In Vivo Obrazowanie ujawnia migracyjne zachowanie leukocytów w stawach

Ponieważ komórki krwi leukocytów pochodzą z szpiku kostnego, muszą przenikać do tkanek, aby wywołać stan zapalny. Kontrola tego procesu stanowi kluczowy punkt, w którym można opracować nowe terapie łagodzące stan zapalny. Ogólnie rzecz biorąc, transport leukocytów do tkanek zapalnych odbywa się w żyłkach ponaczynkowych i następuje po kaskadzie adhezji, która zaczyna się od wychwytu wolno przepływającego leukocytu przez ścianę naczynia.

Następnie toczy się wzdłuż ściany statku w kierunku pro. Zatrzymanie śródbłonka. Jest to od adhezji i pełzania we wszystkich kierunkach po powierzchni naczynia, aby znaleźć odpowiednie miejsce i przenieść się do konkretnego miejsca w tkance.

Wywoływanie stanów zapalnych. Te wyraźne etapy są regulowane przez kombinację sygnałów molekularnych, w tym chemioatraktantów. Chemoatraktant aktywuje leukocyty za pomocą ZP Cs i odgrywa kluczową rolę w kaskadzie migracyjnej.

Dodatkowe badania końcowe i eksperymenty in vitro nie dostarczyły wglądu w to, jak sygnalizacja receptorów chemoatraktantów i chemoatraktantów dynamicznie regulują zachowania migracyjne leukocytów in vivo. Najnowsze postępy w technologii obrazowania dostarczyły bezprecedensowego wglądu w migrację komórek odpornościowych u żywych zwierząt, co znacznie pogłębia nasze zrozumienie molekularnej regulacji handlu komórkami immunologicznymi in vivo. Ostatnio złożyliśmy wniosek o zbadanie molekularnego mechanizmu kontrolującego transport neutrofili do miejsc zapalenia stawów.

Nasze obrazowanie stawów in vivo to nowy paradygmat reakcji nadwrażliwości typu III w stanie stawu. Składnik komplementowy C5a działa jako inicjator stanu zapalnego, podczas gdy komórki tkankowe odgrywają ważniejszą rolę w stanie zapalnym w obecnym paradygmatze reakcji nadwrażliwości typu III. Dlatego obrazowanie stawu in vivo jest cenną techniką do odkrywania migrującego zachowania leukocytów i dynamiki molekularnej z zapalonym stawem.

Dlatego udostępniamy ten protokół obrazowania stawów in vivo, aby wspierać grupy badawcze badające ten proces w stanach zapalnych. Przygotuj kolagen typu II z rozcieńczenia bydła w stężeniu 0,05 kwas molowy, wstrząsając przez noc w temperaturze czterech stopni, aby uzyskać rozcieńczenie mieszanki emulsji z pełnym adiuwantem Freunda w stosunku 1:2 w szklanej strzykawce. Można było też mieszanie ręcznie przez około 20 minut.

Proces ten generuje ciepło, więc schładz szklaną strzykawkę zawierającą emulsję na lodzie. Mysz znieczulona przed szczepieniami. Kształtuj włosy wzdłuż ogona za pomocą maszynki do przygotowań do szczepień.

Powoli wstrzykuj 100 mikrolitrów objętości emulsji do przestrzeni podskórnej blisko podstawy ogona. Kliniczne oceny artretyzmu oraz pomiar grubości łapy są niezbędne do oceny aktywności choroby. Zazwyczaj kliniczne oceny i pomiary grubości łap w przypadku artretyzmu wykonuje się co jeden do trzech dni po pierwszych szczepieniach.

Kliniczny wynik artretyzmu do tego wyniku to suma wyników dla wszystkich czterech łap każdej myszy. Wyniki są rejestrowane następująco. Więc zero to nienormalność.

Jednym z nich jest rumień i obrzęk jednego palca. Drugim jest rumień oraz obrzęk dwóch palców lub rumień oraz obrzęk stawu skokowego. Po trzecie: rumień i obrzęk więcej niż trzech palców lub obrzęk dwóch palców i stawu skokowego.

Czwartym jest rumień i poważne obrzęk kostki, stopy i palca z deformacją. Pomiar grubości łapy jest mierzony grubością każdej łapy za pomocą cyfrowych zacisków przesuwanych. Średnia grubość łapy na wszystkich czterech łapach jest stosowana dla każdej myszy.

Myszy są znieczulone, a następnie kształtują nogę myszy za pomocą maszynek. Użyj kremu do usuwania włosów, aby usunąć pozostałe włosy. Usuń krem wilgotną gazą.

Stosuj sterylny lubrykant rogówki na oba oczy, aby zapobiec wysuszaniu rogówki i zmniejszyć ryzyko drgań rogówki. Pod mikroskopem chirurgicznym wykonaj nacięcie w jednym centymetrze wzdłuż skóry za pomocą mikronożyczek. Pokryj obrazowanie wcześniej, z 1,5% agarozy w PBS.

Scena jest ustawiona na mikroskopie. Dostosuj ustawienia mikroskopu konfokalnego, w tym moc lasera, wzmocnienie, przesunięcie i lokalizację. Gdy odpowiednie miejsce zostanie zidentyfikowane, rozpocznij akwizycję obrazu.

Reprezentatywny wynik CIA. Zazwyczaj początek artretyzmu obserwuje się około 28. dnia, a wynik kliniczny artretyzmu i grubość łapy osiągają szczyt w 35. dniu. Częstość występowania CIA u myszy DBA jednodniowych zwykle przekracza 900 do 100% do 35. dnia.

Tutaj film po lewej pokazuje myszy z klubem kontrolującym miejsce, a ten po prawej pokazuje staw w myszach CIA. W tych filmach zielone komórki reprezentują neutrofile dodatnie Ly6G. Pomarańczowe komórki wskazują na dodatkowe limfocyty T na poziomie CD4, a białe obszary odpowiadają naczyniom krwionośnym.

W 35. dniu wyraźnie widać, że poza naczyniami krwionośnymi występuje więcej neutrofilów Ly6G w porównaniu do CD4+T-komórek. Te neutrofile są bardzo ruchome, aktywnie poruszają się w wielu kierunkach wewnątrz zapalonego stawu. Tutaj przedstawiam reprezentatywną analizę obrazowania stawów in vivo.

Wykres po lewej pokazuje liczbę nowo przyklejonych neutrofilów, natomiast ten po prawej pokazuje liczbę nowo transmigrowanych neutrofilów podczas 30-minutowego nagrania. W stawach artretycznych liczba zarówno nowo przyklejonych, jak i przetransmigrowanych neutrofilów jest znacząco wyższa niż w stawach kontrolnych. Podsumowując, przedstawiamy nasz obecny protokół obrazowania stawów in vivo, który umożliwia wysokorozdzielczą, w czasie rzeczywistym wizualizację migracyjnego zachowań leukocytów u żywych myszy w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Ta technika pozwala nam bezpośrednio obserwować, jak komórki odpornościowe oddziałują w tkankach zapalnych, jak przylegają do ścian naczyń krwionośnych, transmigrują do tkanki oraz organizują reakcję zapalną. Dzięki temu podejściu możemy uchwycić dynamiczne zachowania komórkowe, które w innym przypadku byłyby niewidoczne konwencjonalnymi metodami histologicznymi lub in vitro. Łącząc ten system obrazowania z analizą ilościową i markerami molekularnymi, możemy odkryć kluczowe szlaki napędzające inicjację i postęp artretyzmu.

Co ważne, spostrzeżenia uzyskane z tych obserwacji in vivo nie tylko pogłębiają nasze zrozumienie dynamiki komórek odpornościowych, ale także stanowią naukowe podstawy lub identyfikację nowych celów terapeutycznych. W miarę jak ta technologia będzie się rozwijać i coraz więcej badaczy dostosowuje i udoskonala metodologię, wierzymy, że obrazowanie in vivo stanie się nieodłączną platformą do badania złożonych chorób immunologicznych oraz potężnym przełamaniem łączącym podstawową immunologię z badaniami translacyjnymi i klinicznymi. Ostatecznie mamy nadzieję, że to podejście przyczyni się do rozwoju innowacyjnych terapii reumatoidalnego zapalenia stawów i innych przewlekłych chorób zapalnych w najbliższej przyszłości.