Name: In Ovo Ksenografacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (PDX-ALL) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Poznaj metodę ksenografacji in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjentów. To szybkie i opłacalne narzędzie umożliwia badania przedkliniczne oraz ocenę odpowiedzi na leczenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Andrew Kungowi z Columbia University za udostępnienie FUW-Luc-mCherry-puro. Prace te były wspierane przez granty CIHR (PJT-174983) dla KYL oraz z National Research Foundation of Korea (NRF; RS-2023-00284121) do KYL i M-YJ.

Eksperymenty przeprowadzono w oparciu o protokół zatwierdzony przez Komitet Etyki Uniwersytetu w Calgary (REB15-1143; w którym uzyskano świadomą zgodę od WSZYSTKICH uczestników) oraz Radę Etyki Badań Zdrowotnych Komitetu ds. Raka Alberty (HREBA. CC-17-0108_REN8). Do badania włączono pacjentów z ALL w momencie rozpoznania (przed rozpoczęciem jakiejkolwiek terapii), u których występowały krążące blasty (wybuchy nie tylko w szpiku, ale także we krwi). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Inkubacja jaj
<ol>
	<li>Zaopatrz się w zapłodnione jaja kurze. Zdobądź ~10% więcej jaj niż jest to potrzebne, aby wziąć pod uwagę liczbę jaj uszkodzonych podczas transportu lub procedury krakingu.</li>
	<li>Zapłodnione jaja należy przechowywać do dwóch tygodni w temperaturze 12 °C, nie tracąc przy tym zdolności do życia.</li>
	<li>Przenieś jaja do nawilżonego (~50%-60%) inkubatora rolkowego w temperaturze 39 °C.</li>
	<li>Wysiaduj jaja w inkubatorze przez 10 dpf. Należy pamiętać, że dzień 1 rozpoczyna się w momencie przeniesienia jaj do inkubatora.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej z próbek krwi od pacjentów z ALL
<ol>
	<li>Wyizolować komórki zgodnie z wcześniejszym opisem14,15.</li>
	<li>Zbierz 10 ml krwi obwodowej (lub szpiku) od pacjentów z B- i T-ALL do heparynizowanych probówek.</li>
	<li>Przenieść próbki krwi do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i rozcieńczyć trzykrotnie 2 objętościami 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 i 1,8 mM KH2PO4.</li>
	<li>Nałożyć 1 objętość rozcieńczonych próbek krwi na 1 objętość pożywki o gradifikacji gęstości i odwirować w temperaturze pokojowej bez hamulca przy 300 x g przez 30 minut.</li>
	<li>Pobrać warstwę kożucha komórek jednojądrzastych (MNC) z granicy faz i przenieść ją do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej pipety.</li>
	<li>Dodać 10 ml 1x PBS i wirować przy 300 x g przez 5 minut, aby usunąć wszelkie pozostałe składniki surowicy (powtórz ten krok dwukrotnie).</li>
	<li>Dodać 2 ml 0,8% NH4Cl do osadu komórkowego, delikatnie wirować, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i wirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut, aby zlizować czerwone krwinki (w razie potrzeby powtórz ten krok).</li>
	<li>Umyj komórki w 1x PBS zgodnie z opisem w kroku 2.6.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w RPMI 1640 zawierającym 10% FBS i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Oceń żywotność komórek za pomocą testu wykluczenia błękitu trypanowego.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce zamrażającej (10% DMSO w FBS), zamrozić je w temperaturze -80 °C i przechowywać w ciekłym azocie.</li>
</ol>
3. Amplifikacja lentiwirusa 2. generacji niekompetentnego replikacji przenoszącego mCherry
<ol>
	<li>Wysiew HEK293T ludzkich embrionalnych komórek nerkowych przy zbiegu ~60%-70% do 6-dołkowej płytki zawierającej DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 .</li>
	<li>Kotransfekcja komórek (1,5 x 106) za pomocą transferu FUW-Luc-mCherry-puro, opakowania pCMVΔr8,91 i wektorów obwiedni pVSV-G w stosunku 3:2:1 przy użyciu Lipofectaminy 3000 przez 2 dni.</li>
	<li>Zebrać supernatant zawierający lentiwirusa i przefiltrować przez filtr 0,45 μm.</li>
	<li>Przenieść oczyszczony supernatant wirusowy do probówek wirówkowych, odwirować przy 20 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl PBS lub pożywce wolnej od surowicy.</li>
	<li>Zmierz wielokrotność infekcji (MOI) za pomocą zestawu do miana lentiwirusa qPCR.</li>
</ol>
4. Znakowanie stale rosnących linii komórkowych ALL i komórek ALL pochodzących od pacjenta za pomocą mCherry
<ol>
	<li>Płytka 1 x 106 komórek/ml linii komórkowych B-(SEM) i T-ALL (MOLT3)16,17 oraz komórki B- lub T-ALL pochodzące od pacjenta na płytkach 6-dołkowych zawierających RPMI 1640 + 10% FBS.</li>
	<li>Zakażone komórki 300 μl preparatu lentiwirusowego o mianie wirusa 3,47 x 106 IU/ml w celu uzyskania MOI 1 na 1 x 106 komórek, delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 dni.</li>
	<li>Dodaj 1 μg/ml puromycyny do pożywki hodowlanej, aby wybrać stabilnie transdukowane komórki przez 2 dni.</li>
	<li>Wizualizuj komórki znakowane mCherry za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
5. Szczepienie ksenograficzne in ovo
<ol>
	<li>W dniu 10 (patrz powyżej sekcja dotycząca inkubacji jaj) zbadaj unaczynienie zarodków piskląt pod światłem, aby ocenić żywotność zarodka. Następnie delikatnie umyj jajka 70% etanolem, aby wysterylizować powierzchnię.</li>
	<li>Wwiercić się w komórkę powietrzną jaj, aby utworzyć małe (~2,0 cm średnicy) okienko za pomocą wiertarki ręcznej.</li>
	<li>Uszczelnić przezroczystą taśmą klejącą i umieścić z powrotem w inkubatorze o stężeniu 5%CO2 .</li>
	<li>W dniu 11 wstrzyknij 1 x 107 mKomórki ALL znakowane wiśnią do naczyń krwionośnych rozwijających się zarodków za pomocą igieł 34 G. Należy zauważyć, że okazało się, że trudno jest potwierdzić, czy WSZYSTKIE komórki zostały wstrzyknięte w identyczne miejsca w różnych zarodkach, ponieważ otwarcie okna w tych samych miejscach nie jest gwarantowane.</li>
	<li>Uszczelnij okna przezroczystą taśmą klejącą, wróć do inkubatora o stężeniu 5% CO2 i codziennie monitoruj żywotność zarodka.</li>
	<li>W 15 dniu wypreparuj naczynia krwionośne z zarodków, umieść je na szklanych szkiełkach i sfotografuj udane ksenoprzeszczepy za pomocą mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w zdolności fluorescencyjne. UWAGA: Powyżej 15dpf (ponieważ pióra pokrywają całe ciało, a białko prawie zniknęło), należy przeprowadzić immunohistochemię, aby ocenić zmiany w proliferacji i kolonizacji WSZYSTKICH komórek w unaczynieniu zarodka pisklęcia.</li>
</ol>
6. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>W dniu 15 pobrać krew z układu naczyniowego zarodka kurczaka za pomocą sterylnej strzykawki z igłą o sile 32 G, przenieść ją do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej heparynę i odwirować przy 226 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant (osocze) i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1x PBS zawierającym 1% BSA (albumina surowicy bydlęcej).</li>
	<li>Wykonaj kroki 2.7 i 2.8, aby przeprowadzić lizę czerwonych krwinek.</li>
	<li>Znakować komórki B-ALL ludzkimi przeciwciałami FITC-CD10 i ludzkimi przeciwciałami PE-CD19 oraz komórkami T-ALL odpowiednio ludzkimi przeciwciałami FITC-CD4 i ludzkimi przeciwciałami PE-CD8 w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 min.</li>
	<li>Przepłukać znakowane komórki dwukrotnie PBS zawierającym 1% BSA, odwirować przy 226 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w 1x PBS i przeanalizować metodą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Ustaw napięcie rozproszenia w przód (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC) odpowiednio na 400 V i 360 V. Dostosuj wzmocnienia detektora dla kanałów FITC i PE odpowiednio na 450-500 V i 400-450 V. UWAGA: Strategia bramkowania: (a) bramkowanie z rozproszeniem światła (FSC vs. SSC): użyj FSC-A vs. SSC-A do identyfikacji populacji z pośrednim rozproszeniem do przodu (wielkość) i niskim rozrzutem bocznym (ziarnistość), co odpowiada regionowi limfoblastów. Należy pamiętać, że ten krok pomaga wykluczyć zanieczyszczenia i bardziej ziarniste komórki, takie jak monocyty lub granulocyty; b) wybór podkoszulka (FSC-H vs. FSC-A): wykonaj dyskryminację dubletową poprzez bramkowanie na FSC-H vs. FSC-A, zapewniający, że analizowane są tylko zdarzenia z pojedynczej komórki18.</li>
	<li>Określ ilościowo komórki C-ALL CD10/CD19+ B-ALL i CD4/CD8+ T-ALL, zliczając zdarzenia w ćwiartce 2 (Q2; FITC/PE+) FITC vs. Działki PE18. Present oznacza ± SEM trzech niezależnych eksperymentów (n = 3).</li>
</ol>

<ol><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent.</a> J Natl Cancer Inst. 82 (1), 4-6 (1990).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).</li>
<li>Dumartin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrin-1+mediates+early+events+in+pancreatic+adenocarcinoma+progression%2C+acting+on+tumor+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells.</a> Gastroenterology. 138 (5), 1595-1606 (2010).</li>
<li>Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+activity+as+a+determinant+of+tumor+growth+and+dormancy%3A+Regulation+by+p38%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">ERK activity as a determinant of tumor growth and dormancy: Regulation by p38.</a> Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).</li>
<li>Baroni, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonomic+and+short+hairpin+RNA+gene+silencing+methods+to+explore+functional+gene+programs+associated+with+tumor+growth+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest.</a> Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).</li>
<li>Lopez-Rivera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+drives+mTOR+pathway+activation+and+proliferation+of+human+melanoma+by+reversible+nitrosylation+of+TSC2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2.</a> Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).</li>
<li>Balke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short-term+in+vivo+model+for+giant+cell+tumor+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone.</a> BMC Cancer. 11, 241(2011).</li>
<li>Balke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+osteosarcoma+growth+on+the+chick+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane.</a> BMC Res Notes. 3, 58(2010).</li>
<li>Sys, G. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CAM-assay+as+a+xenograft+model+for+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The CAM-assay as a xenograft model for sarcoma.</a> J Vis Exp. (77), e50522(2013).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chick+Chorioallantoic+Membrane+%28CAM%29+assay+as+an+efficient+xenograft+model+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma.</a> J Vis Exp. (104), e52411(2015).</li>
<li>Pontel, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+lymphoblastic+leukemia+necessitates+GSH-dependent+ferroptosis+defenses+to+overcome+FSP1-epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Acute lymphoblastic leukemia necessitates GSH-dependent ferroptosis defenses to overcome FSP1-epigenetic silencing.</a> Redox Biol. 102408, (2022).</li>
<li>Oriol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+after+relapse+of+acute+lymphoblastic+leukemia+in+adult+patients+included+in+four+consecutive+risk-adapted+trials+by+the+PETHEMA+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Outcome after relapse of acute lymphoblastic leukemia in adult patients included in four consecutive risk-adapted trials by the PETHEMA Study Group.</a> Haematologica. 95 (4), 589-596 (2010).</li>
<li>Xin, Q., Chen, Z., Wei, W., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+Recapitulating+the+human+disease+to+evaluate+drug+efficacy+and+discover+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Animal models of acute lymphoblastic leukemia: Recapitulating the human disease to evaluate drug efficacy and discover therapeutic targets.</a> Biochem Pharmacol. 198, 114970(2022).</li>
<li>Gilmore, M. J., Prentice, H. G., Blacklock, H. A., Janossy, G., Hoffbrand, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+rapid+isolation+of+bone+marrow+mononuclear+cells+using+Ficoll-Metrizoate+and+the+IBM+2991+blood+cell+processor%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">A technique for rapid isolation of bone marrow mononuclear cells using Ficoll-Metrizoate and the IBM 2991 blood cell processor.</a> Br J Haematol. 50 (4), 619-626 (1982).</li>
<li>Boyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+to+estimate+leukemia+stem+cells+in+primary+acute+myeloid+leukemia+and+in+patient-derived+xenografts%2C+at+diagnosis+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry to estimate leukemia stem cells in primary acute myeloid leukemia and in patient-derived xenografts, at diagnosis and follow-up.</a> J Vis Exp. (133), e56976(2018).</li>
<li>Kang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+loss-of-function+genetic+screening+identifies+opioid+receptor+mu1+as+a+key+regulator+of+L-asparaginase+resistance+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Genome-wide loss-of-function genetic screening identifies opioid receptor mu1 as a key regulator of L-asparaginase resistance in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 36 (42), 5910-5913 (2017).</li>
<li>Lee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAP1+loss+confers+L-asparaginase+resistance+in+ALL+by+downregulating+the+calpain-1-Bid-caspase-3%2F12+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HAP1 loss confers L-asparaginase resistance in ALL by downregulating the calpain-1-Bid-caspase-3/12 pathway.</a> Blood. 133 (20), 2222-2232 (2019).</li>
<li>Kalina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuroFlow+standardization+of+flow+cytometer+instrument+settings+and+immunophenotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols.</a> Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Zidentyfikowano trzy kluczowe etapy ksenoprzeszczepuin ovo w celu zapobieżenia skażeniu mikrobiologicznemu i maksymalizacji przeżywalności zarodków kurczaków: tj. (1) sterylizacja powierzchni skorupki jaja 70% etanolem przed wykonaniem okienka oraz (2) szczelne uszczelnienie okienka skorupki jaja taśmą wiolonczelową, aby zapobiec parowaniu zawartości zarodka kurzego podczas inkubacji, oraz (3) użycie cienkiej igły (np. 34 G) i wstrzyknięcie WSZYSTKICH komórek w minimalnej objętości (np. 100 μL) w celu zapewnien...

Błona kosmówkowo-omoczniowa pisklęcia (CAM) zaczyna nabierać kształtu w 7 dniu po zapłodnieniu po inkubacji i jest gotowa do 12 dnia. CAM znajduje się w centrum uwagi jako odpowiedni model in vivo do angiogenezy1 i wszczepiania komórek nowotworowych 2,3,4,5,6,7,8,9,10, w szczególności komórek nowotworowych związanych z krwią 11, ponieważ jest z natury z niedoborem odporności i ma dobrze rozwinięte unaczynienie. Co więcej, CAM jest również pożądanym systemem do badania inwazji guza i przerzutów, ponieważ przenosi szereg białek macierzy zewnątrzkomórkowej, w tym kolagen, integrynę αVβ3, fibronektynę, lamininę i metaloproteinazę macierzy-2 (MMP-2)10.
Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) to nowotwór szpiku kostnego i krwi, który charakteryzuje się szybkim wzrostem liczby niedojrzałych limfocytów B i T. Jest to najbardziej rozpowszechniony nowotwór dziecięcy i główna przyczyna zgonów z powodu raka wśród dzieci. ALL jest uleczalna u >85% dotkniętych nią dzieci, ale dorośli i niemowlęta mają znacznie niższe wskaźniki wyleczeń, a nawrotowa/oporna na leczenie ALL ma 5-letnie przeżycie wynoszące <10%12. W związku z tym pilnie potrzebne jest opracowanie nowych strategii leczenia w celu zapobiegania nawrotom lub oporności na leczenie ALL lub ich zatrzymania. Chociaż opracowano wiele modeli ksenoprzeszczepów, takich jak mysz i szczur13, metody te są czasochłonne (np. miesiące) i kosztowne oraz wymagają kompleksowych regulacji etycznych. Aby sprostać niezaspokojonym potrzebom klinicznym w zakresie nowatorskiej terapii ALL, konieczne jest opracowanie powtarzalnego, efektywnego czasowo i kosztowo modelu zwierzęcego, który mógłby rozszerzyć podstawowe badania in vitro .
W tym badaniu informujemy o pomyślnym ustanowieniu protokołu ksenoprzeszczepu in ovo , który niezawodnie wytwarza 3D kolonizację naczyń krwionośnych komórek B i T-ALL pacjenta, co jest potencjalnie wykorzystywane do projektowania nowej terapii, która może zatrzymać postęp ALL oraz do opracowania narzędzia predykcyjnego dla wyników leczenia ALL i ryzyka.

<table><tbody><tr><td>Igły 34 G</td><td>BD Perisafe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Attune NxT</td><td>Rybak termiczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka BD Perisafe (32 g)</td><td>BD Perisafe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9647 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do zamrażania komórek</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka (Wirówka Allegra X-22R)</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawiczki jednorazowe</td><td>Rękawice diagnostyczne nitrylowe Royal Touch300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica MZ16FA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (DMEM)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific</td><td>Zobacz materiał D12345</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do jaj, inkubator rolkowy Vevitts 120</td><td>Vixest Trading Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy (95%)</td><td>VWR Polska</td><td>BDH1158-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Ficoll (Ficoll?? Paque Plus)</td><td>MiliporeSigma</td><td>Przekaźnik GE17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało FITC-CD10</td><td>Biotechnologia Santa Cruz</td><td>sc-46656 FITC</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało FITC-CD4</td><td>Biotechnologia Santa Cruz</td><td>sc-19641 FITC</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td>Mikrosystemy Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka ręczna (Dremel3000)</td><td>Bosch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T&nbsp;</td><td>ATCC, WIRGINIA, STANY ZJEDNOCZONE</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>VWR international, Hausser Scientific</td><td>15170-263</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świń</td><td>Millipore Sigma</td><td>Zobacz materiał H3149</td><td></td></tr><tr><td>Probówki heparynizowane</td><td>Odkurzacz BD&nbsp;</td><td>BD 366480</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamina 3000</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw miana multipleksowego lentiwirusa (zestaw miana lentiwirusa qPCR)</td><td>Abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl (chloride_ amonowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9434 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Olympus IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało PE-CD19</td><td>Biotechnologia Santa Cruz</td><td>sc-19650 PE</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało PE-CD8</td><td>Biotechnologia Santa Cruz</td><td>sc-1177 PE</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)&nbsp;</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał P3813</td><td></td></tr><tr><td>Pipety (regulowana objętość)</td><td>Eppendorf powiedział:</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Silnik RPMI 1640</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Taśma klejąca do wiolonczeli</td><td>3 mln</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne płytki 6-dołkowe</td><td>VWR international, Corning</td><td>22250-140</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki wirówkowe</td><td>Axygen Inc, Corning</td><td>AXYMCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne kolby hodowlane (75T)</td><td>VWR Polska</td><td>10062-872</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki Falcon (15 ml)</td><td>SARSTEDT (w języku angielskim)</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki Falcon (50 ml)</td><td>SARSTEDT (w języku angielskim)</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Filtr sterylny (0,45 &mikro; m filtr)</td><td>VWR Polska</td><td>76778-974</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne kleszcze</td><td>VWR Polska</td><td>82027-404</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe sterylne</td><td>VWR Polska</td><td>48300-031</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne końcówki do pipet</td><td>VWR Polska</td><td>76322-136, 76322-134, 76322-154</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne strzykawki</td><td>Strzykawka BD</td><td>309628?</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific</td><td>Zobacz materiał T10282</td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo ksenografacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (all) (pdx-all)

In Ovo Xenografting of Patient-Derived Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) Cells (PDX-ALL)

Badanie to wprowadza szybką, opłacalną i wydajną metodę ksenoprzeszczepu in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjenta, obejmującej zarówno linie komórek B, jak i komórek T. Korzystając z zapłodnionych zarodków kurczaków, wstrzyknęliśmy komórki B-ALL i T-ALL pochodzące od pacjenta do układu naczyniowego zarodków 11 dni po zapłodnieniu (11dpf). Co ciekawe, cztery dni po wstrzyknięciu przeszczepione ludzkie komórki białaczki wykazywały znaczną przeżywalność, proliferację i kolonizację naczyń krwionośnych w rozwijającym się zarodku kurczaka. Do 15dpf wykryliśmy znaczny wzrost komórek B-ALL CD10/CD19+ i T-ALL CD4/CD8+ w próbkach krwi z układu naczyniowego zarodka, potwierdzając pomyślne wszczepienie. System ten ułatwia wydajną i powtarzalną ocenę zachowania komórek białaczkowych w żywym organizmie bez znacznych kosztów i ograniczeń etycznych związanych z innymi modelami zwierzęcymi. To szybkie podejście zapewnia wysokowydajną i biologicznie istotną platformę in vivo do oceny potencjalnych związków terapeutycznych. Zaprezentowany tutaj system in ovo patient-derived xenograft (PDX)-ALL oferuje obiecujące narzędzie do przedklinicznych badań przesiewowych leków, badań mechanistycznych i potencjalnie do spersonalizowanych podejść medycznych w badaniach nad białaczką.

Aby ustalić, czy wszczepienie ludzkich komórek ALL w rozwijające się zarodki kurczaka zakończyło się sukcesem, amplifikowano lentiwirus 2. generacji z niekompetentną replikacją przenoszący mCherry i wykorzystano je do znakowania linii komórkowych B- i T-ALL, SEM i MOLT316,17, odpowiednio. Jak pokazano na rysunku 1A, ~ 50% komórek B - (lewy górny lewy panel) i T - (prawy górny róg dwa panele) WSZYSTKIE komórki były oznaczon...

Protokół ten opisuje ksenoprzeszczep in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjenta, który występuje 4 dni po wstrzyknięciu.

In Ovo Ksenografacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (PDX-ALL)

This study introduces a rapid, cost-effective, and efficient method for in ovo xenografting of patient-derived acute lymphoblastic leukemia (ALL) cells, ...

Zakres tych badań obejmuje biologię nowotworów, z naciskiem na identyfikację strategii terapeutycznych w leczeniu raka. Model ostrej białaczki limfoblastycznej in ovo pobrany od pacjenta jest ograniczony przez stosunkowo krótkie okno eksperymentalne wynoszące około 10 dni, co ogranicza długoterminowe badania nad progresją ostrej białaczki limfoblastycznej lub odpowiedzią na lek poza tymi ramami czasowymi. Protokół ten ustanawia szybką, opłacalną metodę ksenoprzeszczepu in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej pochodzących od pacjenta, w tym linii komórek B i limfocytów T.Protokół ten stanowi obiecujące narzędzie do przedklinicznych badań przesiewowych leków, badań mechanistycznych i potencjalnie spersonalizowanych podejść medycznych w badaniach nad białaczką. Zbadana zostanie możliwość wykorzystania ustalonego modelu ksenoprzeszczepu in ovo do zastosowań przedklinicznych. Na początek przenieś pozyskane jaja do nawilżonego inkubatora rolkowego o wilgotności około 50 do 60% i temperaturze 39 stopni Celsjusza.Wysiaduj jaja w tym inkubatorze przez 10 dni po zapłodnieniu. Przenieś próbki krwi do sterylnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej i rozcieńcz każdą próbkę trzykrotnie,

in-ovo-xenografting-patient-derived-acute-lymphoblastic-leukemia-all

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje technikę tworzenia modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z danio pręgowanego. W protokole próbki oceniamy skuteczność leków Gemcytabina i Navitoclax na modelu ksenoprzeszczepu guza trzustki.

Ksenoprzeszczep danio pręgowanego od pacjenta (zPDX): model raka

Opisana tutaj jest metoda wytwarzania egzogennej cytokiny u myszy z ksenoprzeszczepem pochodzącym od pacjenta (PDX) poprzez cotygodniowe dootrzewnowe wstrzykiwanie linii komórek zrębu transdukowanej cytokinami. Metoda ta rozszerza użyteczność PDX i zapewnia opcję przejściowego lub trwałego dostarczania cytokin egzogennych w wielu modelach PDX.

Ekspresja cytokin egzogennych w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjentów poprzez wstrzyknięcie linii komórek zrębu transdukowanej cytokiną

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania i stereotaktycznego podawania allogenicznych ludzkich limfocytów u myszy z niedoborem odporności z ortotopowymi ludzkimi pierwotnymi guzami mózgu. Badanie to dostarcza dowodów na słuszność koncepcji zarówno wykonalności, jak i skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii komórkowych dostarczanych do mózgu.

Stereotaktyczny transfer adoptywny cytotoksycznych komórek odpornościowych w mysich modelach ortotopowego ludzkiego glejaka wielopostaciowego ksenoprzeszczepów

Ten protokół opisuje procedury optymalizacyjne w opartym na wirusie, dwufluorescencyjnie znakowanym modelem ksenoprzeszczepu guza, wykorzystującym larwy danio pręgowanego jako gospodarzy. Ten heterogeniczny model ksenoprzeszczepu naśladuje skład tkankowy mikrośrodowiska raka trzustki in vivo i służy jako bardziej precyzyjne narzędzie do oceny reakcji leków w spersonalizowanych modelach zPDX (ksenoprzeszczep pobrany od pacjentów z danio pręgowanego).

Heterogeniczny model ksenoprzeszczepu raka trzustki uzyskany od pacjenta z wykorzystaniem larw danio pręgowanego jako gospodarzy do porównawczej oceny leków

Opisujemy ludzką komórkę jednojądrzastą krwi obwodowej (PBMC) — humanizowany model myszy ksenoprzeszczepu do translacyjnych badań immunoonkologicznych. Protokół ten może służyć jako ogólna wskazówka do ustanawiania i charakteryzowania podobnych modeli oceny terapii I-O.

Humanizowany model ksenoprzeszczepu z ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) do badań immunoonkologicznych translacyjnych (I-O)

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Tutaj opisujemy protokół, w którym model ksenoprzeszczepu uzyskany od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną jest używany jako strategia oceny i monitorowania toksyczności związanej z receptorem chimerycznego antygenu T ukierunkowanym na CD19.

Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące generowania i rozwiązywania problemów z ludzkimi ksenoprzeszczepami ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) z linii komórkowych i świeżego materiału pacjenta w przejściowo immunosupresyjnych zarodkach danio pręgowanego, wraz z wytycznymi dotyczącymi oceny odpowiedzi na lek za pomocą cytometrii przepływowej. Rurociąg eksperymentalny może być również dostosowany do guzów litych.

Szybkie przewidywanie odpowiedzi na leki in vivo przy użyciu przeszczepów komórek białaczkowych w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje skuteczną, niechirurgiczną metodę ortotopowego wszczepiania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi u myszy. Technika ta polega na enzymatycznej dysocjacji guza, a następnie bezpośrednim wstrzyknięciu do poduszek tłuszczowych sutka, co umożliwia implantację o wysokiej przepustowości. Kompleksowa walidacja zapewnia wierność modelu, ułatwiając rygorystyczne badania nad różnymi podtypami raka piersi.

Wysokoprzepustowa dysocjacja i ortotopowa implantacja ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi

W tym miejscu opisano metodę opartą na cytometrii fosfoprzepływowej do analizy sygnalizacji za szlakami mTORC1, JAK / STAT5 i MAPK w ostrych ludzkich komórkach białaczki szpikowej ksenoprzeszczepowanych myszom i uzyskanych z aspiratów szpiku kostnego. Poziomy p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 i p-ERK1/2 są jednocześnie mierzone za pomocą spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości.

Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

Poznaj metodę ksenografacji in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjentów. To szybkie i opłacalne narzędzie umożliwia badania przedkliniczne oraz ocenę odpowiedzi na leczenie.

In Ovo Ksenografacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (PDX-ALL)

Przeglądaj więcej filmów