Name: Identyfikacja inhibitorów PD-1/PD-L1 za pomocą technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji inhibitorów PD-1/PD-L1 przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Technologia SPR umożliwia szybkie badanie interakcji białkowych w immunoterapii przeciwnowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy doceniają główny obiekt RI-INBRE na Uniwersytecie Rhode Island, wspierany przez Grant P20GM103430 z National Center for Research Resources (NCRR), składnika National Institutes of Health (NIH). Badania te były wspierane przez Pilot Grant Award z College of Pharmacy na University of Rhode Island, Small Grant Award z Rhode Island Life Science Hub (RILSH) oraz grant Rhode Island Foundation, wszystkie przyznane dr Chang Liu.

Odczynniki i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Unieruchomienie białka streptawidyny (SA) na chipie CM5
<ol>
	<li>Ustaw metodę immobilizacji w instrumencie SPR: Otwórz/nowy szablon kreatora, wybierz unieruchomienie, ustaw typ chipa na CM5 i przepływaj komórki na cykl na 1. Sprawdzić unieruchomioną komorę przepływową 1 i komorę przepływową 2.
	<ol>
		<li>Ustaw aminę jako metodę unieruchomienia. Ustaw cel dla poziomu unieruchomionego, stężenie ligandów: 40 μg/ml streptawidyny, poziom docelowy: 2000 RU, roztwór do mycia: 50 mM NaOH. Następnie sprawdź prime przed uruchomieniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj następujące probówki: R2 B1 i R2 C1 - 40 μg/ml streptawidyny; R2 B2 i R2 C2: 50 mM NaOH; R2 B3 i R2 C3: EDC; R2 B4 i R2 C4: NHS; R2 B5 i R2 C5: Puste; R2 B6 i R2 C6: Etanoloamina. 
	UWAGA: EDC i NHS aktywują grupy karboksylowe na chipie CM5, umożliwiając kowalencyjne sprzężenie z aminami na ligandzie. Etanoloamina jest stosowana jako bufor blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu podczas unieruchomienia.</li>
	<li>Rozcieńczyć 20 ml buforu HBS-EP+ 10× w 180 ml wody dejonizowanej (DI), aby przygotować 200 ml 1× roztworu buforowego HBS-EP+.</li>
	<li>Dodać 1 ml wody wolnej od DNaz do 1 mg streptawidyny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie rozcieńczyć roztwór streptawidyny do 40 μg/ml w buforze octanowym (pH 4,5). Przygotuj odczynniki z zestawu odczynników do sprzęgania aminowego zgodnie z instrukcjami producenta i umieść wszystkie odpowiednie układy odczynników, jak wskazano w kroku 1.2.</li>
	<li>Wymień chip czujnika konserwacji na chip CM5, a następnie umieść rurkę A w przygotowanym buforze 1× HBS-EP+, ponownie otwórz metodę immobilizacji i włóż rurki zgodnie z układem kroku 1.2. Uruchom metodę i zapisz plik wyników.</li>
	<li>Konserwacja po uruchomieniu: wymień chip CM5 na chip czujnika konserwacji, umieść rurkę A w butelce wypełnionej wodą dejonizowaną i uruchom prime. Po wyjęciu chipa CM5 umyj go kilkoma kroplami wody DI i wysusz na powietrzu. Umieścić chip w probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Unieruchomiony układ SA umożliwia chipowi CM5 działanie jako układ SA.</li>
</ol>
2. Immobilizacja białka PD-1 na chipie SA
<ol>
	<li>Ustaw metodę unieruchomienia w instrumencie SPR: Otwórz/nowy szablon kreatora, wybierz immobilizację, ustaw typ chipa na SA i przepływaj komórki na cykl na 1. Sprawdź unieruchomioną komórkę przepływu 1 i komórkę 2.
	<ol>
		<li>Ustaw wychwytywanie biotyny SA jako metodę. W przypadku ślepej immobilizacji w komórce 1, w przypadku komórki 2 należy dążyć do unieruchomionego poziomu, 10 μg/ml PD-1 jako liganda, poziom docelowy: 4000 RU, a następnie sprawdź prime przed uruchomieniem. 
		UWAGA: Przygotuj następujące probówki - R2 B1 i R2 C1: 1 M NaCl, 50 mM NaOH; R2 B2 i R2 C2: 50% izopropanolu/50 mM NaOH/1 m NaCl; R2 C3: 10 μg/ml PD-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuścić 58,44 mg NaCl w 1 ml 50 mM NaOH w celu przygotowania 1 M NaCl i 50 mM roztworu NaOH. Rozpuścić 58,44 mg NaCl i 4,0 mg NaOH w 500 μl wody, a następnie dodać 500 μl izopropanolu, aby przygotować 50% roztwór izopropanolu/50 mM NaOH/1 M NaCl.</li>
	<li>Przygotuj roztwór PD-1: Dodaj 200 μl wody wolnej od DNaz do 100 μg Biotynylowanego ludzkiego PD-1 (Fc i Avitagged) i stabilizuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie rozcieńcz do 10 μg/ml w buforze octanowym (pH 5,0).</li>
	<li>Umieść wszystkie układy odczynników zgodnie z opisem w kroku 2.1. Umieść probówkę A w 1× roztworze buforowym HBS-EP+, a następnie wysuń chip czujnika konserwacji i włóż chip SA (chip CM5 pokryty białkiem streptawidyny z kroku 1). Ponownie otwórz metodę unieruchomienia, włóż stojak na odczynniki 2 i sprawdź pozycje, a następnie uruchom metodę dla szacowanego czasu działania.</li>
	<li>Powtórz krok 1.6.</li>
</ol>
3. Zwiad regeneracyjny dla PD-1 i PD-L1
<ol>
	<li>Ustaw metodę rozpoznania regeneracji: Otwórz/nowy szablon kreatora, wybierz Regeneration Scouting, ustaw ścieżkę przepływu: 2-1, 4-3, typ chipa na SA, sprawdź cykl kondycjonowania przebiegu, zapisz roztwór jako HBS-EP+, czas kontaktu jako 30 s, liczba wstrzyknięć jako 3, roztwór jako PD-L1, czas kontaktu: 30 s, natężenie przepływu: 30 μL/min.
	<ol>
		<li>Dla parametrów regeneracji natężenie przepływu wynosi 30 μL/min, a okres stabilizacji wynosi 300 s. W projekcie eksperymentalnym ustaw liczbę warunków na 4, a liczbę cykli dla każdego warunku na 2. Ustaw warunki jako 4, roztwór regeneracyjny: Glicyna 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, czas kontaktu: 30 s, a następnie sprawdź zalanie przed uruchomieniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić każde stężenie PD-L1 jako oddzielną pozycję dołka próbki w układzie 96-dołkowym mikropłytki: R1 A1 do R1 A9: 1 μM PD-L1; R1 A10 do R1 A12: bufor HBS-EP+; R1 B1: Glicyna 1,5; R1 B2: Glicyna 2; R1 B3: Glicyna 2,5; R1 B4: Glicyna 3, 
	UWAGA: Jako bufor regeneracyjny stosuje się bufor glicynowy o różnym pH.</li>
	<li>Przygotuj roztwór PD-L1: Dodaj 200 μl wody wolnej od DNaz do 100 μg ludzkiego białka PD-L1 Fc Tag (9,42 μM), a następnie rozcieńcz do 1 μM w buforze HBS-EP+.</li>
	<li>Umieść wszystkie odpowiednie odczynniki w układzie zgodnie z opisem w kroku 3.2. Umieść rurkę A w buforze 1× HBS-EP+, a następnie wymień układ czujnika konserwacji na układ SA. Ponownie otwórz metodę Regeneration Scouting, postępuj zgodnie z pozycją probówki z kroku 3.2, włóż stojak na odczynniki, a następnie uruchom metodę dla szacowanego czasu działania.</li>
	<li>Powtórz krok 1.6.</li>
</ol>
4. Walidacja interakcji PD-1/PD-L1
UWAGA: Dla walidacji, poprzednio opublikowany raport18 został uzupełniony niewielkimi poprawkami.
<ol>
	<li>Użyj tych samych parametrów, co w opublikowanym raporcie, w obszarze Ustawienia ogólne, Etapy oznaczania i Typy cykli, ustaw czas kontaktu na 60 s, czas dysocjacji na 60 s, a natężenie przepływu na 30 μl/min. W obszarze zmiennych metody, zmiennych oceny i poleceń użyj tego samego ustawienia, z wyjątkiem użycia glicyny 2.0 jako regeneracji, ustaw natężenie przepływu na 30 μl/min, przechodzi przez ścieżkę przepływu 1, 2, 3, 4.
	<ol>
		<li>Następnie skonfiguruj run i wybierz ścieżkę przepływu: 2-1, 4-3. Wprowadź PD-L1 o stężeniach od 0 μM, 0,037 μM, 0,111 μM, 0,333 μM i masie cząsteczkowej 51 300 Da. Sprawdź wszystkie kroki testu w celu weryfikacji i wybierz prime przed uruchomieniem.</li>
		<li>Następnie ustaw każde stężenie PD-L1 jako oddzielną pozycję dołka na próbkę w układzie Reagent Rack 2: R2 B1: PD-L1 0 μM; R2 B2: PD-L1 0,037 μM; R2 B3: PD-L1 0,111 μM; R2 B4: PD-L1 0,333 μM; R2 A1: Glicyna 2.0 jako bufor regeneracyjny; R2 A2: HBS-EP+ jako bufor startowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 200 ml 1× roztworu buforowego HBS-EP+. Przygotować stężenia PD-L1: rozcieńczyć białko PD-L1 w proporcjach 9,42 μM do 0,333 μM, 0,111 μM i 0,037 μM w HBS-EP+. Następnie umieść wszystkie odpowiednie odczynniki w układzie zgodnie z opisem w kroku 4.1.2.
	<ol>
		<li>Włóż rurkę A do 1× roztworu buforowego HBS-EP+, wysuń układ czujnika konserwacji i włóż chip SA. Ponownie otwórz metodę zwiadowczą regeneracji, postępuj zgodnie z położeniem probówki z kroku 4.1, włóż stojak na odczynniki 2 i uruchom metodę przez szacowany czas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz krok 1.6.</li>
</ol>
5. Test blokady PD-1/PD-L1 z inhibitorem małych cząsteczek: BMS-1166
UWAGA: Dla testu blokady, poprzednio opublikowany raport18 został zastosowany z niewielkimi poprawkami.
<ol>
	<li>Użyj tych samych parametrów, co w opublikowanym raporcie, w obszarze Ustawienia ogólne, Etapy oznaczania i Typy cykli, ustaw czas kontaktu na 60 s, czas dysocjacji na 60 s, a natężenie przepływu na 30 μl/min. W ramach zmiennych metody, zmiennych oceny i poleceń również używa tego samego ustawienia, z wyjątkiem użycia glicyny 2.0 jako regeneracji, ustawienie natężenia przepływu na 30 μl/min, przechodzi przez ścieżkę przepływu 1, 2, 3, 4.
	<ol>
		<li>Następnie skonfiguruj run i wybierz ścieżkę przepływu: 2-1, 4-3. Wprowadzić roztwór próbki: PD-L1 (0,111 μM, masa cząsteczkowa 51 300 Da) z BMS-1166 przy 0 μM, 0,125 μM, 0,625 μM, 3,125 μM. Sprawdź wszystkie etapy testu w celu weryfikacji i wybierz prime przed przebiegiem.</li>
		<li>Następnie ustaw każde stężenie PD-L1 jako oddzielną pozycję studzienki na próbkę w układzie Reagent Rack 2: R2 B1: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0 μM R2 B2: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,125 μM; R2 B3: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,625 μM; R2 B4: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 3,125 μM; R2 A1: Glicyna 2.0 do regeneracji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 200 ml 1× roztworu buforowego HBS-EP+. Przygotować mieszaninę BMS-1166/PD-L1: Rozpuścić 5 mg BMS-1166 w 77,99 μl dimetylosulfotlenku (DMSO), aby przygotować 100 mM roztwór podstawowy. Rozcieńczyć roztwór podstawowy białkiem PD-L1 (0,11 μM) do docelowych stężeń BMS-1166 przy 0 μM, 0,125 μM, 0,625 μM i 3,125 μM w HBS-EP+. Umieść wszystkie odpowiednie układy odczynników zgodnie z opisem w kroku 5.1.2.
	<ol>
		<li>Umieść rurkę A w 1× roztworze buforowym HBS-EP+, a następnie wysuń chip czujnika konserwacji i włóż chip SA. Ponownie otwórz metodę zwiadowczą regeneracji, postępuj zgodnie z pozycją probówki z 5.1 i włóż stojak na odczynniki 2, a następnie uruchom metodę dla szacowanego czasu działania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz krok 1.6.</li>
</ol>

<ol><li>Ribas, A., Wolchok, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+using+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy using checkpoint blockade.</a> Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analysis+of+the+costimulatory+receptor+programmed+death-1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analysis of the costimulatory receptor programmed death-1.</a> Immunity. 20 (3), 337-347 (2004).</li>
<li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> J Exp Med. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li>
<li>Han, Y., Liu, D., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1%2FPD-L1+pathway%3A+Current+researches+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">PD-1/PD-L1 pathway: Current researches in cancer.</a> Am J Cancer Res. 10 (3), 727-742 (2020).</li>
<li>Lyu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+PDL1%2FL2+by+different+induced-fit+mechanisms+of+PD1%3A+A+comparative+study+of+molecular+dynamics+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Recognition of PDL1/L2 by different induced-fit mechanisms of PD1: A comparative study of molecular dynamics simulations.</a> Phys Chem Chem Phys. 22 (3), 1276-1287 (2020).</li>
<li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+inflammatory+response+with+B7-H1+expression+in+human+melanocytic+lesions+supports+an+adaptive+resistance+mechanism+of+immune+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Trans+Med%22%5BJournal%5D)">Colocalization of inflammatory response with B7-H1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape.</a> Sci Trans Med. 4 (127), 127ra37(2012).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-related+adverse+events+associated+with+programmed+cell+death+protein-1+and+programmed+cell+death+ligand+1+inhibitors+for+non-small+cell+lung+cancer%3A+A+PRISMA+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immune-related adverse events associated with programmed cell death protein-1 and programmed cell death ligand 1 inhibitors for non-small cell lung cancer: A PRISMA systematic review and meta-analysis.</a> BMC Cancer. 19 (1), 558(2019).</li>
<li>Alkholifi, F. K., Alsaffar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dostarlimab+an+inhibitor+of+PD-1%2FPD-L1%3A+A+new+paradigm+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina%22%5BJournal%5D)">Dostarlimab an inhibitor of PD-1/PD-L1: A new paradigm for the treatment of cancer.</a> Medicina. 58 (11), 1572(2022).</li>
<li>Uzar, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+patent+review+on+PD-1%2FPD-L1+antagonists+%282022-present%29%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Pat%22%5BJournal%5D)">An updated patent review on PD-1/PD-L1 antagonists (2022-present).</a> Expert Opin Ther Pat. 34 (8), 627-650 (2024).</li>
<li>Ai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+status+and+outlook+of+PD-1%2FPD-L1+inhibitors+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">Research status and outlook of PD-1/PD-L1 inhibitors for cancer therapy.</a> Drug Des Devel Ther. 14, 3625-3649 (2020).</li>
<li>Conroy, M., Naidoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-related+adverse+events+and+the+balancing+act+of+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immune-related adverse events and the balancing act of immunotherapy.</a> Nat Commun. 13 (1), 392(2022).</li>
<li>Guzik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+Programmed+Cell+Death-1%2FProgrammed+Death-Ligand+1+%28PD-1%2FPD-L1%29+interaction+via+transiently+induced+protein+states+and+dimerization+of+PD-L1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the Programmed Cell Death-1/Programmed Death-Ligand 1 (PD-1/PD-L1) interaction via transiently induced protein states and dimerization of PD-L1.</a> J Med Chem. 60 (13), 5857-5867 (2017).</li>
<li>Sifniotis, V., Cruz, E., Eroglu, B., Kayser, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advancements+in+addressing+key+challenges+of+therapeutic+antibody+design%2C+manufacture%2C+and+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Antibodies%22%5BJournal%5D)">Current advancements in addressing key challenges of therapeutic antibody design, manufacture, and formulation.</a> Antibodies. 8 (2), 36(2019).</li>
<li>Beck, H., Härter, M., Haß, B., Schmeck, C., Baerfacker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+and+their+impact+in+drug+discovery%3A+A+perspective+on+the+occasion+of+the+125th+anniversary+of+the+Bayer+Chemical+Research+Laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Small molecules and their impact in drug discovery: A perspective on the occasion of the 125th anniversary of the Bayer Chemical Research Laboratory.</a> Drug Discov Today. 27 (6), 1560-1574 (2022).</li>
<li>Nguyen, H. H., Park, J., Kang, S., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance%3A+A+Versatile+technique+for+biosensor+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance: A Versatile technique for biosensor applications.</a> Sensors (Basel, Switzerland). 15 (5), 10481-10510 (2015).</li>
<li>Liu, C., Seeram, N. P., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibitors+against+PD-1%2FPD-L1+immune+checkpoints+and+current+methodologies+for+their+development%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibitors against PD-1/PD-L1 immune checkpoints and current methodologies for their development: A review.</a> Cancer Cell Int. 21 (1), 239(2021).</li>
<li>Hu, K., Li, X. -J., Asmamaw, M. D., Shi, X. -J., Liu, H. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+high-throughput+screening+HTRF+assay+for+identification+small+molecule+inhibitors+of+Skp2-Cks1%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment of high-throughput screening HTRF assay for identification small molecule inhibitors of Skp2-Cks1.</a> Sci Rep. 11 (1), 21105(2021).</li>
<li>Puopolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+PD-1%2FPD-L1+blockade+assay+based+on+surface+plasmon+resonance+%28SPR%29+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protoc%22%5BJournal%5D)">Establishment of human PD-1/PD-L1 blockade assay based on surface plasmon resonance (SPR) biosensor.</a> Bio-protoc. 13 (15), e4765(2023).</li>
<li>Ding, M., Chen, Y., Lang, Y., Cui, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cellular+prion+protein+in+cancer+biology%3A+A+potential+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of cellular prion protein in cancer biology: A potential therapeutic target.</a> Front Oncol. 11, 742949(2021).</li>
<li>Li, H., Seeram, N. P., Liu, C., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+investigation+of+blockade+effects+and+binding+affinities+of+selected+natural+compounds+to+immune+checkpoint+PD-1%2FPD-L1%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Further investigation of blockade effects and binding affinities of selected natural compounds to immune checkpoint PD-1/PD-L1.</a> Front Oncol. 12, 995461(2022).</li>
<li>Kamrani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+immunotherapeutic+approaches+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">New immunotherapeutic approaches for cancer treatment.</a> Pathol Res Pract. 248, 154632(2023).</li>
<li>Yan, Y., Zhang, L., Zuo, Y., Qian, H., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+blockade+in+cancer+immunotherapy%3A+mechanisms%2C+clinical+outcomes%2C+and+safety+profiles+of+PD-1%2FPD-L1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint blockade in cancer immunotherapy: mechanisms, clinical outcomes, and safety profiles of PD-1/PD-L1 inhibitors.</a> Arch Immunol Ther Exp. 68 (6), 36(2020).</li>
<li>Chandrasekharan, G., Unnikrishnan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+methods+to+study+protein-protein+interactions+during+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High throughput methods to study protein-protein interactions during host-pathogen interactions.</a> Eur J Cell Biol. 103 (2), 151393(2024).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMS-202%2C+a+PD-1%2FPD-L1+inhibitor%2C+decelerates+the+profibrotic+effects+of+fibroblasts+derived+from+scar+tissues+via+ERK+and+TGF%CE%B21%2FSmad+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immun+Inflamm+Dis%22%5BJournal%5D)">BMS-202, a PD-1/PD-L1 inhibitor, decelerates the profibrotic effects of fibroblasts derived from scar tissues via ERK and TGFβ1/Smad signaling pathways.</a> Immun Inflamm Dis. 10 (1), e591(2022).</li>
<li>Surmiak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+inhibitors%3A+Different+classes%2C+activities%2C+and+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">PD-L1 inhibitors: Different classes, activities, and mechanisms of action.</a> Int J Mol Sci. 22 (21), 11797(2021).</li>
<li>Feoli, A., Sarno, G., Castellano, S., Sbardella, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO-Related+effects+on+ligand-binding+properties+of+lysine+methyltransferases+G9a+and+SETD8%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">DMSO-Related effects on ligand-binding properties of lysine methyltransferases G9a and SETD8.</a> ChemBioChem. 25 (4), e202300809(2024).</li>
<li>Tjernberg, A., Markova, N., Griffiths, W. J., HalléN, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO-Related+effects+in+protein+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">DMSO-Related effects in protein characterization.</a> SLAS Discov. 11 (2), 131-137 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ciągu ostatnich kilku dekad różne podejścia do immunoterapii – w tym szczepionki przeciwnowotworowe, inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych i terapie limfocytami T CAR – znacznie posunęłynaprzód leczenie raka. Immunologiczne punkty kontrolne odgrywają kluczową rolę w zapobieganiu ubocznym uszkodzeniom komórek odpornościowych podczas reakcji patogennych oraz w tłumieniu autoimmunizacji. Kluczowym przykładem jest interakcja między PD-L1 i PD-1, która tworzy główny immunologiczny punkt kon...

Terapie blokujące immunologiczne punkty kontrolne, szczególnie te ukierunkowane na Programowaną Śmierć Komórki-1 (PD-1) i Ligand Programowanej Śmierci Komórki 1 (PD-L1), stoją w czołówce strategii immunoterapii raka. Terapie anty-PD-1/PD-L1 zostały zatwierdzone do stosowania w różnych typach nowotworów, takich jak rak hematologiczny, skórny, płucny, wątroby, pęcherza moczowego i nerki1. PD-1 jest transbłonową glikoproteiną należącą do nadrodziny immunoglobulin, charakteryzującą się pojedynczą domeną podobną do zmiennej immunoglobuliny (IgV) na N-końcu, około 20-aminokwasową łodygą oddzielającą domenę IgV od błony plazmatycznej, domeną transbłonową i cytoplazmatycznym ogonem zawierającym motywy sygnalizacyjne oparte na tyrozynie2. PD-L1, zidentyfikowany jako jeden z ligandów PD-1, jest białkiem transbłonowym typu I charakteryzującym się regionem transbłonowym, dwiema domenami zewnątrzkomórkowymi - stałą immunoglobuliny (IgC) i IgV - oraz stosunkowo krótką domeną cytoplazmatyczną, która wyzwala wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe3. Szlak hamujący PD-1/PD-L1 służy jako krytyczny immunologiczny punkt kontrolny, który reguluje aktywację limfocytów T i autoimmunizację4. PD-1 ulega ekspresji na limfocytach T, gdzie oddziałuje z PD-L1, hamuje sygnalizację receptora limfocytów T i blokuje stymulację cząsteczek CD28 i CD80 na komórkach prezentujących antygen i limfocytach T5. Tkanki nowotworowe wykorzystują ten fizjologiczny mechanizm poprzez nadekspresję PD-L1 podczas fazy ucieczki, tworząc w ten sposób środowisko immunosupresyjne, które sprzyja wzrostowi i progresji guza6. Inhibitory PD-1 i PD-L1 zakłócają tę interakcję, umożliwiając układowi odpornościowemu uniknięcie supresji wywołanej przez nowotwór i ponowne zainicjowanie procesu śmierci komórek nowotworowych za pośrednictwem limfocytów T7.
Opierając się na fundamencie położonym przez znaczącą rolę terapii blokujących immunologiczne punkty kontrolne, rozwój inhibitorów PD-1/PD-L1 oznaczał znaczący postęp w immunoterapii nowotworów. Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła dziewięć inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych, które są specyficznie ukierunkowane na szlak PD-1 / PD-L1. Należą do nich sześć inhibitorów PD-1 - pembrolizumab, dostarlimab, niwolumab, cemiplimab, orypalimab i tislelizumab - oraz trzy inhibitory PD-L1 - atezolizumab, awelumab i durwalumab8,9. Terapie te są skutecznie stosowane w leczeniu różnych nowotworów, takich jak czerniak, rak płuc, rak dróg moczowych, rak szyjki macicy, rak żołądka lub przełyku i inne guzy lite10. Pomimo swojej skuteczności, terapie oparte na przeciwciałach monoklonalnych napotykają na znaczne ograniczenia, w tym niskie wskaźniki odpowiedzi, wysokie koszty, wydłużone okresy półtrwania, poważne zdarzenia niepożądane związane z układem immunologicznym oraz ograniczenia w podawaniu dożylnym lub podskórnym11,12,13. W związku z tym badania coraz częściej koncentrują się na opracowywaniu małocząsteczkowych inhibitorów ukierunkowanych na oś PD-1/PD-L1. Te małe cząsteczki oferują wyraźne korzyści, takie jak lepsza penetracja komórkowa, modulacja różnych celów biologicznych, zwiększona biodostępność po podaniu doustnym i zmniejszone koszty, w celu osiągnięcia porównywalnych wyników terapeutycznych przy mniejszej liczbie działań niepożądanych14. Jednak rozwój inhibitorów małocząsteczkowych ukierunkowanych na interakcję PD-1/PD-L1 jest na wczesnym etapie, głównie ze względu na brak niezawodnej platformy do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Takie platformy są niezbędne do szybkiej oceny ogromnych bibliotek małych cząsteczek i identyfikacji związków wiodących w celu dalszej walidacji i optymalizacji. Sprostanie temu wyzwaniu ma kluczowe znaczenie dla postępu w immunoterapii nowotworów.
Technologia powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) jest szeroko stosowana do wykrywania różnych biomolekuł, w tym antygenów przeciwciał, enzymów, kwasów nukleinowych i leków, i jest szczególnie skuteczna w badaniach przesiewowych leków małocząsteczkowych15,16. W przeciwieństwie do innych technik biofizycznych, SPR oferuje detekcję bez znaczników, dane kinetyczne w czasie rzeczywistym i szeroki zakres wykrywania. Z kolei kalorymetria miareczkowa izotermiczna nie ma wglądu w kinetykę w czasie rzeczywistym i wymaga większych objętości próbek, co ogranicza przepustowość. Termoforeza w mikroskali jest podatna na zakłócenia buforowe i nie może dostarczyć danych kinetycznych, podczas gdy interferometria biowarstw ma ograniczenia specyficzne dla aplikacji oparte na wielkości i właściwościach molekularnych. Jednorodna fluorescencja czasowo-rozdzielcza wymaga znakowania i jest podatna na zakłócenia fluorescencyjne. Zdajemy sobie sprawę, że HTRF jest kolejną odpowiednią technologią do badania inhibitorów PD-1/PD-L1. Jednym z nieodłącznych ograniczeń HTRF, w porównaniu do SPR, jest wygaszanie fluorescencji spowodowane zewnętrznymi interakcjami z procesem wzbudzenia wewnątrzcząsteczkowego (np. transfer elektronów, FRET i bielenie), czułość jest zbyt niska w procesie przesiewowym leków ze względu na mały zakres okna i interferencję ze związkami z biblioteki fluorescencyjnej lub białkami biologicznymi17. Cechy te pozycjonują SPR jako doskonałe narzędzie do odkrywania leków. Nasze poprzednie badania wykazały, że SPR jest w stanie określić efekt blokady małych cząsteczek przeciwko PD-1/PD-L1, co jest korzystne w porównaniu z innymi technikami, które wymagają wysokich wymagań technologii znakowania, wielu etapów, słabej swoistości i wysokich kosztów w procesie odkrywania leków18.
To badanie wprowadza zoptymalizowaną platformę opartą na SPR, integrującą dwuetapowy proces sprzęgania, który wykorzystuje zarówno sprzężenie aminowe, jak i bio-streptawidynowe, aby poprawić orientację PD-1 na chipie i zminimalizować zużycie białka. To zaktualizowane podejście zostało pomyślnie zweryfikowane przy użyciu inhibitora PD-1/PD-L1 BMS-1166 jako spoiwa kontroli pozytywnej, wykazując efekty blokady porównywalne zarówno z naszą poprzednią metodą SPR, jak i innymi uznanymi technikami, takimi jak ELISA19,20. To nie tylko potwierdza niezawodność i odtwarzalność naszego protokołu, ale także ilustruje skuteczność naszej zmodyfikowanej platformy w ułatwianiu wysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów PD-1/PD-L1. Włączenie etapu wychwytywania biostreptawidyny zapewnia orientację białka skierowaną na miejsce, a nie losową, co pozwala na zmniejszenie stężenia PD-1 (40 μg/ml vs. 10 μg/ml) i oszczędność kosztów poprzez umożliwienie użytkownikowi końcowemu immobilizacji streptawidyny (SA) do chipa CM5, tańszej alternatywy dla skomercjalizowanych, wstępnie unieruchomionych chipów SA. To sprawia, że jest to korzystne dla dużych, opłacalnych badań przesiewowych bibliotek związków/peptydów. Chociaż dodatkowe metody charakteryzacji, w tym testy in silico, in vitro i in vivo, są niezbędne do oceny potencjału klinicznego inhibitorów PD-1/PD-L1 przeciwko nowotworom, nasza ulepszona platforma przesiewowa oparta na SPR wyróżnia się jako skuteczne narzędzie do badań przesiewowych na dużą skalę inhibitorów PD-1/PD-L1.

<table><tbody><tr><td>50 mM NaOH</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>100358</td><td></td></tr><tr><td>50 mM NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>905376</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe mikropłytki polistyrenowe</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100503</td><td></td></tr><tr><td>Amina Coupling Kit</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>35120</td><td></td></tr><tr><td>System i oprogramowanie ewaluacyjne Biacore T200 SPR 3.2</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>28975001</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowany ludzki PD-1 Fc, białko Avitag</td><td>Acro Biosystems</td><td>PD1-H82F1</td><td></td></tr><tr><td>BMS1166</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-102011</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od DNaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>188506</td><td></td></tr><tr><td>Glycine 1.5</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100354</td><td></td></tr><tr><td>Glycine 2.0</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100355</td><td></td></tr><tr><td>Glycine 2.5</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100356</td><td></td></tr><tr><td>Glycine 3.0</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100357</td><td></td></tr><tr><td>HBS-EP+ Buffer</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100669</td><td></td></tr><tr><td>Human PD-L1 Fc Tag Białko</td><td>Acro Biosystems</td><td>PD-1-H5258</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Folia do mikropłytek, 96-dołkowa&nbsp;</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>28975816</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki plastikowe 7 mm</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100212</td><td></td></tr><tr><td>Gumowe nakrętki, typ 3</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>Series S Sensor Chip CM5</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>29149603</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu 4.5</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>100350</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu 5.0</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>100351</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja inhibitorów pd-1/pd-l1 za pomocą technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Identifying PD-1/PD-L1 Inhibitors with Surface Plasmon Resonance Technology

Zakłócenie interakcji PD-1/PD-L1 jest obiecującą strategią immunoterapii nowotworów. Wiarygodne platformy przesiewowe są niezbędne do oceny skuteczności inhibitorów PD-1/PD-L1. Wcześniej opracowany test blokady PD-1/PD-L1 u ludzi wykorzystujący technologię powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) (platforma przesiewowa SPR inhibitora PD-1/PD-L1 pierwszej generacji) wykazał wyniki porównywalne z wynikami uzyskanymi za pomocą jednorodnej fluorescencji rozdzielczej w czasie (HTRF) i testów komórkowych, z potencjałem do badań przesiewowych na dużą skalę. W niniejszym artykule przedstawiono zoptymalizowaną wersję tego testu (platforma przesiewowa SPR inhibitora PD-1/PD-L1 drugiej generacji), charakteryzującą się dwuetapowym procesem sprzęgania, który łączy sprzężenie aminy i bio-streptawidyny w celu poprawy kontroli orientacji PD-1 na chipie i zmniejszenia zużycia białka PD-1. Zaktualizowana platforma została pomyślnie zwalidowana przy użyciu inhibitora PD-1/PD-L1 BMS-1166, wykazując efekty blokady porównywalne z poprzednią metodą opartą na SPR i innymi uznanymi technikami, takimi jak ELISA. Wyniki te potwierdzają wiarygodność tego podejścia. Ta zoptymalizowana platforma przesiewowa SPR oferuje wysokowydajne i niezawodne narzędzie do identyfikacji nowych inhibitorów PD-1/PD-L1, postępu w badaniach nad immunoterapią nowotworów i podkreślenia potencjału SPR w badaniach przesiewowych inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych.

Immobilizacja SA na chipie CM5 
Dane zostały poddane analizie poprzez wynik z urządzenia SPR i powiązanego oprogramowania analitycznego wskazujący na pomyślne osiągnięcie docelowej wartości RU (2000 RU) białka SA na komórce przepływowej 1 i komórce przepływowej 2. Na komórkach przepływowych 1 i 2 unieruchomiono SA (40 μg/mL) na powierzchni chipa CM5, z końcowym sygnałem odpowiedzi wynoszącym 1902,3 RU w komorce przepływowej 1 (Rysunek 1A) oraz 1900,7 RU na ogniwi...

Ten protokół opisuje test blokady dla inhibitorów PD-1/PD-L1 przy użyciu technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Wykorzystuje dwuetapową strategię unieruchomienia i dostosowany system buforowy do dokładnego pomiaru jednostek reakcji, ułatwiając ocenę wskaźników blokady dla związków lub leków biologicznych. Dodatkowo wspomaga wysokoprzepustową identyfikację inhibitorów PD-1/PD-L1.

Identyfikacja inhibitorów PD-1/PD-L1 za pomocą technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego

The disruption of the PD-1/PD-L1 interaction is a promising strategy for cancer immunotherapy. Reliable screening platforms are essential for evaluating ...

Zajmuję się odkrywaniem leków, odkrywaniem nowych inhibitorów immunologicznych punktów kontrolnych raka, takich jak PD-1, PD-L1. Moje kluczowe pytanie brzmi: jak możemy zaprojektować platformę ekranową o wysokiej przepustowości, aby to przyspieszyć? W ostatnich latach poczyniono znaczne postępy w zakresie leków biologicznych ukierunkowanych na PD-1, PD-L1. Podczas gdy leki małocząsteczkowe są wciąż na wczesnym etapie rozwoju, naszym celem jest opracowanie leków małocząsteczkowych ukierunkowanych na PD-1, PD-L1.Jednorodna fluorescencja czasowo-rozdzielcza, HTIF i af-ah-ly-zer to dwie technologie mające zastosowanie w badaniach przesiewowych inhibitorów PD-1, PD-L1. Rozpuszczalność małych cząsteczek i niedopasowanie są głównymi wyzwaniami w obecnym eksperymencie.Odkryliśmy, że SPR może być opracowany nie tylko do pomiaru powinowactwa wiązań, ale także jako platforma przesiewowa dla inhibitorów PD-1 i PD-L1.[Instruktor] Aby rozpocząć, włącz powierzchniowy rezonans plazminowy lub instrument SPR. Kliknij na otwarty lub nowy szablon kreatora i wybierz unieruchomienie, aby ustawić metodę unieruchomienia. Ustaw typ układu na CM-5. Ustaw metodę Amina i komórki przepływu na cykl na jeden. Następnie sprawdź, czy unieruchomiona komórka przepływowa pierwsza i komora przepływowa druga mają SA-40 mikrogramów na mililitr. Wybierz wychwytywanie biotyny SA jako metodę unieruchomienia. Ustaw jedną komórkę przepływową do unieruchomienia ślepej próby. W przypadku drugiej komórki przepływowej należy dążyć do unieruchomionego poziomu z 10 mikrogramami na mililitr, PD-1 jako ligandem i celem 4,000 jednostek odpowiedzi. Następnie sprawdź prime przed uruchomieniem. Umieścić dwie komory zawierające wloty buforu w roztworze buforowym HBSEP o dodatnim działaniu. Wysuń chip czujnika konserwacji i włóż chip CM-5. Ponownie otwórz metodę unieruchomienia. Następnie włóż stojak na odczynniki w dwóch i sprawdź położenie odczynników. Uruchom metodę dla szacowanego czasu trwania. Umieść dwie wnęki w roztworze bufora buforowego HBSEP z dodatnim biegunem. Wysuń układ czujnika konserwacji i włóż chip SA. Po ponownym otwarciu metody unieruchomienia włóż drugi stojak na odczynniki i sprawdź pozycje odczynników. Uruchom metodę dla szacowanego czasu trwania. W celu walidacji interakcji PD-1, PD-L1, w ustawieniach ogólnych ustaw szybkość zbierania danych na 10 herców. Detekcja jest wieloraka. Temperatura komory próbki do 25 stopni Celsjusza i jednostka stężenia jako mikromolowa. W ramach etapów testu ustaw powtórzenia kondycjonowania na 10 razy. Rozpocznij od kinetyki z powtórzeniami co 10 razy. Próbka do kinetyki z jedną kontrpróbą i temperaturą 25 stopni Celsjusza. Następnie ustaw czas kontaktu na 60 sekund, czas dysocjacji na 60 sekund, a natężenie przepływu na 30 mikrolitrów na minutę. W obszarze zmienne metody ustaw właściwość jako zmienną i wybierz przykładowe rozwiązanie. W obszarze zmiennych oceny wybierz cel oceny jako powinowactwo kinetyczne i wybierz wstępnie zdefiniowane zmienne, takie jak stężenie i MW. Skonfiguruj przebieg i wybierz ścieżkę przepływu dwa do jednego i cztery do trzech. Wejściowe stężenia PD-L1 wynoszące zero mikromolów, 0,037 mikromola, 0,111 mikromola i 0,333 mikromola o masie cząsteczkowej 51 300 daltonów. Przygotować 200 mililitrów dodatniego roztworu buforowego HBSEP i rozcieńczyć rozcieńczenie PD-L1 w działającym buforze. Umieść wszystkie odczynniki w odpowiednich miejscach na układzie i uruchom przez szacowany czas. W przypadku testu blokady z inhibitorem małocząsteczkowym należy użyć tych samych ustawień i natężeń przepływu, co w przypadku testów walidacyjnych. Po skonfigurowaniu przebiegu i wybraniu ścieżek przepływu wprowadź próbkę roztworu PD-L1 i rozcieńczone roztwory BMS 1166. Przypisz pozycje studzienek w układzie dwóch stojaków na odczynniki, jak podano. Następnie rozpuść pięć miligramów BMS 1166 w 77,99 mikrolitrach DMSO, aby przygotować 100-milimolowy roztwór podstawowy. Ułóż wszystkie odczynniki zgodnie z podaniem. Docelowa jednostka odpowiedzi wynosząca 2000 jednostek odpowiedzi została prawie osiągnięta dla immobilizacji białka streptawidyny na komórce przepływowej pierwszej i komórce przepływowej drugiej. Pierwsza komórka przepływowa wykazała ostateczną odpowiedź 1902,3 jednostek odpowiedzi, podczas gdy druga komórka przepływowa wykazała 1900,7 jednostek odpowiedzi. Ślepa komórka na pierwszej komórce przepływowej miała niską jednostkę odpowiedzi wynoszącą minus 161, podczas gdy druga komórka przepływowa osiągnęła cel 4000 jednostek odpowiedzi z końcową odpowiedzią 3698,5. Wśród badanych warunków pH glicyny, glicyna pH 2,0 została zidentyfikowana jako najbardziej optymalna dla regeneracji ze stabilną odpowiedzią wyjściową, wskazując na minimalną utratę białka PD-1 i skuteczne usunięcie PD-L1. Interakcję wiązania PD-L1 w różnych stężeniach z PD-1 określono ilościowo, uzyskując mierzalną odpowiedź. Efekt blokady interakcji wiązania PD-1, PD-L1 obserwowano przy rozcieńczeniu BMS 1166 od zera do 3,125 mikromola. Jednostka odpowiedzi wiązania zmniejszała się proporcjonalnie wraz ze wzrostem stężenia BMS 1166.

identifying-pd-1pd-l1-inhibitors-with-surface-plasmon-resonance

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje technikę powierzchniowego rezonansu plazmonowego, czyli SPR, do badania interakcji między dwiema cząsteczkami za pomocą chipa czujnika. Zmiana kąta rezonansu i natężenie odbitego światła są wykrywane jako funkcja asocjacji i dysocjacji dwóch cząsteczek, a to dostarcza informacji o oddziaływaniach między dwiema cząsteczkami.

Powierzchniowy rezonans plazmonów do badania oddziaływań biomolekularnych za pomocą chipa czujnika

Ten film pokazuje zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonów w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki. Wykorzystując układ mikroprzepływowy i plazmoniczny chip nanostrukturalny związany z peptydami, zmiany natężenia światła odbitego pod kątem rezonansu ujawniają interakcje z wydzielanymi białkami z pojedynczej komórki.

Zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki

Prezentujemy metodę szybkiego, odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek i funkcjonalizowanych zespołów nanocząstek do badań powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR), wykorzystując sekwencyjną bioortogonalną chemię cykloaddycji na chipie i wychwytywanie przeciwciała-antygen.

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to bezznacznikowa metoda wykrywania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W niniejszym artykule opisano protokół eksperymentu interakcji białko błona / receptor, omawiając jednocześnie zalety i wady tej techniki.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

Obecny protokół opisuje nowe narzędzia do testowania wiązania SPR do badania wiązania CV-N z HA, glikoproteiną S, pokrewnymi glikanami typu hybrydowego i oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy. SPR służy do oznaczaniaK D do wiązania dimerycznego lub monomerycznego CV-N z tymi glikanami.

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Inhibitory punktów kontrolnych są ważnymi celami w opracowywaniu terapii do walki z rakiem. Raport ten przedstawia nową szczepionkę przeciwnowotworową opartą na peptydzie PDL1, PDL1-Vaxx, która indukuje neutralizującą produkcję przeciwciał poliklonalnych, które blokują tworzenie kompleksu PD-1 / PDL1. Praca ta szczegółowo opisuje również rozwój i testowanie testu opartego na koralikach fluorescencyjnych do analizy tej aktywności.

Magnetyczna analiza przepływu podwójnego reportera oparta na kulkach magnetycznych blokady przeciwciał wywołanych szczepionką peptydu PDL1-Vaxx w interakcji PD-1/PD-L1

Ten protokół opisuje unikalną metodę wykrywania wiązania między związkami a cząsteczkami białka, oferując korzyści w postaci minimalnej utraty próbki białka i wysokiej dokładności danych.

Wykrywanie interakcji białko-baldaszek CD40 za pomocą różnicowej fluorescencji skaningowej

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Poznaj metodę identyfikacji inhibitorów PD-1/PD-L1 przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Technologia SPR umożliwia szybkie badanie interakcji białkowych w immunoterapii przeciwnowotworowej.

Identyfikacja inhibitorów PD-1/PD-L1 za pomocą technologii powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Przeglądaj więcej filmów