Name: In vivo (in vivo) Monitorowanie aktywności transkrypcyjnej podczas przemiany metabolicznej za pomocą bioluminescencyjnego reportera w drożdżach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj metodę monitorowania aktywności transkrypcyjnej w czasie rzeczywistym w drożdżach Saccharomyces eubayanus podczas przemiany metabolicznej. Technika bioluminescencyjna umożliwia badanie adaptacji glukozowo-maltodextrynowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie zostało sfinansowane przez Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID), FONDECYT (1220026) oraz ANID-Programa Iniciativa Científica Milenio, ICN17_022 i NCN2024_040. FM otrzymało wsparcie z grantu ANID FONDECYT Postdoctorado nr 3220597. Projekt PQ otrzymał wsparcie z grantu ANID nr 21201057. Wsparcie finansowe otrzymano również dla Centro Ciencia & Vida, FB210008, Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID.

1. Budowa epizodycznych reporterów
UWAGA: Wybraliśmy region regulacyjny reporterowy na podstawie literatury drożdżowej do skonstruowania plazmidu episomalnego do monitorowania zużycia maltozy6,11,12. Promotor kandydującego genu reporterowego zdefiniowano jako sekwencję regulatorową znajdującą się bezpośrednio przed kandydującym ORF aż do nukleotydu flankującego sąsiedni ORF znajdujący się w górę. Region ten został amplifikowany z genomowego DNA S. eubayanus CBS12357 szczepu referencyjnegoT10. Takie podejście zapewnia wysoką wierność konstrukcji plazmidów episomalnych odpowiednich do dalszych zastosowań, w tym do badania innych interesujących warunków u drożdży.
<ol>
	<li>Zaprojektuj fragmenty DNA i nakładające się startery tak, aby zawierały 30 sekwencji parowania nukleotydów między fragmentami w celu bezproblemowego złożenia poprzez klonowanie rekombinacyjne drożdży13 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Patrz Tabela uzupełniająca S1 dla sekwencji starterów.</li>
	<li>Aby uniknąć mutacji, amplifikuj region promotora (patrz wyżej), a także zdestabilizowaną lucyferazy (LUC-PEST) i kasety hphMX1 przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności (szczegóły protokołu można znaleźć u producenta polimerazy). Ustawić termocykler na 98 °C na 10 minut w celu wstępnej denaturacji, a następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C, wyżarzania w temperaturze 60 °C i przedłużania w temperaturze 72 °C; wypełnić protokół z końcowym przedłużeniem w temperaturze 72 °C przez 10 min. 
	UWAGA: W przypadku stosowania plazmidów transportowych drożdży jako matryc do PCR, zaleca się poddanie reakcji amplikonowych trawieniu DpnI (patrz protokół producenta enzymu) w celu wyeliminowania wszelkich śladów plazmidu matrycowego, które mogą zakłócać przemianę drożdży.</li>
	<li>Przetrawić szkielet plazmidu pRS426 < klasy sup = "xref">14 za pomocą enzymów restrykcyjnych EcoRI i XhoI, aby zlinearyzować wektor, przecinając go w miejscu wielokrotnego klonowania i przygotować go do rekombinacji (patrz protokół producenta enzymu).</li>
	<li>Wymieszaj zlinearyzowany szkielet pRS426 ze amplifikowanymi fragmentami DNA i przekształć mieszaninę w Saccharomyces cerevisiae BY4741 za pomocą klonowania rekombinacyjnego drożdży13,15, aby umożliwić maszynerii rekombinacji homologicznej drożdży złożenie konstruktu plazmidu in vivo.</li>
	<li>Umieść przekształcone drożdże na syntetycznym kompletnym (SC) pożywce pozbawionej uracylu (SC-URA) w celu wybrania transformantów auksotroficznych zawierających nowo skonstruowany plazmid wektorowy pRS426-MAL32-LUC-hphMX .</li>
	<li>Ekstrahuj plazmidy z drożdży za pomocą zestawu do miniprzygotowania drożdży zgodnie z instrukcjami producenta i przekształć wyekstrahowany plazmid w Escherichia coli DH5α w celu amplifikacji konstruktu do dalszych analiz.</li>
	<li>Przebadaj kolonie bakteryjne za pomocą PCR, aby potwierdzić prawidłowe złożenie konstruktów.</li>
	<li>Oczyść DNA plazmidu za pomocą standardowego zestawu do oczyszczania plazmidu i wykonaj sekwencjonowanie Sangera w celu sprawdzenia integralności i sekwencji połączonych plazmidów.</li>
</ol>
2. Przemiana szczepów drożdży
UWAGA: Protokół transformacji drożdży został zaadaptowany z wcześniej ustalonej metody dla S. eubayanus16 i z powodzeniem zastosowany do innych gatunków Saccharomyces i fermentacyjnych szczepów drożdży. Protokół ten wywodzi się z tradycyjnej metody transformacji drożdży z klasy Gietz Lab<sup="xref">15. Takie podejście umożliwia efektywną integrację i selekcję plazmidów w różnych warunkach eksperymentalnych, oferując solidną i elastyczną metodę przekształcania różnych szczepów drożdży. Zapewnia niezawodną selekcję i utrzymanie plazmidu episomalnego pod ciśnieniem higromycyny.
<ol>
	<li>Hodowla wstępna pojedynczej kolonii świeżo wyhodowanych drożdży w 5 ml YPD (1% w/v ekstraktu drożdżowego, 2% w/v peptonu, 2% w/v glukozy) w temperaturze 20 °C przy 200 obr./min mieszania przez noc.</li>
	<li>Rozcieńczyć kulturę do średnicy zewnętrznej620 0,2 w świeżej pożywce YPD i inkubować w temperaturze 20 °C z mieszaniem przy 200 obr./min aż do połowy fazy logarytmicznej (OD620 0,4-0,6). W zależności od szczepu drożdży zwykle wymaga to 3-4 godzin.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w ilości 21 380 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, wyrzucić supernatant i przemyć osad 3x sterylną wodą.</li>
	<li>Ponownie zawiesić umyte komórki w 100 μl 0,1 M octanu litu, odwirować zgodnie z opisem w kroku 2.3 i powtórzyć proces 2x.</li>
	<li>Dodaj następujące składniki do komórek w tej kolejności: 240 μL 50% w/v PEG-4000, 35 μL 1 M LiAc, 5 μL plazmidowego DNA (100 ng/μL), 20 μL jednoniciowego nośnika DNA (ssDNA) uprzednio podgrzewanego w temperaturze 98 °C przez 10 min. Delikatnie wymieszać do homogenizacji mieszaniny transformacyjnej.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 20 °C przez 30 minut, a następnie szok termiczny w temperaturze 34 °C przez 55 minut. Po szoku cieplnym dodać 38 μl 100% etanolu do końcowego stężenia prawie 0,1% i inkubować przez dodatkowe 5 minut w temperaturze 34 °C. 
	UWAGA: Temperatury użyte w tym protokole są zoptymalizowane dla Saccharomyces eubayanus, szczepu kriotolerancyjnego wyizolowanego z lasów strefy umiarkowanej. 
	Użycie 100% etanolu jest wymagane do wywołania stresu komórkowego, zwiększając wydajność protokołu transformacji.</li>
	<li>Dodać 600 μl YPD do przekształconych komórek, odwirować jak w kroku 2.3 i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 600 μl świeżego YPD i inkubować zawiesinę bez mieszania przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić odzysk.</li>
	<li>Utrzyj transformowane komórki na agarze YPD uzupełnionym 200 μg/ml higromycyny i inkubuj w temperaturze 20 °C-30 °C przez 48-72 godzin.</li>
	<li>Wybierz 10-12 kolonii z płytek transformacyjnych i ponownie nałóż je na agar YPD zawierający 200 μg/ml higromycyny, aby zapewnić obecność plazmidu i wygenerować mieszany plaster wybranych kolonii do dalszego wykorzystania.</li>
</ol>
3. Walidacja luminescencji
UWAGA: Aby sprawdzić funkcjonalność reporterów luminescencyjnych, przetestowano przekształcone szczepy w warunkach zaprojektowanych do wywołania zróżnicowanej ekspresji reportera lucyferazy. Ta stopniowa walidacja pozwala na ocenę funkcjonalności reportera w zmiennych warunkach cukru, wykorzystując solidność testów luminescencyjnych do uchwycenia odpowiedzi metabolicznych w czasie rzeczywistym.
<ol>
	<li>Pobrać próbkę z przekształconego plastra szczepu drożdży i zaszczepić ją w pożywce YP (1% w/v ekstraktu drożdżowego, 2% w/v peptonu) zawierającej 5% w/v glukozy i 200 μM higromycyny. Inkubować w temperaturze 25 °C bez wytrząsania przez 24 godziny. Odświeżyć kultury w świeżej pożywce w rozcieńczeniu 1:10 i inkubować w tych samych warunkach przez kolejne 24 godziny.</li>
	<li>Umyj komórki pożywką YP bez cukru i zaszczep je w pożywce testowej w rozcieńczeniu 1:10. Pożywka testowa jest uzupełniana lucyferyną do końcowego stężenia 3 mM i zawiera 200 μM higromycyny w celu utrzymania stabilności plazmidu.</li>
	<li>Do badania wzrostu cukrów mieszanych należy użyć matrycy glukozowo-maltozowej o następujących stężeniach (% w/v): glukoza (0%, 0,5%, 1%, 2%) i maltoza (0%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%) w pożywce YP. Każdy stan jest uzupełniany lucyferyną (3 mM stężenie końcowe) i 200 μM higromycyną. Dozuj 200 μl kultury do każdego dołka na 96-dołkowej płytce (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Mierz luminescencję i OD620 co 30 minut przez 72 godziny za pomocą czytnika płytek luminometru, bez tłumienia i 1 s czasu integracji, zapewniając ciągłą aktywność reporterową i monitorowanie gęstości komórek.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek fermentacji i monitorowanie luminescencji
UWAGA: Przekształcone szczepy zostały poddane kontrolowanym warunkom mikrofermentacji, aby ocenić aktywację luminescencji podczas fermentacji. Umożliwia to porównanie aktywacji luminescencji w różnych warunkach fermentacji, dostarczając informacji na temat reakcji metabolicznych drożdży podczas dłuższych okresów fermentacji.
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę z ekstraktem słodowym (12 °Plato), rozpuszczając ekstrakt słodowy w wodzie i sterylizować w temperaturze 100 °C przez 20 minut. Przed inokulacją pozostawić pożywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Szczepy drożdży przekształcone przed hodowlą w 5 ml YPD (1% w/v ekstraktu drożdżowego, 2% w/v peptonu, 2% w/v glukozy) w temperaturze 20 °C z mieszaniem przy 200 obr./min przez 24 godziny. Przenieś prekulturę do 50 ml pożywki z ekstraktem słodowym. Inkubować kulturę w temperaturze 20 °C z mieszaniem przy 200 obr./min przez 24 godziny.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w ilości 21 380 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić je w celu przygotowania potrójnej 50 ml mikrofermentacji w 12 °Plato słod ekstrakt z pożywki9. Aby zwiększyć wydajność fermentacji, uzupełnij pożywkę 0,3 mg/L ZnCl2.</li>
	<li>Aby zapewnić stałą gęstość komórek we wszystkich kontrpróbach, oblicz objętość inokulum za pomocą wzoru: 
	Objętość inokulum = (1.5 ×10 6) × Objętość (ml) × Stopnie Plato</li>
	<li>Zaszczepić przygotowaną pożywkę i inkubować kultury w temperaturze 20 °C bez wstrząsania przez 14 dni. Monitoruj postęp fermentacji, rejestrując codzienną utratę CO2 . Ważenie naczyń jednocześnie każdego dnia w celu zmierzenia skumulowanego ubytku masy jako wskaźnika produkcji CO2 .</li>
	<li>W celu monitorowania luminescencji należy okresowo pobierać próbki 200 μl z każdej mikrofermentacji. Dodaj lucyferynę do próbek, aby osiągnąć końcowe stężenie 3 mM i zmierz luminescencję i OD620 za pomocą czytnika płytek luminometru bez tłumienia i 1 s czasu integracji. Wykonuj pomiary w określonych odstępach czasu przez cały okres fermentacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>

<ol><li>Salinas, F., Rojas, V., Delgado, V., López, J., Agosin, E., Larrondo, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+light-oxygen-voltage+domains+for+optogenetic+control+of+gene+expression+and+flocculation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Fungal light-oxygen-voltage domains for optogenetic control of gene expression and flocculation in yeast.</a> mBio. 9 (4), e00626-e00718 (2018).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Perez-Samper, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Crabtree+Effect+shapes+the+Saccharomyces+cerevisiae+lag+phase+during+the+switch+between+different+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The Crabtree Effect shapes the Saccharomyces cerevisiae lag phase during the switch between different carbon sources.</a> mBio. 9 (5), e01331-e01418 (2018).</li>
<li>Vermeersch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+duration+of+the+microbial+lag+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">On the duration of the microbial lag phase.</a> Curr Genet. 65 (3), 721-727 (2019).</li>
<li>New, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+levels+of+catabolite+repression+optimize+growth+in+stable+and+variable+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Different levels of catabolite repression optimize growth in stable and variable environments.</a> PLoS Biol. 12 (1), e1001764(2014).</li>
<li>Molinet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+diauxic+shift+between+Patagonian+Saccharomyces+eubayanus+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Natural variation in diauxic shift between Patagonian Saccharomyces eubayanus Strains.</a> mSystems. 7 (6), e0064022(2022).</li>
<li>Libkind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe+domestication+and+the+identification+of+the+wild+genetic+stock+of+lager-brewing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Microbe domestication and the identification of the wild genetic stock of lager-brewing yeast.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (35), 14539-14544 (2011).</li>
<li>Peris, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+ancestries+of+lager-brewing+hybrids+were+shaped+by+standing+variation+in+the+wild+yeast+Saccharomyces+eubayanus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Complex ancestries of lager-brewing hybrids were shaped by standing variation in the wild yeast Saccharomyces eubayanus.</a> PLoS Genet. 12 (7), e1006155(2016).</li>
<li>Mardones, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+beer+wort+fermentation+diversity+across+natural+Saccharomyces+eubayanus+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of beer wort fermentation diversity across natural Saccharomyces eubayanus isolates.</a> Microb Biotechnol. 13 (4), 1012-1025 (2020).</li>
<li>Brickwedde, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((physiological+and+regulatory+analysis+of+maltose+transporter+genes+in+Saccharomyces+eubayanus+CBS+12357T%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">physiological and regulatory analysis of maltose transporter genes in Saccharomyces eubayanus CBS 12357T.</a> Front Microbiol. 9, 1786(2018).</li>
<li>Brouwers, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recombination+of+Saccharomyces+eubayanus+maltose-transporter+genes+yields+a+chimeric+transporter+that+enables+maltotriose+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo recombination of Saccharomyces eubayanus maltose-transporter genes yields a chimeric transporter that enables maltotriose fermentation.</a> PLoS Genet. 15 (4), e1007853(2019).</li>
<li>Meurer, M., Chevyreva, V., Cerulus, B., Knop, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulatable+MAL32+promoter+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+characteristics+and+tools+to+facilitate+its+use%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">The regulatable MAL32 promoter in Saccharomyces cerevisiae: characteristics and tools to facilitate its use.</a> Yeast. 34 (1), 39-49 (2017).</li>
<li>Mashruwala, A. A., Boyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+of+plasmids+using+yeast+recombinational+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">De novo assembly of plasmids using yeast recombinational cloning.</a> Methods Mol Biol. 1373, 33-41 (2016).</li>
<li>Sikorski, R. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+of+shuttle+vectors+and+yeast+host+strains+designed+for+efficient+manipulation+of+DNA+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).</li>
<li>Baker, E. P., Hittinger, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+a+novel+chimeric+maltotriose+transporter+in+Saccharomyces+eubayanus+from+parent+proteins+unable+to+perform+this+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution of a novel chimeric maltotriose transporter in Saccharomyces eubayanus from parent proteins unable to perform this function.</a> PLoS Genet. 15 (4), e1007786(2019).</li>
<li>Nespolo, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Out-of-Patagonia+migration+explains+the+worldwide+diversity+and+distribution+of+Saccharomyces+eubayanus+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An Out-of-Patagonia migration explains the worldwide diversity and distribution of Saccharomyces eubayanus lineages.</a> PLoS Genet. 16 (5), e1008777(2020).</li>
<li>Hohnholz, R., Pohlmann, K. J., Achstetter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+plasmid+architecture+on+stability+and+yEGFP3+reporter+gene+expression+in+a+set+of+isomeric+multicopy+vectors+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Impact of plasmid architecture on stability and yEGFP3 reporter gene expression in a set of isomeric multicopy vectors in yeast.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 101 (23-24), 8455-8463 (2017).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+efficient+expression+using+heterologous+GAL+promoters+and+transcriptional+activators+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering an efficient expression using heterologous GAL promoters and transcriptional activators in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synth Biol. 12 (6), 1859-1867 (2023).</li>
<li>Calvey, C. H., Willis, L. B., Jeffries, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transformation+protocol+for+Lipomyces+starkeyi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">An optimized transformation protocol for Lipomyces starkeyi.</a> Curr Genet. 60 (3), 223-230 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Badanie to wykazało skuteczność epizodycznego bioluminescencyjnego reportera w monitorowaniu aktywacji transkrypcji u S. eubayanus podczas przemian metabolicznych. Wykorzystując MAL32 jako reporter transkrypcyjny11, mogliśmy śledzić kluczowe przemiany metaboliczne w czasie rzeczywistym, zapewniając solidne ramy do zrozumienia adaptacji specyficznych dla szczepu. Ten reporter, wybrany ze względu na ich rolę w metabolizmie maltozy, oferuje wyraźne korzyści w ocenie elastyczności me...

Mikroorganizmy, takie jak drożdże, muszą stale dostosowywać się do dynamicznych warunków środowiskowych, aby utrzymać sprawność i przetrwać1. Adaptacje te często obejmują złożone obwody regulacyjne genów integrujące wiele sygnałów zewnątrzkomórkowych w celu koordynowania precyzyjnych odpowiedzi metabolicznych2,3. W warunkach przemysłowych wydajność tych przemian metabolicznych ma kluczowe znaczenie, szczególnie w procesach fermentacji, w których zakłócenia mogą prowadzić do nieoptymalnych plonów lub niepełnej fermentacji3. Kluczowym wyzwaniem metabolicznym, któremu należy sprostać, jest przejście komórek z preferowanego źródła węgla na wtórne, takie jak przesunięcie glukozy do maltozy. Proces ten wprowadza fazę opóźnienia, podczas której geny niezbędne do metabolizmu wtórnych źródeł węgla są depreparowane, umożliwiając wznowienie wzrostu4,5. 
Podczas warzenia piwa drożdże Saccharomyces muszą sprawnie przechodzić z metabolizmu glukozy na maltozę. W szczególności S. eubayanus, tolerancyjny na zimno gatunek rodzicielski drożdży lagerowych, wykazuje znaczną zmienność fenotypową w swojej zdolności do przystosowania się do takich przemian6. Dzikie izolaty, takie jak te z Patagonii, często wykazują przedłużone fazy opóźnienia i wolniejsze spożycie maltozy w porównaniu ze szczepami udomowionymi, które zostały wybrane ze względu na ich zoptymalizowane zdolności fermentacyjne7,8. Podczas gdy udomowione szczepy przystosowały się do efektywnej fermentacji mieszanych środowisk cukrowych, dzikie odmiany często wykazują wolniejsze przejście metaboliczne, potencjalnie z powodu silniejszej represji glukozy i zmiennej regulacji locus MAL 6,9.
To badanie wykorzystuje naturalną zmienność S. eubayanus jako model do badania adaptacji metabolicznych w warunkach od glukozy do maltozy, wykorzystując epizodyczną zdestabilizowaną reporterkę lucyferazy do monitorowania ekspresji genów in vivo, poprzez śledzenie luminescencji1. Wybrany reporter MAL32 koduje białko maltazy, enzym kluczowy dla katabolizmu maltozy podczas przemian glukozy w maltozę10,11. Co ciekawe, promotor MAL32 stanowi skuteczny marker do oceny indukcji metabolizmu maltozy po wyczerpaniu glukozy12. Wprowadzając ten system reporterowy, naszym celem było wyjaśnienie mechanizmów adaptacyjnych specyficznych dla szczepu i zidentyfikowanie potencjalnych celów optymalizacji wydajności fermentacji. Co więcej, protokół ten może zostać rozszerzony poza warzenie piwa, oferując zastosowania w biotechnologii i badaniach środowiskowych, w których złożone środowiska cukrowe odgrywają znaczącą rolę. Zrozumienie genetycznych i regulacyjnych uwarunkowań zmiennych reakcji środowiska u S. eubayanus poszerza naszą wiedzę na temat fizjologii drożdży, wspierając rozwój wytrzymałych szczepów do różnych zastosowań przemysłowych i badawczych.

<table><tbody><tr><td>Ampicylina, sól sodowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11593027</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>Gold Biotechnology</td><td>H-270-1</td><td></td></tr><tr><td>L-Lucyferine</td><td>Gold Biotechnologia</td><td>L-127-10</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat maltozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47288</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Plus PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F631S</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite 200 PRO M</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps System oczyszczania DNA</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep Plazmid drożdżowy Miniprep I</td><td>Zymo Research</td><td>D2001</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) monitorowanie aktywności transkrypcyjnej podczas przemiany metabolicznej za pomocą bioluminescencyjnego reportera w drożdżach

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Sekwencyjne spożycie cukru, od preferowanego źródła cukru do mniej preferowanego, stanowi krytyczną adaptację metaboliczną drożdży, która jest szczególnie istotna dla przetrwania w zmiennych środowiskach, takich jak te występujące podczas fermentacji piwa. Jednak przemiany cukrów są zmienną środowiskową, która jest trudna do przewidzenia i wykrycia, co wpływa na wynik fermentacji piwa. Protokół ten opisuje system in vivo do monitorowania aktywacji transkrypcji związanej z przesunięciem metabolicznym glukozy do maltozy w Saccharomyces eubayanus, który dotyczy różnych dzikich szczepów drożdży Saccharomyces. 
System wykorzystuje epizodyczny bioluminescencyjny reporter transkrypcyjny do metabolizmu maltozy, skupiając się na MAL32, ponieważ zapewnia dobry odczyt zmian metabolicznych, jak badano u S. cerevisiae. W tym celu szczepy drożdży zostały przekształcone za pomocą plazmidów zawierających region regulatorowy MAL32 z S. eubayanus, kontrolując ekspresję genu kodującego zdestabilizowaną wersję świetlika lucyferazy1 oraz genu oporności na higromycynę używanego wyłącznie podczas transformacji w celu zapewnienia akwizycji plazmidu. Po selekcji przekształcone komórki drożdży mogą być hodowane w warunkach nieselektywnych, ponieważ plazmid episomalny pozostaje stabilny w warunkach hodowli przez okres do 7 dni. 
Ten system został zweryfikowany w złożonym środowisku cukrowym w testach mikrofermentacji, potwierdzając skuteczność reportera lucyferazy w informowaniu o przemianach metabolicznych. Próbki były regularnie pobierane i analizowane za pomocą luminometru, zapewniając ciągły wgląd w reakcje drożdży. Chociaż protokół ten ma szerokie zastosowanie, jest szczególnie cenny dla oceny wydajności drożdży w warunkach fermentacji, gdzie zmiany metaboliczne stanowią poważne wyzwanie. Ponadto metodologia ta może być dostosowana poprzez wybór alternatywnych promotorów w celu zbadania szerszego zakresu reakcji na zmiany środowiskowe, co pozwala na charakterystykę i optymalizację dzikich szczepów drożdży do różnych zastosowań przemysłowych.

Poniższe wyniki demonstrują użyteczność nowo skonstruowanego reportera luminescencyjnego do monitorowania przejścia z glukozy na maltozę w komórkach drożdży w procesie fermentacyjnym. Plazmidy reporterowe są początkowo składane przy użyciu rekombinacyjnego klonowania drożdżowego13 w celu wygenerowania episomalnych konstruktów reporterowych. Proces ten wymaga nakładania się sekwencji nukleotydowych o długości co najmniej 30 nukleotydów pomiędzy różnymi amplikonami, co przedstawiono na <strong class...

Ten protokół wykorzystuje bioluminescencyjny reporter, który umożliwia pomiary aktywności transkrypcyjnej u Saccharomyces eubayanus w celu monitorowania przejścia z glukozy do maltozy, umożliwiając analizę adaptacji metabolicznych w czasie rzeczywistym i wspierając optymalizację szczepu do fermentacji przemysłowej w różnych warunkach.

In vivo (in vivo) Monitorowanie aktywności transkrypcyjnej podczas przemiany metabolicznej za pomocą bioluminescencyjnego reportera w drożdżach

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

Nasze badania lub główne badania koncentrują się na różnorodności mikrobiologicznej, filogenomice i zastosowaniach fermentacji, kładąc nacisk na różnorodność drożdży, adaptacje, a zwłaszcza na przemysłowe zastosowanie biologii drożdży. Konkretnie przechodząc do tych zastosowań, badamy wydajność fermentacji, produkcję smaku i tolerancję na stres w drożdżach. Tak więc nasze najnowsze osiągnięcia są związane z filogenomiką drożdży, szczególnie z Patagonii.Następnie używamy ich do generowania nowych drożdży typu lager do fermentacji piwa, ale używamy również nowych drożdży do piwa o niskiej zawartości alkoholu. W sumie wykorzystujemy różne techniki omiczne i ewolucję eksperymentalną, aby opracować te nowe drożdże do zastosowań biogenologicznych. Obecnie używamy różnych technik, takich jak sekwencjonowanie genomu, sekwencjonowanie genomu z długim odczytem, a także transkryptomika.Następnie, w sumie, wykorzystujemy te informacje do przeprowadzenia eksperymentalnej ewolucji różnych szczepów, które posiadamy, a następnie próbujemy zweryfikować niektóre zmiany genomowe za pomocą technik CRISPR lub różnych technik transformacji drożdży, i w ten sposób docieramy do molekularnych szczegółów ad

in-vivo-monitoring-transcriptional-activity-during-metabolic

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do liczenia mRNA w pojedynczych komórkach w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki.

Wizualizacja i analiza cząsteczek mRNA z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ u Saccharomyces cerevisiae

Opisujemy użycie dwóch ratiometrycznych, genetycznie kodowanych biosensorów, które są oparte na GFP, do monitorowania mitochondrialnego stanu redoks i poziomów ATP w rozdzielczości subkomórkowej w żywych komórkach drożdży.

Biosensory ratiometryczne, które mierzą mitochondrialny stan redoks i ATP w żywych komórkach drożdży

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę szybkiej budowy sztucznych czynników transkrypcyjnych (ATF) z pokrewnymi reporterami GFP oraz ilościowe określenie zdolności ATF do stymulowania ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej.

Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP

Protokół jest opisany do wykrywania in vivo efektów inhibitorów mitochondrialnych w organizmie modelowym Caenorhabditis elegans oraz do identyfikacji potencjalnych związków wzmacniających. Protokół ten może być używany do badań przesiewowych bibliotek leków pod kątem związków modulujących funkcję mitochondriów.

Przesiewowy test in vivo dla modulatorów mitochondrialnych przy użyciu transgenicznych bioluminescencyjnych Caenorhabditis elegans

Przedstawiono test bioluminescencji in vitro w celu określenia komórkowego rytmu dobowego w komórkach nabłonka sutka. Metoda ta wykorzystuje plazmidy reporterowe komórek ssaków eksprymujące zdestabilizowaną lucyferazy pod kontrolą promotora genu PERIOD 2. Można go dostosować do innych typów komórek w celu oceny specyficznego dla narządu wpływu na rytm okołodobowy.

In vitro Test bioluminescencji w celu scharakteryzowania rytmu okołodobowego w komórkach nabłonka sutka

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący sekwencję RNA do monitorowania poziomów mRNA w czasie podczas niedotlenienia komórek S. cerevisiae. Metodę tę można dostosować do analizy ekspresji genów podczas dowolnej odpowiedzi komórkowej.

Pomiar poziomu mRNA w czasie podczas odpowiedzi niedotlenienia drożdży S. cerevisiae

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Rytmy okołodobowe, które istnieją w większości organizmów, regulują czasową organizację organoidów biologicznych processes. 3D ostatnio pojawiły się jako fizjologicznie istotny model in vitro. Protokół ten opisuje zastosowanie bioluminescencyjnych reporterów do obserwacji rytmów okołodobowych w organoidach, umożliwiając badania in vitro rytmów okołodobowych w układach wielokomórkowych.

Monitorowanie oscylacji okołodobowych za pomocą reportera bioluminescencji w organoidach

Poznaj metodę monitorowania aktywności transkrypcyjnej w czasie rzeczywistym w drożdżach Saccharomyces eubayanus podczas przemiany metabolicznej. Technika bioluminescencyjna umożliwia badanie adaptacji glukozowo-maltodextrynowych.

In vivo (in vivo) Monitorowanie aktywności transkrypcyjnej podczas przemiany metabolicznej za pomocą bioluminescencyjnego reportera w drożdżach (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Monitorowanie aktywności transkrypcyjnej podczas przemiany metabolicznej za pomocą bioluminescencyjnego reportera w drożdżach

Przeglądaj więcej filmów