Name: Produkty końcowe zaawansowanej glikacji uwrażliwiają ludzkie czuciowe komórki neuronowe na indukowany kapsaicyną napływ wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Poznaj wpływ zaawansowanych produktów glikacji kolagenu na wrażliwość neuronów czuciowych na kapsaicynę. Badanie pokazuje, że glikacja zwiększa napływ wapnia przez kanały TRPV1, co ma znaczenie dla mechanizmów bólu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundação Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo FAPESP Grant numer 2015/50040-4 i 2020/13139-0, São Paulo Research Foundation i GlaxoSmithKline, FAPESP 2022/08417-7 i 2024/04023-0.

1. Hodowla komórek SH-SY5Y i ich różnicowanie w komórki neuronopodobne o charakterze sensorycznym
UWAGA 1: Wszystkie etapy opisane w tej sekcji muszą być wykonywane pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, a wszystkie roztwory i materiały muszą być sterylne.
<ol>
	<li>Najpierw przygotować kolbę hodowlaną (25 cm2), dodając 5 mL pożywki hodowlanej. 
	UWAGA: Do rozmrażania, namnażania i utrzymania tego typu komórek należy stosować mieszaninę pożywek: DMEM/F12 (Dulbecco Modified Eagle's and Ham's Medium F12) uzupełnioną o 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Następnie wyjąć z ciekłego azotu kriotubkę zawierającą komórki SH-SY5Y i przechowywać ją w lodzie. Rozmrozić komórki w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 2 min.</li>
	<li>Do krioprobówki dodać 1 mL pełnej pożywki hodowlanej, przenieść komórki do probówki 15 mL, dodać 3 mL pełnej pożywki hodowlanej (DMEM/F12 uzupełniony o 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej) i wymieszać, wielokrotnie pobierając i wydmuchując zawiesinę do probówki za pomocą pipety.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki 15 mL i odwirować przy 290 g. Odlać supernatant, aby usunąć dimetylosulfoksyd (DMSO), środek krioprotekcyjny stosowany w celu zapobiegania tworzeniu się kryształków lodu podczas zamrażania komórek.</li>
	<li>Do osadu komórkowego dodać 1 mL pożywki hodowlanej, dobrze wymieszać za pomocą pipety i przenieść do kolby hodowlanej 25 cm2 w celu namnożenia komórek. Umieścić komórki w inkubatorze w zwilżonej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Komórki można wykorzystać, gdy osiągną około 80% konfluencji. W przypadku różnicowania neuronalnego zaleca się stosowanie komórek SH-SY5Y do dwudziestego pasażu.</li>
	<li>Przygotować zewnątrzkomórkową macierz kolagenową (100 µg/mL), rozcieńczając kolagen typu I z ogona szczura w sterylnym PBS, a następnie wlać 1 mL tego roztworu do szalki Petriego (35/10 mm) w celu powlekania.</li>
	<li>Inkubować w inkubatorze w zwilżonej atmosferze 5% CO2 przez około 1 h.</li>
	<li>Po tym czasie dwukrotnie przemyć płytkę sterylnym PBS, a następnie policzyć komórki przy użyciu komory Neubauera.</li>
	<li>Aby policzyć komórki, najpierw przemyć kolbę hodowlaną 25 cm2 zawierającą komórki 5 mL sterylnego PBS, aby usunąć całą pożywkę hodowlaną. Następnie usunąć sterylną PBS, dodać do komórek 3 mL 0,05% trypsyny i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez około 3-5 min, aby całkowicie odlepić komórki.</li>
	<li>Następnie wyjąć komórki z inkubatora, dodać do kolby hodowlanej 6 mL pożywki hodowlanej i przenieść ten roztwór do probówki 15 mL. Odwirować przy 290 g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dobrze resuspendować komórki w 1 mL pełnej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Na koniec policzyć komórki przy użyciu komory liczbowej Neubauera. Wymieszać 20 µL zawiesiny komórkowej i 20 µL błękitu trypanu, a następnie dodać 10 µL tej mieszaniny do komory Neubauera. Policzyć żywe komórki, które nie zabarwiły się na niebiesko.</li>
	<li>Wysiać komórki w stężeniu 5 × 104 komórek/mL do szalki Petriego (35/10 mm) w tej samej pożywce hodowlanej, która została opisana wcześniej. Zastosować całkowitą objętość 1 mL na płytkę.</li>
	<li>Następnie odczekać 24 h przed rozpoczęciem protokołu różnicowania neuronalnego. W tym celu usunąć pożywkę hodowlaną i zastąpić ją 1 mL DMEM/F12 uzupełnionego o 2% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 10 µM całkowitego kwasu retinowego (RA 10 µM).</li>
	<li>Odczekać 48 h i wymieniać pożywkę hodowlaną codziennie przez 3 dni. Komórki przechowywać w inkubatorze w zwilżonej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Piątego dnia usunąć pożywkę z komórek i dodać do każdej płytki 1 mL bezsurowiczej pożywki hodowlanej uzupełnionej o ludzki neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF 50 ng/mL). 
	UWAGA: Przetestowano BDNF od różnych producentów (patrz tabela materiałów). Wszystkie działały w ten sam sposób.</li>
	<li>Siódmego dnia różnicowania przemyć komórki raz sterylnym PBS i wykorzystać komórki neuronopodobne do eksperymentów. Jeśli nie jest możliwe natychmiastowe wykorzystanie tych komórek, dodać bezsurowiczą pożywkę hodowlaną, aby utrzymać ich żywotność do czasu użycia. 
	UWAGA: Po zakończeniu różnicowania neuronalnego konieczne jest przemycie komórek sterylnym PBS w celu usunięcia pozostałego BDNF, aby uniknąć toksyczności komórkowej.</li>
</ol>
2. Kolagen glikowany i proces glikacji
UWAGA: Wszystkie etapy w tej sekcji muszą być wykonywane pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza, a wszystkie roztwory i materiały muszą być sterylne.
<ol>
	<li>Przygotuj glikowany kolagen poprzez inkubację kolagenu typu I z ogona szczura w formie włóknistej (3,89 mg/mL) z 200 mM D-rybozą, 160 mM D-glukozą i 200 mM D-treozą w temperaturze 4 °C przez 7 dni. 
	UWAGA: Aby przygotować kolagen glikowany, odważ cukry na podstawie ich masy cząsteczkowej i wymieszaj je z kolagenem typu I z ogona szczura w formie włóknistej (3,89 mg/mL).</li>
	<li>Inkubuj hodowlę komórek neuronów zmysłowych przez 24 h z macierzą zewnątrzkomórkową z kolagenu glikowanego (ECM-GC, 100 µg/mL) lub macierzą zewnątrzkomórkową z normalnego kolagenu (ECM-NC, 100 µg/mL) przygotowaną w pośrodku hodowlanym DMEM/F12 bez dodatku surowicy i antybiotyków.</li>
</ol>
3. Analiza napływu wapnia
<ol>
	<li>W celu oznaczenia napływu wapnia należy użyć zestawu do pomiaru strumienia wapnia i przygotować roztwory zgodnie z instrukcjami producenta, jak wskazano poniżej.</li>
	<li>W pierwszej kolejności należy przygotować 1 mL roztworu do ładowania barwnika Fluo-8, dodając 2 µL roztworu zapasowego Fluo-8 do 998 µL 1x buforu do analizy (mieszaniny buforu HBSS i 10x Pluronic F127 Plus). 
	UWAGA: Ten roztwór roboczy jest stabilny przez co najmniej 2 h w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Następnie 250 µL tego roztworu należy dodać do każdej płytki z komórkami neuronopodobnymi, które zostały uprzednio zróżnicowane i potraktowane ECM-NC lub ECM-GC, i inkubować przez 30 min w uwilgotnionej atmosferze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Następnie płytkę należy wyjąć z inkubatora i pozostawić w RT (w ciemności) na 30 min. 
	UWAGA: Roztwór ten staje się cytotoksyczny, jeśli czas inkubacji zostanie przekroczony ponad 2 h. W czasie inkubacji należy przygotować roztwór kapsaicyny.</li>
</ol>
4. Indukcja kapsaicyną
UWAGA: Do indukowania napływu wapnia do komórek użyto kapsaicyny, która jest agonistą TRPV1.
<ol>
	<li>Odważyć i rozcieńczyć kapsaicynę w 1% etanolu i wodzie ultrapure. Następnie przygotować roztwór o stężeniu 2 µM, rozcieńczając go również w wodzie ultrapure. 
	UWAGA: Roztwór kapsaicyny należy przygotować w dniu użycia. Kapsaicynę należy rozcieńczać najpierw w etanolu, a następnie w wodzie; w przeciwnym razie ulegnie ona wytrąceniu.</li>
	<li>Dodać 250 µL roztworu kapsaicyny o stężeniu 2 µM do każdej szalki Petriego 35/10 mm, tak aby stężenie końcowe wynosiło 1 µM. 
	UWAGA: Stężenie roztworu stokowego kapsaicyny wynosiło 2 µM, aby zapewnić lepszą dyspersję i uniknąć izolowanych pików fluorescencji.</li>
</ol>
5. Obrazowanie napływu wapnia i analiza z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej
UWAGA: Obrazowanie przeprowadzono za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 20x/0,75NA i laser wzbudzający 488 nm (intensywność 0,5%). Emisję wykrywano przy 520 nm. Komórki skanowano w osiach xy (512 x 512 pikseli) w czasie (t) z prędkością 600 Hz, przy odstępie akwizycji 433 ms i całkowitym czasie akwizycji 5 min. Obrazowanie przeprowadzono w temperaturze 37 °C, aby za pomocą oprogramowania mikroskopowego utrzymać fizjologiczne warunki komórek.
<ol>
	<li>Przygotować strzykawkę z 250 µL 2 µM roztworu kapsaicyny (stężenie końcowe na płytce wyniesie 1 µM) i podłączyć ją do kaniuli typu motylkowego (Butterfly) 23 GA, sterylnej. Strzykawkę należy zabezpieczyć za pomocą statywu laboratoryjnego i zacisku.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego na stoliku mikroskopu i z najwyższą ostrożnością wprowadzić igłę kaniuli do szalki, unikając kontaktu z dnem; końcówka igły nie powinna być zanurzona w cieczy. 
	UWAGA: Do ustalenia pozycji kaniuli można użyć taśmy klejącej.</li>
	<li>Znaleźć pole z odpowiednią liczbą komórek (więcej niż 20) i ustawić ostrość, korzystając z oświetlenia w polu jasnym.</li>
	<li>Uruchomić tryb Live z użyciem lasera 488 nm oraz dostosować parametry ostrości i oświetlenia.</li>
	<li>Rozpocząć rejestrację obrazu, a po okresie bazowym (t = 0 do t = 60 sekund) dodać 250 µL 2 µM kapsaicyny, delikatnie naciskając tłok strzykawki, aby pobudzić napływ wapnia do komórek. 
	UWAGA: Końcowy czas akwizycji nagrania wynosił około 300 s na płytkę.</li>
</ol>
6. Obróbka danych / analiza danych
<ol>
	<li>Przeprowadź analizę komórek za pomocą oprogramowania do mikroskopii w trybie Quantification (Kwantyfikacja). Najpierw przeanalizuj komórki wykazujące skoki fluorescencji przed i po stymulacji kapsaicyną.</li>
	<li>Wyznacz obszar zainteresowania (ROI) dla każdej komórki reagującej, tj. komórek, które wykazują skok fluorescencji po podaniu kapsaicyny. Należy upewnić się, że ROI obejmuje cały obszar komórki, jak pokazano powyżej (Rycina 1).</li>
	<li>Wyeksportuj dane do pliku wartości rozdzielanych przecinkami (CSV) w celu przeprowadzenia dalszej analizy.</li>
	<li>Alternatywnie przeprowadź analizę przy użyciu bezpłatnego oprogramowania FIJI7 (https://fiji.sc).
	<ol>
		<li>Aby otworzyć pliki obrazów, użyj wtyczki Bio-Formats, przechodząc do File &gt; Import &gt; Bio-Formats i wybierając odpowiedni plik.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie użyj narzędzia Magnifying Glass (Lupa), aby powiększyć obraz, oraz narzędzia Freehand Selection (Zaznaczanie swobodne), aby wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI) wokół reagujących komórek.</li>
	<li>Po wyrysowaniu każdego ROI naciśnij klawisz T, aby dodać go do ROI Manager (Menedżera ROI). Powtórz ten proces dla wszystkich interesujących komórek (Rycina 2).</li>
	<li>Po dodaniu wszystkich ROI przejdź do okna ROI Manager, zaznacz wszystkie ROI, a następnie w menu głównym wybierz Analyze &gt; Set Measurements.</li>
	<li>Następnie wróć do ROI Manager i wybierz More &gt; Multi Measure, aby zmierzyć intensywność we wszystkich klatkach. Wyniki pojawią się w nowym oknie; wyeksportuj je do pliku CSV, przechodząc do File &gt; Save As. 
	UWAGA: Plik CSV można analizować w programach Excel, Google Sheets oraz GraphPad. Użyj równania ΔF/F0  = (F(t) - F0)/F0, aby przeliczyć wartości intensywności fluorescencji uzyskane za pomocą zestawu Fluo-8 Calcium Flux Assay Kit na względną miarę zmiany napływu wapnia. Tutaj F0 reprezentuje fluorescencję bazową, obliczaną jako średnia intensywność z obrazów zarejestrowanych od t = 0 s do t = 60 s przed stymulacją kapsaicyną. F(t) to wartość maksymalnej intensywności fluorescencji zaobserwowana po stymulacji, co pozwala na ocenę szczytowego napływu wapnia. Takie podejście podkreśla wzrost fluorescencji względem poziomu bazowego, gdzie wzrost ΔF/F0 wskazuje na podwyższony wewnątrzkomórkowy poziom wapnia.</li>
</ol>
<img alt="Analiza mikroskopii fluorescencyjnej, segmentacja obrazu; struktura komórki wyróżniona za pomocą interfejsu oprogramowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68036/68036fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przykład ROI w wybranych komórkach do analizy napływu wapnia w oprogramowaniu LAS X. (A) Interfejs LAS X w trybie kwantyfikacji. Różowy prostokąt wskazuje kartę kwantyfikacji. Żółty prostokąt wskazuje narzędzie rysowania polilinii, a cyjanowy prostokąt wskazuje narzędzia pomniejszania i powiększania obrazu. (B) Przechwycone pole widzenia (FOV). (C) Powiększenie FOV w celu ułatwienia wyznaczenia ROI w całej komórce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68036/68036fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy, analiza fluorescencji z wyborem ROI, oprogramowanie do przetwarzania danych neurocytologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68036/68036fig2v5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przykład ROI w wybranych komórkach do analizy napływu wapnia w oprogramowaniu FIJI. (A) Interfejs FIJI przedstawiający menu główne i narzędzia. Czerwony kwadrat wskazuje narzędzie lupy, a zielony kwadrat wskazuje wybór swobodny (Freehand selection). (B) Pole widzenia (FOV) uchwycone z powiększeniem i narysowanym ROI. (C) Okno menedżera ROI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68036/68036fig2v5large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
7. Rozwiązywanie problemów
<ol>
	<li>Jeśli obraz jest nieostry, należy wypróbować następujące kroki:
	<ol>
		<li>Sprawdzić przyczepność taśmy; jeśli poluzowała się, może to spowodować przesunięcie igły i wpłynąć na ostrość obrazu.</li>
		<li>Ponownie przymocować igłę za pomocą dodatkowej taśmy, aby zwiększyć stabilność.</li>
		<li>Wymienić standardowe igły. Użyć wcześniej zgiętych końcówek igieł dentystycznych, aby poprawić ich dopasowanie do płytki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli komórki wykazują nasycony sygnał, należy wypróbować następujące kroki:
	<ol>
		<li>Zmniejszyć intensywność lasera oraz ustawienia wzmocnienia (gain).</li>
		<li>Zweryfikować czas inkubacji odczynników. Jeśli przekracza on zalecenia producenta, może to doprowadzić do nasycenia sygnału, co utrudni detekcję napływu jonów wapnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu rozwiązywania problemów należy zastosować następujące dodatkowe sugestie:
	<ol>
		<li>Regularna kalibracja: Upewnić się, że sprzęt obrazujący jest regularnie kalibrowany w celu utrzymania ostrości i jakości detekcji sygnału.</li>
		<li>Dokumentowanie zmian: Prowadzić dziennik wszelkich modyfikacji wprowadzonych do protokołu, aby umożliwić przyszłe odniesienie i ułatwić rozwiązywanie problemów.</li>
		<li>Korekty reaktywne: Jeśli problemy nadal występują, rozważyć testy z różnymi stężeniami odczynników lub alternatywnymi metodami detekcji sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bierhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+RAGE%2C+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Understanding RAGE, the receptor for advanced glycation end products.</a> J Mol Med. 83 (11), 876-886 (2005).</li>
<li>Hudson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+receptor+for+advanced+glycation+endproducts%3A+A+new+target+for+therapeutic+intervention+in+diabetic+complications+and+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Blockade of receptor for advanced glycation endproducts: A new target for therapeutic intervention in diabetic complications and inflammatory disorders.</a> Arch Biochem Biophys. 419 (1), 80-88 (2003).</li>
<li>Dandia, H., Makkad, K., Tayalia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycated+collagen+-+a+3D+matrix+system+to+study+pathological+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Glycated collagen - a 3D matrix system to study pathological cell behavior.</a> Biomater Sci. 7 (8), 3480-3488 (2019).</li>
<li>Bufalo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sensory+neuron-like+cells+and+glycated+collagen+matrix+as+a+model+for+the+screening+of+analgesic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human sensory neuron-like cells and glycated collagen matrix as a model for the screening of analgesic compounds.</a> Cells. 11 (2), 247(2022).</li>
<li>Frias, B., Merighi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsaicin%2C+nociception+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Capsaicin, nociception and pain.</a> Molecules. 21 (6), 797(2016).</li>
<li>Lam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE-dependent+potentiation+of+TRPV1+currents+in+sensory+neurons+exposed+to+high+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RAGE-dependent potentiation of TRPV1 currents in sensory neurons exposed to high glucose.</a> PLoS One. 13 (2), e0193312(2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+activity+and+substance+P+release+are+required+for+corneal+cold+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">TRPV1 activity and substance P release are required for corneal cold nociception.</a> Nat Commun. 10 (1), 5678(2019).</li>
<li>Mickle, A. D., Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+TRP+channels%3Athe+key+transducers+of+nociception+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensory TRP channels:the key transducers of nociception and pain.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 131, 73-118 (2015).</li>
<li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).</li>
<li>Vetter, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+Nav+types+endogenously+expressed+in+human+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of Nav types endogenously expressed in human SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> Biochem Pharmacol. 83 (11), 1562-1571 (2012).</li>
<li>Dekker, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+Nav1.8+expressed+in+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human Nav1.8 expressed in SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> Eur J Pharmacol. 528 (1-3), 52-58 (2005).</li>
<li>Lam, P. M. W., Hainsworth, A. H., Smith, G. D., Owen, D. E., Davies, J., Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+recombinant+human+TRPV1+receptors+expressed+in+SH-SY5Y+human+neuroblastoma+cells+increases+%5BCa2%2B%5Di+initiates+neurotransmitter+release+and+promotes+delayed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Activation of recombinant human TRPV1 receptors expressed in SH-SY5Y human neuroblastoma cells increases [Ca2+]i initiates neurotransmitter release and promotes delayed cell death.</a> J Neurochem. 102 (3), 801-811 (2007).</li>
<li>Koplas, P. A., Rosenberg, R. L., Oxford, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+the+desensitization+of+capsaicin+responses+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in the desensitization of capsaicin responses in rat dorsal root ganglion neurons.</a> J Neurosci. 17 (10), 3525-3537 (1997).</li>
<li>Tominaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cloned+capsaicin+receptor+integrates+multiple+pain-producing+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli.</a> Neuron. 21 (3), 531-543 (1998).</li>
</ol>

MCB, AMCT i VOZ posiadają patent na proces identyfikacji jednostek molekularnych zaangażowanych w ból związany z chorobą zwyrodnieniową stawów (BR102018008561-1).

Nocyceptory to wyspecjalizowane podzbiory neuronów czuciowych, które pośredniczą w bólu. Komórki te wyrażają kanały jonowe bramkowane napięciem i ligandowe, takie jak TRPV1, których aktywacja prowadzi do napływu wapnia i uwalniania neuropeptydów i neuroprzekaźników regulujących przekaźnictwo nocyceptywne. W tym miejscu opisujemy protokół różnicowania SH-SY5Y w czuciowe komórki neuronalne w celu oceny napływu wapnia wywołanego kapsaicyną 8,9. Co ważne, wykazaliśmy...

Glikacja to nieenzymatyczny, nieodwracalny i spontaniczny proces, w którym białka, takie jak kolagen, wiążą się z cząsteczkami cukru redukującego, co skutkuje zaawansowanymi produktami końcowymi glikacji (AGEs). AGE mogą aktywować receptory błony komórkowej, wyzwalając aktywację szlaków wewnątrzkomórkowych, takich jak zewnątrzkomórkowa kinaza białkowa regulowana sygnałem (ERK) 1/2, kinaza białkowa aktywowana mitogenem p38 (MAPK) i kinazy n-końcowe c-jun (JNK), rho-GTPazy, kinaza fosfoinozytolo-3 (PI3K), kinaza janusowa/przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji (JAK/STAT) oraz kinaza białkowa C (PKC), zwiększając uwalnianie cząsteczek prozapalnych i stres oksydacyjny1. Kolagen glikowany upośledza również strukturę i właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej, a zwiększone AGE pochodzące z kolagenu są konsekwentnie powiązane z bolesnymi chorobami, w tym chorobą zwyrodnieniową stawów, neuropatią cukrzycową i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi2,3.
Nasza grupa wcześniej wykazała, że linia komórkowa SH-SY5Y może być różnicowana w komórki neuronów podobnych do czuciowych, ponieważ komórki te wyrażają kanały zaangażowane w nocycepcję, takie jak kanały sodowe (Nav 1.7, Nav 1.8 i Nav 1.9) oraz przejściowy potencjał receptora waniloidowego typu 1 (TRPV1), markery zwykle występujące w obwodowych neuronach czuciowych4. TRPV1 jest nieselektywnym kanałem kationowym przepuszczalnym dla jonów wapnia i wrażliwym na bodziec kapsaicyny. Co ważne, gdy czuciowe komórki neuronalne są wystawione na działanie glikowanej macierzy kolagenowej (ECM-GC), uzyskują funkcje pronocyceptywne poprzez zwiększenie ekspresji c-Fos, czynnika transkrypcyjnego zaangażowanego w aktywację neuronów, oraz uwalnianie substancji P, neuropeptydu szeroko zaangażowanego w zapalenie nerwów i ból. Komórki te reagują na leki przeciwbólowe, takie jak morfina, prototyp opiatu, zmniejszając uwalnianie substancji P indukowanej przez ECM-GC. Łącznie dane te wskazują, że model ten reaguje na cząsteczkę pro i anty-nocyceptywną4,5.
Monitorowanie wewnątrzkomórkowych zmian stężenia Ca2+ jest niezbędne do badania wielu procesów komórkowych. W neuronach może być użytecznym narzędziem do przewidywania uszkodzeń neuronów i neuroprotekcyjnych właściwości leków. Kapsaicyna, ostry składnik aktywny ostrej papryczki chili, jest najlepiej przebadanym agonistą receptora TRPV15 i cennym narzędziem do badania mechanizmów bólu i badań przesiewowych potencjalnych nowych leków przeciwbólowych. Wcześniejsze badania wykazały, że pierwotne neurony czuciowe z grzbietowych zwojów korzeniowych gryzoni inkubowanych z wysokim poziomem glukozy wykazują znaczny wzrost napływu wapnia indukowanego kapsaicyną6. Jednak to, czy kanał TRPV1 był funkcjonalnie aktywny w naszym modelu komórkowym i czy glikowany kolagen uwrażliwia czuciowe komórki neuronalne na wzbudzenie kapsaicyny, które może aktywować nocyceptywne szlaki sygnałowe, pozostaje nieznane. Dlatego naszym celem było opracowanie opłacalnego protokołu wykorzystującego proste narzędzia do monitorowania wapnia w komórkach sensorycznych w czasie rzeczywistym, przy jednoczesnym zapewnieniu wiarygodnej analizy. W tym miejscu przedstawiamy kompleksowy protokół, który pomaga naukowcom przejść przez kolejne etapy różnicowania komórek SH-SY5Y w czuciowych komórkach neuronowych i jak uwrażliwić je na bodźce pronocyceptywne. Metoda ta może przyczynić się do odkrycia nowych związków przeciwbólowych lub neuroprotekcyjnych.

<table><tbody><tr><td>Kwas all-trans retinowy</td><td>Tocris</td><td>695</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td></td><td>Tocris TOCR-2837</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3795</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly typ 23GA sterylny</td><td>Beckton Dickinson Asepto</td><td>38833814</td><td>Zestaw żył skóry głowy</td></tr><tr><td>Kapsaicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>Podłoże podstawowe</td></tr><tr><td>D-ryboza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7500</td><td></td></tr><tr><td>D-treoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7392</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 Zestaw do oznaczania topnika wapnia</td><td>Abcam</td><td>ab112129</td><td>Bez mycia</td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>A5670801</td><td></td></tr><tr><td>Wysoka zawartość Badania przesiewowe&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne Oprogramowanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LASX</td><td>Oprogramowanie do mikroskopii</td><td>Leica Microsystems</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica TCS SP8</td> Szalka</tr> Petriego <tr><td></td><td>15140130</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>(35/10 mm)</td><td>Greiner bio-one</td><td>627965</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td> Ogon szczura <td>Corning</td><td></td><td></td>354236</tr><tr><td>SH-SY5Y</td><td>Merck</td><td>94030304-1VL</td><td>Linia komórkowa nerwiaka zarodkowego</td></tr></tbody></table>

produkty końcowe zaawansowanej glikacji uwrażliwiają ludzkie czuciowe komórki neuronowe na indukowany kapsaicyną napływ wapnia

Advanced Glycation End-Products Sensitize Human Sensory-Like Neuron Cells to Capsaicin-Induced Calcium Influx

Zwiększone produkty końcowe zaawansowanej glikacji (AGE) pochodzące z kolagenu są konsekwentnie powiązane z bolesnymi chorobami, w tym chorobą zwyrodnieniową stawów, neuropatią cukrzycową i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi. Ludzkie neurony czuciowe zróżnicowane z linii komórkowej SH-SY5Y zyskują funkcje pro-nocyceptywne po wystawieniu na działanie AGE poprzez uwalnianie substancji P i zwiększanie ekspresji przejściowego potencjału receptora waniloidowego 1 (TRPV1). Tutaj zbadaliśmy, czy receptor ten jest funkcjonalnie aktywny i czy proces glikacji uwrażliwia neurony czuciowe na pobudzenie kapsaicyny. Czuciowe komórki neuronalne uzyskano z różnicowania komórek SH-SY5Y z kwasem all-trans-retinowym i neurotroficznym czynnikiem pochodzenia mózgowego. Inkubacja z macierzą zewnątrzkomórkową z glikowanym kolagenem (ECM-GC) symulowała bodziec pronocyceptywny. Komórki kontrolne inkubowano z nieglikowaną zewnątrzkomórkową macierzą kolagenową (ECM-NC). Zestaw do oznaczania strumienia wapnia Fluo-8 użyto do oceny napływu wapnia, który był stymulowany przez kapsaicynę. Wyniki pokazują, że glikacja zwiększa napływ wapnia w porównaniu z komórkami traktowanymi normalnym kolagenem, co sugeruje, że neurony czuciowe wyrażają funkcjonalne kanały TRPV1 i że glikacja zwiększa pobudzenie kapsaicyny. Dane te wskazują na nadwrażliwe czuciowe komórki neuronowe AGE, wyzwalające sygnalizację pronocyceptywną. Podsumowując, nasze wyniki sugerują, że stworzyliśmy funkcjonalny model reagujący na kapsaicynę, który może być przydatny do badań przesiewowych kandydatów do leczenia bolesnych stanów.

Różnicowanie komórek SH-SY5Y w neurony sensoryczno-podobne 
Obrazy z przesiewu wysokotreściowego (high-content screening) wykazują, że protokół różnicowania neuronalnego zmienia morfologię komórek SH-SY5Y. Komórki neuronów sensoryczno-podobnych (komórki zróżnicowane) wykazują zaokrąglone ciało komórki, z którego odchodzi rozbudowana sieć neurofilamentów. Tworzą one rozgałęzienia bardziej wydłużonych wypustek neurytowych łączących sąsiednie neurony, co jest zgodne z cechami dojrzałych neuronów (<strong...

Zwiększone produkty końcowe zaawansowanej glikacji (AGE) pochodzące z kolagenu są konsekwentnie powiązane z bolesnymi chorobami. Tutaj zbadaliśmy, czy glikacja uwrażliwia neurony czuciowe na pobudzenie kapsaicyny.

Produkty końcowe zaawansowanej glikacji uwrażliwiają ludzkie czuciowe komórki neuronowe na indukowany kapsaicyną napływ wapnia

Increased collagen-derived advanced glycation end products (AGEs) are consistently linked to painful diseases, including osteoarthritis, diabetic ...

Zwiększone produkty końcowe zaawansowanej glikacji pochodzące z kolagenu lub AGE są konsekwentnie powiązane z bolesnymi chorobami. Tutaj zbadaliśmy, czy proces glikacji uwrażliwia neurony czuciowe na pobudzenie kapsaicyny.Nasze wyniki pokazują, że glikacja kolagenu zwiększa się, powodując strumień w porównaniu z komórkami traktowanymi normalnym kolagenem, co sugeruje, że neurony czuciowe wyrażają funkcjonalne kanały TRPV1 i że glikacja zwiększa pobudzenie kapsaicyny.Badania te pokazują, że naśladowanie środowiska prognos susceptywnego za pomocą glikowanego kolagenu prowadzi do zwiększenia napływu wapnia indukowanego kapsaicyną. Potwierdzenie funkcjonalności kanału TRPV1 i zasugerowanie, że AGE może uwrażliwiać ten kanał.Ponieważ glikacja kolagenu zachodzi wraz ze starzeniem się i stanami patologicznymi, podejście to może służyć jako realne narzędzie do badania nowych celów molekularnych w leczeniu różnych chorób zwyrodnieniowych.[Narrator] Na początek przygotuj jeden mililitr roztworu do ładowania barwnikiem FLU-08, dodając dwa mikrolitry roztworu podstawowego FLU-08 do 998 mikrolitrów buforu ASE. Odpipetować 250 mikrolitrów tego roztworu do każdego poszczepionego naczynia zawierającego czuciowe komórki neuronowe, które są wcześniej różnicowane i traktowane glikowaną lub nieglikowaną zewnątrzkomórkową macierzą kolagenową. Inkubuj przez 30 minut w wilgotnej atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 30 minutach wyjmij naczynie z inkubatora i trzymaj je w temperaturze pokojowej w ciemności przez kolejne 30 minut. Do obrazowania napływu wapnia przygotuj strzykawkę z 250 mikrolitrami dwumikromolowego roztworu kapsaicyny. Podłączyć strzykawkę do sterylnego zestawu żył motylkowych skóry głowy o rozmiarze 23, Zachowując szczególną ostrożność, umieść igłę do skóry głowy na szalce Petriego umieszczonej na stoliku mikroskopu konfokalnego, nie dotykając dna. Zidentyfikuj pole zawierające więcej niż 20 komórek i dostosuj ostrość za pomocą jasnego światła pola. Uruchom tryb na żywo z laserem 488 nm i dostosuj parametry ostrości i oświetlenia. Rozpocznij nagrywanie akwizycji. Gdy okres podstawowy od T jest równy zero do T wynosi 60 sekund, delikatnie wciśnij tłok strzykawki, aby uwolnić 250 mikrolitrów kapsaicyny na szalkę Petriego. Otwórz oprogramowanie mikroskopowe i wybierz tryb kwantyfikacji, aby przeprowadzić analizę komórkową. Analizuj fluorescencyjne komórki kolczaste przed i po bodźcu kapsaicyny. Utwórz obszar zainteresowania lub ROI w każdej responsywnej komórce, upewniając się, że uwzględniony jest cały obszar komórki. Wyeksportuj dane jako plik CSV do dalszej analizy. Aby przeprowadzić analizę za pomocą oprogramowania Fidżi, otwórz pliki obrazów, wybierając Plik, a następnie Importuj, Formaty biologiczne, a następnie wybierz odpowiedni plik. Użyj narzędzia lupy, aby powiększyć, i narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby narysować ROI wokół responsywnych komórek. Naciśnij T, aby dodać go do menedżera ROI. Następnie przejdź do menu głównego i wybierz Analizuj, wybierz opcję Średnia wartość szarości i kliknij przycisk OK. Przejdź do okna Menedżer ROI i wybierz wszystkie ROI. Wybierz pozycję Więcej, a następnie pozycję Wiele miar. Pojawi się nowe okno wyświetlające pomiary intensywności fluorescencji w wielu klatkach. Przejdź do pozycji Plik, Zapisz jako i wyeksportuj wyniki jako plik CSV. Teraz zaimportuj plik CSV do arkusza Google. Znormalizuj wartość intensywności dla każdego punktu czasowego. Oblicz średnią intensywność jako F zero dla wszystkich obrazów zarejestrowanych w okresie od zera do 60 sekund. Obliczać FT, średnia maksymalnej intensywności fluorescencji obserwowanej po bodźcu. Oblicz deltę F przez F zero dla każdego ROI, korzystając z podanego równania. Teraz wklej dane do oprogramowania GraphPad Prism i wybierz Wykres rozrzutu, aby zwizualizować dane. Ekspresja tubuliny beta trzy w komórkach niezróżnicowanych i zróżnicowanych jest przedstawiona na tym rysunku. Z wyników wynika, że zróżnicowane komórki wykazywały morfologię podobną do neuronów z wydłużonymi neurytami, podczas gdy niezróżnicowane komórki zachowały zaokrąglony kształt. Zróżnicowane komórki wykazywały również zwiększoną ekspresję TRPV1 w porównaniu z komórkami niezróżnicowanymi. Komórki traktowane kolagenem glikowanym wykazywały większy napływ wapnia indukowany kapsaicyną w porównaniu z normalnymi komórkami traktowanymi kolagenem.

advanced-glycation-end-products-sensitize-human-sensory-like-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Test Cold Plantar (CPA) mierzy reakcję na zimno w zakresie od 30 °C do 5 °C, a także może mierzyć adaptację do zimna. Protokół ten opisuje, jak używać CPA do pomiaru nadwrażliwości na zimno, analgezji i adaptacji u myszy.

Prosta i niedroga metoda określania wrażliwości na zimno i adaptacji u myszy

Ten manuskrypt opisuje, jak przygotować nienaruszone zwoje korzenia grzbietowego do nagrań z zaciskiem łatowym. Preparat ten utrzymuje mikrośrodowisko dla neuronów i satelitarnych komórek glejowych, unikając w ten sposób zmian fenotypowych i funkcjonalnych obserwowanych przy użyciu zdysocjowanych neuronów DRG.

Nagrania zacisków łatkowych na nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego od dorosłych szczurów

To badanie ustanawia eksperymentalny model czystej neuropatii małych włókien z resiniferatoksyną (RTX). Unikalna dawka RTX (50 μg/kg) jest optymalna do opracowania modelu neuropatii małowłóknistych, który naśladuje charakterystykę pacjenta i może pomóc w zbadaniu nocyceptywnego znaczenia molekularnego leżącego u podstaw bólu neuropatycznego.

Ustalenie mysiego modelu czystej neuropatii drobnowłóknistej z ultrasilnym agonistą przejściowego potencjału receptora waniloidowego typu 1

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Obecny protokół opisuje model uwalniania peptydu związanego z genem kalcytoniny (CGRP) ex vivo oraz strategię ilościowego określania wpływu środków farmakologicznych na ilość CGRP uwalnianego z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni.

Ex vivo Uwalnianie peptydu związanego z genem kalcytoniny z układu trójdzielno-naczyniowego u gryzoni

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

To badanie przedstawia chirurgiczną manipulację polegającą na uwidocznieniu T-DRG u znieczulonych myszy do obrazowania wapnia in vivo, wraz z synchronicznymi zapisami EKG. Metoda ta stanowi najnowocześniejsze narzędzie do badania obwodowej stymulacji nerwów elektrycznych i danych wejściowych narządów trzewnych klatki piersiowej, a także ich interakcji na podstawowym poziomie sensorycznym.

Obrazowanie in vivo wapnia zwojów korzenia grzbietowego klatki piersiowej (DRG) i zapis EKG w celu badania stymulacji nerwów obwodowych

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Poznaj wpływ zaawansowanych produktów glikacji kolagenu na wrażliwość neuronów czuciowych na kapsaicynę. Badanie pokazuje, że glikacja zwiększa napływ wapnia przez kanały TRPV1, co ma znaczenie dla mechanizmów bólu.

Produkty końcowe zaawansowanej glikacji uwrażliwiają ludzkie czuciowe komórki neuronowe na indukowany kapsaicyną napływ wapnia

Przeglądaj więcej filmów