Name: Obrazowanie in vivo 2-fotonowego wapnia w warstwie 2/3 myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj obrazowanie wapnia 2-fotonowego in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy. Ta technika umożliwia rejestrację aktywności gęstych populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Oldze Garaschuk za pomocne dyskusje na temat optymalizacji masowego wprowadzania wskaźników wapnia.

<ol>
<li>Przygotować roztwór fluorescencyjnego wskaźnika wapnia. Stosujemy barwniki z estrem acetoksymetylowym, w skrócie barwniki AM. Są to barwniki, które mogą być pobierane przez komórki podczas wstrzykiwania pozakomórkowego. Zazwyczaj używamy Oregon-Green BAPTA-1 AM lub Fluo-4 AM w stężeniu 1 mM. Barwniki AM można nabyć od firmy Invitrogen w fiolkach o zawartości 50 µg. Najpierw przygotowujemy 20% roztwór Pluronic F-127 w DMSO. Roztwór ten podgrzewamy codziennie przed użyciem, aż stanie się klarowny. Rozpuszczamy wskaźnik wapnia w 20% Pluronic F-127/DMSO przez 15-20 minut do stężenia 10 mM. Następnie rozcieńczamy roztwór do 1 mM w roztworze zawierającym (w mM): 150 NaCl, 2.5 KCl, 10 Hepes, pH 7.4. Dodatkowo zazwyczaj dodaje się 100 µM Sulforhodamine 101 w celu znakowania astrocytów i wizualizacji pipety podczas wstrzykiwania. Przed wstrzyknięciem filtrujemy roztwór za pomocą wirówkowego filtra 0.49 µm (Stosiek et al., 2003; Garaschuk et al., 2006). </li>
<li>Zaimplantować okno czaszkowe nad obszarem poddanym obrazowaniu. <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=680" target="_blank">Opisaliśmy ogólne podejście w JoVE</a>, jednak następujące modyfikacje są istotne dla wstrzykiwania barwnika wapniowego: Wykonujemy mniejszą kraniotomię o średnicy 2 mm nad interesującym nas obszarem kory, zachowując szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić leżącej poniżej opony twardej. Mocujemy szkiełko nakrywkowe nad kraniotomią, ale zakrywamy ją tylko częściowo, pozostawiając niewielką szczelinę między krawędzią kraniotomii a szkiełkiem, aby umożliwić ukośne wprowadzenie pipety do kory. Przed wstrzykiwaniem formujemy płytką studzienkę z cementu dentystycznego wokół kraniotomii. Studzienka powinna rozciągać się w kierunku rostralnym i być na tyle płytka, aby umożliwić wprowadzenie mikropipety do wstrzykiwania. </li>
<li>Przenieść mysz na stolik mikroskopu i unieruchomić głowę, zgodnie z instrukcjami w naszym <a href="https://www.jove.com/index/details.stp?ID=678" target="_blank">filmie dotyczącym obrazowania przepływu krwi</a>. </li>
<li>Wytworzyć szklane pipety mikroelektrod o średnicy końcówki zapewniającej rezystancję 2-4 Mega Ohm, używając wyciągarki do pipet. Napełnić szklaną pipetę mieszaniną barwnika wskaźnika wapnia za pomocą mikrosyringi. Za pomocą mikromanipulatora delikatnie opuścić mikropipetę na powierzchnię mózgu, korzystając z obiektywu 4X, a następnie precyzyjnie ustawić ją pod obiektywem 40X. Wybrać odpowiednie miejsce wstrzyknięcia, tak aby nad nim znajdowało się mało lub żadnych naczyń krwionośnych, które mogłyby utrudniać obrazowanie. Przy użyciu mikroskopii dwufotonowej wizualizujemy końcówkę pipety i powoli wprowadzamy ją do kory na głębokość 200 µm poniżej opony twardej. Następnie wstrzykujemy mieszaninę barwnika pod ciśnieniem 10 PSI przez 1 minutę za pomocą Picospritzera. Zazwyczaj wykonujemy od dwóch do czterech wstrzyknięć mieszaniny barwnika wapniowego AM, oddalonych od siebie w przestrzeni o około 200-300 µm. To podejście polegające na masowym wprowadzaniu lekko nakładających się wstrzyknięć zapewnia odpowiednie zabarwienie obszaru o wielkości do 600 x 600 µm dla obrazowania wapnia. Obrazowanie rozpoczynamy 1 godzinę po wstrzyknięciu mieszaniny barwnika AM, aby umożliwić dyfuzję barwnika i jego pobranie przez neurony. </li>
<li>Przeprowadzić obrazowanie dwufotonowe in-vivo przy użyciu specjalnie zbudowanego mikroskopu dwufotonowego z laserem tytano-szafirowym Chameleon (dostrojonym do 800-880 nm) i lustrami galwanometrycznymi Cambridge Technology. Obrazy pozyskujemy przy użyciu oprogramowania ScanImage opracowanego w laboratorium Karela Svobody (Pologruto et al., 2003). Moc lasera w punkcie próbki wynosi zazwyczaj znacznie poniżej 70 mW. Obrazy całego pola pozyskiwane są przy użyciu obiektywów Olympus 20X (0.95 NA) lub 40X (0.8 NA), z prędkością 1.95-15.63 klatek na sekundę (od 512 x 256 pikseli do 256 x 64 pikseli). Skany liniowe są pozyskiwane z częstotliwością 500 Hz. Podczas obrazowania zwierzęta znajdują się pod lekką anestezją izofluranem (0.6-0.9%) i są utrzymywane w temperaturze 37°C przy użyciu urządzenia do kontroli temperatury Harvard Apparatus. Dbamy o to, aby częstość oddechów zwierząt była jak najbliższa 100 oddechom/minutę. Ten poziom anestezji jest najniższym poziomem, który unieruchamia zwierzę, ale wciąż pozwala na rejestrację aktywności spontanicznej.</li>
</ol>

<ol><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, (2006).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.%26nbsp%3B%26nbsp%3B+Biomed+Eng+Online+2%3A13%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.&nbsp;&nbsp; Biomed Eng Online 2:13.</a> Biomed Eng Online. 2, (2003).</li>
</ol>

Przewagą tej metody nad rejestracją elektrofizjologiczną jest jej mniejsza inwazyjność oraz możliwość rejestrowania aktywności w gęstych sieciach neuronalnych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu szczególnej ostrożności podczas kraniotomii, aby nie uszkodzić opony twardej. Nawet niewielka ilość krwawienia podtwardówkowego może znacznie pogorszyć jakość obrazowania.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green BAPTA1-AM</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>O-6807</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4- AM</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 w DMSO</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Filtr wirowkowy (0.45 micron)</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC3 0HV 0S</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neokorze, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronowej z rozdzielczością pojedynczych komórek. Metoda ta polega na implantacji czaszkowego okna obrazującego, wstrzyknięciu fluorescencyjnego barwnika wskaźnikowego wapnia, który może zostać pobrany przez dużą liczbę neuronów, a następnie zarejestrowaniu aktywności neuronów za pomocą obrazowania wapnia w odstępach czasu przy użyciu mikroskopu dwufotonowego in-vivo. Współiniekcja barwników specyficznych dla astrocytów pozwala na odróżnienie neuronów od astrocytów. Technikę tę można przeprowadzić u myszy wykazujących ekspresję cząsteczek fluorescencyjnych w specyficznych subpopulacjach neuronów, aby lepiej zrozumieć interakcje sieciowe różnych grup komórek.

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortexie, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów.

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów in vivo. Obrazowanie wapniowe jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek.Metoda ta polega na implantacji okna do obrazowania czaszki, wstrzyknięciu fluorescencyjnego barwnika wapnia, który może być pobierany przez dużą liczbę neuronów, a następnie rejestracji aktywności neuronów za pomocą obrazowania wapnia w trybie time-lapse. Cześć, jestem Payman z laboratorium Carlosa Portera Cayo w Departamencie Neurologii w David Geffen School of Medicine na UCLA. W poprzednich filmach nasze laboratorium zaprezentowało procedurę wykonywania kraniotomii oraz dwufotonowego obrazowania przepływu krwi u myszy.Dzisiaj przedstawimy procedurę obrazowania wapnia in vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej u myszy. Przejdźmy zatem do szczegółów. Przed rozpoczęciem należy przygotować roztwór do wstrzykiwania barwnika.W pierwszej kolejności należy przygotować roztwór fluorescencyjnego wskaźnika wapnia. Stosujemy barwniki będące estrami etylu, w skrócie barwniki AM. Są to barwniki, które mogą być po

in-vivo-2-photon-calcium-imaging-in-layer-23-of-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie in vivo 2-fotonowego wapnia w warstwie 2/3 myszy

Zależne od doświadczenia zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne.  Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Tutaj opisujemy procedury eksperymentalne związane z dwufotonowym obrazowaniem kory myszy podczas zachowania w środowisku wirtualnej rzeczywistości.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia u myszy poruszających się w środowisku rzeczywistości wirtualnej

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Tutaj prezentujemy procedurę wykonywania wielkoskalowego obrazowania Ca2+ z rozdzielczością komórkową w wielu warstwach kory mózgowej u swobodnie poruszających się myszy. Setki aktywnych komórek można obserwować jednocześnie za pomocą miniaturowego mikroskopu montowanego na głowie w połączeniu z wszczepioną sondą pryzmatyczną.

Wielowarstwowe obrazowanie kory Ca2+ u swobodnie poruszających się myszy z sondami pryzmatycznymi i zminiaturyzowaną mikroskopią fluorescencyjną

Prezentujemy protokół obrazowania in vivo dwufotonowego do obrazowania kory mózgowej noworodków myszy. Metoda ta jest odpowiednia do analizy dynamiki rozwojowej neuronów korowych, mechanizmów molekularnych kontrolujących dynamikę neuronów oraz zmian w dynamice neuronów w modelach chorób.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie neuronów korowych u nowonarodzonych myszy

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Poznaj obrazowanie wapnia 2-fotonowego in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy. Ta technika umożliwia rejestrację aktywności gęstych populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Przeglądaj więcej filmów