Name: Ustanowienie systemu kohodowli organoidów i limfocytów naciekających nowotwór jelita grubego pochodzących od pacjentów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę kohodowli organoidów raka jelita grubego z limfocytami TIL pochodzącymi od pacjentów. Protokół umożliwia badanie interakcji immunologicznych i ocenę potencjału terapeutycznego terapii TIL w personalizowanej onkologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin [82172822]; Program Wsparcia Innowacji Talentów Wysokiego Szczebla Biura Nauki i Technologii Dalian [2021RD02]; Wspólny plan programu nauki i technologii prowincji Liaoning [2024JH2/102600067]; Projekt Międzynarodowej Współpracy Naukowo-Technologicznej Prowincji Liaoning [2024JH2/101900006].

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem materiałów pochodzenia ludzkiego zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i zostały wcześniej zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Zhongshan powiązanego z Uniwersytetem Dalian (numery zatwierdzenia: KY2023-206-1). Pisemną świadomą zgodę uzyskano od wszystkich pacjentów, którzy dostarczyli próbki kliniczne do tego badania. Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
Kryteria włączenia obejmowały patologicznie potwierdzoną tkankę pierwotnego raka jelita grubego, wystarczającą wielkość próby (≥1 cm3), brak historii terapii neoadjuwantowej (chemoradioterapii lub terapii celowanej) oraz podpisaną świadomą zgodę. Kryteria wykluczenia obejmowały niską jakość próbki z martwicą lub zwłóknieniem przekraczającą 50%, obecność współistniejącej ciężkiej infekcji lub choroby autoimmunologicznej, historię innych nowotworów złośliwych oraz odmowę udziału pacjenta.
1. Przygotowanie odczynnika do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Pożywka dla ChNP CRC: Przygotować kompletną pożywkę CRC ChNP zgodnie ze składem opisanym w tabeli 1.</li>
	<li>Kompletna pożywka (CM) dla TILs16: Uzupełnij pożywkę RPMI1640 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, HEPES, 2-merkaptoetanolu i 3000 j.m./ml IL-2.</li>
	<li>Pożywka ekspandująca TILs (EM): Uzupełnij pożywkę RPMI1640 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, HEPES i 600 IU / ml IL-2.</li>
	<li>AdDMEM++++: Suplement Advanced DMEM z 1% penicyliny-streptomycyny, 1% HEPES, 1% glutaminy i 5 mM Y-27632.</li>
	<li>Bufor do wytrawiania CRC: Dodać 50 μl kolagenazy typu IV i 10 μl roztworu penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B do AdDMEM++++.</li>
	<li>Roztwór do przemywania tkanek: Dodać 2% penicyliny-streptomycyny do PBS.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie tkanek pochodzących od pacjenta
<ol>
	<li>Wyciąć pierwotną tkankę nowotworową raka jelita grubego (do wykonania przez doświadczonych chirurgów). Po pobraniu podziel tkankę na dwie części. Umieść jedną część w AdDMEM++++ w pojemniku na lód i przetransportuj ją do laboratorium w celu dysocjacji komórek nowotworowych i hodowli. Umieść drugą część w 4% paraformaldehydzie do analizy histopatologicznej17.</li>
	<li>Powoli rozmrażaj Matrigel w lodówce o temperaturze 4 °C. Bufor do lizy erytrocytów należy wstępnie podgrzać do temperatury pokojowej. Przygotuj nożyczki do tkanek, kleszcze, pożywkę AdDMEM++++ i bufor do trawienia CRC.</li>
	<li>Przenieść tkankę na szalkę Petriego i spłukać trzykrotnie 5 ml PBS. Wymień naczynie na nowe i spłucz trzykrotnie 5 ml buforu do płukania chusteczek, aby zminimalizować zanieczyszczenie.</li>
	<li>Tkankę rozdrobnić nożyczkami, przenieść do buforu wytrawiającego i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut, aż do całkowitej dysocjacji.</li>
	<li>Przetnij tkankę nożyczkami do tkanek i przenieś ją do roztworu do trawienia tkanek. Trawić tkankę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i monitorować aż do zakończenia dysocjacji tkanek.</li>
	<li>Dodaj równą objętość AdDMEM++++, aby zneutralizować trawienie. Wirować przy 380 × g przez 5 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Obserwuj liczbę erytrocytów w osadzie. Dodać 1-3 ml lizatu erytrocytów i inkubować przez 10 minut w temperaturze 25 °C.<ol>
		<li>Zakończ lizę równą objętością AdDMEM++++. Wirować przy 380 × g przez 5 minut w temperaturze około 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad komórek w odpowiedniej objętości AdDMEM++++.</li>
	<li>Określ ilościowo żywe komórki za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego w celu uzyskania jednokomórkowej zawiesiny tkanki nowotworowej.</li>
</ol>
3. Ustanowienie modelu ChNP i kultura TIL
<ol>
	<li>Podziel jednokomórkową zawiesinę tkanki nowotworowej na dwie części: użyj jednej do ustalenia modelu PDO, a drugiej do hodowli TIL.</li>
	<li>Po zliczeniu komórek wymieszaj 80 000 komórek na studzienkę zawiesiny komórkowej z Matrigelem w stosunku 1:1 w celu ustalenia modelu PDO.</li>
	<li>Zawiesić pozostałą zawiesinę komórek w CM na 24-dołkowej płytce o stężeniu 1 × 106 komórek/ml do hodowli TILs.</li>
	<li>Obserwuj codziennie. Rób zdjęcia, aby rejestrować status PDO i TIL. Zmieniaj podłoże co 2 dni.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie i rozprężanie TIL
<ol>
	<li>Hoduj TIL przez 10-20 dni przed oczyszczeniem.</li>
	<li>Zebrać TIL do probówki wirówkowej. Przepłukać płytkę studzienkową świeżą pożywką i zebrać wszelkie pozostałe komórki z płytki studzienki.</li>
	<li>Wirować przy 125 × g przez 5 minut w temperaturze około 25 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Przemyć 2 ml PBS i ponownie odwirować w temperaturze 125 × g przez 5 minut w temperaturze około 25 °C.</li>
	<li>Wykonaj zliczanie komórek.</li>
	<li>Użyj kulek magnetycznych CD3 + do sortowania, aby wyizolować limfocyty T CD3 + 18.</li>
	<li>Inkubować przeciwciało z zawiesiną komórkową w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut.</li>
	<li>Inkubować kulki magnetyczne z zawiesiną przeciwciało-komórek w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut.</li>
	<li>Umieść kolumnę sortującą w magnesie sortującym. Dodaj zawiesinę komórek do kolumny i pozwól, aby w kolumnie sortującej pozostały tylko dodatnie komórki oznaczone kulkami magnetycznymi.</li>
	<li>Usuń kolumnę sortującą z pola magnetycznego. Dodaj roztwór buforowy, aby wymyć dodatnie komórki zatrzymane w kolumnie. Zawiesić komórki w 2 ml PBS i odwirować przy 195 × g przez 5 minut w temperaturze około 25 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant za pomocą pipety. Zawiesić komórki na 12-dołkowej płytce ze świeżą pożywką EM o stężeniu 1 × 106 komórek/ml. Dodać 5 μg/ml przeciwciała CD3. Komórki należy umieszczać w nowych kolbach hodowlanych co 3 dni.</li>
</ol>
5. Histologia i charakterystyka IHC ChNP
<ol>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną po tym, jak organoidy osiągną wielkość 50 μm.</li>
	<li>Utrwal kulki organoidowe bezpośrednio w 4% paraformaldehydzie. Odessać organoidy, odwirować przy 195 × g przez 5 minut w temperaturze około 25 °C, zanurzyć w 2% agarozie, pozostawić do utwardzenia i przenieść do 4% paraformaldehydu w celu utrwalenia przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia wykonaj odwodnienie gradientowe. Przygotuj bloki woskowe, wytnij skrawki 4 μm, ponownie nawodnij za pomocą gradientu i wykonaj barwienie immunohistochemiczne przy użyciu przeciwciał CK7, CK20, Ki-67 i CDX-2.</li>
</ol>
6. Charakterystyka IF TIL
<ol>
	<li>Oczyść TIL, hoduj je aż do osiągnięcia odpowiedniej liczby i wyekstrahuj porcję do charakteryzacji.</li>
	<li>Scharakteryzować komórki zawiesiny za pomocą metody płatkowania. Ustawić prędkość obrotową płatkownicy na 343 × g przez 4 minuty w temperaturze około 25 °C.</li>
	<li>Policz i zasiej komórki w ilości 1 × 104 na szkiełko.</li>
	<li>Mocno przymocuj komórki do szkiełek przez odwirowanie.</li>
	<li>Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 15 minut i umyj trzy razy PBS.</li>
	<li>Inkubować z roztworem blokującym (PBS zawierający 2% FBS) przez 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi (CD45, CD3, EpCAM) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy PBS.</li>
	<li>Przygotować i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym zgodnie ze stężeniem zalecanym przez producenta przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy PBS. UWAGA: Zwróć uwagę na homologię przeciwciał.</li>
	<li>Inkubować z DAPI przez 15 minut w temperaturze około 25 °C.</li>
	<li>Obserwuj wybarwione komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
7. System kohodowli ChNP i TIL
<ol>
	<li>Dodaj IFN-γ do pożywki organoidowej, aby poprawić prezentację antygenu. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny15.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało anty-CD28 PBS. Pokryj 96-dołkową płytkę, dodając 50 μl roztworu przeciwciała do każdej studzienki. Uszczelnić płytkę folią uszczelniającą i inkubować w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Po 24 godzinach zdysocjuj organoidy na pojedyncze komórki za pomocą TrypLE. Policz komórki i przemyj dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Zbierz sparowane TIL, policz komórki i umyj dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Zaszczepić organoidy w ilości 1 ×10 4 komórek na studzienkę i zaszczepić TIL w ilości 1 × 105 komórek na studzienkę, aby osiągnąć stosunek efektora do celu (E:T) wynoszący 10:1 dla kohodowli.</li>
	<li>Przeprowadzić kohodowlę w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny, 3000 U/ml IL-2 i 20 μg/ml przeciwciała blokującego anty-PD-1. Inkubuj przez 3 dni i rób zdjęcia do obserwacji i dokumentacji. UWAGA: Ustaw organoidy bez TIL jako grupę kontrolną.</li>
</ol>
8. Funkcjonalny test TIL metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Zbierz ChNP i TIL na koniec okresu wspólnej kultury.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 5 minut za każdym razem. Odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Przygotuj koktajl przeciwciał zawierający CD3-FITC, CD4-APC/cyjaninę7, CD8-APC, CD107a-PE-cyjaninę7, CD279-PE i 7-AAD.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 100 μl koktajlu przeciwciał i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Dodaj 1 ml PBS, aby umyć komórki. Odwirować przy 300 × g przez 5 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS.</li>
	<li>Wykonaj analizę cytometrii przepływowej. Patrz rysunek uzupełniający 1 , aby zapoznać się ze szczegółową strategią analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Eng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Colorectal cancer.</a> Lancet. 404 (10449), 294-310 (2024).</li>
<li>Sarnaik, A. A., Hwu, P., Mulé, J. J., Pilon-Thomas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-infiltrating+lymphocytes%3A+A+new+hope%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-infiltrating lymphocytes: A new hope.</a> Cancer Cell. 42 (8), 1315-1318 (2024).</li>
<li>Paijens, S. T., Vledder, A., De Bruyn, M., Nijman, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-infiltrating+lymphocytes+in+the+immunotherapy+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-infiltrating lymphocytes in the immunotherapy era.</a> Cell Mol Immunol. 18 (4), 842-859 (2021).</li>
<li>Betof Warner, A., Corrie, P. G., Hamid, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-infiltrating+lymphocyte+therapy+in+melanoma%3A+Facts+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor-infiltrating lymphocyte therapy in melanoma: Facts to the future.</a> Clin Cancer Res. 29 (10), 1835-1854 (2023).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+adjuvant+immunotherapy+with+autologous+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+locally+advanced+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Phase I study of adjuvant immunotherapy with autologous tumor-infiltrating lymphocytes in locally advanced cervical cancer.</a> J Clin Invest. 132 (15), e157726(2022).</li>
<li>Mengus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+tumor-immune+system+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of tumor-immune system interaction.</a> ACS Biomater Sci Eng. 4 (2), 314-323 (2018).</li>
<li>Wang, H., Tian, T., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+%28tams%29+in+colorectal+cancer+%28crc%29%3A+From+mechanism+to+therapy+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages (tams) in colorectal cancer (crc): From mechanism to therapy and prognosis.</a> Int J Mol Sci. 22 (16), 8470(2021).</li>
<li>Rasyid, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+PD-1+and+PD-L1+as+prognostic+and+predictive+biomarkers+in+colorectal+adenocarcinoma+based+on+TILs+grading%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol%22%5BJournal%5D)">The potential of PD-1 and PD-L1 as prognostic and predictive biomarkers in colorectal adenocarcinoma based on TILs grading.</a> Curr Oncol. 31 (12), 7476-7493 (2024).</li>
<li>Chen, E., Zeng, Z., Zhou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+key+role+of+matrix+stiffness+in+colorectal+cancer+immunotherapy%3A+Mechanisms+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The key role of matrix stiffness in colorectal cancer immunotherapy: Mechanisms and therapeutic strategies.</a> Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1879 (6), 189198(2024).</li>
<li>Xu, H., Jiao, D., Liu, A., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+organoids%3A+Applications+in+cancer+modeling+and+potentials+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor organoids: Applications in cancer modeling and potentials in precision medicine.</a> J Hematol Oncol. 15 (1), 58(2022).</li>
<li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+tumor+organoids+and+their+application+to+cancer+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Construction of tumor organoids and their application to cancer research and therapy.</a> Theranostics. 14 (3), 1101-1125 (2024).</li>
<li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Sci Transl Med. 11 (513), eaay2574(2019).</li>
<li>Magré, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+organoid-immune+co-culture+models+for+cancer+research%3A+From+oncoimmunology+to+personalized+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emerging organoid-immune co-culture models for cancer research: From oncoimmunology to personalized immunotherapies.</a> J Immunother Cancer. 11 (5), e006290(2023).</li>
<li>Matsueda, S., Chen, L., Li, H., Yao, H., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+clinical+researches+and+technological+development+in+til+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Recent clinical researches and technological development in til therapy.</a> Cancer Immunol Immunother. 73 (11), 232(2024).</li>
<li>Cattaneo, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+organoid-t-cell+co-culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tumor organoid-t-cell co-culture systems.</a> Nat Protoc. 15 (1), 15-39 (2020).</li>
<li>Itzhaki, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+large-scale+expansion+of+minimally+cultured+%26%2334%3Byoung%26%2334%3B+tumor+infiltrating+lymphocytes+for+adoptive+transfer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Establishment and large-scale expansion of minimally cultured &#34;young&#34; tumor infiltrating lymphocytes for adoptive transfer therapy.</a> J Immunother. 34 (2), 212-220 (2011).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+predict+chemoradiation+responses+of+locally+advanced+rectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids predict chemoradiation responses of locally advanced rectal cancer.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26.e16 (2020).</li>
<li>Moore, D. K., Motaung, B., Du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+b-cells+using+miltenyi+macs+bead+isolation+kits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of b-cells using miltenyi macs bead isolation kits.</a> PLoS One. 14 (3), e0213832(2019).</li>
<li>Albrecht, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+colon+cancer-derived+tumor-infiltrating+t+cells+%28tils%29+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Generation of colon cancer-derived tumor-infiltrating t cells (tils) for adoptive cell therapy.</a> Cytotherapy. 25 (5), 537-547 (2023).</li>
<li>Tan, Y. S., Lei, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+tumor-infiltrating+lymphocytes+by+ficoll-paque+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of tumor-infiltrating lymphocytes by ficoll-paque density gradient centrifugation.</a> Methods Mol Biol. 1960, 93-99 (2019).</li>
<li>Ou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+melanoma+organoid+models+facilitate+the+assessment+of+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Patient-derived melanoma organoid models facilitate the assessment of immunotherapies.</a> EBioMedicine. 92, 104614(2023).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+as+personalized+avatars+and+a+potential+immunotherapy+model+in+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids as personalized avatars and a potential immunotherapy model in cervical cancer.</a> iScience. 26 (11), 108198(2023).</li>
<li>Parikh, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+patient-derived+tumor+organoids+from+common+epithelial+cancers+to+analyze+personalized+T-cell+responses+to+neoantigens%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">Using patient-derived tumor organoids from common epithelial cancers to analyze personalized T-cell responses to neoantigens.</a> Cancer Immunol Immunother. 72 (10), 3149-3162 (2023).</li>
<li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell exhaustion.</a> Nat Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+IL-15+cytokine+mutein+fused+to+an+anti-PD1+improves+intratumoral+T-cell+function+and+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">An engineered IL-15 cytokine mutein fused to an anti-PD1 improves intratumoral T-cell function and antitumor immunity.</a> Cancer Immunol Res. 9 (10), 1141-1157 (2021).</li>
<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+control+of+T+cell+effector+function+by+aerobic+glycolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis.</a> Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).</li>
<li>Trefny, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Snx9+alleviates+CD8+T+cell+exhaustion+for+effective+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deletion of Snx9 alleviates CD8 T cell exhaustion for effective cellular cancer immunotherapy.</a> Nat Commun. 14 (1), 86(2023).</li>
<li>Sarnaik, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifileucel%2C+a+tumor-infiltrating+lymphocyte+therapy%2C+in+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lifileucel, a tumor-infiltrating lymphocyte therapy, in metastatic melanoma.</a> J Clin Oncol. 39 (24), 2656-2666 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W badaniu tym wykorzystuje się tkankę CRC pochodzącą od pacjenta w celu uzyskania zarówno komórek nowotworowych, jak i TIL, z których ustanawia się PDO i rozszerza TIL. Interakcja między tymi dwoma składnikami jest następnie badana za pomocą systemu kokultur.
W poprzednich badaniach TIL ekstrahowano przy użyciu złożonego oprzyrządowania19 lub bezpośrednio z zawiesin tkanki nowotworowej20. Jednak metody te często nie są w stanie wygenerować wystar...

Rak jelita grubego (CRC) jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych i śmiertelnych nowotworów na świecie, stanowiącym poważne wyzwanie dla zdrowia publicznego1. Pomimo postępów w metodach leczenia, w tym chirurgii, chemioterapii i immunoterapii, rokowanie dla pacjentów z CRC - zwłaszcza tych z przerzutami - pozostaje złe. Mikrośrodowisko guza (TME) odgrywa istotną rolę w kształtowaniu progresji raka i odpowiedzi na leczenie, a limfocyty naciekające nowotwór (TIL) stają się kluczowym elementem wpływającym na odpowiedź immunologiczną przeciwko nowotworowi2. TIL, zróżnicowana populacja komórek odpornościowych znajdujących się w nowotworach, została zidentyfikowana jako znaczące markery prognostyczne w CRC, z wysokim poziomem infiltracji TIL często związanym z lepszymi wynikami klinicznymi3. Ostatnie badania podkreśliły również potencjał terapeutyczny TIL w innych nowotworach, takich jak czerniak4 i rak szyjki macicy5, w przypadku których immunoterapia oparta na TIL wykazała obiecującą skuteczność.
Jednak pomimo sukcesu TIL w niektórych typach raka, ich zastosowanie w CRC pozostaje obszarem trwających badań. Złożoność i niejednorodność CRC, w połączeniu z immunosupresyjnym mikrośrodowiskiem guza, stanowią wyzwanie dla skutecznej immunoterapii opartej na TIL6. Guzy CRC często wykazują wysoce immunosupresyjny TME7, charakteryzujący się obecnością regulatorowych komórek T (Treg), komórek supresorowych pochodzących z mieloidu (MDSC) i makrofagów związanych z nowotworem (TAM), z których wszystkie aktywnie hamują funkcję TIL. Co więcej, komórki CRC często wyrażają cząsteczki immunologicznych punktów kontrolnych, takie jak PD-L1, które mogą dodatkowo utrudniać zabijanie za pośrednictwem TIL8. Ponadto genetyczna heterogeniczność guzów CRC, w połączeniu z immunosupresyjnym zrębem, komplikuje zdolność TIL do skutecznego celowania i eliminowania komórek nowotworowych, co utrudnia osiągnięcie tego samego poziomu sukcesu, jaki obserwuje się w czerniaku i raku szyjki macicy9. Krytyczną luką w obecnych badaniach jest brak odpowiednich modeli in vitro , które mogłyby dokładnie symulować interakcje między CRC i TIL. Takie modele są niezbędne do oceny potencjału TIL w terapii CRC i optymalizacji ich zastosowania w spersonalizowanych strategiach leczenia.
Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) stały się potężnym narzędziem do modelowania nowotworów u ludzi10. Te hodowle 3D, pochodzące z tkanek nowotworowych pacjenta, ściśle naśladują histologiczne i genetyczne cechy oryginalnych guzów, zapewniając dokładniejsze odwzorowanie biologii guza w porównaniu z tradycyjnymi liniami komórkowymi 2D. Modele PDO zachowują również heterogeniczność między pacjentami, co czyni je idealnymi dla podejść medycyny spersonalizowanej11. W CRC PDO były wykorzystywane do badań przesiewowych leków i badania biologii nowotworów12, ale ich zastosowanie w ocenie odpowiedzi immunologicznej - szczególnie w kontekście TIL - pozostaje ograniczone. Projekt modelu kohodowli komórek PDO i immunologicznych musi zrównoważyć złożoność mikrośrodowiska z możliwością kontroli eksperymentalnej. Chociaż składniki takie jak makrofagi i komórki dendrytyczne mogą wzmacniać biomimikrę, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) stały się głównym wyborem ze względu na ich dostępność. Jednak PBMC mają niski odsetek limfocytów T specyficznych dla nowotworu, a subpopulacje monocytów mogą zakłócać stabilność mikrośrodowiskową13. W przeciwieństwie do tego, TIL naturalnie wzbogacają klony reagujące na nowotwór i przenoszą fenotyp wyczerpania in situ, co czyni je doskonałym modelem do precyzyjnej analizy mechanizmów unikania odpowiedzi immunologicznej w raku jelita grubego.
Celem tego badania jest opracowanie nowatorskiej platformy in vitro do oceny odpowiedzi przeciwnowotworowych w CRC za pośrednictwem TIL poprzez ustanowienie systemu kohodowli CRC PDO i TIL. Model ten umożliwia bezpośrednią ocenę cytotoksyczności TIL wobec CRC PDO oraz analizę odpowiedzi immunologicznej w kontekście specyficznym dla pacjenta. Wykorzystanie tego systemu może dostarczyć głębszego wglądu w potencjał immunoterapii opartych na TIL w leczeniu raka jelita grubego i wesprzeć badanie strategii mających na celu zwiększenie skuteczności TIL poprzez podejścia inżynieryjne. Poprzednie metody były ograniczone ze względu na niewielką liczbę TIL14. W większości przypadków PBMC były najpierw hodowane wspólnie z PDO przez dwa tygodnie, po czym specyficzne dla nowotworu TIL można było roznwać z PBMC, a następnie dalej hodować razem z PDO, aby zaobserwować efekty cytotoksyczne15. Jednak takie podejście ma również długi czas modelowania i niską ogólną wydajność. Natomiast opisana metoda pozwala na izolację i ustalenie PDO i TIL z mniejszych próbek tkanek nowotworowych, które następnie mogą być bezpośrednio współhodowane. Takie podejście może zapewnić większą wygodę zarówno pod względem metodologii, jak i wydajności. Ostatecznie system ten ma na celu zapewnienie potężnego narzędzia do przedklinicznej oceny terapii TIL, torując drogę do spersonalizowanych strategii leczenia, które mogą poprawić wyniki leczenia pacjentów z CRC.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowany DMEM/F-12</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu</td><td>BBI (Biało-Czerwon</td><td>E672002-0100</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>Legenda biologiczna</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris powiedział:</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Suplement witaminy B27</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>CD107a-PE-cyjanina7</td><td>Legenda biologiczna</td><td>328618</td><td></td></tr><tr><td>CD279-PE</td><td>Legenda biologiczna</td><td>329906</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne CD3 (OKT3)</td><td>Invitrogen</td><td>14-0037-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3-FITC</td><td>Legenda biologiczna</td><td>300406</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (domena wewnątrzkomórkowa) (D9M8I)&nbsp;</td><td>CST</td><td>Numer katalogowy: 13917S</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC/Cyjanina7</td><td>Legenda biologiczna</td><td>300518</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC (Przekaźnik Zabezpieczenia)</td><td>Legenda biologiczna</td><td>344722</td><td></td></tr><tr><td>CDX-2</td><td>Płyta tysiąclecia (MXB</td><td>Zobacz materiał RMA-0631</td><td></td></tr><tr><td>Zobacz materiał CK20</td><td>Płyta tysiąclecia (MXB</td><td>Zestaw-0025</td><td></td></tr><tr><td>CK7 powiedział:</td><td>Płyta tysiąclecia (MXB</td><td>Zestaw-0021</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488, kozia IgG Anty-Królik</td><td>Abbkine powiedział:</td><td>A23220</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 549, Kozia IgG Anty-Mysz</td><td>Abbkine powiedział:</td><td>Nr kat. A23310</td><td></td></tr><tr><td>EFG (EFG)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (Protokół EpCAM)</td><td>CST</td><td>36746T</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Komórka Cellmax</td><td>Zobacz materiał SA211.02</td><td></td></tr><tr><td>FGF 10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin (człowiek)</td><td>Tocris powiedział:</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał H4034</td><td></td></tr><tr><td>HEPESY</td><td>Sigma</td><td>Zobacz materiał H4034</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki zestaw do separacji komórek CD3+ (RUO)</td><td>RWD</td><td>Zobacz materiał K1201-10</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie białko rekombinowane IFN-gamma</td><td>PeproTech</td><td>300-02-20UG</td><td></td></tr><tr><td>Czołg Ki-67</td><td>CST</td><td>Zobacz materiał 9449s</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma</td><td>A9165 (wersja angielska)</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>N0636 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Niwolumab (anty-PD-1)</td><td>Sprzedawca</td><td>A2002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>V900929</td><td></td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>NCM Biotechnologia</td><td>Zobacz materiał C100C5</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Szczepionka Invivogen</td><td>Ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RBC</td><td>Thermo-Invitrogen</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-2 (bez nośnika)</td><td>Legenda biologiczna</td><td>589104</td><td></td></tr><tr><td>Silnik RPMI 1640</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sprzedawca</td><td>Zobacz materiał S1077</td><td></td></tr><tr><td>Bejca błękitu trypanowego 0,4%</td><td>Thermo-Invitrogen</td><td>Zobacz materiał T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF Oczyszczone przeciwciało anty-ludzkie CD28</td><td>Legenda biologiczna</td><td>302934</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone przeciwciało anty-ludzkie CD3 Ultra-LEAF</td><td>Legenda biologiczna</td><td>317325</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sprzedawca</td><td>Zobacz materiał S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

ustanowienie systemu kohodowli organoidów i limfocytów naciekających nowotwór jelita grubego pochodzących od pacjentów

Establishment of a Co-culture System of Patient-Derived Colorectal Tumor Organoids and Tumor-Infiltrating Lymphocytes (TILs)

Rak jelita grubego (CRC) jest trzecim najczęściej występującym nowotworem na świecie. Limfocyty naciekające nowotwór (TIL) zostały zidentyfikowane jako ważny marker prognostyczny w CRC. Terapeutyczne zastosowanie TIL wykazało już obiecujące wyniki w przypadku czerniaka i raka szyjki macicy. Jednak ich zastosowanie w terapii CRC pozostaje w fazie eksploracyjnej. Odpowiedni model in vitro do oceny skuteczności TIL jest obecnie niedostępny, co utrudnia dalsze postępy w tej dziedzinie. Modele organoidów pochodzących od pacjenta (PDO), które ściśle zachowują cechy oryginalnej tkanki nowotworowej i odzwierciedlają heterogeniczność między pacjentami, stanowią doskonałą platformę do badania interakcji między CRC i TILs. W tym badaniu opisano metodę polegającą na ustaleniu pochodzącego od pacjenta modelu organoidowego CRC ze świeżo wyciętej tkanki nowotworowej, a następnie izolacji i ekspansji TIL. System ten umożliwia jednoczesną hodowlę organoidów CRC i TIL, umożliwiając ocenę cytotoksyczności i odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem TIL. Analizując skuteczność zabijania TIL na organoidach, można przewidzieć potencjalne wyniki immunoterapii opartej na TIL w spersonalizowanym leczeniu CRC. Co więcej, dalsza inżynieria TIL może zwiększyć ich skuteczność przeciwnowotworową, oferując obiecującą strategię opracowywania skuteczniejszych terapii komórkowych. Ten model kohodowli PDO-TIL zapewnia potężne narzędzie do przedklinicznej oceny terapii TIL i spersonalizowanych strategii leczenia raka jelita grubego.

Utworzenie i charakterystyka PDO z raka jelita grubego (CRC) 
Próbki nowotworowe pobrano od pacjentów z CRC. Świeżo wyresekcyjną tkankę nowotworową CRC wykorzystano do utworzenia PDO oraz TIL, które następnie zastosowano w eksperymentach z kokulturą PDO-TIL (Rycina 1).
<img alt="Schemat trawienia guza; kokultura PDO-TILs; cytometria przepływowa; test cytotoksyczności; metoda CRC." class="xfigimg" src="...

Protokół opisuje metodę tworzenia modelu organoidowego raka jelita grubego (CRC) pochodzącego od pacjenta, współhodowanego z limfocytami naciekającymi nowotwór (TIL) w celu zbadania ich interakcji i potencjału terapeutycznego. Model ten stanowi platformę przedkliniczną do badania odpowiedzi immunologicznych w mikrośrodowisku guza oraz do przewidywania skuteczności terapii opartej na TIL w spersonalizowanym leczeniu raka jelita grubego.

Ustanowienie systemu kohodowli organoidów i limfocytów naciekających nowotwór jelita grubego pochodzących od pacjentów

Colorectal cancer (CRC) is the third most common cancer worldwide. Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) have been identified as an important prognostic ...

Badania mają na celu zbadanie interakcji limfocytów naciekających nowotwór z organoidami raka jelita grubego oraz potencjału terapeutycznego terapii opartej na TIL w spersonalizowanym leczeniu raka jelita grubego. Nasz protokół uprościł zapobieganie limfocytom naciekającym nowotwór limfocytom i umożliwia ich współhodowlę z organoidami raka jelita grubego, przezwyciężając gorszą skuteczność i powszechną zachorowalność u pacjentów.[Narrator] Aby rozpocząć, przygotuj eksperymentalne odczynniki i odzież laboratoryjną do użycia. Następnie trzykrotnie przepłucz pierwotną tkankę nowotworową raka jelita grubego pięcioma mililitrami PBS, a następnie buforem do płukania tkanek. Za pomocą nożyczek do tkanek zmiel tkankę na małe fragmenty. Przenieść zmieloną tkankę do buforu do trawienia CRC. Próbkę inkubować w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, aż tkanka zostanie całkowicie zdysocjowana. Następnie dodać równą objętość Ad DMEM do strawionej próbki, aby zneutralizować reakcję. Odwirować zawiesinę o sile 380G przez pięć minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Teraz wyrzucić supernatant z odwirowanej próbki za pomocą pipety. Odpipetować od jednego do trzech mililitró

establishment-co-culture-system-patient-derived-colorectal-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnego organoidu guza jelita grubego u myszy. Metoda ta wykorzystuje tę cechę, że komórki nowotworowe jelita grubego przeżywają i rosną w organoidy w pożywkach zawierających ograniczone czynniki wzrostu, podczas gdy normalny nabłonek okrężnicy nie.

Metody in vitro Hodowla organoidowa pierwotnych guzów jelita grubego myszy

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Model zwierzęcy jest potrzebny do rozszyfrowania roli krążących komórek nowotworowych (CTC) w promowaniu kolonizacji płuc podczas przerzutów raka. W tym miejscu opracowaliśmy i z powodzeniem przeprowadziliśmy test in vivo, aby przetestować wymóg składania polimerycznej fibronektyny (polyFN) na CTC w celu kolonizacji płuc.

Opracowanie testu kolonizacji płuc do wizualizacji krążących komórek nowotworowych w tkankach płuc

Aby umożliwić bardzo czułe wykrywanie komórek kolonizujących tkanki ludzkiego raka jelita grubego (CRC), pokazujemy protokół efektywnej transdukcji cząsteczek lentiwirusa z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do komórek organoidowych CRC pochodzących z PDX przed ich wstrzyknięciem myszom biorcy, z obserwacją mikroskopową stereofluorescencji.

Wysoka czułość wykrywania mikroprzerzutów generowanych przez organoidy transdukowane przez GFP lentiwirus hodowane z guza jelita grubego pochodzącego od pacjenta

System modelowy in vitro został opracowany w celu uchwycenia zmian architektonicznych tkanek podczas progresji raka płaskonabłonkowego płuc (LUSC) w trójwymiarowej (3D) kohodowli z fibroblastami związanymi z rakiem (CAF). Ten system organoidów stanowi unikalną platformę do badania ról różnych zmian wewnętrznych i zewnętrznych komórek nowotworowych, które modulują fenotyp guza.

Wielowymiarowy system kokultury do modelowania progresji raka płaskonabłonkowego płuca

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) są potężnym narzędziem w translacyjnych badaniach nad rakiem, odzwierciedlając zarówno genetyczną i fenotypową heterogeniczność choroby, jak i odpowiedź na spersonalizowane terapie przeciwnowotworowe. W tym miejscu szczegółowo omówiono skonsolidowany protokół generowania PDO ludzkiego pierwotnego raka pęcherza moczowego w ramach przygotowań do oceny analiz fenotypowych i odpowiedzi na leki.

Hodowla organoidów raka pęcherza moczowego jako narzędzia medycyny precyzyjnej

Szczegółowy protokół jest tutaj podany do ustalania ludzkich organoidów piersi na podstawie resekcji guza piersi pochodzących od pacjenta lub normalnej tkanki piersi. Protokół zawiera kompleksowe instrukcje krok po kroku dotyczące hodowli, zamrażania i rozmrażania organoidów piersi pochodzących od ludzkich pacjentów.

Tworzenie i hodowla organoidów piersi pochodzących od pacjentów

Organoidy nowotworowe zrewolucjonizowały badania nad rakiem i podejście do medycyny spersonalizowanej. Reprezentują one klinicznie istotny model guza, który pozwala naukowcom być o krok przed guzem w klinice. Protokół ten ustanawia organoidy nowotworowe ze świeżych próbek tkanki guza trzustki i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów pochodzących od gruczolakoraka trzustki.

Tworzenie organoidów nowotworowych i fibroblastów pochodzących z raka trzustki ze świeżych tkanek

Protokół ten opisuje metodę jednoczesnej izolacji organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakem (CAF) oraz fibroblastów niezwiązanych z nowotworem (CF) u tego samego pacjenta z rakiem płaskonabłonkowym przełyku (ESCC). Wykorzystanie tych materiałów dopasowanych do pacjentów mogłoby uniknąć problemów związanych z zmiennością między pacjentami i zapewnić odpowiednią platformę eksperymentalną dla badań ESCC.

Ustanowienie organoidów nowotworowych, fibroblastów związanych z rakiem oraz odpowiedników fibroblastów u tego samego pacjenta z rakiem przełyku

Poniższy protokół skupia się na ustanowieniu pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich (STS) pochodzącego od pacjenta. Model ten może pomóc nam lepiej zrozumieć podłoże molekularne i profil farmakologiczny tych rzadkich nowotworów złośliwych i może stanowić punkt wyjścia do dalszych badań mających na celu poprawę leczenia STS.

Ustanowienie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta

Poznaj metodę kohodowli organoidów raka jelita grubego z limfocytami TIL pochodzącymi od pacjentów. Protokół umożliwia badanie interakcji immunologicznych i ocenę potencjału terapeutycznego terapii TIL w personalizowanej onkologii.

Ustanowienie systemu kohodowli organoidów i limfocytów naciekających nowotwór jelita grubego pochodzących od pacjentów

Przeglądaj więcej filmów