Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne oparte na kodach kreskowych DNA do analizy próbek FFPE z genetycznie przeprogramowanego mysiego czerniaka

Przedstawiamy protokół opracowania i walidacji multipleksowego panelu immunofluorescencyjnego do badania mysich tkanek FFPE i demonstrujemy jego użyteczność poprzez badanie próbek z modelu czerniaka traktowanego nanocząstkami dostarczającymi DNA osocza, kodujące sygnały immunologiczne do przeprogramowania mikrośrodowiska guza. W tej dziedzinie brakowało rygorystycznie opracowanych i zwalidowanych protokołów immunofluorescencji multipleksowych kompatybilnych z mysimi tkankami FFPE zatopionymi w parafinie utrwalonymi w formalinie.

Osadzanie parafiny utrwalonej formaliną zachowuje morfologię tkanek przez długi czas, jest łatwe w obsłudze i przechowywaniu oraz umożliwia tworzenie mikromacierzy tkankowych do oglądania wielu próbek na jednym szkiełku.

Przestrzenne obrazowanie proteomiczne poprawi wizualizację i analizę złożonego mikrośrodowiska guza, ostatecznie pomagając w przewidywaniu odpowiedzi immunologicznych, co może przyczynić się do opracowania lepszych metod terapeutycznych.

Będziemy korzystać z tego protokołu, aby umożliwić lepsze profilowanie przestrzenne mysich modeli nowotworów w wielu innych typach nowotworów i różnych narządach odpornościowych.

[Narrator] Na początek upiecz szkiełka z bibuły FFPE w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia schłodzić szkiełka w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed rozpoczęciem deparafinowania i ponownego nawodnienia. Następnie inkubuj szkiełka w roztworze ksylenu dwa razy przez pięć minut każde, aby usunąć parafinę, a następnie ponownie uwodnić tkankę, przesuwając szkiełka przez 100% etanol dwa razy przez pięć minut każda. Umieść szkiełko kolejno w 90%, 70%, 50% i 30% roztworach etanolu na pięć minut każdy. Umyj szkiełka dwukrotnie wodą destylowaną przez pięć minut każde. Wykonaj pobranie antygenu, a następnie użyj świeżego roztworu wybielającego, aby dwukrotnie wybielić tkankę w odstępach 45-minutowych przed wykonaniem barwienia przeciwciałami. Następnie wykonaj barwienie przeciwciał przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą plastikowej komory. Po zabarwieniu wyjmij plastikową komorę i zbierz wcześniej nałożony koktajl przeciwciał. Umyj szkiełka dwa razy w buforze barwiącym przez dwie minuty każde. Inkubować szkiełka w słoiku barwiącym zawierającym 40 mililitrów roztworu utrwalającego po barwieniu przez 10 minut, a następnie płukać je PBS trzy razy przez dwie minuty każde. Teraz przenieś szkiełka do lodowatego metanolu na pięć minut, a następnie spłucz PBS. Nałożyć 200 mikrolitrów końcowego roztworu utrwalającego na każde szkiełko w komorze wilgotnościowej. Po 20-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej ponownie umyć szkiełka w PBS przez trzy cykle po dwie minuty każdy. W przypadku natychmiastowego obrazowania przetrzyj szkiełko wokół tkanki za pomocą niestrzępiącej się chusteczki. Naciśnij komorę przepływową przez 30 sekund za pomocą sprzętu do montażu komory przepływowej. W przypadku późniejszego obrazowania należy przechowywać szkiełko bez umieszczania komory przepływowej w buforze pamięci w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Gdy będziesz gotowy do obrazowania, przenieś slajdy z bufora pamięci masowej do PBS na 10 minut przed zastosowaniem komórki przepływowej. Następnie przygotuj DMSO do docierania w oparciu o żądane cykle obrazowania. Przygotować reporterowy roztwór podstawowy wymagany dla całkowitej liczby cykli obrazowania. Odpipetować 250 mikrolitrów reporterowego roztworu podstawowego i pięć mikrolitrów każdego reportera do oznakowanych czarnych lub bursztynowych jednomililitrowych probówek wirówek. Przenieść roztwór na czarną 96-dołkową płytkę i uszczelnić ją folią klejącą. Teraz uruchom urządzenie do obrazowania i użyj menedżera instrumentów, aby ustawić parametry i czasy ekspozycji. Umieść płytkę reporterową w urządzeniu, a następnie umieść szkiełko w uchwycie mikroskopu, aby rozpocząć obrazowanie. Zdobądź obrazy poplamionych tkanek. Zainstaluj najnowszą wersję oprogramowania do cyfrowej analizy patologii. Kliknij przycisk Utwórz projekt i wybierz folder docelowy dla obszaru projektu. Następnie kliknij Dodaj obrazy, a następnie Wybierz pliki. Następnie przejdź do pliku QuP TIFF utworzonego z multipleksowego obrazowania immunofluorescencyjnego. Ustaw typ obrazu na fluorescencję, zachowaj ustawienia domyślne i kliknij przycisk Importuj. Jeśli korzystasz z aplikacji QuPath, kliknij dwukrotnie nowy obraz, aby otworzyć przestrzeń roboczą, a następnie naciskaj przycisk Plik i Zapisz okresowo, aby śledzić zmiany w projekcie. Przełącz ustawienia widoczności i wyświetlania znacznika za pomocą narzędzia Jasność i kontrast na pasku narzędzi. Użyj pędzla lub narzędzia różdżki, aby narysować adnotację wokół całego odcinka tkanki. Zdefiniuj tę adnotację jako pełną tkankę, wykluczając pokrywającą ją skórę lub obszary, które nie powinny być analizowane. Przytrzymaj ALT, aby utworzyć adnotacje ujemne lub zmniejszyć granice. Teraz wybierz adnotację, klikając kartę Adnotacje i naciskając Obiekty, a następnie Adnotacje, a następnie kliknij Duplikuj wybrane adnotacje. Włącz kanał SOX 10, a następnie zmniejsz zduplikowaną adnotację, aby zdefiniować region guza za pomocą narzędzia ALT + pędzel/różdżka. Teraz wybierz pełną adnotację tkanki. Następnie przejdź do Obiekty, a następnie Adnotacje i Rozwiń Adnotacje. Ustaw promień rozwinięcia na jeden mikrometr i kliknij przycisk Uruchom. Zmień nazwę tej nowej adnotacji na Pełne rozszerzenie tkanki. Wybierz adnotację guza, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Wstaw w hierarchii. Ponownie wybierz adnotację guza, a następnie przejdź do Obiekty, Adnotacje, a teraz kliknij opcję Odwróć. Zdefiniuj tę nową adnotację jako Zrąb i powtórz tę czynność dla wszystkich odcinków tkanki. Aby uruchomić segmentację komórek, kliknij kartę Obraz, aby znaleźć szerokość i wysokość obrazu. Pobierz rozszerzenie StarDist z GitHub. Zaimportuj plik StarDist.jar rozszerzenia QuPath do programu QuPath. Pobierz również pliki skryptu StarDist groovy i plik modelu z GitHub. Dla każdej sekcji tkanki wybierz adnotacje guza i zrębu. Na pasku ustawień kliknij Automatyzuj, a następnie Edytor skryptów, aby otworzyć interfejs skryptu. Otwórz odpowiedni skrypt segmentacji komórek StarDist odpowiadający rozmiarowi piksela obrazu. Po wyświetleniu monitu wybierz StarDistcellsegmodel.pb do segmentacji komórek. Po segmentacji komórek zapisz obraz, a następnie kolejno kliknij Zmierz, Eksportuj pomiary, wybierz odpowiednie obrazy i ustaw typ eksportu jako komórki i separator jako .csv. Wybierz lokalizację pliku wyjściowego, a następnie kliknij przycisk Wypełnij, aby uwzględnić odpowiednie dane. Dla każdego znacznika pochodzenia, który ma być używany w grupowaniu lub fenotypowaniu, wybierz jedną wartość średnią do wyeksportowania. Aby znormalizować dane proteomiczne, otwórz wyeksportowany plik CSV i obetnij nagłówki kolumn, aby zachować tylko nazwę znacznika. Po zainstalowaniu najnowszej wersji programu R & R Studio pobierz skrypt .r normalizacji znacznika z GitHub i uruchom go, aby odfiltrować komórki na podstawie rozmiaru jądra. Wykonaj minimalną/maksymalną normalizację dla każdego znacznika. Po zakończeniu zapisz nowy plik CSV ze znormalizowanymi danymi. Koniugacja kodu kreskowego DNA przeciwciała została potwierdzona za pomocą elektroforezy w żelu białkowym, wykazując dodatkowe prążki w regionie łańcucha ciężkiego. Multipleksowe obrazowanie immunofluorescencyjne guzów bocznych B16-F10 leczonych nanocząstkami 4-1BBL/IL-12 i ogólnoustrojowym anty-PD1 wykazało wyraźną ekspresję markerów immunologicznych w różnych sekcjach guza. Grupowanie FlowSOM zidentyfikowało szerszy zakres intensywności ekspresji markerów w porównaniu z fenotypowaniem Seurat, przy maksymalnej różnicy intensywności wynoszącej około 0,7 w porównaniu z 0,5. Fenotypowanie FlowSOM sklasyfikowało również większą liczbę makrofagów do podtypów M1 i M2. Kwantyfikacja gęstości makrofagów wykazała, że FlowSOM wykrył wyższe gęstości zarówno makrofagów M1, jak i M2 w porównaniu z Seurat, podczas gdy Seurat sklasyfikował więcej makrofagów jako Inne. Analiza przestrzenna wykazała, że makrofagi M2 i komórki NK miały najwyższe średnie minimalne odległości po leczeniu, a makrofagi M1 były bardziej rozpowszechnione wokół limfocytów T CD8.