danych</td></tr><tr><td>BTS</td><td>Sigma</td><td>203895-5MG</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72054</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysty arkusz akrylowy odporny na zarysowania i promieniowanie UV, 12 "x 12" x 0,01 cala</td><td>McMaster Carr</td><td>4076N11</td><td>Produkcja chipów tkankowych</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II&nbsp;</td><td>Worthington</td><td>CLS-2 / LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DNase II</td><td>VWR</td><td>89346-540</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Średni&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>VWR</td><td>47743-654</td><td>Powłoka</td></tr><tr><td>Żelatyna z żelu do skóry świń o wytrzymałości 175 Typ A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625-100G</td><td>Produkcja chipów tkankowych</td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free, zakwalifikowany przez hESC, o obniżonym współczynniku wzrostu Matryca membrany podstawnej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td>Coating</td></tr><tr><td>HBSS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>H1399</td><td>Do barwienia komórek</td></tr><tr><td>Roztwór insuliny ludzkiej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>IWR-1-endo</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72564</td><td></td></tr><tr><td>Paraformadehyd 16% roztwór wodny (PFA)</td><td>VWR</td><td>100503-917</td><td>Do barwienia komórek</td></tr><tr><td>PBS, sterylny, 500 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>Produkcja chipów tkankowych</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (20% roztwór w DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>Inhibitor ROCK Y-27632</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870127</td><td>Do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11835030</td><td>Mapowanie optyczne</td></tr><tr><td>Roztwór Versene</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td>czynnik chelatujący</td></tr><tr><td>VWR Uniwersalna taśma do etykietowania laboratoryjnego VWR</td><td>VWR</td><td>89098-058</td><td>Produkcja chipów tkankowych</td></tr><tr><td>X-Rhod-1 AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>X14210</td><td>Mapowanie optyczne</td></tr></tbody></table>

mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjica2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

A Cardiac Microphysiological System for Studying Ca2+ Propagation via Non-genetic Optical Stimulation

Modele mikrofizjologiczne serca in vitro są wysoce wiarygodne dla badań naukowych, rozwoju leków i zastosowań medycznych. Chociaż systemy te są powszechnie akceptowane przez społeczność naukową, ich żywotność jest nadal ograniczona ze względu na brak nieinwazyjnych technik stymulacji. Fotoprzetworniki zapewniają wydajną metodę stymulacji, oferując bezprzewodowe podejście o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej przy jednoczesnej minimalizacji inwazyjności w procesach stymulacji. W niniejszej pracy przedstawiono w pełni optyczną metodę stymulacji i wykrywania aktywności modelu mikrofizjologicznego serca in vitro. W szczególności wytworzyliśmy zmodyfikowane laminarne tkanki anizotropowe poprzez wysiewanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) generowanych w hodowli zawiesinowej bioreaktora 3D. Użyliśmy fotoprzetwornika, amfifilowej pochodnej azobenzenu o nazwie Ziapin2, do stymulacji oraz barwnika Ca2+ (X-Rhod 1) do monitorowania odpowiedzi systemu. Wyniki pokazują, że Ziapin2 może fotomodulować odpowiedzi Ca2+ w zastosowanym systemie bez uszczerbku dla integralności tkanki, żywotności lub zachowania. Co więcej, wykazaliśmy, że podejście oparte na stymulacji światłem oferuje podobną rozdzielczość w porównaniu ze stymulacją elektryczną, która jest obecnie złotym standardem. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten otwiera obiecujące perspektywy dla zastosowania Ziapin2 i fotostymulacji opartej na materiale w badaniach kardiologicznych.

Opracowano i wdrożono wieloetapowy proces wytwarzania inżynieryjnej laminarniej tkanki serca, wykorzystując kombinację technik wzorowania laserowego, formowania z żelatyny oraz zasiewu komórek. Metoda ta, pierwotnie opracowana przez McCain i wsp.22 oraz Lee i wsp.24, została ponownie zaimplementowana zgodnie z ich protokołami w celu stworzenia inżynieryjnych laminarnych mikrotykanek. Proces ten integruje precyzyjne wzorowanie laserowe służące do prowadzenia strukturalnego, ...

Użycie światła do kontrolowania komórek i tkanek serca umożliwia bezkontaktową stymulację, zachowując w ten sposób naturalny stan i funkcję komórek, co czyni ją wartościowym podejściem zarówno do badań podstawowych, jak i zastosowań terapeutycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacjiCa2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

In vitro cardiac microphysiological models are highly reliable for scientific research, drug development, and medical applications. Although widely ...

Badania mają na celu udoskonalenie modeli mikrofizjologicznych serca in vitro poprzez integrację metod fotostymulacji opartych na materiale. Koncentruje się na pokonywaniu ograniczeń w długowieczności i inwazyjności stymulacji, dostarczając niezawodnych narzędzi do badania fizjologii serca, ulepszając procesy badań przesiewowych leków i wspierając zastosowania w modelowaniu chorób. Ostatnie postępy w biostymulacji wykorzystują, na przykład do precyzyjnej, nieinwazyjnej kontroli komórkowej.Optogenetyka umożliwia modyfikację genetyczną w celu regulacji aktywności komórkowej, podczas gdy pojawiające się fotoprzetworniki oparte na materiale oferują alternatywy niegenetyczne. Ta innowacja stanowi znaczący przełom w badaniu i modulowaniu neuronów, kardiomiocytów i komórek mięśni szkieletowych w różnych zastosowaniach. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują osiągnięcie spójnego dostarczania światła do tkanek głębokich, optymalizację biokompatybilności i stabilności fotoprzetworników oraz poprawę precyzji technik stymulacji opartej na świetle.Ponadto kluczową przeszkodą pozostaje integracja tych metod ze złożonymi systemami biologicznymi przy jednoczesnym zachowaniu żywotności i funkcjon

a-cardiac-microphysiological-system-for-studying-ca2-propagation-via

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Ten protokół opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków myszy za pomocą optycznego systemu mapowania o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, w tym podwójne zapisy napięcia membranowego i Ca2+ przejściowego pod zaprogramowaną stymulacją przez specjalistyczny cewnik elektrodowy.

Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości

Przedstawiamy protokół oceny elektromechanicznych efektów aktywacji GtACR1 w kardiomiocytach królików. Dostarczamy szczegółowych informacji na temat izolacji komórek, hodowli i transdukcji adenowirusa oraz na temat eksperymentów funkcjonalnych z użyciem technik patch-clamp i włókna węglowego.

Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Ten protokół opisuje użycie nanoprzewodów krzemowych do wewnątrzkomórkowej optycznej biomodulacji komórki w prosty i łatwy do wykonania sposób. Technika ta jest wysoce elastyczna i może być stosowana zarówno do zastosowań in vitro, jak i in vivo.

Nanodruty krzemowe i stymulacja optyczna do badań wewnątrz- i międzykomórkowego sprzężenia elektrycznego

Ta praca opisuje metodę kontrolowania rytmu serca nienaruszonych mysich serc transgenicznych myszy z rodopsyną kanałową-2 (ChR2) za pomocą lokalnej fotostymulacji za pomocą mikro-LED i jednoczesnego optycznego mapowania potencjału błony nasierdziowej.

Zaawansowane zarządzanie rytmem serca poprzez zastosowanie optogenetycznej fotostymulacji wieloośrodkowej w mysich sercach

Prezentujemy metodę elastycznej chemicznej i multimodalnej stymulacji oraz rejestrowania jednoczesnej aktywności neuronalnej wielu robaków Caenorhabditis elegans. Metoda ta wykorzystuje mikrofluidykę, sprzęt i oprogramowanie typu open source oraz nadzorowaną automatyczną analizę danych, aby umożliwić pomiar zjawisk neuronalnych, takich jak adaptacja, hamowanie czasowe i przesłuchy bodźców.

Zautomatyzowana stymulacja multimodalna i jednoczesna rejestracja neuronów z wielu małych organizmów

Protokół ten przedstawia zaawansowane metody wytwarzania materiałów i ex vivo badania serca szczurów do optycznego i elektrycznego dwukierunkowego biointerfejsu, umożliwiając precyzyjną stymulację serca, rejestrację i modelowanie zawału na potrzeby badań bioelektronicznych.

Dwukierunkowe interfejsy elektryczne i optoelektroniczne w zdrowych i niedokrwionych sercach szczurów ex vivo

Poznaj niegenetyczną fotostymulację w mikrofizjologicznym systemie serca przy użyciu fototransduktorów materiałowych. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę aktywności komórek serca bez modyfikacji genetycznych.

Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacji^Ca2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Przeglądaj więcej filmów