Name: In vitro Hodowla limfocytów T kaczki specyficznych dla H5N1 i wykrywanie odpowiedzi immunologicznej metodą barwienia cytokinami wewnątrzkomórkowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj metodę hodowli limfocytów T kaczki specyficznych dla H5N1 i wykrywania IFN-γ barwieniem wewnątrzkomórkowym. Protokół umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej ptaków przeciwko wirusom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32473060 i 32461120064) (do MD i ML); Guangzhou Basic and Applied Basic Research Project (2025A04J5445) (do MD); Program Profesorski dla Młodych Uczonych Rzeki Jangcy (2024, Manman Dai); oraz Young Peal River Scholar of "Guangdong Special Support Plan" (2024, Manman Dai). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu.

Wszystkie eksperymenty ze wszystkimi dostępnymi wirusami ptasiej grypy A (H5N1) zostały przeprowadzone w laboratorium i obiekcie dla zwierząt o 3 poziomie bezpieczeństwa biologicznego zgodnie z protokołami Uniwersytetu Rolniczego Południowochińskiego (CNAS BL0011). Wszystkie projekty badawcze na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (kod identyfikacyjny 2021f154, 29 lipca 2021 r.) Uniwersytetu Rolniczego Południowochińskiego. Wszystkie zabiegi na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami i wytycznymi ustanowionymi przez ten komitet oraz międzynarodowymi standardami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Zwierzętami wykorzystanymi w tym badaniu były 4-tygodniowe domowe kaczki krzyżówki (Anas platyrhynchos domestica), w tym zarówno samce, jak i samice, o masie ciała od 500 do 600 g.
1. Izolacja PBMC kaczki i przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
<ol>
	<li>Zbierz 2 ml heparynizowanej krwi z żyły szyjnej każdej kaczki i przenieś do probówek zawierających EDTA, aby zapobiec krzepnięciu u każdej kaczki z osobna</li>
	<li>Rozcieńczyć krew za pomocą dostarczonego rozcieńczalnika do próbek z zestawu do izolacji limfocytów lub PBS. Delikatnie wymieszać, pipetując pipetą Pasteura. Zwykły stosunek rozcieńczenia wynosi 1:1 dla krwi do rozcieńczalnika.</li>
	<li>Przenieść taką samą objętość roztworu do separacji limfocytów do probówki wirówkowej, jak rozcieńczona krew. Ostrożnie ułóż zawiesinę krwi na wierzchu roztworu do separacji limfocytów. Odwirować mieszaninę w temperaturze 400 x g, 25 °C przez 15 minut, ustawiając przyspieszenie opadania na 1, 
	UWAGA: Ilość roztworu do separacji limfocytów nie powinna być mniejsza niż 4 ml. Składniki zestawu roztworu do separacji limfocytów można znaleźć w Tabeli materiałów.</li>
	<li>Po odwirowaniu obserwuj cztery odrębne warstwy w probówce wirówkowej od góry do dołu. Górna warstwa to rozcieńczalnik do próbek, po której następuje pierścieniowa mlecznobiała warstwa limfocytów, następnie roztwór rozdzielający, a dolna warstwa składa się z czerwonych krwinek.</li>
	<li>Ostrożnie użyj pipety, aby zebrać drugą warstwę, pierścieniową mlecznobiałą warstwę limfocytów i przenieś ją do nowej probówki wirówkowej. Dodaj 10 ml roztworu czyszczącego, aby wymieszać z komórkami.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 440 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml pożywki RPMI 1640 w celu zliczenia komórek.</li>
	<li>Opcjonalnie) W celu dalszego oczyszczenia próbki, po odwirowaniu przy 440 x g przez 5 minut, należy użyć buforu do lizy czerwonych krwinek w celu usunięcia wszelkich pozostałych zmieszanych krwinek.</li>
</ol>
2. Hodowla in vitro H5N1 specyficzna dla AIV
<ol>
	<li>Kup 2-tygodniowe, zdrowe kaczki krzyżówki (Sheldrake) z fermy kaczek i umieść je w izolatorach podciśnieniowych. Potwierdź, że kaczki są ujemne na obecność grypy ptaków, stosując testy hamowania hemaglutynacji (HI) przed eksperymentem. Zakażone 4-tygodniowe kaczki wirusem H5N1 AIV 1 x 106, z 50% dawką zakaźną jaj [EID50]/0,2 ml donosowo.</li>
	<li>Wyizolować PBMC pamięci od kaczek zakażonych wirusem H5N1 28 dni po zakażeniu, postępując zgodnie z metodą opisaną w kroku 1. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w stosunku 1:1 0,08% błękitu trypanowego i ręcznie policzyć żywe (niebarwione) komórki pod mikroskopem świetlnym. 
	UWAGA: Jak potwierdza nasze wcześniej opublikowane badanie20, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) wyizolowane 28 dni po zakażeniu są uważane za wzbogacone w limfocyty T pamięci. Na tym etapie faza efektorowa ustąpiła, a populacje komórek pamięci są dominujące.</li>
	<li>Ustaw stężenie na 3 x 106 komórek/ml, upewniając się, że do każdego dołka 48-dołkowej płytki dodaje się 1 ml pożywki.</li>
	<li>Jednoczesne zakażenie wyizolowanych PBMC wirusem ptasiej grypy H5N1 (AIV), aby służyły jako APC. Dawka wirusa wynosi MOI = 5. Współhodowlę PBMC z wirusem przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Delikatnie wstrząsać ręką co 15 minut.</li>
	<li>Po 1 godzinie infekcji przemyj komórki 2x PBS, aby usunąć niezwiązane cząsteczki wirusa. Ponownie zawiesić przemyte PBMC w 1 ml pożywki do hodowli limfocytów T i dalej inkubować zawieszone komórki w temperaturze 37 °C przez 5 godzin.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 440 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić inkubowane komórki prezentujące antygen (APC) w 100 μl pożywki do hodowli limfocytów T i dodać je do komórek efektorowych. Stosunek komórek prezentujących antygen do komórek efektorowych powinien wynosić 1:5.</li>
	<li>Inkubować komórki w atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 14 dni. Co 2 dni zastępować połowę supernatantu hodowli komórkowej świeżą pożywką z limfocytów T, ostrożnie pipetując, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Odrzucić połowę pożywki zawierającej komórki, a następnie dodać równą objętość nowego podłoża.</li>
	<li>W dniu 7 obserwuj komórki pod mikroskopem optycznym pod kątem 100x.</li>
	<li>Użyj PBMC pamięci traktowanych PBS jako niestymulowanej grupy kontrolnej.</li>
</ol>
3. Karboksyl-fluoresceina Diacetan sukcynimidylu Ester (CFSE) do monitorowania proliferacji limfocytów T
<ol>
	<li>Dostosuj gęstość komórek do 0,5-1 x 107 komórek/ml i ponownie zawieś komórki z 5 ml PBS po odwirowaniu przy 440 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć 10 mM bulionu do 1 μM CFSE za pomocą 5 ml wstępnie schłodzonego PBS; pracować w ciemności.</li>
	<li>Przechylić dwie probówki wirówkowe pod kątem 45°, dodać rozcieńczenie CFSE do zawiesiny komórek za pomocą pipety Pasteura, dobrze wymieszać i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15 minut w ciemności.</li>
	<li>Przemyć komórki, rozcieńczając je w 10 objętościach wstępnie schłodzonego PBS zawierającego 5% FBS, osadzać przez odwirowanie przy 440 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Powtórz pranie 2x.</li>
	<li>Stymuluj komórki znakowane CFSE in vitro zgodnie z krokiem 2. Po zakończeniu testu proliferacji należy pobrać komórki i przeanalizować je za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
4. Analiza cytometryczna przepływowa pod kątem proliferacji limfocytów T CD8+ i limfocytów T CD4+
<ol>
	<li>Po 7 dniach hodowli zbierz wszystkie komórki z każdej studzienki i podziel je na dwie rurki przepływowe do analizy.</li>
	<li>Przenieść komórki do nowej probówki wirówkowej, odwirować przy 440 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 100 μl koktajlu przeciwciał (mysi anty-kaczkowy CD8, 1:50 lub mysi anty-kaczkowy CD4, 1:50) i inkubować komórki przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść komórki do nowej probówki wirówkowej, odwirować przy 440 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 100 μl koktajlu przeciwciał (kozio-sprzężony z FITC Kozia IgG2b, 1:50) i inkubować komórki przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki raz 1 ml PBS, wirując przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania FlowJo. Strategia bramkowania jest pokazana na rysunku uzupełniającym 1.</li>
</ol>
5. Odpowiedź limfocytów T za pomocą testów ekspresji genów sygnaturowych za pomocą qPCR
<ol>
	<li>Policz komórki na końcu hodowli limfocytów T, zbierz do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 400 x g przez 5 minut. Ostrożnie wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Ekstrakcja RNA 
	UWAGA: Ekstrakcję można przeprowadzić w dygestorii lub ultra czystej ławce, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNA.
	<ol>
		<li>Zdaj komórki za pomocą buforu do lizy dostarczonego w zestawie zgodnie z instrukcjami producenta. Przenieś zlizowaną próbkę do kolumn filtrujących gDNA (wstępnie umieszczonych w probówkach zbiorczych), odwiruj przy 13 400 x g przez 30 s, odrzuć kolumny i zbierz filtrat. Dodać 0,5 objętości bezwzględnego etanolu do filtratu. Dokładnie wymieszaj. 
		UWAGA: Mętny roztwór lub osad po dodaniu etanolu jest normalny. Wstrząśnij i przejdź do następnego kroku.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę do kolumn RNA, odwirować przy 13 400 x g przez 30 s. Wyrzucić filtrat, dodać 700 μl buforu RW1 i ponownie odwirować.</li>
		<li>Odrzucić przesąc, dodać 700 μl buforu RW2 (z absolutnym etanolem) i odwirować. Odrzucić przesąc, dodać 500 μl buforu RW2 (z absolutnym etanolem) i odwirować przez 2 minuty. Ostrożnie wyjmij kolumnę z rurki, aby uniknąć zanieczyszczenia filtratem. Upewnij się, że wszystkie roztwory płuczące zostały usunięte, aby zapobiec zakłóceniom w dalszych reakcjach.</li>
		<li>Przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej wolnej od RNaz, dodać 50-200 μl ddH2O bez RNaz, pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 minutę, a następnie odwirować przy 13 400 x g przez 1 minutę w celu wymycia RNA. Zmierz czystość i stężenie RNA. 
		UWAGA: Podgrzej ddH2O bez RNaz do 65 °C w celu zwiększenia wydajności i w razie potrzeby wykonaj drugą elucję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zsyntetyzuj cDNA zgodnie z instrukcjami zestawu. Zsyntetyzuj nić cDNA zgodnie z instrukcjami producenta, dodając 5x więcej odwrotnej transkryptazy. Odwrotną transkrypcję w temperaturze 37 °C przez 15 minut, następnie w temperaturze 85 °C przez 5 s i schładzanie do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Ustaw reakcję PCR zgodnie z protokołem producenta.
	<ol>
		<li>W probówce qPCR połącz 10 μl mieszaniny 2x enzymów reakcyjnych PCR, 0,4 μl startera 1, 0,4 μl startera 2, 1 μl matrycy cDNA i 8,2 μl ddH2O, aby uzyskać mieszaninę 20 μl.</li>
		<li>Uruchom PCR w ilościowym aparacie PCR w czasie rzeczywistym za pomocą następującego programu: 
		Etap 1: 95 °C przez 30 s, Rep x 1 
		Etap 2: 95 °C przez 3 s, 60 °C przez 30 s, Rep x 35 
		Etap 3: 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 60 s, 95 °C przez 15 s, Rep x 1</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin (ICS)
UWAGA: Ten protokół został opracowany w celu oceny odpowiedzi efektorowej limfocytów T CD8+ specyficznych dla H5N1 poprzez wykrywanie wewnątrzkomórkowego wydzielania IFN-γ u kaczek.
<ol>
	<li>Hodowla limfocytów T specyficznych dla H5N1 in vitro zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2. Zbierz wszystkie komórki (z każdej studzienki) po 7 dniach od rozpoczęcia hodowli.</li>
	<li>Inkubować komórki prezentujące antygen (APC) zgodnie z opisem w kroku 2. Dodać inkubowane APC i Brefeldin A (1:1 000) do komórek efektorowych i współinkubować przez 6 godzin w inkubatorze o temperaturze 39 °C.</li>
	<li>Przenieść komórki do nowej probówki wirówkowej, odwirować przy 440 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 100 μl koktajlu przeciwciał (mysi anty-kaczka CD8, 1:50) do komórek i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki przez odwirowanie w stężeniu 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić je w 1 ml PBS. Dodać koktajl przeciwciał (sprzężony z FITC kozioł anty-mysi IgG2b, 1:50) i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ponownie umyć komórki przez odwirowanie w stężeniu 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu utrwalającego i inkubować przez 20-25 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ponownie przepłukać komórki, odwirowując przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 1 ml 1x buforu permeabilizacyjnego i przemyć komórki 2x przez odwirowanie w 440 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu permeabilizacji i dodać przeciwciało (Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10) do komórek. Po utrwaleniu i przepuszczalności błony inkubować mieszaninę komórka-przeciwciało przez 30 minut w ciemności, od czasu do czasu wstrząsając podczas inkubacji w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Roztwór do permeabilizacji/płukania jest 10-krotnym roztworem podstawowym i przed użyciem należy go rozcieńczyć PBS.</li>
	<li>Przemyć komórki ponownie 1 ml PBS przez odwirowanie w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 100 μl koktajlu przeciwciał (kozi anty-mysi IgG3 sprzężony z PE, 1:250) i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą oprogramowania FlowJo. Strategia bramkowania jest pokazana w Rysunek 1.</li>
</ol>

<ol><li>Almeida, L., Lochner, M., Berod, L., Sparwasser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathways+in+T+cell+activation+and+lineage+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathways in T cell activation and lineage differentiation.</a> Semin Immunol. 28 (5), 514-524 (2016).</li>
<li>Weidle, U. H., Georges, G., Tiefenthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-MHC%2Fpeptide+interaction%3A+prospects+for+new+anti-tumoral+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genom+Proteom%22%5BJournal%5D)">TCR-MHC/peptide interaction: prospects for new anti-tumoral agents.</a> Cancer Genom Proteom. 11 (6), 267-277 (2014).</li>
<li>Mazza, C., Malissen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+guides+MHC-restricted+TCR+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">What guides MHC-restricted TCR recognition.</a> Semin Immunol. 19 (4), 225-235 (2007).</li>
<li>Nel, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation+through+the+antigen+receptor.+Part+1%3A+signaling+components%2C+signaling+pathways%2C+and+signal+integration+at+the+T-cell+antigen+receptor+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-cell activation through the antigen receptor. Part 1: signaling components, signaling pathways, and signal integration at the T-cell antigen receptor synapse.</a> J Allergy Clin Immunol. 109 (5), 758-770 (2002).</li>
<li>Dai, M., Xu, C., Chen, W., Liao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+on+chicken+T+cell+immunity+to+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Progress on chicken T cell immunity to viruses.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (14), 2779-2788 (2019).</li>
<li>Deng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+and+therapeutic+strategies+for+tissue-resident+memory+T+cells%2C+central+memory+T+cells%2C+and+effector+memory+T+cells+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The role and therapeutic strategies for tissue-resident memory T cells, central memory T cells, and effector memory T cells in psoriasis.</a> Immunology. 173 (3), 470-480 (2024).</li>
<li>Corrado, M., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+memory+T+cell+metabolism+to+improve+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Targeting memory T cell metabolism to improve immunity.</a> J Clin Invest. 132 (1), 148546(2022).</li>
<li>Liu, X., Li, H., Li, S., Yuan, J., Pang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+and+recall+of+memory+T+cell+populations+against+tuberculosis%3A+Implications+for+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Maintenance and recall of memory T cell populations against tuberculosis: Implications for vaccine design.</a> Front Immunol. 14, 1100741(2023).</li>
<li>Zanker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+establishing+high+purity+murine+CD8%2B+T+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for establishing high purity murine CD8+ T cell cultures.</a> J Immunol Methods. 387 (1-2), 173-180 (2013).</li>
<li>Yang, W., Chen, X., Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29+T-Cell+Differentiation+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CD4(+) T-Cell Differentiation In Vitro.</a> Methods Mol Biol. 2111, 91-99 (2020).</li>
<li>Jiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+novel+CD8%28%2B%29+T-cell+epitopes+from+the+H5N1+avian+influenza+virus+in+HBW%2FB1+haplotype+ducks%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Revealing novel CD8(+) T-cell epitopes from the H5N1 avian influenza virus in HBW/B1 haplotype ducks.</a> Vet Res. 55 (1), 169(2024).</li>
<li>Faulkner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+in+vitro+culture+methods+to+characterize+primary+T-cell+responses+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">The development of in vitro culture methods to characterize primary T-cell responses to drugs.</a> Toxicol Sci. 127 (1), 150-158 (2012).</li>
<li>Cimen Bozkus, C., Blazquez, A. B., Enokida, T., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+T-cell-based+immunogenicity+protocol+for+evaluating+human+antigen-specific+responses%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A T-cell-based immunogenicity protocol for evaluating human antigen-specific responses.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100758(2021).</li>
<li>Masuda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+effects+of+chicken+type+III+interferon+on+expression+of+interferon-stimulated+genes+in+chickens%3A+comparison+with+type+I+and+type+II+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Biological effects of chicken type III interferon on expression of interferon-stimulated genes in chickens: comparison with type I and type II interferons.</a> J Vet Med Sci. 74 (11), 1381-1386 (2012).</li>
<li>Ding, H., Wang, G., Yu, Z., Sun, H., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+interferon-gamma+%28IFN-%CE%B3%29+and+IFN-%CE%B3+receptor+1%2F2+%28IFN%CE%B3R1%2F2%29+in+regulation+of+immunity%2C+infection%2C+and+cancer+development%3A+IFN-%CE%B3-dependent+or+independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Role of interferon-gamma (IFN-γ) and IFN-γ receptor 1/2 (IFNγR1/2) in regulation of immunity, infection, and cancer development: IFN-γ-dependent or independent pathway.</a> Biomed Pharmacother. 155, 113683(2022).</li>
<li>Gong, Z., Li, Q., Shi, J., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Artifact+in+Intracellular+Cytokine+Staining+for+Studying+T+Cell+Responses+and+Its+Alleviation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">An Artifact in Intracellular Cytokine Staining for Studying T Cell Responses and Its Alleviation.</a> Front Immunol. 13, 759188(2022).</li>
<li>Yu, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+assays+show+human+gamma-delta+T+cells+specific+for+common+allergens+are+Th1-polarized+in+allergic+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Ex vivo assays show human gamma-delta T cells specific for common allergens are Th1-polarized in allergic donors.</a> Cell Rep Methods. 2 (12), 100350(2022).</li>
<li>Grant, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+CD8%28%2B%29+T+cell+cross-recognition+of+distinct+influenza+A+strains+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Broad CD8(+) T cell cross-recognition of distinct influenza A strains in humans.</a> Nat Commun. 9 (1), 5427(2018).</li>
<li>Letsch, A., Scheibenbogen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+characterization+of+specific+T-cells+by+antigen-specific+cytokine+production+using+ELISPOT+assay+or+intracellular+cytokine+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining.</a> Methods. 31 (2), 143-149 (2003).</li>
<li>Dai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duck+CD8%28%2B%29+T+Cell+Response+to+H5N1+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+Virus+Infection+In+Vivo+and+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Duck CD8(+) T Cell Response to H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Infection In Vivo and In Vitro.</a> J Immunol. 209 (5), 979-990 (2022).</li>
<li>Jabbari, A., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+and+modulation+of+antigen-specific+memory+CD8+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The generation and modulation of antigen-specific memory CD8 T cell responses.</a> J Leukoc Biol. 80 (1), 16-23 (2006).</li>
<li>Puleo, A., Carroll, C., Maecker, H. T., Gupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+Using+Vacutainer+Cellular+Preparation+Tubes+%28CPT%28TM%29%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Vacutainer Cellular Preparation Tubes (CPT(TM)).</a> Bio Protoc. 7 (2), e2103(2017).</li>
<li>Chometon, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+monocyte+isolation+and+generation+of+singular+human+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells.</a> PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).</li>
<li>Qin, S., Zhang, Y., Tian, Y., Xu, F., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+metabolomics%3A+Isolation%2C+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Subcellular metabolomics: Isolation, measurement, and applications.</a> J Pharm Biomed Anal. 210, 114557(2022).</li>
<li>Pertoft, H., Johnsson, A., Wärmegård, B., Seljelid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+human+monocytes+on+density+gradients+of+Percoll%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Separation of human monocytes on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 33 (3), 221-229 (1980).</li>
<li>Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+proteasomes+function+to+increase+viral+peptide+diversity+and+broaden+antiviral+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses.</a> J Immunol. 191 (1), 52-59 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+CD4%28%2B%29+T-cell+response+to+Helicobacter+pylori+reduces+risk+for+gastric+disease+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A dominant CD4(+) T-cell response to Helicobacter pylori reduces risk for gastric disease in humans.</a> Gastroenterology. 144 (3), 591-600 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zapewnia skuteczną metodę hodowli in vitro limfocytów T specyficznych dla antygenu kaczki, a także ustanawia wewnątrzkomórkowy protokół barwienia cytokin dla kaczek, który można wykorzystać do oceny odpowiedzi efektorowych limfocytów T. Obecnie nie ma opublikowanych doniesień na temat protokołów hodowli in vitro limfocytów T kaczki. Odnieśliśmy się przede wszystkim do protokołów dla ludzkich limfocytów T specyficznych dla antygenu, ale jesteśmy zaangażowani w optymalizację warunków inkubacj...

Proces aktywacji, proliferacji, różnicowania i przekształcania limfocytów T w pamięć jest kluczowy dla odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla antygenu1. Początkowo limfocyty T są aktywowane, gdy ich receptory limfocytów T (TCR) rozpoznają peptydy antygenowe prezentowane na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC) przez cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC)2,3. Ten proces aktywacji wymaga nie tylko wiązania TCR z cząsteczkami MHC, ale także koordynacji sygnałów kostymulujących, które są kluczowe dla pełnej aktywacji funkcji komórek T4. Po aktywacji limfocyty T szybko wchodzą w fazę proliferacji, generując liczne klony, które mają taką samą specyficzność antygenową jak oryginalne limfocyty T. Podczas tej fazy proliferacji limfocyty T dalej różnicują się w zależności od ich funkcji, głównie na limfocyty T CD8 + i limfocyty T CD4 + 5. Te zróżnicowane komórki pośredniczą odpowiednio w zabijaniu cytotoksycznym i wspomagają odpowiedź immunologiczną. Po początkowej infekcji część aktywowanych limfocytów T przekształca się w długotrwałe limfocyty T pamięci6. Te limfocyty T pamięci mogą utrzymywać się w układzie odpornościowym przez dłuższy czas, szybko reagując na ten sam patogen po ponownym narażeniu. W rezultacie generują silniejszą i bardziej wydajną odpowiedź immunologiczną, zapewniając długotrwałą ochronę immunologiczną dla hosta7. Cały ten proces ma kluczowe znaczenie dla projektowania szczepionek z limfocytami T, ponieważ pomaga poprawić skuteczność i trwałość szczepionki8.
W tym kontekście, hodowla limfocytów T specyficznych dla antygenu in vitro staje się niezbędna. Protokół ten został opracowany w oparciu o uznane metody hodowli in vitro ludzkich limfocytów T, z niezbędnymi adaptacjami dla ptasiego układu odpornościowego9. Hodując te komórki poza organizmem, naukowcy mogą badać odpowiedź limfocytów T w różnych stanach odpornościowych, takich jak aktywacja, proliferacja, różnicowanie i tworzenie pamięci10. To podejście in vitro jest nieocenione dla zrozumienia ról, jakie limfocyty T odgrywają w odpowiedziach immunologicznych. Ponadto w warunkach hodowli in vitro można monitorować wydzielanie cytokin (takich jak IFN-γ) przez limfocyty T11,12. Monitorowanie to ma kluczowe znaczenie dla oceny jakości, intensywności i trwałości odpowiedzi immunologicznej, a także badania interakcji między limfocytami T a innymi komórkami odpornościowymi. Dodatkowo, ekspansja in vitro limfocytów T specyficznych dla antygenu umożliwia wzbogacenie na dużą skalę, zwiększa czułość wykrywania i poprawia ocenę poziomów odpowiedzi limfocytów T13. W związku z tym hodowla in vitro limfocytów T specyficznych dla antygenu służy jako potężne narzędzie do lepszego zrozumienia roli limfocytów T drobiu w odpowiedziach immunologicznych, co zwiększa czułość wykrywania i poprawia ocenę poziomów odpowiedzi limfocytów T. Podczas gdy podobne metody in vitro są dobrze znane w systemach ssaków, zastosowanie takich technik u gatunków ptaków pozostaje ograniczone. Jest to szczególnie istotne w immunologii drobiu, gdzie narzędzia do analizy odpowiedzi limfocytów T są słabo rozwinięte. W szczególności kaczki służą jako naturalne rezerwuary dla kilku wirusów ptasiej grypy, ale niewiele wiadomo na temat ich odporności limfocytów T specyficznej dla antygenu. W związku z tym opracowanie znormalizowanego protokołu hodowli komórek T in vitro dostosowanego do systemów ptasich ma zasadnicze znaczenie dla postępu zarówno w badaniach podstawowych, jak i immunologii stosowanej u drobiu.
Kluczową cytokiną biorącą udział w tych procesach jest IFN-γ, interferon typu II, wytwarzany głównie przez limfocyty T CD8+, limfocyty T CD4+ typu 1 i komórki NEK14. IFN-γ odgrywa kluczową rolę w hamowaniu replikacji wirusa i regulacji odpowiedzi immunologicznej15. Poziom ekspresji IFN-γ odzwierciedla status immunologiczny i służy jako marker aktywacji limfocytów T, umożliwiając naukowcom ocenę poziomu odpowiedzi limfocytów T poprzez jego expression16,17. Jedną z powszechnych metod wykrywania ekspresji cytokin w komórkach odpornościowych jest wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin (ICS)18,19. Jednak ze względu na ograniczenia w materiałach i technikach eksperymentalnych, badania nad kaczkami pozostają w tyle za badaniami nad ssakami5. Obecnie wielu badaczy polega na qPCR do pomiaru poziomów ekspresji IFN-γ, chociaż ta metoda ma pewne ograniczenia11. W naszym laboratorium udało nam się opracować przeciwciało przeciwko IFN-γ kaczki, które jest kompatybilne z cytometrią przepływową. Opierając się na tym sukcesie, w tym badaniu opracowaliśmy metodę ICS do wykrywania ekspresji białka IFN-γ w limfocytach T kaczki, zapewniając niezawodne narzędzie do dalszych badań nad odpowiedziami limfocytów T kaczki.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml MIKRO-probówki wirówkowe</td><td>Biosharp</td><td>Cat#BS-15-M</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Probówki wirówkowe</td><td>Labselect</td><td>Cat#CT-002-15A</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (55 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka do hodowli tkankowej (bez obróbki, płaskie dno)</td><td>Biofil</td><td>Cat#TCP000048</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Probówki wirówkowe</td><td>Labselect</td><td>Cat#CT-002-50A</td> 96-dołkowe <td></td></tr><tr><td>płytki qPCR bez osłony</td><td>Labselect</td><td>Cat#PP-96-NS-0100</td><td></td></tr><tr><td>BD Zestaw Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Bioscience</td><td>Cat#BD 554714</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>BD Bioscience</td><td>Cat#347688</td><td></td></tr><tr><td>Hodowla komórkowa Inkubator CO2</td><td>Thermo</td><td>Fisher Heracell 150i GP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zestaw</td> do znakowania CFSE Eppendorf <td>5810R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>Cat#ab113853</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Cat#Q341-02</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji limfocytów krwi obwodowej kaczki</td><td>Tbdscience</td><td>Cat#LTS1090D</td><td></td></tr><tr><td>Evo M-MLV RT Premix</td><td>Dokładna biotechnologia</td><td>Cat#AG11706</td><td></td></tr><tr><td>FastPure Izolacja całkowitego RNA komórek/tkanek Zestaw V2</td><td>Vazyme</td><td>Cat#RC112-01</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>Cat#10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>BA43347</td><td></td></tr><tr><td>Rurka przepływowa</td><td>Beyotime</td><td>Cat#FFC005</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.8.1</td><td>Drzewo Gwiazda</td><td>https://www.flowjo.com</td><td></td></tr><tr><td>Koza Anty-Myszy 488, 1:50 rozcieńczenie</td><td>Abbkine</td><td>Cat#A23210</td><td></td></tr><tr><td>Kozia Anty-Mysia IgG2b, FITC, 1:50 rozcieńczenie</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat#1091-31</td><td></td></tr><tr><td>Kozia Anty-Mysz IgG3, PE, 1:250 rozcieńczenie</td><td>Southern Biotech&nbsp;</td><td>Cat#1100-09S</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad prism 8.0.2</td><td>Oprogramowanie GraphPad</td><td>https://www.graphpad-prism.cn</td><td></td></tr><tr><td>H5N1 AIV szczep DK383</td><td>Krajowe i Regionalne Wspólne Laboratorium Inżynieryjne ds. Leków Zapobiegania i Kontroli Chorób Odzwierzęcych</td><td>A/Kaczka/Guangdong/383/2008</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>Cat#25030081</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Motic</td><td>AE2000</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti-Duck CD4, rozcieńczenie 1:50</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat#MCA2478</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti-Duck CD8&alpha;, rozcieńczenie 1:50</td><td>GeneTex&nbsp;</td><td>Cat#GTX41834</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anti-Duck IFN-&gamma; mAb, rozcieńczenie 1:10</td><td>Przygotowane w naszym laboratorium&nbsp;</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher</td><td>AZY1603209</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (nieistotne</td><td>Gibco</td><td>Cat#11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>Cat#10010023</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermal Cycler</td><td>Biometra</td><td>Biometra Tone 96G</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>Gibco</td><td>Cat#15070063</td><td></td></tr><tr><td>System Real-Time PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI7500</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowaną ludzką IL-2 (10 &mu; g)</td><td>USCNK</td><td>Cat#RPA111Ga01</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek</td><td>Tbdscience</td><td>Cat#NH4CL2009</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>Cat#11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>Cat#11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#93595</td><td></td></tr><tr><td>Dwutygodniowe kaczki krzyżówki (Sheldrake)</td><td>ferma kaczek w Kanton</td>, <td>Ameryka Północna</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro hodowla limfocytów t kaczki specyficznych dla h5n1 i wykrywanie odpowiedzi immunologicznej metodą barwienia cytokinami wewnątrzkomórkowymi

In Vitro Culture for H5N1-Specific Duck T Cells and Detection of Immune Responses Using Intracellular Cytokine Staining Method

Hodowla in vitro limfocytów T jest kluczową metodą badania odpowiedzi immunologicznych, infekcji wirusowych i potencjalnych strategii terapeutycznych. Jednak do tej pory nie zgłoszono żadnych ustalonych protokołów hodowli limfocytów T ptaków in vitro. W niniejszym badaniu po raz pierwszy przedstawiamy protokół, w którym jako model wykorzystano wirusa H5N1 wysoce zjadliwej grypy ptaków (HPAIV). W tym przypadku 4-tygodniowe kaczki zostały zakażone wirusem, a limfocyty T pamięci wyizolowano 28 dni po zakażeniu w celu wyhodowania limfocytów T kaczki specyficznych dla H5N1, co umożliwiło zbadanie specyficznej odpowiedzi immunologicznej na wirusa H5N1. Kluczowe kroki w protokole obejmują izolację komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pamięci (PBMC) od zakażonych kaczek, aktywację komórek prezentujących antygen (APC) o optymalnej wielokrotności infekcji (MOI = 5) przez 6 godzin oraz przygotowanie pożywki do hodowli komórek T uzupełnionej rekombinowaną IL-2 i innymi specyficznymi dodatkami. Proliferacja limfocytów T, wydzielanie cytokin i aktywność cytotoksyczna były ściśle monitorowane przez cały proces. Dodatkowo ustaliliśmy wewnątrzkomórkowy protokół barwienia cytokin w celu ilościowego określenia wydzielania IFN-γ w limfocytach T kaczki. Wiązało się to z wytworzeniem linii komórkowej hybrydoma wykazującej ekspresję przeciwciał IgG3κ specyficznych dla IFN-γ kaczki, a następnie pomyślnym oczyszczeniem przeciwciał. Oczyszczone przeciwciało rozcieńczono w stosunku 1:10 i zastosowano w cytometrii przepływowej w celu precyzyjnego pomiaru wydzielania IFN-γ. Metoda ta stanowi wiarygodne narzędzie do oceny odpowiedzi limfocytów T kaczki i stanowi podstawę dla przyszłych badań nad immunologią wirusów ptaków.

Protokół ten opracowano na podstawie wcześniejszego badania dotyczącego wykrywania odpowiedzi efektorowych limfocytów T swoistych dla antygenu u kaczek20. Pierwszy etap eksperymentu obejmuje hodowlę in vitro limfocytów T swoistych dla wirusa, które stanowią podstawę do późniejszych badań nad odpowiedzią efektorową. Początkowo APC inkubowano i hodowano wspólnie z komórkami efektorowymi. Obserwacje morfologiczne wykazały, że po proliferacji komórki wykazywały wzrost w skupiskach (<strong cl...

Protokół opisuje metodę hodowli komórek T ptaków in vitro poprzez izolowanie limfocytów T pamięci od zakażonych kaczek, co pozwala na generowanie wysoce oczyszczonych specyficznych limfocytów T kaczki. Ponadto ustalono metodę barwienia cytokin wewnątrzkomórkowych (ICS) w celu dokładnego pomiaru wydzielania IFN-γ w limfocytach T kaczki.

In vitro Hodowla limfocytów T kaczki specyficznych dla H5N1 i wykrywanie odpowiedzi immunologicznej metodą barwienia cytokinami wewnątrzkomórkowymi

The in vitro culture of T cells is a critical method for studying immune responses, viral infections, and potential therapeutic strategies. However, no ...

Naszym celem jest ustanowienie protokołu in vitro do hodowli limfocytów T kaczki specyficznych dla H5N1 i ilościowego określenia wydzielania IFN-γ za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin. Ostatnie badania podkreślają znaczenie odporności ptasich limfocytów T w kontrolowaniu infekcji wirusowych, ale nadal brakuje znormalizowanych metod hodowli kaczek. Udało nam się wyhodować specyficzne dla H5N1 limfocyty T kaczki i opracować nowatorski, oparty na segmentach przepływu protokół ICS do wykrywania ekspresji IFN-γ u kaczek. Zbadamy odpowiedzi limfocytów T specyficzne dla antygenu u innych gatunków drobiu i opracujemy ptasie narzędzia immunologiczne do oceny szczepionek i badań przeciwwirusowych.[Narrator] Na początek wyizoluj komórki jednojądrzaste krwi obwodowej pamięci (PBMC) od kaczek, które zostały zakażone wirusem H5N1 28 dni wcześniej, i dostosuj stężenie izolowanych komórek do 3 razy 10 do mocy 6 komórek na mililitr. Teraz dozuj 1 mililitr pożywki do każdego dołka 48-dołkowej płytki. Następnie dodać wirusa ptasiej grypy H5N1 do PBMC przy wielokrotności infekcji 5 w celu koinfekcji komórek i inkubować kokulturę przez godzinę w temperaturze 37 ° Celsjusza. Co 15 minut delik

in-vitro-culture-for-h5n1-specific-duck-t-cells-detection-immune

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

W przeciwieństwie do bezkomórkowych cząsteczek HIV-1, zakażone limfocyty T CD4+ są skutecznie wykrywane przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC). Niniejszy manuskrypt opisuje metodę, w której jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) lub izolowane pDC są hodowane wspólnie z limfocytami T zakażonymi wirusem HIV-1 w celu oceny wrodzonego wykrywania przez pDC, oceniane przez uwalnianie IFN typu I.

Ocena wrodzonego wyczuwania limfocytów T CD4 + zakażonych wirusem HIV-1 przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne przy użyciu systemu kohodowli ex vivo.

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia &gt;250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

Dwie metody oparte na cytometrii przepływowej - test in vitro na bazie limfocytów T i wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin zostały wykorzystane do zmierzenia zdolności komórek dendrytycznych do prezentacji antygenu i odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu na infekcję mutantem wirusa Zachodniego Nilu u myszy.

In vitro Analiza komórkowej odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem Myd88 na zakażenie zmutowanym szczepem wirusa Zachodniego Nilu

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Wirusy grypy typu A (IAV) są ważnymi ludzkimi patogenami układu oddechowego. Aby zrozumieć patogenność wirusów IAV i przeprowadzić badania przedkliniczne nowych metod szczepień, potrzebne są modele zwierzęce naśladujące ludzką fizjologię. W tym miejscu opisujemy techniki oceny patogenezy IAV, odpowiedzi humoralnych i skuteczności szczepionki przy użyciu mysiego modelu infekcji.

Badania wirusa grypy A w mysim modelu infekcji

Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.

Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy

Rozwój testu interferon-gamma ELISpot dla PBMC świnek morskich pozwala na scharakteryzowanie odpowiedzi limfocytów T w tym bardzo istotnym modelu do badania chorób zakaźnych. Zastosowaliśmy test do pomiaru odpowiedzi limfocytów T związanych z śródskórnym dostarczaniem szczepionek DNA.

Zoptymalizowany test ELISpot interferonu gamma do pomiaru odpowiedzi limfocytów T w modelu świnki morskiej po szczepieniu

Ten artykuł opisuje protokoły oceny odpowiedzi Tfh i GC B w mysim modelu infekcji wirusem grypy.

Ocena komórek pomocniczych pęcherzyków T i odpowiedzi centrum rozrodczego podczas infekcji wirusem grypy A u myszy

Ten protokół opisuje eksperymentalny proces wytwarzania zakaźnych cząsteczek pseudotypowych wirusa o wysokim mianie (pp) z glikoproteinami otoczkowymi z dwóch szczepów grypy A i jak określić ich zakaźność. Protokół ten jest wysoce elastyczny do tworzenia pps dowolnego innego typu wirusów otoczkowych z różnymi glikoproteinami otoczki.

Produkcja zakaźnych cząstek pseudotypowanych grypy zakaźnej o wysokim mianie z glikoproteinami otoczkowymi z wysoce zjadliwych wirusów H5N1 i ptasich H7N9

Tutaj opisujemy protokół pakowania pseudowirusów i pomiaru aktywności neutralizującej przeciwciała.

Otrzymywanie pseudotypowych wirusów ptasiej grypy H5 metodą transfekcji fosforanu wapnia i pomiar aktywności neutralizującej przeciwciała

Poznaj metodę hodowli limfocytów T kaczki specyficznych dla H5N1 i wykrywania IFN-γ barwieniem wewnątrzkomórkowym. Protokół umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej ptaków przeciwko wirusom.

In vitro Hodowla limfocytów T kaczki specyficznych dla H5N1 i wykrywanie odpowiedzi immunologicznej metodą barwienia cytokinami wewnątrzkomórkowymi (Wideo) | JoVE Journal

In vitro Hodowla limfocytów T kaczki specyficznych dla H5N1 i wykrywanie odpowiedzi immunologicznej metodą barwienia cytokinami wewnątrzkomórkowymi

Przeglądaj więcej filmów