Name: Pomiar siły w czasie rzeczywistym między kropelkami emulsji podczas rozpadu enzymatycznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Poznaj pomiar siły w czasie rzeczywistym między kropelkami emulsji podczas rozpadu enzymatycznego za pomocą pęset optycznych. Ta metoda pozwala badać stabilność emulsji w naukach o żywności i farmacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania zostały sfinansowane przez NARODOWY KLUCZOWY PROJEKT BADAWCZO-ROZWOJOWY CHIN, Grant nr 2023YFF0613603, oraz NARODOWĄ FUNDACJĘ NAUK PRZYRODNICZYCH CHIN, Grant nr 22202167.

Rysunek 1 ilustruje schemat zatrzymywania kropel pęsetą optyczną z podwójną pułapką. Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie dyspersji białek serwatkowych
<ol>
	<li>Przygotuj 5% (w/v) dyspersję białek serwatkowych w wodzie dejonizowanej.
	<ol>
		<li>Za pomocą wagi elektronicznej dokładnie zważ 2,5 g białka serwatkowego w proszku.</li>
		<li>Za pomocą cylindra z podziałką odmierz 47,5 ml wody dejonizowanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz składniki.
	<ol>
		<li>Przenieś zważone białko w proszku i odmierzoną wodę do zlewki.</li>
		<li>Dodaj magnetyczny pręt mieszający do zlewki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknij zlewkę.
	<ol>
		<li>Przykryj zlewkę folią uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu i zanieczyszczeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszaj dyspersję.
	<ol>
		<li>Umieść zlewkę na mieszadle magnetycznym. Ustaw prędkość mieszania na 1500 obr./min (<klasa silna="xfig">Rysunek 2A), aż białko w proszku całkowicie się rozpuści, a roztwór zostanie równomiernie zdyspergowany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uwodnij białko
	<ol>
		<li>Aby zapewnić całkowite uwodnienie białka serwatkowego i zminimalizować pienienie, należy przygotować dyspersję na jeden dzień przed przygotowaniem emulsji.</li>
		<li>Pozostaw 5% dyspersję białka serwatkowego do wymieszania przez noc w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Upewnij się, że wszystkie szklane naczynia i przybory kuchenne są czyste i wolne od zanieczyszczeń, aby uniknąć wpływu na dyspersję białek. 
		UWAGA: Etap nawodnienia przez noc ma kluczowe znaczenie dla optymalnej funkcjonalności białka i stabilności emulsji. Pominięcie tego kroku może spowodować zmniejszenie wydajności emulgowania. W tej części protokołu przedstawiono początkowe etapy przygotowania dyspersji białka serwatkowego, która zostanie wykorzystana do stabilizacji kropelek oleju rzepakowego w kolejnym przygotowaniu emulsji. Następujące kroki zazwyczaj obejmują przygotowanie emulsji typu olej w wodzie, przygotowanie eksperymentu z pęsetą optyczną i wprowadzenie trypsyny do badań trawienia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie emulsji typu olej w wodzie
<ol>
	<li>Zoptymalizuj recepturę.
	<ol>
		<li>Przygotuj emulsję, mieszając 15% oleju z 85% objętościowo roztworu białka, aby uzyskać stosunek masy białka do lipidów wynoszący 0,3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj fazę lipidową.
	<ol>
		<li>Olej rzepakowy jest płynny w temperaturze pokojowej. Dodaj 30 ml oleju rzepakowego do probówki wirówkowej do późniejszego wykorzystania.</li>
		<li>Tłuszcz mleczny jest stały w temperaturze pokojowej. Weź około pięciu miarek tłuszczu mlecznego i umieść je w probówce wirówkowej.</li>
		<li>Umieścić probówkę w zlewce i dodać do niej około 40 ml wody dejonizowanej.</li>
		<li>Użyj cyfrowej płyty grzewczej, aby podgrzać zlewkę do 42 °C i utrzymuj tę temperaturę przez 30 minut, aby zapewnić całkowite stopienie (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2B). 
		UWAGA: Temperatura topnienia tłuszczu mlecznego wynosi około 30 °C do 40 °C. Temperatura laboratoryjna jest utrzymywana na poziomie 26 °C. Stopiony tłuszcz mleczny może pozostawać płynny przez pewien czas, ale stopniowo zestala się w temperaturze pokojowej, jeśli zostanie pozostawiony w pozycji odstawionej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz składniki.
	<ol>
		<li>Do probówki wirówkowej o pojemności 5 ml dodaj 0,6 ml oleju (oleju rzepakowego lub stopionego tłuszczu mlecznego) i 3,4 ml przygotowanego roztworu białka serwatkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Homogenizować emulsję.
	<ol>
		<li>Użyj mieszalnika szybkotnącego (HSM). Ustaw prędkość na 25 000 obr./min i mieszaj przez 5 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		<li>Opcjonalnie przepuścić gruboziarnistą emulsję przez homogenizator wysokociśnieniowy. Typowe warunki: 2-3 przejścia przy ciśnieniu 500-1000 bar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozcieńczyć emulsję.
	<ol>
		<li>Przygotować emulsję w rozcieńczeniu 1:1000. Odmierzyć 4 μl oryginalnej emulsji za pomocą pipety. Dodaj to do 3996 μl wody dejonizowanej. Dokładnie wymieszać, aby zapewnić równomierne rozcieńczenie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wstępna konfiguracja pęsety optycznej
<ol>
	<li>Przygotować i oczyścić mikroprzepływowe komory przepływowe (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Urządzenie wyposażone jest w sześć kanałów mikroprzepływowych. W tym eksperymencie użyto jednego kanału - użyto tylko skrajnego lewego kanału w Rysunek 3B.
	<ol>
		<li>Aby przygotować kanał mikroprzepływowy, wyczyść wszystkie niezbędne urządzenia i kanały przepływowe. Dokładnie spłucz wszystkie urządzenia wodą dejonizowaną, aby upewnić się, że nie pozostały żadne pozostałości.</li>
		<li>Aby wyczyścić, przepłucz wymagany kanał etanolem. Ustaw natężenie przepływu na 1,0 bar i przepłucz etanolem. Na 1 godzinę przed eksperymentem przepłukać albuminę surowicy bydlęcej (BSA) do komory przepływowej. BSA tworzy warstwę "blokującą" na powierzchniach w celu zmniejszenia niespecyficznej adsorpcji kropelek emulsji lub innych biomolekuł.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlej przygotowaną emulsję do kanału doświadczalnego.</li>
	<li>Przygotuj instrument przed eksperymentem.
	<ol>
		<li>Otwórz pęsetę optyczną.</li>
		<li>Dodaj około 70 μl wody dejonizowanej do dolnej soczewki obiektywu.</li>
		<li>Włożyć komorę na próbkę, aż usłyszysz "kliknięcie".</li>
		<li>Umieść kroplę olejku immersyjnego na górze komory próbki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C).</li>
		<li>Delikatnie opuść soczewkę skraplacza, aż lekko dotknie górnej powierzchni komory próbki.</li>
		<li>Zamknij pęsetę optyczną przed włączeniem lasera. Laser pracuje w odległości fali 1064 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zlokalizuj płaszczyznę Z i dostosuj ścieżkę optyczną.
	<ol>
		<li>Włącz laser i ustaw moc na 100%.</li>
		<li>Wyreguluj dolne pokrętło (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A) na systemie pęsety optycznej, aby zlokalizować plamkę lasera. Przesuwając się od dołu do góry (regulacja zgodnie z ruchem wskazówek zegara), obserwuj plamki lasera trzy razy. Ustaw płaszczyznę Z między drugim a trzecim zestawem plamek laserowych. 
		UWAGA: Trzy zestawy plamek laserowych pojawiają się, gdy laser jest skupiony na dolnej powierzchni celi przepływowej, górnej powierzchni dolnego szkiełka nakrywkowego i dolnej powierzchni górnego szkiełka podstawowego. Laser powinien być skupiony między górną powierzchnią szkiełka nakrywkowego a dolną powierzchnią szkiełka podstawowego.</li>
		<li>Zmniejsz moc lasera do 30%.</li>
		<li>Sprawdź, czy na ekranie pojawia się od 7 do 11 prążków interferencyjnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E). Jeśli liczba jest zbyt wysoka lub zbyt niska, wyreguluj dolne pokrętło. 
		UWAGA: Liczba prążków interferencyjnych odzwierciedla optymalizację odstępów między skraplaczem a komorą przepływową. W zakresie od 7 do 11 prążków kondensator skutecznie wychwytuje wystarczającą ilość światła, aby zapewnić dobry stosunek sygnału do szumu dla mierzonych sygnałów, takich jak odpowiedź mechaniczna. Odstęp ten utrzymuje również bezpieczną odległość, aby uniknąć kontaktu soczewki z komórką przepływową i zmniejszyć rozpraszanie ścieżki optycznej lub zakłócenia odbicia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj kanały przepływu. Zamknij niepotrzebne kanały i upewnij się, że otwarty jest tylko wymagany kanał eksperymentalny.</li>
	<li>Ustaw moc lasera. Zwykle ustaw laser na 100%, aby wychwytywać kropelki, ale dostosuj do wymaganej intensywności dla określonych warunków eksperymentalnych.</li>
	<li>Skonfiguruj magazyn danych. Skonfiguruj katalog zapisywania plików, aby zapewnić natychmiastowe pobieranie danych eksperymentalnych.</li>
</ol>
4. Pomiar krzywej siła-odległość dla emulsji
<ol>
	<li>Ustaw natężenie przepływu na 0,5 bara. Kropelki powinny być widoczne na ekranie przez około 5 sekund. Następnie zatrzymaj przepływ, wybierając opcję Podciśnienie i zamknij zawór kanału.</li>
	<li>Uchwyć kropelki.
	<ol>
		<li>Użyj joysticka, aby przechwycić dwie kropelki o podobnej wielkości w kanale. Schemat pomyślnie przechwyconych kropel jest pokazany w Rysunek 4.</li>
		<li>Dostosuj odległość między dwiema kroplami do około 10 μm. Jeśli utworzy się linka, zaobserwuje się zauważalną zmianę siły.</li>
		<li>Ustal położenie x i y prawej pułapki optycznej oraz położenie y lewej pułapki optycznej. Zaznacz dwie kropelki odpowiednio w kolorze magenta i zielonym polu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz gęstość widmową mocy (PSD).
	<ol>
		<li>Przejdź do menu Kalibracja.</li>
		<li>Na lewym ekranie wybierz pozycję Zmierz. Jeśli poziom hałasu jest nadmierny, powtarzaj pomiar aż do uzyskania zadowalających wyników.</li>
		<li>Wybierz opcję Zastosuj, aby potwierdzić kalibrację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyczyść oryginalne dane i zmierz siłę-odległość.
	<ol>
		<li>Na tym etapie joystick powinien sterować tylko lewą pułapką optyczną. Powoli przesuwaj lewą pułapkę w kierunku prawej kropli ze stałą prędkością (1,0 μm/s), aż odległość osiągnie zero. Ta procedura daje wymaganą krzywą siła-odległość.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz dane i zapisz.
	<ol>
		<li>Użyj lewego przycisku myszy, aby wybrać interesujący nas przedział danych, zaczynając od separacji kropel 10 μm do 0 μm. Przy odległości 0 μm mierzona siła zwykle osiąga wartość maksymalną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz wybrane dane.
	<ol>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zapisać wybrany segment danych w początkowym katalogu folderów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie roztworu buforowego Tris i roztworu trypsyny
<ol>
	<li>Przygotować roztwór buforowy Tris o następującym składzie: 11,860 g/l zasady Tris, 0,735 g/l dwuwodnego chlorku wapnia (CaCl2·2H2O) i 8,766 g/l chlorku sodu (NaCl). Dostosuj końcową objętość do 100 ml. Dostosuj pH początkowo do około 8,4 za pomocą kwasu solnego (HCl) i potwierdź końcowe pH za pomocą pasków testowych pH.</li>
	<li>Przygotować roztwór trypsyny, rozpuszczając 100 mg trypsyny w stosunku 1:250 (pochodzącej z trzustki świni) w 1000 ml buforu Tris. Mieszać mieszaninę mieszadłem magnetycznym w temperaturze 4 °C i prędkości 500 obr./min przez 15 min. Następnie odwirować roztwór w temperaturze 4 °C przez 15 minut.</li>
</ol>
6. Działanie trypsyny i dynamiczny schemat wykrywania
<ol>
	<li>Dodaj roztwór trypsyny do emulsji.
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety o zakresie od 0,5 μl do 10 μl pobrać 4 μl roztworu trypsyny i ostrożnie dodać go do przygotowanej emulsji o pojemności 4 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonuj dynamiczne monitorowanie w czasie rzeczywistym.
	<ol>
		<li>Po dodaniu roztworu trypsyny należy dynamicznie monitorować emulsje za pomocą technologii pęsety optycznej. Pomiary wykonuje się co 10 minut, przy czym pierwszy pomiar przeprowadza się 10 minut po dodaniu roztworu trypsyny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Uzyskaj dane eksperymentalne w formacie .h5 i wykonaj wymaganą konwersję formatu przy użyciu środowiska przetwarzania danych w celu utworzenia plików danych tabelarycznych. Przekonwertowane pliki składają się z dwóch sekcji, rejestrujących odpowiednio dane dotyczące siły i odległości.</li>
	<li>Dopasuj dane z tych dwóch sekcji za pomocą technik dopasowywania krzywych i wizualnie wykreśl wynikowe dopasowane krzywe do dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Kale, S. N., Deore, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsion+micro+emulsion+and+nano+emulsion%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Syst+Rev+Pharm%22%5BJournal%5D)">Emulsion micro emulsion and nano emulsion: A review.</a> Syst Rev Pharm. 8 (1), 39-47 (2016).</li>
<li>Li, N., Fang, S., Liu, S., Duan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+measuring+the+interaction+forces+between+droplets+in+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Oilfield+Chem%22%5BJournal%5D)">Methods for measuring the interaction forces between droplets in emulsions.</a> Oilfield Chem. 37 (4), 752-758 (2020).</li>
<li>Tan, C., McClements, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+advanced+emulsion+technology+in+the+food+industry%3A+A+review+and+critical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Application of advanced emulsion technology in the food industry: A review and critical evaluation.</a> Foods. 10 (4), 812(2021).</li>
<li>Dhaval, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-based+emulsion+drug+delivery+systems-a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Lipid-based emulsion drug delivery systems-a comprehensive review.</a> Drug Deliv Transl Res. 12 (7), 1616-1639 (2022).</li>
<li>Jost, R., Monti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+enzymatic+hydrolysis+of+whey+protein+by+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dairy+Sci%22%5BJournal%5D)">Partial enzymatic hydrolysis of whey protein by trypsin.</a> J Dairy Sci. 60 (9), 1387-1393 (1977).</li>
<li>Sarkar, A., Zhang, S., Holmes, M., Ettelaie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+aspects+of+digestion+of+Pickering+emulsions%3A+Experiments+and+theoretical+models+of+lipid+digestion+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Colloidal aspects of digestion of Pickering emulsions: Experiments and theoretical models of lipid digestion kinetics.</a> Adv Colloid Interface Sci. 263, 195-211 (2019).</li>
<li>Gillies, G., Prestidge, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+forces%2C+deformation+and+nano-rheology+of+emulsion+droplets+as+determined+by+colloid+probe+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Interaction forces, deformation and nano-rheology of emulsion droplets as determined by colloid probe AFM.</a> Adv Colloid Interface Sci. 108 - 109, 197-205 (2004).</li>
<li>Manca, M., Zhang, C., Vasconcelos de Melo Freire, R., Scheffold, F., Salentinig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+investigation+of+triolein+digestion+using+optical+manipulation%2C+polarized+video+microscopy+and+SAXS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Single particle investigation of triolein digestion using optical manipulation, polarized video microscopy and SAXS.</a> J Colloid Interface Sci. 649, 1039-1046 (2023).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75 (9), 2787-2809 (2004).</li>
<li>Maragò, O. M., Jones, P. H., Gucciardi, P. G., Volpe, G., Ferrari, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+and+manipulation+of+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Optical trapping and manipulation of nanostructures.</a> Nat Nanotechnol. 8 (11), 807-819 (2013).</li>
<li>Simmons, R. M., Finer, J. T., Chu, S., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurements+of+force+and+displacement+using+an+optical+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurements of force and displacement using an optical trap.</a> Biophys J. 70 (4), 1813-1822 (1996).</li>
<li>McClements, D. J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+emulsion-based+delivery+systems%3A+Controlling+the+digestion+and+release+of+lipophilic+food+components%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Structured emulsion-based delivery systems: Controlling the digestion and release of lipophilic food components.</a> Adv Colloid Interface Sci. 159 (2), 213-228 (2010).</li>
<li>Dai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers-controlled+hotspot+for+sensitive+and+reproducible+surface-enhanced+Raman+spectroscopy+characterization+of+native+protein+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers-controlled hotspot for sensitive and reproducible surface-enhanced Raman spectroscopy characterization of native protein structures.</a> Nat Commun. 12 (1), 1292(2021).</li>
<li>Tavano, O. L., Berenguer-Murcia, A., Secundo, F., Fernandez-Lafuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotechnological+applications+of+proteases+in+food+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Rev+Food+Sci+Food+Saf%22%5BJournal%5D)">Biotechnological applications of proteases in food technology.</a> Compr Rev Food Sci Food Saf. 17 (2), 412-436 (2018).</li>
<li>Mitropoulos, V., Mütze, A., Fischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+protein+adsorption+layers+at+the+air%2Fwater+and+oil%2Fwater+interface%3A+A+comparison+in+light+of+the+thermodynamical+stability+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of protein adsorption layers at the air/water and oil/water interface: A comparison in light of the thermodynamical stability of proteins.</a> Adv Colloid Interface Sci. 206, 195-206 (2014).</li>
<li>Rusli, S., Grabowski, J., Drews, A., Kraume, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-scale+approach+to+modeling+the+interfacial+reaction+kinetics+of+lipases+with+emphasis+on+enzyme+adsorption+at+water-oil+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">A multi-scale approach to modeling the interfacial reaction kinetics of lipases with emphasis on enzyme adsorption at water-oil interfaces.</a> Processes. 8 (9), 1082(2020).</li>
<li>Ghimire, C., Koirala, D., Mathis, M. B., Kooijman, E. E., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+particle+collision+leads+to+direct+observation+of+docking+and+fusion+of+lipid+droplets+in+an+optical+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Controlled particle collision leads to direct observation of docking and fusion of lipid droplets in an optical trap.</a> Langmuir. 30 (5), 1370-1375 (2014).</li>
<li>Català-Castro, F., Schäffer, E., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+cell+and+tissue+mechanics+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploring cell and tissue mechanics with optical tweezers.</a> J Cell Sci. 135 (15), jcs259355(2022).</li>
<li>Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical-trap+force+transducer+that+operates+by+direct+measurement+of+light+momentum%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum.</a> Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).</li>
<li>Zhang, H., Wang, F., Ratke, L., Nestler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+of+droplets+induced+by+thermal+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E%22%5BJournal%5D)">Brownian motion of droplets induced by thermal noise.</a> Phys Rev E. 109 (2), 024208(2024).</li>
<li>Pawar, N. D., Bahga, S. S., Kale, S. R., Kondaraju, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetric+and+asymmetric+coalescence+of+droplets+on+a+solid+surface+in+the+inertia-dominated+regime%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Fluids%22%5BJournal%5D)">Symmetric and asymmetric coalescence of droplets on a solid surface in the inertia-dominated regime.</a> Phys Fluids. 31 (9), 092106(2019).</li>
<li>Jiang, Y., Drelich, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+droplet+spreading+and+adhesion+studied+with+a+microbalance%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Surf+Innov%22%5BJournal%5D)">Fluid droplet spreading and adhesion studied with a microbalance: A review.</a> Surf Innov. 12 (1-2), 4-17 (2024).</li>
<li>Zhang, L., Hu, Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+emulsion+systems+for+specialized+infant+formulas%3A+Research+process+and+formulation+proposals+for+optimizing+bioavailability+of+nutraceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Rev+Food+Sci+Food+Saf%22%5BJournal%5D)">Advancements in emulsion systems for specialized infant formulas: Research process and formulation proposals for optimizing bioavailability of nutraceuticals.</a> Compr Rev Food Sci Food Saf. 23 (6), e70043(2024).</li>
<li>Buyukozturk, F., Benneyan, J. C., Carrier, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+emulsion-based+drug+delivery+systems+on+intestinal+permeability+and+drug+release+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Impact of emulsion-based drug delivery systems on intestinal permeability and drug release kinetics.</a> J Control Release. 142 (1), 22-30 (2010).</li>
<li>Xiao, J., Li, C., Huang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kafirin+nanoparticle-stabilized+Pickering+emulsions+as+oral+delivery+vehicles%3A+Physicochemical+stability+and+in+vitro+digestion+profile%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Kafirin nanoparticle-stabilized Pickering emulsions as oral delivery vehicles: Physicochemical stability and in vitro digestion profile.</a> J Agric Food Chem. 63 (47), 10263-10270 (2015).</li>
<li>Johnson, E., Koh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+smart+emulsion+materials%3A+From+synthesis+to+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Eng+Mater%22%5BJournal%5D)">Recent advances in smart emulsion materials: From synthesis to applications.</a> Adv Eng Mater. 26 (24), 2400995(2024).</li>
<li>Rajbanshi, A., Hilton, E., Dreiss, C. A., Murnane, D., Cook, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+polymers+for+engineered+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive polymers for engineered emulsions.</a> Macromol Rapid Commun. 45 (10), 2300723(2024).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podstawowa innowacja tej metodologii polega na zsynchronizowanym działaniu podwójnych pułapek optycznych i technologii monitorowania mechanicznego w czasie rzeczywistym (ilustracja 3A), umożliwiającej bardzo precyzyjną analizę dynamiczną na poziomie pojedynczej kropli. Dzięki niezależnemu uwięzieniu dwóch kropel za pomocą podwójnej pęsety optycznej i precyzyjnej regulacji ich separacji z początkową odległością 10 μm (patrz krok 4.2.2), metoda ta pozwala przezwyciężyć tradycyjne ograniczenia ...

Emulsje to niejednorodne systemy składające się z dwóch niemieszających się cieczy, gdzie jedna ciecz jest rozproszona jako kropelki w drugiej. Systemy te są wszechobecne w różnych branżach, w tym spożywczej, farmaceutycznej1, kosmetycznej i petrochemicznej. Stabilność i funkcjonalność emulsji są krytycznie zależne od interakcji między kropelkami, na które mogą wpływać różne czynniki, takie jak chemia powierzchni, warunki środowiskowe i obecność enzymów2.
W wielu zastosowaniach, szczególnie w nauce o żywności i dostarczaniu leków, emulsje są wystawione na działanie środowisk enzymatycznych3,4. Na przykład w ludzkim układzie pokarmowym spożyte pokarmy i leki na bazie emulsji napotykają różne enzymy, które mogą zmieniać ich strukturę i funkcję. Zrozumienie dynamiki interakcji kropelkowych podczas trawienia enzymatycznego ma kluczowe znaczenie dla projektowania stabilnych i skutecznych produktów na bazie emulsji5,6.
Tradycyjne metody badania stabilności emulsji2,7, takie jak rozpraszanie światła lub pomiary reologiczne, dostarczają cennych informacji objętościowych, ale nie mogą bezpośrednio obserwować i określać ilościowo interakcji między poszczególnymi kropelkami8. To ograniczenie utrudnia zrozumienie procesów zachodzących w mikroskali podczas trawienia enzymatycznego emulsji.
Pęsety optyczne stały się potężnym narzędziem do manipulowania mikroskopijnymi obiektami i mierzenia sił w skali mikro- i nano9. Wykorzystując pęd światła, pęseta optyczna może wychwytywać i przesuwać pojedyncze kropelki z wyjątkową precyzją. Ta zdolność otwiera nowe możliwości badania interakcji kropelka-kropelka w złożonych środowiskach10,11.
Ten protokół prezentuje unikalną metodę, która łączy podwójną pęsetę optyczną z pomiarami siły w czasie rzeczywistym w celu zbadania interakcji między kropelkami emulsji podczas trawienia enzymatycznego. Jako reprezentatywny przykład metody przedstawiono przy użyciu układu emulsji złożonego z oleju rzepakowego lub jednej kropelki tłuszczu stabilizowanej białkiem serwatkowym, poddawanej trawieniu przez trypsynę. Ten system modelowy jest szczególnie istotny dla nauki o żywności i żywieniu, ponieważ naśladuje popularne emulsje pokarmowe i ich zachowanie w przewodzie pokarmowym12.
Podejście pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację sił pomiędzy poszczególnymi kropelkami podczas ich rozkładu enzymatycznego, dostarczając bezprecedensowego wglądu w dynamikę stabilności emulsji w warunkach trawiennych. Metoda wykorzystuje system pęsety optycznej, najnowocześniejszą konfigurację pęsety optycznej z podwójną pułapką, do manipulowania kropelkami emulsji i mierzenia sił między kroplami z dużą precyzją13.
Ta eksperymentalna technika wypełnia lukę między badaniami emulsji masowych a badaniami na poziomie molekularnym, oferując unikalną perspektywę na zachowanie emulsji podczas trawienia enzymatycznego. Spostrzeżenia uzyskane dzięki tej metodzie mają daleko idące implikacje dla różnych dziedzin, w tym inżynierii żywności, preparatów farmaceutycznych i podstawowej nauki o koloidach. Chociaż jako przykład posłużono się specyficznym układem olej-białko-enzym, przedstawiona tutaj metodologia może być zaadaptowana do badania szerokiej gamy organicznych systemów emulsyjnych i enzymów trawiennych w różnych gałęziach przemysłu.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie Bluelake</td><td>LUMICKS, Holandia</td><td></td><td>Oprogramowanie do sterowania pęsetą optyczną</td></tr><tr><td>CaCl2.H4O2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dome LED CYFROWE MIESZADŁO PŁYTOWE</td><td>SCILOGEX</td><td>SCI280-Pro&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Waga elektroniczna</td><td>Shanghai Hengping Instrument Co., LTD</td><td>FA1204</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator szybkoobrotowy</td><td>Ningbo Kemai Instrument Co., LTD</td><td>KM-S10</td><td></td></tr><tr><td>Olejek</td><td></td><td></td><td></td>immersyjny</tr><tr><td>Aparat do mieszania wirów indukowanych światłem</td><td>Shanghai HUXI Industrial Co., LTD</td><td>Vortex-5S</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tłuszcz</td><td>mleczny SM Mlekovita</td><td>Maslo Klarowane</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęseta optyczna platforma</td><td>LUMICKS,Holandia</td><td>m-pułapka</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Origin</td><td>Origin Lab</td><td>2024</td><td>Aby narysować krzywą dopasowania siły i odległości</td></tr><tr><td>Pistolet do pipet</td><td>Eppendorf</td><td>10 &mu; L,100 &mu; L,1000 &mu; L</td><td></td></tr><tr><td>Olej rzepakowy&nbsp;</td><td>Bunge Polska Sp. z o.o.&nbsp;</td><td>Kujawski</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca</td><td>Parafilm</td><td>4IN*125FT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100458-0010</td><td>Trypsyna 1:250, z trzustki świńskiej</td></tr><tr><td>Koncentrat białka serwatkowego&nbsp;</td><td>SM Mlekovita</td><td>WPC</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar siły w czasie rzeczywistym między kropelkami emulsji podczas rozpadu enzymatycznego

Real-Time Force Measurement Between Emulsion Droplets During Enzymatic Breakdown

Ten protokół wprowadza unikalną metodologię badania stabilności emulsji i dynamicznego rozpadu kropelek emulsji podczas trawienia enzymatycznego za pomocą pęsety optycznej z podwójną pułapką. Proces ten polega na przygotowaniu emulsji, wprowadzeniu enzymu i skonfigurowaniu systemu pomiaru siły w celu monitorowania sił między kroplami w czasie rzeczywistym. Dzięki zastosowaniu pęsety optycznej z podwójną pułapką, metoda umożliwia precyzyjną manipulację i obserwację kropelek emulsji, ułatwiając pomiar sił między kroplami podczas rozpadu enzymatycznego. Ta eksperymentalna technika oferuje istotny wgląd w interakcje i stabilność emulsji podczas trawienia, ze szczególnym znaczeniem dla badań w dziedzinie nauk o żywności, farmaceutykach i innych gałęziach przemysłu związanych z emulsjami organicznymi. Metodę można dostosować i zastosować do różnych konfiguracji pęsety optycznej i różnych rodzajów emulsji lub enzymów, służąc jako wszechstronne narzędzie do badania właściwości mechanicznych i procesów rozpadu w wielu dziedzinach. Co więcej, to wizualne podejście zapewnia przewagę w postaci monitorowania dynamiki siły w czasie rzeczywistym, otwierając nowe możliwości badania zachowania emulsji w różnych zastosowaniach.

W niniejszym badaniu za pomocą pęsety optycznej przeanalizowano emulsje zawierające olej rzepakowy i białka serwatkowe oraz tłuszcz mleczny i białka serwatkowe. Najpierw zmierzono zależność siła-odległość między dwiema emulsjami w celu ustalenia danych bazowych (Rysunek 5A-F). Następnie do każdej emulsji dodano trypsynę i co 10 min ponownie mierzono zależność siła-odległość.
Rysunek 5 przedstawia krzy...

Ten protokół wykorzystuje pęsetę optyczną z podwójną pułapką do pomiaru sił między kroplami w czasie rzeczywistym podczas enzymatycznego trawienia emulsji. Ułatwia badanie stabilności emulsji i dynamiki kropel, co ma zastosowanie w naukach o żywności i farmaceutykach.

Pomiar siły w czasie rzeczywistym między kropelkami emulsji podczas rozpadu enzymatycznego

This protocol introduces a unique methodology for investigating the stability of emulsions and the dynamic disintegration of emulsion droplets during ...

Użyliśmy pęsety optycznej do pomiaru sił w czasie rzeczywistym między poszczególnymi kropelkami emulsji podczas trawienia enzymatycznego, aby zrozumieć stabilność podczas procesu trawienia. Podczas eksperymentu z pęsetą optyczną proces trawienia jest ciągły. Optymalne stężenie enzymów jest trudne do określenia, a jeśli nie uda nam się wychwycić kropelek na czas, musimy ponownie rozpocząć trawienie. Nachylenie i maksymalna siła między poszczególnymi kropelkami są rzeczywiście związane z rodzajem oleju, czasem trawienia i rodzajem enzymu. Wydaje się, że jest trawiony z proteazą, rodzaj oleju nie wpływa na proces trawienia. Być może jest to eksperyment, w którym wykorzystuje się zarówno monitorowanie spektroskopowe, jak i monitorowanie sił, aby zobaczyć związek między siłą a zmianami struktur chemicznych.[Narrator] Aby rozpocząć, przygotuj celę przepływową próbki, a następnie otwórz pęsetę optyczną. Dodaj około 70 mikrolitrów wody dejonizowanej do dolnej soczewki obiektywu i włóż komorę na próbkę do instrumentu, aż usłyszysz kliknięcie. Umieść kroplę olejku immersyjnego na górnej powierzchni komory próbki. Następnie za pomocą pokrętła kondensatora delikatnie opuść soczewkę skraplacza, aż lekko dotknie górnej powierzchni komory próbki. Zamknij pęsetę optyczną, aby zakończyć konfigurację przed aktywacją lasera. Teraz włącz laser i ustaw moc na 100%. Wyreguluj dolne pokrętło na pęsetach optycznych w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, aby zlokalizować plamkę lasera, przesuwając się od dołu do góry. Obserwuj plamki lasera trzy razy i ustaw płaszczyznę Z między drugim a trzecim zestawem. Następnie zmniejsz moc lasera do 30%. Użyj joysticka, aby przechwycić dwie kropelki o podobnej wielkości w kanale. Dostosuj odległość między dwiema kroplami do około 10 mikrometrów. Ustal pozycje X i Y prawej pułapki optycznej oraz pozycję Y lewej pułapki optycznej, a następnie zaznacz kropelki odpowiednio magentowymi i zielonymi polami. Teraz przejdź do menu kalibracji i wybierz pomiar, aby rozpocząć kalibrację. Jeśli poziom hałasu jest nadmierny, powtarzaj pomiar, aż będą widoczne zadowalające wyniki. Wybierz opcję Zastosuj, aby potwierdzić kalibrację. Następnie wyczyść oryginalne dane za pomocą odpowiedniego interfejsu oprogramowania i zmierz odległość siły za pomocą skalibrowanego systemu pułapki optycznej. Na koniec dodaj roztwór trypsyny do systemu. Dostosuj ustawienia tak, aby mierzyć co 10 minut, zaczynając 10 minut po dodaniu roztworu trypsyny, aby dynamicznie monitorować emulsje za pomocą systemu pęsety optycznej. Emulsje zawierające olej rzepakowy i białko serwatkowe oraz tłuszcz mleczny i białko serwatkowe analizowano za pomocą pęsety optycznej. W przypadku emulsji oleju rzepakowego bez trypsyny szczytowa siła oddziaływania wzrastała wraz z wielkością kropli, osiągając ponad 100 pikonewtonów przy ośmiu mikrometrach w porównaniu do około 10 pikonewtonów przy trzech mikrometrach. Podobną tendencję zaobserwowano w przypadku kropelek emulsji tłuszczu mlecznego. W obu emulsjach średnia szczytowa siła oddziaływania wzrastała wraz ze średnicą kropli, wykazując mniej więcej liniową zależność. Kropelki o średnicy pięciu mikrometrów miały najwyższą liczbę wychwytywania spośród wszystkich rozmiarów, co wskazuje na optymalną skuteczność wychwytywania, podczas gdy częstotliwości wychwytywania dla kropel o średnicy trzech mikrometrów i 10 mikrometrów były najniższe. Po dodaniu trypsyny, kropelki emulsji tłuszczu mlecznego wykazywały stopniowy spadek szczytowej siły oddziaływania z 31,9 pikonewtonów po 10 minutach do 6,6 pikonewtonów po 60 minutach. W emulsjach oleju rzepakowego obróbka trypsyną spowodowała gwałtowne obniżenie krzywych odległości siły, co sugeruje, że skuteczność działania enzymatycznego jest większa w fazie ciekłego oleju.

real-time-force-measurement-between-emulsion-droplets-during

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy dwukolorowy test fluorescencyjny in vitro, służący do wizualizacji fuzji pojedynczych cząsteczek wirusa z płynną dwuwarstwą docelową. Poprzez znakowanie cząsteczek wirusowych fluoroforami, które różnicowo barwią błonę wirusa oraz jego wnętrze, jesteśmy w stanie monitorować kinetykę hemifuzji i tworzenia się porów.

Metoda pomiaru kinetyki fuzji wirusowej na poziomie pojedynczych cząsteczek

Wpływ kropli płynów nienewtonowskich jest złożonym procesem, ponieważ różne parametry fizyczne wpływają na dynamikę w bardzo krótkim czasie (mniej niż jedna dziesiąta milisekundy). Wprowadzono technikę szybkiego obrazowania w celu scharakteryzowania zachowań zderzeniowych różnych płynów nienewtonowskich.

Technika szybkiego obrazowania do badania dynamiki uderzeń kropli płynów nienewtonowskich

Prezentujemy nową technikę pomiaru bocznej dyfuzji gatunków powierzchniowo czynnych na granicy płyn-płyn poprzez połączenie monowarstwy kropelki z płaską monowarstwą.

Odzyskiwanie fluorescencji po połączeniu kropli w celu zmierzenia dwuwymiarowej dyfuzji monowarstwy fosfolipidowej

Mikroprzepływowe wytwarzanie podwójnych emulsji zazwyczaj obejmuje urządzenia o wzorzystej zwilżalności lub specjalnie wykonane elementy szklane. W tym miejscu opisujemy wytwarzanie i testowanie generatora podwójnej emulsji z polidimetylosiloksanu (PDMS), który nie wymaga obróbki powierzchni ani skomplikowanych procesów produkcyjnych i jest w stanie wytwarzać podwójne emulsje do 14 μm.

Podwójne wytwarzanie emulsji przy użyciu współosiowego urządzenia do ustawiania ostrości przepływu z polidimetylosiloksanu (PDMS)

Protokół ma na celu zbadanie interakcji między kropelkami a superhydrofobowymi substratami w powietrzu. Obejmuje to kalibrację systemu pomiarowego i pomiar siły oddziaływania na podłożach superhydrofobowych o różnych frakcjach siatki.

Pomiar siły oddziaływania między kroplą a podłożem superhydrofobowym metodą dźwigni optycznej

Ten protokół umożliwia efektywne zbieranie eksperymentalnych obrazów uderzeń kropel cieczy z dużą prędkością oraz szybką analizę tych danych w partiach. Aby usprawnić te procesy, metoda opisuje, jak skalibrować i ustawić aparaturę, wygenerować odpowiednią strukturę danych i wdrożyć skrypt do analizy obrazu.

Wysokoprzepustowa analiza uderzeń kropel cieczy

Ogólnym celem protokołu jest przygotowanie ponad miliona uporządkowanych, jednolitych, stabilnych i biokompatybilnych kropel femtolitru na płaskim podłożu o powierzchni 1cm2, który może być użyty do syntezy białek bez komórek.

Femtolitrowa matryca kropelkowa do masowo równoległej syntezy białek z pojedynczych cząsteczek DNA

Testy kropelek wody w oleju są przydatne do chemii analitycznej, ewolucji enzymów i analizy pojedynczych komórek, ale zazwyczaj wymagają mikrofluidyki do formowania kropel. W tym miejscu opisujemy emulgację z szablonami cząstek, bezprzepływowe podejście do wykonywania testów kropelkowych.

Emulgacja szablonowa cząstek umożliwia oznaczanie kropel bez mikroprzepływowości

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Balans folii wisiorek z kroplą powierzchni, zaimplementowany z wymianą wielofazową, nazywaną OCTOPUS, pozwala na naśladowanie warunków trawiennych poprzez sekwencyjną wymianę podfaz oryginalnego roztworu masowego z symulowanymi płynami żołądkowo-jelitowymi. Symulowane trawienie in vitro jest monitorowane poprzez rejestrowanie in situ napięcia międzyfazowego strawionej warstwy międzyfazowej.

Metody in vitro Trawienie emulsji w pojedynczej kropli poprzez wielofazową wymianę symulowanych płynów żołądkowo-jelitowych

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Poznaj pomiar siły w czasie rzeczywistym między kropelkami emulsji podczas rozpadu enzymatycznego za pomocą pęset optycznych. Ta metoda pozwala badać stabilność emulsji w naukach o żywności i farmacji.

Pomiar siły w czasie rzeczywistym między kropelkami emulsji podczas rozpadu enzymatycznego

Przeglądaj więcej filmów