Name: Unikalny model mysi do ilościowej oceny tworzenia biofilmu na implantach chirurgicznych w ropniu podskórnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 3 min 44 s
Description: Poznaj innowacyjny model myszy do ilościowej oceny tworzenia biofilmu na implantach chirurgicznych w ropniu podskórnym. Ta metoda umożliwia jednoczesne porównanie dwóch implantów w identycznych warunkach zakażenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te zostały częściowo sfinansowane przez NSF Industry/University Cooperative Research Program o nazwie Center for Disruptive Musculoskeletal Innovations (IIP-1916629), Komatsuseiki Kosakusho Co., Ltd. i Rosies Base, LLC.

Wszystkie procedury na zwierzętach są zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco (UCSF) i są wykonywane w obiekcie BSL2 po konsultacji i zatwierdzeniu przez UCSF Biosafety Hazard Program, zarządzany przez UCSF Environmental Health and Safety. Wykorzystano samce i samice myszy C57BL/6 (w wieku 12-16 tygodni, 25-50 g). Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie bakterii
<ol>
	<li>Jako patogen należy użyć bioluminescencyjnego Staphylococcus aureus Xen36 (ATCC49525). UWAGA: Szczep ten został uzyskany z American Type Culture Collection (Manassas, VA) i w unikalny sposób wykorzystuje operon luxABCDE , który jest zoptymalizowany i zintegrowany z natywnym plazmidem gospodarza. Xen36 wykorzystuje również gen oporności na kanamycynę związany z operonem luksowym .</li>
	<li>Dodać niewielką ilość mrożonego bulionu glicerolowego Xen 36 i dodać kawałki do 5 ml pożywki z bulionu sojowego tryptycznego (TSB) zawierającej 200 μg/ml kanamycyny.</li>
	<li>Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (200 obr./min).</li>
	<li>Smugi Xen36 nanieść na płytki agarowe TSB (TSB w agarze 1,5%) zawierające 200 μg/ml kanamycyny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wyizolować pojedyncze kolonie Xen36 i wyhodować je w 5 ml TSB zawierającego 200 μg/ml kanamycyny przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (200 obr./min).</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję otrzymanej kultury przy długości fali 630 nm.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę i wykonać kulturę Xen36 o sile 1,0 x 108 jtk/ml w oparciu o absorbancję przy 630 nm. UWAGA: Pomiar absorbancji przy 630 nm (w stosunku do ślepej próby TSB) wynoszący 0,5 jest w przybliżeniu równoważny 1,0 x 108 CFU/ml Xen36.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę i utworzyć kulturę Xen36 o stężeniu 1,0 x 105 jtk/ml.</li>
</ol>
2. Przygotowanie połączonych implantów
<ol>
	<li>Użyj dwóch drutów w kształcie prętów wykonanych z dostępnej w handlu chirurgicznej stali nierdzewnej (SUS316L), każdy o długości 8 mm i średnicy 0.5 mm.</li>
	<li>Połącz oba przewody pionowo, wkładając je do obu końców końcówki do pipety o pojemności 20 μl, przyciętej na długość około 3 mm. UWAGA: Włóż pionowo połączone przewody do końcówki igły 18 G (Rysunek 1). Upewnij się, że przewody są dobrze zabezpieczone końcówką pipety, aby zapobiec rozłączeniu.</li>
	<li>Autoklaw przewodów przed chirurgicznym wszczepieniem ich myszom.</li>
</ol>
3. Stworzenie dojrzałej torebki podskórnej
UWAGA: 7 dni przed inokulacją bakteryjną utwórz woreczek powietrzny w następujący sposób:
<ol>
	<li>Znieczulić mysz (C57BL/6) 2% izofluranem przez inhalację (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). UWAGA: Oceń odpowiedni poziom znieczulenia, obserwując częstość oddechów, napięcie mięśniowe, uszczypnięcie palca, odruch rogówkowy i kolor błon śluzowych. Użyj maści okulistycznej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Przenieś znieczuloną mysz na łóżko chirurgiczne i ogol grzbietowy obszar szyjny/piersiowy myszy.</li>
	<li>Wymaz i wysterylizuj cały region za pomocą 70% etanolu i jodu powidonu.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 10 ml sterylnym powietrzem i przymocuj igłę 27 G do wylotu.</li>
	<li>Delikatnie ściśnij i unieś podstawę szyi myszy, aby stworzyć przestrzeń między tkanką podskórną a powięzią.</li>
	<li>Umieść igłę w linii środkowej między łopatkami myszy i wstrzyknij podskórnie 3 ml sterylnego powietrza, aby utworzyć woreczek powietrzny (ryc. 2). UWAGA: Podczas wstrzykiwania powietrza przytrzymaj obie strony pleców drugą ręką, aby upewnić się, że powietrze rozchodzi się do środka pleców, tworząc woreczek pośrodku.</li>
	<li>Umieść mysz z powrotem w klatce ogrzanej podkładką termiczną i uważnie ją monitoruj, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu.</li>
	<li>Wstrzykiwać 3 ml sterylnego powietrza co 2 dni, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co pierwszego dnia, w tym znieczuleniem i przygotowaniem skóry przed każdym wstrzyknięciem, aby utrzymać napompowanie ubytku i przyspieszyć tworzenie dojrzałego worka. UWAGA: Przed każdym napompowaniem należy zassać powietrze z torebki, aby potwierdzić prawidłowe umieszczenie końcówki igły. Ostrożnie wyjąć strzykawkę z igły, pozostawiając końcówkę igły w woreczku. Napompuj woreczek 3 ml sterylnego powietrza.</li>
</ol>
4. Implantacja połączonych przewodów i inokulacja bakteryjna
<ol>
	<li>7 dni po pierwszym wstrzyknięciu powietrza znieczulij mysz zgodnie z opisem w kroku 3.1. UWAGA: Podczas zabiegu chirurgicznego należy stale sprawdzać, czy mysz oddycha i jest znieczulona. Cały zabieg chirurgiczny trwa zwykle 10-15 minut, jeśli jest wykonywany przez przeszkolonego chirurga. Znieczulenie utrzymuje się poprzez umieszczenie rurki dostarczającej 2% izofluranu zmieszanego z tlenem w pobliżu pyska myszy.</li>
	<li>Wymaz i wysterylizuj cały region za pomocą 70% etanolu i jodu powidonu.</li>
	<li>Bupiwakainę należy wstrzyknąć podskórnie tuż przed zabiegiem.</li>
	<li>Wykonaj 3 mm nacięcie podłużne w linii środkowej w górnej części torebki.</li>
	<li>Włóż igłę 18 G zawierającą połączone przewody do woreczka przez otwór i wypchnij druty za pomocą wewnętrznej strzykawki z igłą rdzeniową 25 G (Rysunek 3A,B).</li>
	<li>Pozostawiając końcówkę igły 18 G wewnątrz torebki, delikatnie wyjąć cylinder wewnętrzny i wstrzyknąć 3 ml kultury Xen36 1,0 x 105 jtk/ml za pomocą strzykawki (Rysunek 3C, D).</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij wszystkie igły, zamknij skórę za pomocą klipsa do ran i uszczelnij miejscowym klejem do skóry (ryc. 3E,F).</li>
	<li>Upewnij się, że nie ma wycieków, umieść mysz z powrotem w indywidualnej klatce ogrzanej podkładką termiczną i monitoruj jak poprzednio. UWAGA: Podczas 14-dniowego okresu tworzenia ropnia myszy były codziennie monitorowane pod kątem oznak dyskomfortu, w tym drapania w miejscu, zaczerwienienia skóry, zmniejszonego apetytu lub zmniejszonej aktywności. W większości przypadków nie zaobserwowano żadnych istotnych zmian w zachowaniu poza pierwszymi kilkoma dniami po zaszczepieniu. Jeśli mysz wykazywała trwałe oznaki niepokoju, takie jak znacznie zmniejszona aktywność lub dreszcze, które nie ustępowały, była humanitarnie uśmiercana, aby zapobiec niepotrzebnemu cierpieniu.</li>
</ol>
5. Ekstrakcja implantów z ropnia podskórnego
<ol>
	<li>Po eutanazji przez przedawkowanie izofluoranu, ogolić grzbiet, szyjkę, klatkę piersiową i odcinek lędźwiowy myszy, a następnie pobrać wymaz i wysterylizować cały obszar 70% etanolem i jodonem powidonu (ryc. 4A). UWAGA: Eutanazja została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynarii (AVMA) dotyczącymi eutanazji zwierząt. Zgon został potwierdzony brakiem oddychania i bicia serca oraz blednięciem błon śluzowych.</li>
	<li>Wykonaj 2 cm nacięcie w linii środkowej w okolicy lędźwiowej i ostrożnie złuszcz tkankę podskórną za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Rozszerz nacięcie i podskórne rozwarstwienie proksymalnie i oddziel przylegającą tkankę otaczającą ropień (ryc. 4B - D).</li>
	<li>Wyciąć cały ropień podskórny (ryc. 4E).</li>
	<li>Przetnij ropień i ostrożnie wyciągnij drut z wnętrza ropnia (ryc. 4F).</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja powstałego biofilmu na powierzchniach implantów
<ol>
	<li>Test fioletu krystalicznego<ol>
		<li>Umieść druty wyjęte z ropnia w pojedynczych studzienkach 24-dołkowej płytki zawierającej 1 ml wody dejonizowanej (DI).</li>
		<li>Przenieś przewody do nowych studzienek zawierających 1 ml wody DI, aby usunąć wszelkie luźno przylegające bakterie z powierzchni przewodów.</li>
		<li>Przymocuj biofilm do drutów 100% etanolem przez 1 minutę i pozostaw do wyschnięcia.</li>
		<li>Przenieś przewody do nowych studzienek zawierających 1 ml 0,1% odczynnika fioletu krystalicznego.</li>
		<li>Po 15 minutach barwienia delikatnie umyj druty dwukrotnie wodą DI, aby usunąć nadmiar barwnika.</li>
		<li>Umieścić implant w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 250 μl 33% kwasu octowego na 15 minut; Rozpuścić fiolet krystaliczny przylegający do biofilmu na implancie, a następnie wirować przez 1 minutę.</li>
		<li>Przenieść 200 μl zawiesiny na płytkę 96-dołkową i zmierzyć absorbancję przy średnicy zewnętrznej630 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wszystkie pomiary wykonywane są w trzech egzemplarzach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zliczanie jednostek tworzących kolonie (CFU)<ol>
		<li>Usuń wszelkie luźno przylegające bakterie z powierzchni przewodów zgodnie z opisem w kroku 6.1.2.</li>
		<li>Umieścić implant w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl 10x trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wirować przez 1 minutę i sonikować w łaźni wodnej o mocy 100 W przez 5 minut, a następnie dodatkowo wirować przez 30 sekund w celu oderwania biofilmu od zawiesiny.</li>
		<li>Zaszczepić 10 μl seryjnie rozcieńczonej zawiesiny na płytkach agarowych TSB (TSB w agarze 1,5%) 200 μg/ml kanamycyny. UWAGA: Wykonaj tę procedurę w trzech egzemplarzach dla każdego roztworu.</li>
		<li>Po inkubacji płytek w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, należy policzyć kolonie na płytkach i obliczyć liczbę komórek bakteryjnych w pierwotnej hodowli, stosując średnią liczbę kolonii17. UWAGA: Aby upewnić się, że wszystkie bakterie zostały usunięte z przewodów, co ma kluczowe znaczenie dla dokładnego pomiaru, zabarwić druty fioletem krystalicznym i obserwować je po nałożeniu zawiesiny na płytki. We wstępnych eksperymentach połączenie powyższej dysocjacji mechanicznej i chemicznej skutecznie usunęło wszystkie biofilmy Xen36 z powierzchni konwencjonalnego drutu ze stali nierdzewnej (ryc. 5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowa analiza łańcuchowej reakcji polimerazy (qPCR)<ol>
		<li>Usuń wszelkie luźno przylegające bakterie z powierzchni przewodów zgodnie z opisem w kroku 6.1.2.</li>
		<li>Umieścić implant w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 600 μl TSB.</li>
		<li>Ekstrakcja DNA za pomocą bezgranulkowego zmodyfikowanego systemu lizy alkalicznej16. UWAGA: Końcowa objętość eluowanego DNA wynosi 20 μL.</li>
		<li>Rozcieńczyć DNA w stosunku 1:10 i przechowywać go w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Wykonaj qPCR dla genów luxA i 16S rRNA 16. UWAGA: Wszystkie reakcje qPCR przeprowadza się w trzech egzemplarzach. Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 10 μl, zawiera 3 μl matrycy DNA, 5 μl SYBR Green, 1 μl wody wolnej od nukleaz i 0,5 μl każdego startera. Starterami dla genu luxA są 5'- GAGCATCATTTCACGGAGTTTG -3' i 5'- ATAGCGGCAGTTCCTACATTC -3'. Starterami dla genu 16S rRNA są 5'- GTGGAGGGTCATTGGAAACT - 3' i 5'- CACTGGTGTTCCTCCATATCTC - 3'. Warunki PCR są następujące: początkowa denaturacja przez 2 minuty w temperaturze 94 °C, a następnie 40 cykli po 15 s w temperaturze 94 °C, 30 s w temperaturze 60 °C i 30 s w temperaturze 72 °C oraz końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Wykreśl średnią wartości progu trzech cykli (Ct) na tle krzywej kalibracyjnej wygenerowanej z DNA oczyszczonego bezpośrednio z seryjnie rozcieńczonych czystych kultur Xen36 w celu oszacowania obciążenia bakteryjnego implantu (ryc. 6).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wukich, D. K., Lowery, N. J., McMillen, R. L., Frykberg, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postoperative+infection+rates+in+foot+and+ankle+surgery%3A+a+comparison+of+patients+with+and+without+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Postoperative infection rates in foot and ankle surgery: a comparison of patients with and without diabetes mellitus.</a> J Bone Joint Surg Am. 92 (2), 287-295 (2010).</li>
<li>Darouiche, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+infections+associated+with+surgical+implants%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of infections associated with surgical implants.</a> N Engl J Med. 350 (14), 1422-1429 (2004).</li>
<li>Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant+infections%3A+Adhesion%2C+biofilm+formation+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Implant infections: Adhesion, biofilm formation and immune evasion.</a> Nat Rev Microbiol. 16 (7), 397-409 (2018).</li>
<li>Li, P., Yin, R., Cheng, J., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilm+formation+on+biomaterials+and+approaches+to+its+treatment+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilm formation on biomaterials and approaches to its treatment and prevention.</a> Int J Mol Sci. 24 (14), ijms241411680(2023).</li>
<li>Chen, X., Zhou, J., Qian, Y., Zhao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+coatings+on+orthopedic+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Antibacterial coatings on orthopedic implants.</a> Mater Today Bio. 19, 100586(2023).</li>
<li>Pan, C., Zhou, Z., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coatings+as+the+useful+drug+delivery+system+for+the+prevention+of+implant-related+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Coatings as the useful drug delivery system for the prevention of implant-related infections.</a> J Orthop Surg Res. 13 (1), 220(2018).</li>
<li>Savvidou, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+antimicrobial+coated+orthopedic+implants+on+the+prevention+of+periprosthetic+infections%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Jt+Infect%22%5BJournal%5D)">Efficacy of antimicrobial coated orthopedic implants on the prevention of periprosthetic infections: A systematic review and meta-analysis.</a> J Bone Jt Infect. 5 (4), 212-222 (2020).</li>
<li>Sussman, E. M., Casey, B. J., Dutta, D., Dair, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+cytotoxicity+responses+to+antimicrobial+nanosilver+coatings+when+comparing+extract-based+and+direct-contact+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Different cytotoxicity responses to antimicrobial nanosilver coatings when comparing extract-based and direct-contact assays.</a> J Appl Toxicol. 35 (6), 631-639 (2015).</li>
<li>Cyphert, E. L., Zhang, N., Learn, G. D., Hernandez, C. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+evaluation+of+antimicrobial+materials+for+resolution+of+orthopedic+implant-associated+infections+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the evaluation of antimicrobial materials for resolution of orthopedic implant-associated infections in vivo.</a> ACS Infect Dis. 7 (12), 3125-3160 (2021).</li>
<li>Stavrakis, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+animal+models+of+postoperative+spine+infection+and+potential+future+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Med+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Current animal models of postoperative spine infection and potential future advances.</a> Front Med (Lausanne). 2, 34(2015).</li>
<li>Carli, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Peri-implant+bacterial+load+and+in+vivo+biofilm+formation+in+an+innovative%2C+clinically+representative+mouse+model+of+periprosthetic+joint+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">Quantification of Peri-implant bacterial load and in vivo biofilm formation in an innovative, clinically representative mouse model of periprosthetic joint infection.</a> J Bone Joint Surg Am. 99 (6), e25(2017).</li>
<li>Bernthal, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+post-arthroplasty+Staphylococcus+aureus+joint+infection+to+evaluate+in+vivo+the+efficacy+of+antimicrobial+implant+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings.</a> PLoS One. 5 (9), e12580(2010).</li>
<li>Kelley, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mouse+model+of+spinal+implant+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo mouse model of spinal implant infection.</a> J Vis Exp. (160), e60560(2020).</li>
<li>Meroni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Journey+into+animal+models+of+human+osteomyelitis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">A Journey into animal models of human osteomyelitis: A review.</a> Microorganisms. 10 (6), 10061135(2022).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+hematogenous+implant-related+Staphylococcus+aureus+biofilm+infection+reveals+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mouse model of hematogenous implant-related Staphylococcus aureus biofilm infection reveals therapeutic targets.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (26), E5094-E5102 (2017).</li>
<li>Mitsuhiro Nishizawa, D. H., et al. A novel approach to reducing spinal implant-associated infections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMitsuhiro+Nishizawa%2C+DH+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Fehlings, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+practice+guideline+for+the+management+of+patients+with+acute+spinal+cord+injury%3A+Recommendations+on+the+use+of+methylprednisolone+sodium+succinate%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Spine+J%22%5BJournal%5D)">A clinical practice guideline for the management of patients with acute spinal cord injury: Recommendations on the use of methylprednisolone sodium succinate.</a> Global Spine J. 7 (3 Suppl), 203S-211S (2017).</li>
<li>Dworsky, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+vivo+mouse+model+of+implant-related+spine+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Novel in vivo mouse model of implant-related spine infection.</a> J Orthop Res. 35 (1), 193-199 (2017).</li>
<li>Masters, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+vasculotropic+versus+osteotropic+features+of+S.+agalactiae+versus+S.+aureus+implant-associated+bone+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct vasculotropic versus osteotropic features of S. agalactiae versus S. aureus implant-associated bone infection in mice.</a> J Orthop Res. 39 (2), 389-401 (2021).</li>
<li>Sheppard, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+vivo+mouse+model+of+shoulder+implant+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Shoulder+Elbow+Surg%22%5BJournal%5D)">Novel in vivo mouse model of shoulder implant infection.</a> J Shoulder Elbow Surg. 29 (7), 1412-1424 (2020).</li>
<li>Mansouri, M. D., Ramanathan, V., Al-Sharif, A. H., Darouiche, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+trypsin+in+enhancing+assessment+of+bacterial+colonization+of+vascular+catheters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hosp+Infect%22%5BJournal%5D)">Efficacy of trypsin in enhancing assessment of bacterial colonization of vascular catheters.</a> J Hosp Infect. 76 (4), 328-331 (2010).</li>
<li>Wang, X., Howe, S., Deng, F., Zhao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+applications+of+absolute+bacterial+quantification+in+microbiome+studies+and+decision-making+regarding+different+biological+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Current applications of absolute bacterial quantification in microbiome studies and decision-making regarding different biological questions.</a> Microorganisms. 9 (9), 9091797(2021).</li>
<li>Lima, A., Franca, A., Muzny, C. A., Taylor, C. M., Cerca, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+leads+to+bias+in+bacterial+quantification+by+qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA extraction leads to bias in bacterial quantification by qPCR.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 106 (24), 7993-8006 (2022).</li>
<li>Eleaume, H., Jabbouri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+standardization+methods+in+real-time+quantitative+RT-PCR+to+follow+Staphylococcus+aureus+genes+expression+during+in+vitro+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of two standardization methods in real-time quantitative RT-PCR to follow Staphylococcus aureus genes expression during in vitro growth.</a> J Microbiol Methods. 59 (3), 363-370 (2004).</li>
<li>Vidlak, D., Kielian, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+dose+dictates+the+host+response+during+Staphylococcus+aureus+orthopedic-implant+biofilm+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Infectious dose dictates the host response during Staphylococcus aureus orthopedic-implant biofilm infection.</a> Infect Immun. 84 (7), 1957-1965 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Badanie to wykazało kompleksowe podejście do precyzyjnej oceny ilościowej tworzenia się biofilmu na wielu implantach poprzez wykorzystanie nowatorskiego modelu mysiego i zoptymalizowanych technik analizy infekcji związanych z implantami. Aby upewnić się, że dwa implanty były inkubowane w identycznych warunkach infekcji u tego samego pacjenta, dojrzała torebka podskórna została stworzona w obrębie jednej myszy poprzez wielokrotne wstrzyknięcia powietrza. Model ten zapewnił zamknięte i stabilne środowisko, w którym dwa poł...

Zakażenia związane z implantami pozostają poważnym wyzwaniem w warunkach klinicznych, ponieważ mogą powodować wysokie wskaźniki zachorowalności i śmiertelności w chirurgii ortopedycznej pomimo postępów w technice chirurgicznej i projektowaniu implantów1. Chociaż częstość występowania zakażeń związanych z implantami chirurgicznymi znacznie się zmniejszyła dzięki nowoczesnym standardom aseptycznej kontroli w środowisku sali operacyjnej i odpowiednim protokołom okołooperacyjnej profilaktyki antybiotykowej, częstość występowania zakażeń związanych z implantami w chirurgii pierwotnej utrzymuje się na poziomie 2%-5%2.
Podstawowym mechanizmem leżącym u podstaw zakażeń związanych z implantami jest tworzenie się biofilmu na powierzchni implantu, który chroni mikroorganizmy przed antybiotykami i układem odpornościowym, co utrudnia zwalczenie infekcji 3,4. Ponieważ adhezja bakteryjna do powierzchni implantu ma kluczowe znaczenie podczas pierwszego etapu tworzenia biofilmu, minimalizacja adhezji bakteryjnej i późniejsze tworzenie biofilmu jest niezbędną strategią zmniejszającą ryzyko infekcji związanych z implantem. Pomimo właściwości przeciwbakteryjnych różnych technologii implantologicznych, nie są one szeroko stosowane klinicznie ze względu na zdarzenia niepożądane, takie jak toksyczność komórek i alergie 5,6,7,8. W związku z tym nadal istnieje niezaspokojone zapotrzebowanie kliniczne na implanty przeciwbakteryjne, które harmonizują bezpieczeństwo, skuteczność, stabilność i trwałość, aby zmniejszyć ryzyko infekcji związanych z implantami. Badania i rozwój implantów o właściwościach przeciwbakteryjnych mogą przyczynić się do postępu w technologii chirurgicznej, aby przezwyciężyć te problemy.
Ocena właściwości przeciwbakteryjnych różnych biomateriałów przy użyciu małych modeli zwierzęcych jest niezbędna przed przystąpieniem do większych modeli zwierzęcych i badań klinicznych9. Liczne badania wykazały zastosowanie mysich modeli zakażeń związanych z implantami przy użyciu bakterii bioluminescencyjnej, która zawiera operon luxABCDE 10,11,12,13,14,15. Chociaż modele te przyspieszają badania nad rozwojem implantów lub technologii antybakteryjnych, mają pewne ograniczenia. Po pierwsze, zaawansowana wiedza specjalistyczna i specjalistyczny sprzęt, taki jak zdjęcia rentgenowskie lub dedykowane systemy obrazowania, są często wymagane do bezpośredniej i dokładnej oceny obciążenia bakteryjnego implantów umieszczonych w modelach mysich. Po drugie, podczas gdy pobrane implanty zazwyczaj oceniają pojedynczy implant w jednym miejscu infekcji na zwierzę, warunki infekcji i reakcje immunologiczne mogą się różnić u poszczególnych osób, co może prowadzić do zmienności wyników ocen porównawczych. Dlatego, porównując działanie przeciwbakteryjne różnych biomateriałów in vivo, wszczepienie i zaszczepienie ich bakteriami w jednolitych warunkach jest bardziej korzystne dla rozwiązania tych problemów. Ponadto niezbędna jest optymalizacja obecnej metodologii i przeprowadzanie ocen ilościowych z odtwarzalnością i dokładnością poprzez wykorzystanie cech modelu zwierzęcego i użytych bakterii.
W badaniu przedstawiono nowatorskie podejście eksperymentalne do zakażeń związanych z implantami in vivo , które umożliwia precyzyjne pomiary w celu oceny tworzenia się biofilmu na powierzchni dwóch implantów w obrębie jednego modelu mysiego za pomocą porównawczych metod analitycznych między i wewnątrzosobniczymi. Biofilm na każdym implancie można określić ilościowo przy użyciu zoptymalizowanych metod wizualizacji biofilmu na implancie, określenia jednostek tworzących kolonie (CFU) i ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) bioluminescencyjnego szczepu Staphylococcus aureus, Xen 36. Poprzednie badanie wykazało, że nowy metalowy implant ma obiecującą skuteczność przeciwbakteryjną in vivo przeciwko Staphylococcus aureus przy użyciu tego kompleksowego podejścia16. Metodologia ta może być łatwo wdrożona w standardowych warunkach laboratoryjnych i może przyspieszyć badania nad opracowaniem biomateriałów przeciwbakteryjnych.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>THOMAS NAUKOWY</td><td>12-16-15-00</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik absorpcji Agilent BioTek 800 TS</td><td>Agilent</td><td>BT800TS</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne igły podskórne Air-Tite, rozstaw igieł: 18 g</td><td>FISHER NAUKOWY</td><td>14817151 (CS)</td><td></td></tr><tr><td>Igły do kręgosłupa BD: 25 g</td><td>FISHER NAUKOWY</td><td>22043805</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do inkubatora stołowego</td><td>FISHER NAUKOWY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa Branson, 115 Vac, 60 Hz</td><td>FISHER NAUKOWY</td><td>2489500</td><td></td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonikator)</td><td></td><td>Czujnik RPI-T48500-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka sorvall pico</td><td>FISHER NAUKOWY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Moduł optyki czasu rzeczywistego System qPCR</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowy sterylizator, 30L</td><td>THOMAS SCIENTIFIC LLC</td><td>22A00N096 (EA/1)</td><td></td></tr><tr><td>Fiolet krystaliczny, 1%, roztwór SCI_ED</td><td>FISHER NAUKOWY</td><td>10114-58-6</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>FISHER NAUKOWY</td><td>877125</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>FISHER NAUKOWY</td><td>8771001</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy mikser wirowy Fisherbrand</td><td>FISHER NAUKOWY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>THOMAS SCIENTIFIC LLC&nbsp;</td><td>15160054</td><td></td></tr><tr><td>Agar z solą mannitolu</td><td>&nbsp; FISHER NAUKOWY&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Micyrobiologiczny</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028063H</td><td></td></tr><tr><td>PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus ATCC 49525 (Xen36)</td><td>Perkin Elmer</td><td>119243</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Bejca żelowa z kwasem nukleinowym</td><td>FISHER NAUKOWY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 10x (% 2,5%)</td><td>FISHER NAUKOWY</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Bulion sojowy tryptyczny&nbsp;</td><td>NETA SCIENTIFIC INC&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Ki</td><td>FISHER NAUKOWY</td><td>501977785</td><td>Modyfikowany system lizy alkalicznej bez granulek</td></tr></tbody></table>

unikalny model mysi do ilościowej oceny tworzenia biofilmu na implantach chirurgicznych w ropniu podskórnym

A Unique Mouse Model for Quantitative Assessment of Biofilm Formation on Surgical Implants in Subcutaneous Abscess

Aby opracować nowy biomateriał o właściwościach przeciwbakteryjnych do ortopedycznych zabiegów chirurgicznych, kluczowe znaczenie ma stworzenie eksperymentalnego modelu zwierzęcego zakażeń związanych z implantami, który ściśle naśladuje stan patologiczny. Dodatkowo wymagane jest porównanie ilościowe z próbkami kontrolnymi w celu oceny tworzenia się biofilmu na materiałach. Jednak obecne modele zwierzęce, które polegają na wszczepieniu każdemu osobnikowi jednego materiału, mogą dawać niespójne wyniki ze względu na niejednorodność statusu infekcji wśród badanych. Co więcej, dokładne ilościowe określenie powstawania biofilmu w materiałach in vivo pozostaje wyzwaniem, a wyniki mogą być niewiarygodne. Aby rozwiązać te problemy, w badaniu tym zademonstrowano unikalny mysi model infekcji związanej z implantem, który umożliwia jednoczesną inkubację dwóch implantów z bakteriami w zamkniętym środowisku w obrębie jednej myszy, tworząc zamknięty ropień podskórny. Dojrzała torebka powietrzna została początkowo utworzona pod skórą pleców. Dwa druty ze stali nierdzewnej zostały połączone i umieszczone w torebce, a następnie zaszczepiono Xen 36, bioluminescencyjny szczep Staphylococcus aureus. Po 14 dniach od inokulacji wokół drutów utworzył się ropień podskórny. Biofilm został całkowicie usunięty z powierzchni każdego drutu, a rozpuszczone zawiesiny bakteryjne zostały dokładnie zmierzone przy użyciu zoptymalizowanych metod w celu oceny tworzenia biofilmu na implancie, określenia jednostek tworzących kolonie i przeprowadzenia ilościowej analizy reakcji łańcuchowej polimerazy. Wykorzystując operon luksa bakterii bioluminescencyjnych, wykorzystano względne poziomy ekspresji luxA i 16S rRNA do określenia obciążenia bakteryjnego w biofilmie na każdym drucie. To zoptymalizowane porównawcze podejście analityczne umożliwia precyzyjną ocenę tworzenia się biofilmu na dwóch przewodach w jednolitych warunkach infekcji w ramach jednego modelu mysiego i może ułatwić rozwój biomateriałów o właściwościach przeciwbakteryjnych.

W badaniu tym oceniono niezawodność kompleksowego podejścia wykorzystującego nowatorski mysi model infekcji związanej z implantami ze zoptymalizowaną oceną ilościową tworzenia biofilmu na powierzchniach implantów, który został wykorzystany w poprzednim badaniu16. Dwa identyczne implanty wykorzystano do zbadania biofilmu utworzonego na ich powierzchni, mając na celu sprawdzenie, czy oba implanty mogą być inkubowane jednocześnie w jednolitych warunkach infekcji w poj...

Protokół ten opisuje unikalny eksperymentalny model zakażeń związanych z implantami, który umożliwia jednoczesną inkubację dwóch implantów z bakteriami w identycznych warunkach u jednej myszy. Umożliwia również precyzyjną ocenę tworzenia się biofilmu na powierzchniach implantów przy użyciu zoptymalizowanych porównawczych metod analitycznych, demonstrując zaawansowane techniki oceny właściwości przeciwdrobnoustrojowych biomateriałów.

Unikalny model mysi do ilościowej oceny tworzenia biofilmu na implantach chirurgicznych w ropniu podskórnym

To develop a novel biomaterial with antibacterial properties for orthopedic surgical procedures, establishing an experimental animal model of ...

Nasze badania mają na celu opracowanie innowacyjnego leczenia zakażeń związanych z implantami. Aby ocenić nowe biomateriały o potencjalnych właściwościach przeciwdrobnoustrojowych, opracowujemy bardziej wartościowe metody testowania in vivo. Wcześniejsze modele zwierzęce zazwyczaj ograniczały się do wywołania pojedynczej infekcji związanej z implantami na zwierzę, co może prowadzić do znacznej zmienności średnich wyników uzyskanych od wielu zwierząt.Nasz mysi model pozwala na bezpośrednie porównanie dwóch odcisków, poddanych identycznym warunkom zakaźnym w obrębie jednego zwierzęcia, zapewniając w ten sposób cenną ocenę aktywności przeciwbakteryjnej. Nasza metodologia eksperymentalna in vivo przyspieszy badania nad potencjalnie przeciwdrobnoustrojowymi biomateriałami, przyczyniając się w przyszłości do opracowania nowego leczenia zakażeń związanych z implantami. Nasze podejście eksperymentalne można odtworzyć przy użyciu standardowego sprzętu i prostych procedur w konwencjonalnych warunkach badawczych, co zwiększa zrozumienie mechanizmów stojących za aktywnością przeciwbakteryjną.Aby rozpocząć, umieść znieczuloną mysz na łóżku chirurgicznym. Napełnij 10-mililitrową strzykawkę stery

a-unique-mouse-model-for-quantitative-assessment-biofilm-formation-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: de Vries, C. R., et.al. Model opóźnionej inokulacji przewlekłej infekcji rany Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje opóźnione szczepienie luminescencyjnego Pseudomonas aeruginosa u myszy noszącej dwie pełnogrube rany grzbietowe pokryte przezroczystym opatrunkiem foliowym. Ułatwia to powstawanie biofilmu i powstawanie przewlekłych infekcji. Regularne monitorowanie bioluminescencji umożliwia ilościowe określenie obciążenia bakteriami oraz śledzenie postępu infekcji...

Opracowywanie mysiego modelu przewlekłej infekcji skóry Pseudomonas aeruginosa 

Source: Zhang, C., et al., Development and Assessment of Intracellular Infection Models for Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2025)The video demonstrates the isolation of kidneys containing Staphylococcus aureus-infected macrophages, followed by tissue homogenization to release intracellular bacteria. It quantifies bacterial persistence within macrophages in control and antibiotic-treated groups by counting colony-forming units.

Assessing Intracellular Bacterial Persistence and Antibiotic Resistance in a Mouse Model

Ten film demonstruje rozwój mysiego modelu in vivo do badania tworzenia biofilmu Candida albicans w tkance podskórnej. Eksperyment polega na wszczepieniu urządzeń zakażonych Candida w okolicy pleców zwierzęcia w celu rozwoju biofilmu.

Candida albicans (Candida albicans) Tworzenie biofilmu w mysim modelu in vivo

Połączone obrazowanie optyczne i μCT w mysim modelu infekcji implantu ortopedycznego, wykorzystujące bioluminescencyjny zmodyfikowany szczep Staphylococcus aureus, zapewniło możliwość nieinwazyjnego i podłużnego monitorowania dynamiki infekcji bakteryjnej, jak również odpowiadającej jej reakcji zapalnej i zmian anatomicznych w kości.

Połączone obrazowanie optyczne in vivo i μCT w celu monitorowania infekcji, stanu zapalnego i anatomii kości w zakażeniu implantu ortopedycznego u myszy

Przedstawiamy eksperymentalną procedurę rozwoju biofilmu Candida albicans w mysim modelu podskórnym. Biofilmy grzybów określono ilościowo, określając liczbę jednostek tworzących kolonie oraz nieinwazyjne obrazowanie bioluminescencyjne, w którym ilość wytwarzanego światła odpowiada liczbie żywotnych komórek.

Candida albicans (Candida albicans) Rozwój biofilmu na istotnych z medycznego punktu widzenia ciałach obcych w mysim modelu podskórnym, a następnie obrazowanie bioluminescencyjne

Tutaj opisujemy nowy model myszy z cukrzycą, wykorzystujący bezwłose myszy do nieinwazyjnego monitorowania w czasie rzeczywistym infekcji ran biofilmu bioluminescencyjnych Pseudomonas aeruginosa. Metodę tę można zaadaptować do oceny infekcji innymi gatunkami bakterii i mikroorganizmami modyfikowanymi genetycznie, w tym biofilmami wielogatunkowymi, oraz do testowania skuteczności strategii zwalczania biofilmu.

Przejdźmy na jasną stronę mocy: monitorowanie in vivo zakażeń biofilmem Pseudomonas aeruginosa w ranach przewlekłych w modelu myszy bezwłosej z cukrzycą

Opisano podejście do wykrywania w czasie rzeczywistym wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zranienia skórne i zakażenie Staphylococcus aureus u myszy. Porównując myszy LysM-EGFP (które posiadają fluorescencyjne neutrofile) z krzyżówką LysM-EGFP szczepu myszy z niedoborem odporności, pogłębiamy naszą wiedzę na temat infekcji i rozwijamy podejścia do zwalczania infekcji.

Mysi model do oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej na zakażenie Staphylococcus aureus

Protokół opisuje nowatorski model infekcji implantu kręgosłupa in vivo, gdzie implant z drutu k-wire ze stali nierdzewnej jest infekowany bioluminescencyjnym Staphylococcus aureus Xen36. Obciążenie bakteryjne jest monitorowane podłużnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i potwierdzane liczbą jednostek tworzących kolonie po eutanazji.

Mysi model zakażenia implantu rdzeniowego in vivo

Opisujemy protokół opóźnionej inokulacji do generowania przewlekłych infekcji ran u myszy immunokompetentnych.

Model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa

Infekcja stawu okołoprotezowego (PJI) spowodowana przez niebezpieczne patogeny jest powszechna w ortopedii klinicznej. Istniejące modele zwierzęce nie są w stanie dokładnie symulować rzeczywistej sytuacji PJI. W tym miejscu stworzyliśmy mysi model PJI związany z biofilmem Candida albicans, aby badać i opracowywać nowe terapie PJI.

Model zakażenia Candida albicans stawu okołoprotezowego u myszy

Niniejszy protokół opisuje model mysi wykorzystujący podskórną implantację grzbietową do badania zakażeń związanych z implantami, umożliwiając kompleksowe badanie mechanizmów patofizjologicznych i wspierając rozwój kryteriów diagnostycznych z ukierunkowanymi strategiami terapeutycznymi.

Zwierzęcy model zakażeń związanych z implantami u myszy

Poznaj innowacyjny model myszy do ilościowej oceny tworzenia biofilmu na implantach chirurgicznych w ropniu podskórnym. Ta metoda umożliwia jednoczesne porównanie dwóch implantów w identycznych warunkach zakażenia.

Unikalny model mysi do ilościowej oceny tworzenia biofilmu na implantach chirurgicznych w ropniu podskórnym

Przeglądaj więcej filmów