Mikrofizjologiczny system serca do badania propagacji^Ca2+ za pomocą niegenetycznej stymulacji optycznej

Badania mają na celu udoskonalenie modeli mikrofizjologicznych serca in vitro poprzez integrację metod fotostymulacji opartych na materiale. Koncentruje się na pokonywaniu ograniczeń w długowieczności i inwazyjności stymulacji, dostarczając niezawodnych narzędzi do badania fizjologii serca, ulepszając procesy badań przesiewowych leków i wspierając zastosowania w modelowaniu chorób. Ostatnie postępy w biostymulacji wykorzystują, na przykład do precyzyjnej, nieinwazyjnej kontroli komórkowej.

Optogenetyka umożliwia modyfikację genetyczną w celu regulacji aktywności komórkowej, podczas gdy pojawiające się fotoprzetworniki oparte na materiale oferują alternatywy niegenetyczne. Ta innowacja stanowi znaczący przełom w badaniu i modulowaniu neuronów, kardiomiocytów i komórek mięśni szkieletowych w różnych zastosowaniach. Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują osiągnięcie spójnego dostarczania światła do tkanek głębokich, optymalizację biokompatybilności i stabilności fotoprzetworników oraz poprawę precyzji technik stymulacji opartej na świetle.

Ponadto kluczową przeszkodą pozostaje integracja tych metod ze złożonymi systemami biologicznymi przy jednoczesnym zachowaniu żywotności i funkcjonalności komórek. Protokół ten wypełnia lukę badawczą związaną z potrzebą nieinwazyjnych technik precyzyjnej stymulacji w modelach mikrofizjologicznych serca. Dzięki zastosowaniu fotoprzetworników opartych na materiale, takich jak Ziapin2, podejście to pozwala przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnej stymulacji elektrycznej i optogenetyki, oferując lepszy kontur czasowy i przestrzenny przy jednoczesnym zachowaniu żywotności i funkcji tkanek.

Moje odkrycia przyczynią się do postępu badań poprzez wprowadzenie nieinwazyjnej, opartej na materiale techniki stymulacji światłem, która zapewnia większą precyzję i kontrolę nad aktywnością komórkową w tkankach serca. Takie podejście eliminuje potrzebę modyfikacji genetycznych, zapewniając wszechstronne narzędzie do modelowania funkcji serca, badania mechanizmów chorobowych i opracowywania skuteczniejszych strategii terapeutycznych. Na początek przyklej dwie warstwy taśmy laboratoryjnej, jedną białą i jedną niebieską, do przezroczystego, odpornego na zarysowania i promieniowanie ultrafioletowe arkusza akrylowego o grubości jednego milimetra.

Wytnij wzór wióra na taśmie zgodnie z zamierzonym projektem, a następnie za pomocą grawera laserowego na dwutlenek węgla pokrój arkusz akrylowy w koła. Usuń dwie warstwy taśmy wewnątrz najbardziej wewnętrznej linii za pomocą pęsety. Namocz frytki w czystym wybielaczu przez 30 minut do jednej godziny, aby usunąć grube linie i ciemne plamy z cięcia, pozostawiając ostrą linię, i opłucz frytki w zlewce pod bieżącą wodą dejonizowaną przez noc lub przez co najmniej trzy godziny.

Sonikować wióry przez 10 minut w stemplach polidimetylosiloksanu lub PDMS, z rowkami liniowymi przez 30 minut w czystym 70% etanolu. Przenieś wióry i stemple do czystego miejsca pod maską i pozwól im wyschnąć pod przepływem powietrza przez około jedną do dwóch godzin. Następnie poddaj świeżo przygotowaną żelatynę sonikacji przez 15 minut, a następnie włóż ją z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 65 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do użycia.

Umieść mikrobiologiczną transglutaminazę lub probówkę MTG w eksykatorze z lekko poluzowaną nakrętką i powoli włącz próżnię, aby usunąć pęcherzyki. Po odgazowaniu włóż rurkę MTG z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przykryj arkusz siatki czystym Parafilmem i umieść wióry na siatce.

Trzymaj stempel PDMS w pobliżu do użytku. Dodaj pięć mililitrów MTG do pięciu mililitrów roztworu żelatyny, ostrożnie pipetując, aby uniknąć pęcherzyków. Teraz szybko nałóż około 0,5 mililitra mieszaniny żelatyny na każdy chips, upewniając się, że mieszanina pokrywa obszar wióra.

Umieść stempel PDMS z wzorem linii na wierzchu i nałóż ciężarek o wadze 200 gramów, aby upewnić się, że żelatyna jest ułożona równolegle do osi podłużnej tkanki. Gdy wszystkie wióry zostaną uformowane, przykryj je szklanym słoikiem, aby uniknąć zakłóceń środowiskowych i pozwól im usieciować się przez noc. Przenieś chip i stempel PDMS umieszczony w umieszczeniu na nowej naczyniu P150 wypełnionej PBS, aby uwodnić żelatynę przez 30 minut do jednej godziny, aby ułatwić oddzielenie stempla PDMS od chipa.

Po usunięciu nadmiaru żelatyny z formy wokół chipa, przenieś czysty wiór do nowego naczynia P150 wypełnionego PBS. Przechowuj znaczki PDMS w 70% etanolu. Aby wysterylizować frytki, namocz je w etanolu na 10 minut pod maską.

Przenieś frytki do PBS, moczyć je przez 10 minut, a następnie trzykrotnie umyj PBS. W przypadku roztworów powlekających należy zmieszać 20 mikrogramów na mililitr fibronektyny z rozcieńczeniem Geltrex od 1 do 100 w pożywkach hodowlanych bez suplementu. Posmaruj frytki tym roztworem przez dwie godziny w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Rozmrozić i wysiać indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych w pożywce RPMI zawierającej 10 mikromolowców Y-27632. Po 24 godzinach wymień pożywkę na RPMI pozbawioną Y-27632. Trzy dni po wysianiu komórek użyj pęsety, aby ostrożnie usunąć białą taśmę z wiórów.

Przygotować aparaturę do mapowania optycznego składającą się ze zmodyfikowanego mikroskopu z soczewkami tandemowymi wyposażonego w szybką kamerę i 200-miliwatową lampę rtęciową jako źródło światła wzbudzającego. Umieść lustro dichroiczne przed wyznaczoną kamerą do obrazowania wapnia. W przypadku stymulacji optycznej zastosuj optyczną stymulację punktową na jednym końcu tkanki za pomocą źródła światła LED, aby stymulować Ziapin2, fotoprzetwornik.

Utrzymuj tempo tkanek z częstotliwością 0,5 lub jednego herca za pomocą czasowo regulowanego światłowodu umieszczonego w odległości jednego milimetra od tkanki. Inkubować próbkę z dwoma mikromolowymi X-Rhod-1 dodanymi do pożywki przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po umyciu wiórów świeżą pożywką hodowlaną przenieś je do pożywki RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej, uzupełnionej witaminą B-27 minus insulina i HEPES.

Umieść chipy tkanek w naczyniu o kontrolowanej temperaturze ustawionej na temperaturę fizjologiczną i rozpocznij nagrywanie z szybkością 2,5 klatki na sekundę. Udało się zobrazować propagację fal wapniowych, z wyraźną rozdzielczością przestrzenną i czasową podczas fotostymulacji na częstotliwościach 0,5 lub 1 herca, przy prędkościach przewodzenia obliczonych na około 4,5 centymetra na sekundę, zgodnych z wartościami fizjologicznymi. Parametry przejściowe wapnia, w tym amplituda, czas narastania, maksymalny zanik, nachylenie i czas zaniku, były ilościowo podobne między stymulacją światłem a stymulacją elektryczną, potwierdzając porównywalne odpowiedzi funkcjonalne.