Obrazowanie in vivo 2-fotonowego wapnia w warstwie 2/3 myszy

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroobwodów w korze nowej, konieczne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. In vivo. Obrazowanie wapnia jest jedyną metodą, która pozwala rejestrować aktywność gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Metoda polega na wszczepieniu okna obrazowania czaszki, wstrzyknięciu fluorescencyjnego barwnika wapniowego, który może być wchłonięty przez dużą liczbę neuronów, a na końcu zarejestrowaniu aktywności neuronów za pomocą poklatkowego obrazowania wapnia. Cześć, jestem Payman i pracuję w laboratorium Carlosa Portera Cayo na Wydziale Neurologii w David Geffen School of Medicine na UCLA. W poprzednich filmach nasze laboratorium zademonstrowało procedurę wykonywania kraniotomii i obrazowania fotonowego przepływu krwi u myszy.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę wykonywania obrazowania wapnia in vivo do fotonów u myszy. Więc przejdźmy do tego Zanim zaczniemy. Należy przygotować roztwór barwnika do wstrzykiwań.

Najpierw przygotuj fluorescencyjny roztwór wskaźnika wapnia. Używamy barwników estrowych lub w skrócie barwników am. Są to barwniki, które mogą być wchłaniane przez komórki po wstrzyknięciu pozakomórkowym, zwykle używamy zielonego BAFTA 1:00 w nocy lub grypy o 4:00 w stężeniu jednego milimola.

Najpierw przygotowujemy 20% roztwór onic F1 27. W DMSO podgrzewamy roztwór przed użyciem każdego dnia, aż będzie klarowny. Wskaźnik wapnia rozpuszczamy w 20%onicznym F1 27 DMSO przez 15 do 20 minut do stężenia 10 milimolowego.

Następnie rozcieńczamy roztwór do jednego milimola w roztworze zawierającym w milimolach 1 50 i ACL 2,5 KCL 10 hałd, pH 7,4 i wirujemy przez dodatkowe 10 do 20 minut. Dodajemy 100 mikromolowych żwaczy siarki 1 0 1, aby selektywnie oznaczyć astrocyty i uwidocznić pipetę podczas wstrzykiwania barwnika, a następnie wszczepiamy okienko czaszkowe nad obszarem, który ma być obrazowany. Ogólne podejście do tej operacji zostało przez nas opisane we wcześniej wydanym artykule z filmem o pracy, ale następujące modyfikacje są ważne dla iniekcji barwnika wapniowego.

Mniejsza kraniotomia o średnicy dwóch milimetrów jest wykonywana nad obszarem kory mózgowej, zwracając szczególną uwagę, aby nie uszkodzić leżącej poniżej opony twardej. Szkiełko nakrywkowe jest zabezpieczone na miejscu nad kraniotomią, ale tylko częściowo zakrywa kraniotomię, pozostawiając niewielką przerwę między krawędzią kraniotomii a szklanym szkiełkiem nakrywkowym, aby umożliwić ukośne wejście pipety do kory przed wstrzyknięciem. Wokół kraniotomii wykonuje się płytką studnię z cementem dentystycznym.

Studzienka do eksperymentów obrazowania wapnia powinna sięgać jak najdalej w kierunku rostralnym i być na tyle płytka, aby umożliwić wprowadzenie iniekcji Mikro pipeta, roztwór filtrujemy filtrem odśrodkowym 0,45 mikrona bezpośrednio przed wstrzyknięciem. Mysz jest następnie przenoszona do stolika mikroskopowego, a głowa unieruchomiona, jak pokazano na naszym filmie na temat obrazowania przepływu krwi. Następnie wyciągamy szklane pipety mikroelektrodowe do średnicy końcówki, co daje rezystancję od dwóch do czterech megaomów.

Za pomocą ściągacza do pipet na szklaną pipetę umieszcza się mieszaninę barwników wskaźnika wapniowego. Za pomocą mikrostrzykawki za pomocą mikromanipulatora, mikropipeta jest delikatnie opuszczana na powierzchnię mózgu za pomocą obiektywu z czterema rozmiarami, a następnie umieszczana bardziej precyzyjnie. W przypadku obiektywu 40 x wybiera się odpowiednie miejsce do wstrzyknięcia, tak aby naczyń krwionośnych było niewiele lub nie było ich wcale.

Aby zaciemnić obrazowanie za pomocą mikroskopii dwufotonowej, końcówka mikropipety jest wizualizowana i powoli przesuwana do kory mózgowej na głębokość 200 mikrometrów poniżej opony twardej. Aby wykonać to tak dokładnie, jak to możliwe, odczyt ostrości Z obiektywu jest ustawiony na zero. Po wizualizacji opony twardej wizualizuje się mikropipetę i pobierany jest odczyt ostrości Z, gdy mikropipeta jest opuszczana do mózgu na głębokość 200 mikrometrów poniżej opony twardej.

Mieszanina D jest następnie wtryskiwana pod ciśnieniem 10 PSI przez jedną minutę. Za pomocą piko spritzera zwykle dostarczamy od dwóch do czterech wstrzyknięć mieszanki barwników wapniowych AM oddzielonych w przestrzeni od około 200 do 300 mikronów. To podejście do masowego ładowania polegającego na lekko nakładających się iniekcjach zapewnia, że obszar o wymiarach 600 na 600 mikronów jest odpowiednio wybarwiony do obrazowania wapnia.

Obrazowanie rozpoczyna się godzinę po wstrzyknięciu mieszaniny barwnika, aby umożliwić dyfuzję barwnika i pobranie go przez neurony. Obrazowanie dwufotonowe in vivo wykonuje się za pomocą specjalnie wykonanego mikroskopu dwufotonowego przy użyciu lasera szafirowego kameleona dostrojonego do 800 do 880 nanometrów i technologii Cambridge. Obrazy lustrzane galwanometru są pozyskiwane za pomocą oprogramowania do skanowania obrazów opracowanego w Carl's Vida's.

Laboratoryjna moc lasera jest zwykle znacznie niższa niż 70 miliwatów w próbce. Obrazy całego pola są rejestrowane za pomocą obiektywu Olympus 20 x 0,95 NA przy 1,95 do 15,63 klatek na sekundę, pięciu 12 na 2 56 pikseli do 2 56 na 64 piksele. Skany liniowe są rejestrowane z częstotliwością 500 Hz podczas obrazowania.

Zwierzęta są trzymane pod światłem fluoru, znieczulenia od 0,6 do 0,9%, a także w temperaturze 37 stopni Celsjusza za pomocą aparatu Harvarda. Urządzenie do kontroli temperatury zwraca uwagę, aby częstość oddechów zwierząt była jak najbardziej zbliżona do 100 oddechów na minutę. Ten poziom użycia znieczulenia jest najniższym poziomem, który unieruchamia zwierzę, ale nadal pozwala na rejestrowanie spontanicznej aktywności.

Przyjrzyjmy się teraz typowemu eksperymentowi z obrazowaniem wapnia. Istnieją dwa trzy neurony somatosensorycznej kory beczkowej postnatalnej do ośmiu 10 myszy. Zostały zabarwione zielonym organem BTA am i sfotografowane obiektywem 20 x 0,95 NA.

Zdjęcia były wykonywane co 0,512 sekundy. Ten trzyminutowy film pokazuje jednoczesną aktywację dużych części tych neuronów barwnika występujących od jednego do dwóch razy na minutę. Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać obrazowanie in vivo wapnia aktywności sieci w warstwie drugiej, trzeciej kory mózgowej.

Przewagą tej metody nad zapisami elektrofizjologicznymi jest to, że jest mniej inwazyjna i pozwala na rejestrację aktywności w gęstych sieciach neuronowych. Podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu szczególnej ostrożności podczas wykonywania kraniotomii, aby nie uszkodzić opony twardej.

Nawet niewielka ilość krwawienia podtwardówkowego znacznie zaciemni obrazowanie. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.