In Ovo Ksenografacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (PDX-ALL)

Zakres tych badań obejmuje biologię nowotworów, z naciskiem na identyfikację strategii terapeutycznych w leczeniu raka. Model ostrej białaczki limfoblastycznej in ovo pobrany od pacjenta jest ograniczony przez stosunkowo krótkie okno eksperymentalne wynoszące około 10 dni, co ogranicza długoterminowe badania nad progresją ostrej białaczki limfoblastycznej lub odpowiedzią na lek poza tymi ramami czasowymi. Protokół ten ustanawia szybką, opłacalną metodę ksenoprzeszczepu in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej pochodzących od pacjenta, w tym linii komórek B i limfocytów T.

Protokół ten stanowi obiecujące narzędzie do przedklinicznych badań przesiewowych leków, badań mechanistycznych i potencjalnie spersonalizowanych podejść medycznych w badaniach nad białaczką. Zbadana zostanie możliwość wykorzystania ustalonego modelu ksenoprzeszczepu in ovo do zastosowań przedklinicznych. Na początek przenieś pozyskane jaja do nawilżonego inkubatora rolkowego o wilgotności około 50 do 60% i temperaturze 39 stopni Celsjusza.

Wysiaduj jaja w tym inkubatorze przez 10 dni po zapłodnieniu. Przenieś próbki krwi do sterylnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej i rozcieńcz każdą próbkę trzykrotnie, używając dwóch objętości PBS. Po odwirowaniu próbki wraz z pożywką o gradiencie gęstości, zebrać warstwę kożucha komórek jednojądrzastych z granicy faz i przenieść ją do nowej sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Dodać 10 mililitrów PBS do probówki i odwirować probówki o stężeniu 300 G przez pięć minut, aby usunąć pozostałe składniki surowicy. Ponownie zawiesić granulowane ogniwa w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS. Użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek.

Ponownie zawiesić komórki w pożywce zamrażającej składającej się z 10% DMSO w FBS. Oceń żywotność komórek za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego i zamroź komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i przechowuj je w ciekłym azocie. Następnie należy przetransfekować 1,5 miliona limfocytów T HEK 293 z pożądanym wektorem plazmidowym za pomocą Lipofectaminy 3000 i inkubować transfekowane komórki przez dwa dni.

Zbierz supernatant zawierający lentiwirusa ze studzienek i przefiltruj go przez filtr 0,45 mikrometra w celu usunięcia zanieczyszczeń. Przefiltrowany supernatant wirusowy przenieść do probówek wirówkowych i odwirować w temperaturze 20 000 G przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Do znakowania umieść 1 milion komórek na mililitr linii komórkowych SEM i komórek T prekursorowych komórek B i MOLT3, a także komórek ostrej białaczki limfoblastycznej B lub T pochodzących od pacjenta na sześciodołkowe płytki zawierające RPMI 1640 z 10% FBS.

Wizualizuj komórki znakowane mCherry pod mikroskopem fluorescencyjnym. W dniu 10 zbadaj unaczynienie zarodków piskląt pod światłem, aby ocenić żywotność zarodka, Delikatnie umyj powierzchnię każdego jaja 70% etanolem. Za pomocą wiertarki ręcznej wywierć w komórce powietrznej każdego jajka, aby stworzyć małe okienko o średnicy około dwóch centymetrów.

Uszczelnij utworzone okno przezroczystą taśmą klejącą i włóż jaja do inkubatora z 5% dwutlenkiem węgla. W dniu 11 wstrzyknij 10 milionów komórek ostrej białaczki limfoblastycznej znakowanych mCherry do naczyń krwionośnych rozwijających się zarodków za pomocą igieł o rozmiarze 34. Po uszczelnieniu okna umieść jaja z powrotem w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla i codziennie monitoruj żywotność zarodków.

W 15 dniu wypreparuj naczynia krwionośne z zarodków. Umieść je na szklanych szkiełkach i sfotografuj udane ksenoprzeszczepy za pomocą mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w właściwości fluorescencyjne. Pobrać krew z układu naczyniowego zarodków kurczaka za pomocą sterylnej strzykawki z igłą o rozmiarze 32.

Przenieś krew do 1,5-mililitrowej sterylnej probówki zawierającej heparynę i odwiruj w temperaturze 226 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Oznacz komórki ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek B ludzkimi przeciwciałami FITC CD10 i ludzkimi PE CD19 oraz komórkami ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek T z ludzkimi przeciwciałami FITC CD4 i ludzkimi PE CD8 w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez 30 minut. Dwukrotnie przemyć znakowane komórki za pomocą PBS zawierającego 1% BSA i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej Kolonizacja naczyń krwionośnych przez linie komórkowe SEM i MOLT3 była wyraźnie widoczna cztery dni po wstrzyknięciu, potwierdzając pomyślne wszczepienie w rozwijający się układ naczyniowy zarodka kurczaka.

Komórki B-all i T-all pochodzące od pacjenta wykazywały silne sygnały fluorescencyjne w naczyniach krwionośnych po czterech dniach od wstrzyknięcia, co wskazuje na aktywną kolonizację i proliferację w układzie naczyniowym. Cytometria przepływowa wykazała znaczny wzrost liczby komórek CD10/CD19 dodatnich w zarodkach, którym wstrzyknięto SEM i komórki B-all pochodzące od pacjenta po czterech dniach od wstrzyknięcia, w porównaniu z grupą kontrolną pobraną sześć godzin po wstrzyknięciu. Podobnie, komórki CD4 / CD8 dodatnie były znacznie wyższe w zarodkach, którym wstrzyknięto MOLT3 i limfocyty T-all pochodzące od pacjenta po czterech dniach od wstrzyknięcia.