Name: Test wymiany lipidów w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę wymiany lipidów w żywych komórkach przy użyciu cyklodekstryny do badania lokalizacji i aktywacji receptorów kinaz tyrozynowych. Technika ta umożliwia dokładne modelowanie dynamiki błon komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez grant NIH GM 122493. Ogniwa CHO IR były miłym prezentem od dr Jonathana Whittakera (Case Western Reserve University).

1. Przygotowanie roztworu metylo-α-CD
<ol>
	<li>Dodaj 20 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do ~10 g proszku MαCD w szklanej butelce. Inkubować w ciepłej łaźni wodnej (45 °C) do rozpuszczenia, mieszając od czasu do czasu, aż do rozpuszczenia. 
	UWAGA: Roztwór może być nadal mętny z powodu nierozpuszczalnych gatunków CD.</li>
	<li>Przepuścić roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 μm. Rozwiązanie stanie się jasne.</li>
	<li>Użyj refraktometru, aby określić dokładne stężenie MαCD.
	<ol>
		<li>Umieścić 10 μl próbki na powierzchni próbki refraktometru, oświetlić ją za pomocą białej żarówki i zapisać współczynnik załamania światła roztworu.</li>
		<li>Obliczyć stężenie MαCD za pomocą równania 
		RI = (1,49 x 10 x C) + 1,33 
		gdzie RI = współczynnik załamania światła, C = stężenie MαCD (mM). Równanie uzyskano poprzez analizę grawimetryczną, czyli pomiar współczynnika załamania światła znanej masy MαCD rozpuszczonego w znanej objętości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknij szklaną butelkę pokrywką i zawiń pokrywkę w przezroczystą folię, aby zapobiec parowaniu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pęcherzyków wielopłytkowych (MLV)
<ol>
	<li>Roztwory podstawowe pożądanych lipidów egzogennych należy utrzymywać rozpuszczone w chloroformie w stężeniach od 20 mM do 50 mM i przechowywać w temperaturze -20 °C lub niższej, aby zminimalizować parowanie rozpuszczalnika. 
	UWAGA: Wszystkie lipidy w Tabeli 1 mogą być całkowicie rozpuszczone w roztworze chloroformu. Możliwe jest jednak, że alternatywne lipidy mogą wymagać chloroformu: metanolu w stosunku 1:1 do całkowitego rozpuszczenia.</li>
	<li>Podwielokrotność lipidów przelać do probówek borokrzemianowych za pomocą pipety wyporowej ze szklaną końcówką. Alternatywnie można użyć szklanej mikrostrzykawki.</li>
	<li>Wysuszyć podwielokrotność lipidów na bloku grzewczym w niskiej temperaturze około 50 °C pod strumieniem gazuN2 aż do odparowania całego widocznego chloroformu.</li>
	<li>Usunąć pozostały rozpuszczalnik z wysuszonego lipidu, umieszczając probówkę w komorze próżniowej i wystawiając ją na działanie wysokiej próżni (poniżej 200 mTorr) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Dodaj bezsurowicową pożywkę F-12 firmy Ham's do suchego filmu lipidowego, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 mM. Przykryj pokrywką lub taśmą teflonową i podgrzewaj w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Wir w celu zawieszenia lipidów i utworzenia MLV. Nośnik powinien być teraz pochmurny. 
	UWAGA: Niektóre nasycone lipidy mogą nie być w pełni zawieszone przez samo wirowanie i mogą wymagać zawieszenia przez pipetowanie w górę iw dół, aż film przestanie być widoczny.
	<ol>
		<li>Przenieś całą objętość do probówki mikrowirówkowej. MLV można przechowywać do 3 dni w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie pożywki do wymiany lipidów
<ol>
	<li>Dodać materiał MαCD do końcowego stężenia 40 mM, wraz z przygotowanymi MLV do końcowego stężenia lipidów znajdującego się w tabeli 1. 
	UWAGA: W przypadku używania MLV przechowywanych w temperaturze 4 °C, zostaną one osadzone na dnie probówki. Rozgrzej się do temperatury pokojowej i upewnij się, że zostały ponownie zawieszone przez trzepanie lub mieszanie probówki.
	<ol>
		<li>Załadować lipidy do MαCD przez inkubację przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub 55 °C zgodnie z tabelą 1. Wybrana temperatura powinna być wyższa od temperatury topnienia fazy żel-ciecz wybranego lipidu. Podłoże powinno zmienić kolor z mętnego na klarowny.</li>
		<li>Pozostaw pożywkę lipidową do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 30-60 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Leczenie komórek metodą wymiany lipidów
<ol>
	<li>Hoduj komórki CHO IR w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Dulbecco (DMEM, 4,5 g / l glukozy) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 300 μg / ml L-glutaminy, 100 μg / ml aminokwasów endogennych, 50 μg / ml G418, 2 μM metotreksatu i 1x antybiotykiem przeciwgrzybiczym.
	<ol>
		<li>Wysiewaj 1,5 x 106 komórek na płytkach 60 mm i rosj, aż będą zlewać się w 80%-90%.</li>
		<li>Umyj komórki 3x, dodając 1 ml PBS, a następnie odsysając. Zagłodź komórki przez noc w 2 ml pożywki F12 bez surowicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj komórki 3x 1 ml PBS. Dodać 1 ml przygotowanej pożywki wymiennej lub pożywki bez surowicy jako kontroli do komórek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (25 °C -27 °C). Obracaj komórki co 15 minut, aby zapewnić równomierną ekspozycję na media wymienne.
	<ol>
		<li>Umyj komórki 3x 1 ml PBS. Każda płytka może być następnie przetworzona w celu ekstrakcji lipidów w kroku 5 lub w celu autofosforylacji IR w kroku 7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ekstrakcja lipidów na płytce do hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Całkowicie usuń PBS i ustaw płytkę pod kątem 45° na 10 minut lub do całkowitego wyschnięcia, usuwając bufor, który może gromadzić się wzdłuż dna.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu heksanu: izopropanolu w proporcji 3:2 (v:v) do wysuszonych komórek i inkubować przez 10 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przenieś roztwór do probówki borokrzemianowej. Przykryj taśmą teflonową i przechowuj w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Rozpuść pozostałe resztki komórek, dodając 500 μl 1N NaOH i wytrząsając przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Użyj tego roztworu w teście ilościowym białka, takim jak test Bradforda, aby określić stężenie białka w każdej próbce. Te wartości stężeń można wykorzystać do normalizacji objętości ładowania ekstraktów lipidowych na płytkach HP-TLC w celu równomiernego obciążenia lipidami we wszystkich próbkach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Sprawdzanie wydajności wymiany za pomocą HP-TLC
<ol>
	<li>Przygotuj 100 ml wodorotlenku amonu w proporcji 65:25:5 (v:v:v) chloroform:metanol:30% (v/v) i wlej go do szklanego zbiornika TLC. Przykryj szczelnie i pozwól parze zrównoważyć się przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Suchą próbkę ekstraktu lipidowego umieścić na bloku grzewczym przy niskim ustawieniu pod strumieniem gazuN2, aż do odparowania całego widocznego rozpuszczalnika organicznego.</li>
	<li>Rozpuścić film lipidowy w 50 μl chloroformy 1:1 (v:v): metanolu.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki Hamilton o pojemności 10 μl załadować 1-10 μl próbki w pasmach o średnicy 1 cm na płytkę HP-TLC z krzemionki. Załaduj maksymalnie 10 taśm na talerz o średnicy 20 cm. Użyj znormalizowanych wartości, aby określić objętości potrzebne do załadowania równych ilości lipidów we wszystkich próbkach. 
	UWAGA: Przed załadowaniem każdej próbki należy aktywować płytkę, umieszczając ją na płycie grzejnej na średnio-wysokim ustawieniu.</li>
	<li>Umieścić płytkę pionowo w zbiorniku TLC i pozwolić, aby czoło rozpuszczalnika przesunęło się o 8 cm, aby zapewnić oddzielenie form fosfolipidów.</li>
	<li>Pozostaw płytkę do wyschnięcia na 10 minut. Spryskaj ją wodnym roztworem 3% (m/v) octanu miedzi i 8% (v/v) kwasu fosforowego.
	<ol>
		<li>Pozostaw talerz do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej lub za pomocą opalarki. Talerz powinien zmienić kolor z półprzezroczystego niebieskiego na nieprzezroczysty biały.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwęglić płytkę w piekarniku o temperaturze 180 °C-200 °C przez 5-10 minut lub do momentu, gdy czarne pasma lipidowe staną się wykrywalne.</li>
</ol>
7. Sprawdzanie aktywacji receptora za pomocą testu autofosforylacji i western blot
<ol>
	<li>Inkubować komórki z 500 μl insuliny 100 nM w pożywce bez surowicy w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Umyj komórki lodowatym PBS i umieść komórki na lodzie, aby zatrzymać stymulację. Natychmiast dodaj 1 ml lodowatego PBS do komórek i zbierz za pomocą skrobaka do komórek. Komórki osadu w temperaturze 3000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 100-200 μl kompletnego buforu do lizy RIPA (50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, 1% (w/v) deoksycholanu sodu, 1 mM aktywowany ortowananian sodu, 10 μg/ml aprotyniny, 10 μg/ml leupeptyny) do osadu komórkowego na lodzie. Pipetuj w górę i w dół 30x-40x, aby lizować.</li>
	<li>Inkubować lizat na lodzie przez 10 minut. Usunąć lizat z resztek komórkowych, wirując z prędkością 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zbierając supernatant. Zarezerwuj około 20 μl lizatu do określenia stężenia białka za pomocą testu Bradforda.</li>
	<li>Połączyć lizat z 5x buforem Laemmli (350 mM Tris HCl pH 6,8, 30% v/v glicerolu, 10% w/v SDS, 25% v/v β-merkaptoetanolu, 0,002 g błękitu bromofenolowego) i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 min. Objętość dodanego buforu powinna być wystarczająca do osiągnięcia końcowego stężenia 1x bufor Laemmli.</li>
	<li>Przepuścić lizaty przez elektroforezę w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE).
	<ol>
		<li>Załadować równą masę białka dla wszystkich próbek wraz ze znacznikiem masy cząsteczkowej na żel SDS-PAGE. Pracować pod napięciem 100 V-150 V w buforze roboczym (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM glicyny, 0,01% (w/v) SDS) do uzyskania dobrej rozdzielczości w zakresie 100-250 kDa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) w buforze transferowym (2,5 mM Tris pH 8, 19,2 mM glicyny) przez 1 godzinę przy napięciu 100 V i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zablokuj membranę PVDF przez 30 minut w temperaturze pokojowej w 5% roztworze BSA w TBST (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20).</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałem pYpY IR lub przeciwciałem IR-β w stężeniu 1:1000 w 5% roztworze BSA w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Przeciwciało pYpY IR specyficznie rozpoznaje fosforylowane tyrozyny 1162 i 1163 i służy do wskazania autofosforylacji receptora. Przeciwciało IR-β rozpoznaje podjednostkę beta receptora bezkrytycznie, niezależnie od stanu fosforylacji i służy do wskazania globalnych poziomów receptora.</li>
	<li>Umyć 3x łyżką stołową w temperaturze pokojowej. Inkubować z przeciwciałem α Rabbit-HRP w stężeniu 1:3000 w 1% roztworze BSA w TBST przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć 3x łyżką stołową w temperaturze pokojowej. Inkubować z substratem o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) przez 1 minutę i obrazować film.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+lipid+rafts+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions of lipid rafts in biological membranes.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 111-136 (1998).</li>
<li>Brown, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts%2C+detergent-resistant+membranes%2C+and+raft+targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts, detergent-resistant membranes, and raft targeting signals.</a> Physiology. 21, 430-439 (2006).</li>
<li>Schroeder, R., London, E., Brown, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+saturated+acyl+chains+confer+detergent+resistance+on+lipids+and+glycosylphosphatidylinositol+%28GPI%29-anchored+proteins%3A+GPI-anchored+proteins+in+liposomes+and+cells+show+similar+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interactions between saturated acyl chains confer detergent resistance on lipids and glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins: GPI-anchored proteins in liposomes and cells show similar behavior.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (25), 12130-12134 (1994).</li>
<li>Suresh, P., Miller, W. T., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+exchange+shows+insulin+receptor+activity+is+supported+by+both+the+propensity+to+form+wide+bilayers+and+ordered+raft+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid exchange shows insulin receptor activity is supported by both the propensity to form wide bilayers and ordered raft domains.</a> J Biol Chem. 297 (3), 101010(2021).</li>
<li>Delle Bovi, R. J., Kim, J., Suresh, P., London, E., Miller, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterol+structure+dependence+of+insulin+receptor+and+insulin-like+growth+factor+1+receptor+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Sterol structure dependence of insulin receptor and insulin-like growth factor 1 receptor activation.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1861 (4), 819-826 (2019).</li>
<li>Zidovetzki, R., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cyclodextrins+to+manipulate+plasma+membrane+cholesterol+content%3A+evidence%2C+misconceptions+and+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies.</a> Biochim Biophys Acta. 1768 (6), 1311-1324 (2007).</li>
<li>Ohtani, Y., Irie, T., Uekama, K., Fukunaga, K., Pitha, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+%CE%B1-%2C+%CE%B2-+and+%CE%B3-cyclodextrins+on+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of α-, β- and γ-cyclodextrins on human erythrocytes.</a> Eur J Biochem. 186 (1-2), 17-22 (1989).</li>
<li>Suresh, P., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+cyclodextrin-induced+lipid+substitution+to+study+membrane+lipid+and+ordered+membrane+domain+%28raft%29+function+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Using cyclodextrin-induced lipid substitution to study membrane lipid and ordered membrane domain (raft) function in cells.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1864 (1), 183774(2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+replacement+of+plasma+membrane+outer+leaflet+phospholipids+and+sphingolipids+in+cells+with+exogenous+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient replacement of plasma membrane outer leaflet phospholipids and sphingolipids in cells with exogenous lipids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14025-14030 (2016).</li>
<li>Yoshimasa, Y., Paul, J. I., Whittaker, J., Steiner, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+amino+acid+replacements+within+the+tetrabasic+cleavage+site+on+the+processing+of+the+human+insulin+receptor+precursor+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of amino acid replacements within the tetrabasic cleavage site on the processing of the human insulin receptor precursor expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J Biol Chem. 265 (28), 17230-17237 (1990).</li>
<li>Gaus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+lipid+structure+and+raft+domains+in+living+cells+with+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualizing lipid structure and raft domains in living cells with two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15554-15559 (2003).</li>
<li>Klymchenko, S., Kreder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+for+lipid+rafts%3A+From+model+membranes+to+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes for lipid rafts: From model membranes to living cells.</a> Chem Biol. 21 (1), 97-113 (2014).</li>
<li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factor+receptors%2C+lipid+rafts+and+caveolae%3A+An+evolving+story%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+ActaMol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Growth factor receptors, lipid rafts and caveolae: An evolving story.</a> Biochim Biophys ActaMol Cell Res. 1746 (3), 260-273 (2005).</li>
<li>Brown, D. A., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+detergent-resistant+membrane+domains%3A+does+phase+separation+occur+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Structure of detergent-resistant membrane domains: does phase separation occur in biological membranes.</a> Biochem Biophys Res Commun. 240 (1), 1-7 (1997).</li>
<li>Lin, Q., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+artificial+plasma+membrane+mimicking+vesicles+with+lipid+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preparation of artificial plasma membrane mimicking vesicles with lipid asymmetry.</a> PLoS One. 9 (1), e87903(2014).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li>
<li>Deveaux, P. F., Hermann, A., Ohlwein, N., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+lipid+flippases+can+modulate+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">How lipid flippases can modulate membrane structure.</a> Biochimica et Biophysica Acta Biomembr. 1778 (7), 1591-1600 (2008).</li>
<li>Balasubramaniam, K., Mirnikjoo, B., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+externalization+of+phosphatidylserine+at+the+cell+surface%3A+implications+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated externalization of phosphatidylserine at the cell surface: implications for apoptosis.</a> J Biol Chem. 282 (25), 18357-18364 (2007).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacing+plasma+membrane+outer+leaflet+lipids+with+exogenous+lipid+without+damaging+membrane+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Replacing plasma membrane outer leaflet lipids with exogenous lipid without damaging membrane integrity.</a> PLoS One. 14 (10), e0223572(2019).</li>
<li>Contreras, F. X., Sanchez-Magraner, L., Alonso, A., Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transbilayer+%28flip-flop%29+lipid+motion+and+lipid+scrambling+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Transbilayer (flip-flop) lipid motion and lipid scrambling in membranes.</a> FEBS Letters. 584 (9), 1779-1786 (2010).</li>
<li>Suresh, P., London, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%CE%B1CD-based+plasma+membrane+outer+leaflet+lipid+exchange+in+mammalian+cells+to+study+insulin+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Approach+Study+Memb+Struct+A+Exp%22%5BJournal%5D)">MαCD-based plasma membrane outer leaflet lipid exchange in mammalian cells to study insulin receptor activity.</a> Biophys Approach Study Memb Struct A Exp. 700, 485-507 (2024).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Od czasu konceptualizacji istnienia tratw lipidowych w błonie komórkowej podjęto liczne próby ich wizualizacji w komórkach i zbadania związku lipidów i receptorów. W eksperymentach z użyciem mikroskopii11 w komórkach wykorzystano fluorescencyjnie znakowane biomarkery, zwykle białka i lipidy, o których wiadomo, że wiążą się z tratwy, do wizualnego zbadania lokalizacji uporządkowanych domen lipidowych w komórce12. Jednak błona komórkowa jest pełna fałdów<sup class...

Błona plazmatyczna składa się z dwuwarstwy lipidowej wzbogaconej o różne białka błonowe, w tym receptory transbłonowe i kanały jonowe. Domeny lipidowe w błonie zostały wyjaśnione za pomocą rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych w detergentach regionów zidentyfikowanych w eksperymentach frakcjonowania membran odpornych na detergenty (DRM)1. Frakcje nierozpuszczalne charakteryzowały się wzbogaceniem w cholesterol, ciasno upakowanymi sfingomielinami i nasyconymi fosfolipidami, wykazującymi wyższą temperaturę topnienia, w przeciwieństwie do frakcji rozpuszczalnych, które składają się głównie z niższej temperatury topnienia i luźno upakowanych fosfolipidów nienasyconych. Ciasno upakowane regiony są określane jako domeny lipidowe uporządkowane cieczą (Lo) lub tratwy lipidowe, podczas gdy luźniej zorganizowane domeny lipidowe nieuporządkowane cieczą (Ld) są regionami błony plazmatycznej2,3. Wiadomo, że regiony tratwy lipidowej ułatwiają procesy sygnalizacyjne, z dowodami wskazującymi, że aktywny receptor insuliny wiąże się z tymi tratwami4,5. Jednak ze względu na dynamiczną naturę błony komórkowej i ogólnie mały rozmiar domen, bezpośrednia wizualizacja obecności tratw w żywych komórkach stanowi poważne wyzwanie. W tym kontekście przedstawiamy metodę badania wpływu tratw lipidowych na receptor insuliny za pomocą technik wymiany lipidów.
Cyklodekstryny (CD) są tworzone przez połączone monomery glukozy, które tworzą strukturę podobną do pierścienia z centralną jamą. Wielkość tej jamy zależy od liczby jednostek glukozy: sześć jednostek tworzy alfa-cyklodekstrynę (α-CD), podczas gdy siedem jednostek tworzy beta-cyklodekstryny (β-CD). CD to wysoce rozpuszczalne w wodzie cząsteczki, zdolne do zamykania lipidów w swojej jamie, ułatwiając w ten sposób ich transport do błony komórkowej6. Beta-cyklodekstryny są szeroko stosowane do dodawania i usuwania lipidów z błon7; Jednak jego większa jama nie jest specyficzna dla cholesterolu lub fosfolipidów<klasa SUP="xref">8. Natomiast alfa-cyklodekstryny, ze swoją mniejszą jamą, wykazują większą selektywność w wiązaniu cząsteczek lipidów nad sterolami. W szczególności metylo-α-cyklodekstryna (metylo-α-CD) nie wchodzi w interakcje ze sterolami i jest skutecznie stosowana do wymiany fosfolipidów i sfingomielin bez zmiany składu cholesterolu błony komórkowej8,9.
W tym manuskrypcie przedstawiamy szczegółowy protokół użycia metylo-α-CD (MαCD) do wymiany lipidów w zewnętrznej warstwie błony komórkowej na egzogenne lipidy, które mają właściwości wspomagające lub zakłócające tworzenie się tratw lipidowych. Wymiana ta służy do badania wpływu tratw lipidowych na aktywność receptora insuliny. Demonstracja skupi się na wprowadzeniu fosfolipidu i sfingomieliny wpływających na tworzenie domen uporządkowanych cieczowo (Lo) w błonie komórkowej linii komórkowych jajnika chomika chińskiego (CHO) stabilnie nadeksprymujących receptor insuliny (IR)10. Zakres wymiany lipidów w komórkach CHO IR zostanie oceniony za pomocą wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HP-TLC), podczas gdy zmiany w aktywności receptora insuliny zostaną określone ilościowo za pomocą analizy western blot po stymulacji insuliną po wymianie lipidów.

<table><tbody><tr><td>1,2-dilauroilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DLPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850335</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td>850355</tr><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycerol-3-fosfocholina (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>Receptor antyinsulinowy i beta</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>przeciwciał CST3025</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-pYpY1162/1163 R</td><td>& D Systems Inc.</td><td>AF2507</td><td></td></tr><tr><td>Anty-królicza IgG, technologia sygnalizacji komórkowej przeciwciał sprzężona z HRP</td><td></td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Probówki ze szkła borokrzemianowego (12 x 75 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>Sfingomielina mózgu (bSM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860062</td><td></td></tr><tr><td>Sfingomielina jaja (eSM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu ( FBS)</td><td>Corning</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>G418 sól dwusiarczanowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka orła (DMEM, 4,5 g/L glukozy, L-glutamina, pirogronian sodu)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Szynka Gibco" s F12 media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>Gibco L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>Gibco MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Gibco sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) bez wapnia i magnezu (0,144 g/L KH2PO4, 9 g/L NaCl, 0,795 g/L Na2- HPO4 (bezwodny))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10010023</tr><tr><td>Gibco Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Wysokosprawna chromatografia cienkowarstwowa (HP-TLC)</td><td>Merck</td><td>HP-TLC Żel krzemionkowy 60 płytek Membrana</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-P</td><td>Milipor</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Metotreksat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>454126</td><td></td></tr><tr><td>Metylo-&alfa;- cyklodekstryna (M&alpha; CD)</td><td>AraChem</td><td>CDexA076/BR</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting</td><td>Substrate Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu, aktywowany</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5.08605</td><td></td></tr></tbody></table>

test wymiany lipidów w żywych komórkach

Lipid Exchange Assay in Living Cells

Tratwy lipidowe to dynamiczne, uporządkowane domeny w błonie plazmatycznej, często powstające podczas grupowania i sygnalizacji białek błonowych. Tożsamość lipidowa płatka zewnętrznego napędza skłonność błony do tworzenia tratw lipidowych. Przejściowy charakter tratw lipidowych utrudnia badanie w żywych komórkach. Dlatego metody, które dodają lub usuwają lipidy tworzące tratwę na zewnętrznym płatku żywych komórek, ułatwiają badanie cech tratwy, takich jak ich wpływ na białka błonowe. Eksperymenty z wymianą lipidów opracowane w naszym laboratorium wykorzystują cyklodekstryny obciążone lipidami do usuwania i dodawania egzogennych fosfolipidów w celu zmiany składu lipidów błony komórkowej. Zastąpienie błony lipidem tratwy lub lipidem nietworzącym tratwy może pomóc w badaniu wpływu na aktywność białek transbłonowych. W tym miejscu opisujemy metodę wymiany lipidów na zewnętrznej płatku błony komórkowej za pomocą cyklodekstryny obciążonej lipidami. Demonstrujemy przygotowanie pożywki wymiennej i późniejszą obróbkę przyłączonych komórek ssaków. Pokazujemy również, jak mierzyć efektywność wymiany za pomocą HP-TLC. Protokół ten zapewnia prawie całkowite zastąpienie zewnętrznej ulotki egzogennymi lipidami bez zmiany żywotności komórek, co pozwala na dalsze eksperymenty na zmodyfikowanych nienaruszonych błonach plazmatycznych.

Aby zademonstrować obserwowalną zmianę w komórkowym składzie lipidów po wymianie, przeprowadzono HP-TLC komórek CHO IR po wymianie na SM mózgową (bSM) oraz 1,2-dioleojlo-sn-glycero-3-fosfocholinę (DOPC) (Rycina 1). W przypadkach, gdy do wymiany stosowane są sfingomieliny, takie jak bSM, widoczny jest wzrost intensywności prążka SM oraz spadek intensywności prążka PC w stosunku do niepoddanej działaniu kontroli. I odwrotnie, podczas wymiany na fosfatydylocholiny, takie jak DOPC, prążek PC sta...

Opisujemy metodę użycia cyklodekstryny do pośredniczenia w wymianie między lipidami błony komórkowej a lipidami egzogennymi. Technikę tę można połączyć z eksperymentami badającymi białka transbłonowe, które zachowują się inaczej w środowiskach podobnych do tratw lipidowych niż w środowiskach niepodobnych do tratwy.

Test wymiany lipidów w żywych komórkach

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the ...

Badamy interakcje między receptorowymi kinazami tyrozynowymi a błoną plazmatyczną ssaków. Chcemy wiedzieć, w jaki sposób tratwy lipidowe i asymetria lipidów napędzają lokalizację, aktywację i sygnalizację receptorów. Bezpośrednie badanie tratw lipidowych jest trudne, ponieważ są małe, dynamiczne i wrażliwe na warunki temperaturowe.Badacze często muszą używać systemów modelowych z dużymi domenami rzędu do badania interakcji. Pęcherzyki błony syntetycznej i plazmatycznej są niedoskonałymi reprezentacjami błon komórkowych pozbawionych asymetrii lipidów i organelli. Pracując z żywymi komórkami, uzyskujemy dokładne odwzorowanie błony plazmatycznej.Podkreślają one inicjację sygnalizacji receptorowej w kontekście żywych komórek. Daje to wgląd w wpływ środowisk błonowych na receptory i ich dalsze szlaki sygnałowe. Na początek podwielokrotność lipidów należy przenieść do probówki borokrzemianowej za pomocą pipety wyporowej ze szklaną końcówką.Umieść rurkę borokrzemianową na bloku grzewczym ustawionym na około 50 stopni Celsjusza i przyłóż strumień azotu do rurki, aż cały widoczny chloroform wyparuje. Przenieś probówkę do komory próżniowej i wystawiaj ją na działanie wysokiej próżni przez godzinę, aby usunąć pozostały rozpuszczalnik. Następnie dodaj pożywkę F-12 bez surowicy do wysuszonego filmu lipidowego, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 milimolów.Przykryj rurkę pokrywką lub taśmą teflonową i podgrzewaj ją w łaźni wodnej o temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie zwiruj roztwór, aby zawiesić lipidy i utworzyć pęcherzyki wielopłytkowe lub MLV. Gdy podłoże stanie się mętne, przenieś całą objętość do mikroprobówki wirówkowej i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech dni.Zmieszać przygotowane MLV z alfa-cyklodekstryną metylu do końcowego stężenia 40 milimolów. Inkubuj mieszaninę lipidów przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza lub 55 stopni Celsjusza. Obserwuj, jak media przechodzą z mętnego do przezroczystego.Następnie pozwól pożywce lipidowej ostygnąć do temperatury pokojowej przez 30 do 60 minut. Uzyskaj komórki receptora insuliny jajnika chomika chińskiego hodowane w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w uzupełnionym DMEM zawierającym 4,5 grama na litr glukozy. Wysiewaj 1,5 razy 10 do mocy sześciu komórek na 60-milimetrowych płytkach i inkubuj je, aby uzyskać 80 do 90% zbieżności.Następnie umyj komórki trzykrotnie jednym mililitrem PBS. Zagłodź komórki przez noc w dwóch mililitrach pożywki F-12 bez surowicy. Po trzykrotnym umyciu komórek PBS dodać jeden mililitr przygotowanej pożywki wymiennej.Inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze pokojowej, wirując co 15 minut, aby zapewnić równomierną ekspozycję na pożywkę wymienną. Następnie umyj komórki trzykrotnie jednym mililitrem PBS. Całkowicie usunąć PBS z płytki do hodowli komórkowej i ustawić płytkę pod kątem 45 stopni na 10 minut lub do całkowitego wyschnięcia.Po usunięciu pozostałego buforu dodać jeden mililitr roztworu izopropanolu heksanu do wysuszonych komórek i inkubować przez 10 minut na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Teraz przenieś roztwór do probówki borokrzemianowej. Po przykryciu probówki przechowuj ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Następnie rozpuść pozostałe resztki komórek za pomocą 500 mikrolitrów jednego normalnego wodorotlenku sodu. Potrząsaj pojemnikiem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie. Aby sprawdzić wydajność wymiany, wlej 100 mililitrów 30% roztworu wodorotlenku amonu metanolu chloroformowego do szklanego zbiornika do chromatografii cienkowarstwowej.Przykryj szczelnie zbiornik i pozwól parze zrównoważyć się przez co najmniej godzinę. Wysuszyć próbkę ekstraktu lipidowego na bloku grzewczym na niskim poziomie pod strumieniem azotu gazowego, aż rozpuszczalnik organiczny odparuje. Następnie rozpuść film lipidowy w 50 mikrolitrach roztworu metanolu chloroformu jeden do jednego.Za pomocą 10-mikrolitrowej strzykawki Hamiltona załaduj od jednego do 10 mikrolitrów próbki na krzemionkową płytkę TLC o wysokiej wydajności. Próbkę należy nakładać w pasmach jednocentymetrowych, ładując maksymalnie 10 pasm na 20-centymetrową płytkę. Umieść płytkę TLC pionowo w zbiorniku TLC i pozwól, aby czoło rozpuszczalnika przesunęło się na osiem centymetrów, aby oddzielić gatunki fosfolipidów.Następnie pozostaw płytkę do wyschnięcia na 10 minut i spryskaj ją wodnym roztworem 3% octanu miedzi i 8% kwasu fosforowego. Pozostaw talerz do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej lub za pomocą opalarki. Talerz powinien zmienić kolor z półprzezroczystego niebieskiego na nieprzezroczysty biały.Następnie zwęglić płytkę w piekarniku zahartowanym w temperaturze od 180 do 200 stopni Celsjusza przez 5 do 10 minut lub do momentu, gdy pojawią się czarne pasma lipidowe. Inkubować leczone komórki z 500 mikrolitrami insuliny o stężeniu 100 nanomolowym w pożywce wolnej od surowicy przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu komórek lodowatym PBS, umieść je na lodzie, aby zatrzymać stymulację.Następnie dodaj jeden mililitr lodowatego PBS i zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek. Granulować komórki w temperaturze 3000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodaj od 100 do 200 mikrolitrów kompletnego buforu do lizy RIPA do osadu komórkowego i ponownie zawieś 30 do 40 razy, aby zlizować komórki.Po inkubacji lizatu na lodzie przez 10 minut, odwirować go w temperaturze 16 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu oddzielenia zanieczyszczeń. Zebrać supernatant do świeżej probówki. Po określeniu stężenia białka wymieszaj lizat z pięciokrotnym buforem laemmli i podgrzewaj go w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.Załadować równe ilości białka na próbkę do żelu poliakryloamidowego z dodecylosiarczanem sodu w celu elektroforezy. Uruchom żel pod napięciem od 100 do 150 woltów w buforze do momentu, aż białka będą dobrze rozdzielone w zakresie od 100 do 250 kilodaltonów. Następnie należy przenieść rozwiązane białka na błonę z polifluorku winylidenu za pomocą buforu transferowego i wybarwić błonę odpowiednimi przeciwciałami.Wymiana lipidów w komórkach IR jajnika chomika chińskiego skutkowała zwiększoną intensywnością pasma sfingomieliny i zmniejszoną intensywnością pasma fosfatydylocholiny podczas wymiany sfingomieliny w mózgu. I odwrotnie, gdy 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina lub DOPC została wymieniona, intensywność pasma fosfatydylocholiny wzrosła, podczas gdy intensywność pasma sfingomieliny zmniejszyła się. Komórki wymienione z DOPC wykazały spadek autofosforylacji IR zależnej od insuliny.W przeciwieństwie do tego, komórki wymieniane przez sfingomielinę mózgu utrzymywały lub umiarkowanie zwiększały fosforylację IR. Znormalizowane poziomy fosforylacji określono przez podzielenie intensywności pYpY IR przez intensywność IR beta z danych western blot.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Proteoliposomy są używane do badania oczyszczonych kanałów i transporterów odtworzonych w dobrze zdefiniowanym środowisku biochemicznym. Zilustrowano eksperymentalną procedurę pomiaru wypływu, w którym pośredniczą te białka. Opisano etapy przygotowania proteoliposomów, wykonywania zapisów i analizy danych w celu ilościowego określenia właściwości funkcjonalnych odtworzonego białka.

Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów Cl

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji szkła za pomocą nanometrycznych plastrów białkowych otoczonych płynną dwuwarstwą lipidową. Substraty te są kompatybilne z zaawansowaną mikroskopią optyczną i oczekuje się, że posłużą jako platforma do badań adhezji i migracji komórek.

Macierze nanoklastrów ligandów w podpartej dwuwarstwie lipidowej

Opisujemy tutaj fluorometryczny, bezkomórkowy test biochemiczny do oznaczania peroksydacji lipidów HDL. Ten szybki i powtarzalny test może być wykorzystany do określenia funkcji HDL w badaniach na dużą skalę i może przyczynić się do zrozumienia funkcji HDL w chorobach ludzkich.

Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości

Ten protokół zapewnia skuteczne podejście do pomiaru wychwytu cholesterolu LDL z rzeczywistymi wskaźnikami napływu przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek w różnych typach komórek. Technika ta stanowi platformę do badania przesiewowego aktywności farmakologicznej związków wpływających na napływ LDL przy jednoczesnym monitorowaniu morfologii komórek, a tym samym potencjalnej cytotoksyczności.

Test wychwytu cholesterolu LDL przy użyciu analizy obrazowania żywych komórek z monitorowaniem stanu zdrowia komórek

Prezentowany tutaj jest czuły test fluorescencyjny do monitorowania aktywności N-acylotransferazy apolipoproteiny przy użyciu peptydu diacyloglicerylu i alkinofosfolipidów jako substratów z chemią kliknięć.

Test fluorometryczny oparty na technologii click-chemistry dla N-acylotransferazy apolipoproteiny od charakterystyki enzymu do wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Prezentujemy metodę pozyskiwania przebiegów czasu reporterowego fluorescencji z pojedynczych komórek za pomocą mikrowzorców. Protokół opisuje przygotowanie macierzy pojedynczych komórek, konfigurację i obsługę mikroskopii poklatkowej ze skanowaniem żywych komórek oraz narzędzie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym do automatycznej preselekcji, kontroli wizualnej i śledzenia przebiegów czasu fluorescencji zintegrowanych z komórkami na miejsce adhezji.

Obrazowanie żywych komórek macierzy jednokomórkowych (LISCA) - wszechstronna technika ilościowego określania kinetyki komórkowej

Tutaj opisujemy protokoły wykorzystujące fluorescencyjne czujniki lipidowe i liposomy do określenia, czy białko ekstrahuje i transportuje fosfatydyloserynę czy fosfatydyloinozytol 4-fosforan in vitro.

Oparte na fluorescencji pomiary wymiany fosfatydyloseryny/4-fosforanu fosfatydyloinozytolu między błonami

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Lipofagia to selektywna forma autofagii, która polega na degradacji kropelek lipidów. Dysfunkcje w tym procesie są związane z rozwojem nowotworów. Jednak dokładne mechanizmy nie są jeszcze w pełni poznane. Protokół ten opisuje ilościowe podejścia do obrazowania, aby lepiej zrozumieć wzajemne zależności między autofagią, metabolizmem lipidów i progresją raka.

Badanie regulacji katabolizmu kropelek lipidów poprzez lipofagię

Tutaj opisujemy protokoły pomiaru ilości fluorescencyjnego fosfolipidu specjalnie usuwanego z cząstek dawcy lipidów za pomocą lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) obecnej w całym ludzkim osoczu lub surowicy. Wykazaliśmy, że ten wskaźnik funkcjonalności HDL przewiduje występ chorób sercowo-naczyniowych.

Testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości

Poznaj metodę wymiany lipidów w żywych komórkach przy użyciu cyklodekstryny do badania lokalizacji i aktywacji receptorów kinaz tyrozynowych. Technika ta umożliwia dokładne modelowanie dynamiki błon komórkowych.

Test wymiany lipidów w żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów