Skuteczne techniki kompleksowego pobierania próbek dostępnych tkanek u dorosłych Xenopus

Praca ta ma na celu stworzenie powtarzalnej metody szybkiego pobierania komory serca Xenopus, pnia tętniczego, lewego płata wątroby, pęcherzyka żółciowego, płuc, trzustki, śledziony, krtani, przełyku, żołądka, jelit, jąder, ciała tłuszczowego, jajowodu, sparowanych nerek, splotu kulszowego, skóry, grasicy i całego oka w czasie krótszym niż jedna godzina. Wyzwaniem eksperymentalnym jest optymalizacja świeżości tkanek. Z tego powodu protokół został zaprojektowany tak, aby można go było ukończyć w czasie krótszym niż jedna godzina. Priorytetowo traktując świeżość tkanek, tkanki te mogą być wykorzystywane do wykonywania wysokiej jakości analiz biochemicznych, takich jak proteomika, przy jednoczesnej minimalizacji liczby wykorzystywanych zwierząt. W przyszłości napiszemy protokół dotyczący tkanek, do których dostęp jest trudniejszy, takich jak mózg, mięśnie i kości.

[Instruktor] Na początek ustaw uśpioną żabę do procedury sekcji i przygwoźdź kończyny. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przetnij skórę wzdłuż linii środkowej, a następnie bocznie, aby utworzyć dwa płaty skóry. Za pomocą kleszczy chwyć kreskę białą i odciągnij ją od jamy celomicznej. Ostrożnie przeciąć mięśnie w kierunku głowy i utwórz dwa płaty ściany jamy. Zmniejsz kości krucze, aby uzyskać lepszy dostęp do serca. Rozciągnij osierdzie, przedziurawij go i oderwij z powrotem, aby odsłonić trzy komory serca. Teraz przytnij wyrocznie na skrzyżowaniu, gdzie spotykają się z komorą i pniem tętniczym. Użyj kleszczy, aby chwycić wierzchołek komory i przeciąć go tuż poniżej jego połączenia z pniem tętnicy, pozostawiając margines. Obserwując rozwidlenie pnia tętniczego, napnij tułów i przetnij pnie aorty tuż za punktami, w których rozdzielają się na łuki. Następnie chwyć wargę lewego płata wątroby i delikatnie ją unieś, aby odsłonić przewody wątrobowe i torbielowate. Pobrać próbkę z dolnych dwóch trzecich lewego płata poniżej tych nasadek. Po zidentyfikowaniu pęcherzyka żółciowego chwyć go i odciągnij od prawego płata wątroby i odetnij jego przyczep. Następnie chwyć wierzchołek płuca i pociągnij go mocno. Przetnij płuco na granicy, gdzie przechodzi do oskrzela. Usuń oskrzela z krtani. W celu usunięcia jajników przesuń płaty jajników na odpowiednie strony, aby uwidocznić miejsca przyczepu brzusznego do nerek. Za pomocą nożyczek usuń jajniki w pobliżu nerek, nie powodując uszkodzeń. Następnie sprawdź przedni płat wątroby, znany również jako płat środkowy, i obserwuj jego połączenie z dwunastnicą przez mesentariusz. Użyj nożyczek do irydektomii, aby przeciąć więzadło wątrobowo-nerwowe. Pozostałą mięsistą masą jest trzustka i wspólny przewód żółciowy. Odetnij połączenie trzustki i wspólnego przewodu żółciowego z przednim płatem wątroby, pozostawiając margines. Chwyć żołądek kleszczami zębatymi i jeden koniec trzustki kleszczami tkankowymi. W powiększeniu delikatnie odsuń trzustkę od żołądka. Następnie zidentyfikuj śledzionę i pobierz z niej próbkę, przecinając jej przyczep do otrzewnej. Chwyć krtań za jej dolny koniec i zacznij podnosić ją z jamy, przecinając wszelkie przyczepy otrzewnej, gdy się napotkają. Gdy krtań jest uniesiona, użyj zakrzywionych nożyczek do irydektomii, aby ostrożnie oddzielić i odciąć tkankę przełyku od krtani. Następnie pociągnij krtań w dół i przytnij ją od jamy ustnej, jednocześnie odcinając pozostałe widoczne przyczepy. Obserwuj krzywiznę żołądka, która odróżnia go od przełyku i ograniczenie odźwiernika oznaczające początek jelita. Przetnij przewód pokarmowy tuż przed krzywizną żołądka, aby oddzielić go od przełyku. Otwórz usta i zlokalizuj wspólny otwór trąbek Eustachiusza na jego dachu. Trzymając usta otwarte, pociągnij przełyk, aby obserwować jego przyczepienie. Następnie odetnij przełyk od jamy policzkowej tuż pod otworem Eustachiusza. Następnie usuń przełyk. Teraz chwyć żołądek i przetnij go w miejscu ograniczenia odźwiernika, gdzie łączy się z dwunastnicą. Napnij okrężnicę i przytnij ją jak najbliżej kloaki. Usuń jelita, przecinając po drodze wszelkie widoczne przyczepy otrzewnej. Jeśli żaba jest samcem, zidentyfikuj jądra i usuń je za pomocą nożyczek do irydektomii, upewniając się, że nerka pozostaje nienaruszona. Rozsuń ciała tłuszczowe i ułóż je po odpowiednich stronach, aby odsłonić przyczep otrzewnowy w pobliżu nerki. Chwyć podstawę tłustego ciała i odetnij ją od otrzewnej, pozostawiając margines. Aby usunąć pęcherz moczowy, przyciąć jak najbliżej kloaki. Jeśli żaba jest samicą lub ma widoczny szczątkowy jajowód, chwyć dolny koniec jajowodu i odciągnij go od kloaki. Przetnij jajowód w pobliżu kloaki, a następnie wyciągnij go z jamy celomicznej, odcinając wszelkie przyczepy otrzewnej. Za pomocą kleszczy chwyć sparowane nerki zaotrzewnowe i odetnij otrzewną u ich podstawy. Wyjmij nerki z jamy, odcinając wszystkie przyczepy otrzewnej. Następnie chwyć pęczek nerwowy w splocie kulszowym za pomocą kleszczy i przetnij nerwy w miejscu, w którym wychodzą z jamy celomicznej. Podnieś pęczek nerwowy i przetnij go ponownie w miejscu jego połączenia z kręgosłupem. Teraz usuń szpilki i odwróć zwierzę na brzuszną stronę. Ponownie przypnij kończyny i wybierz jedną tylną kończynę do pobrania próbki, przypinając jej stopę. Wyciąć fragment skóry w kształcie migdała powyżej mięśnia brzuchatego łydki i okolicy piszczelowo-strzałkowej. Chwyć skórę grzbietową i wykonaj boczne nacięcie wokół środkowej części zwierzęcia. Aby utworzyć ciągłe cięcie kołowe. Usuń szpilki, zabezpiecz nogi jedną ręką i użyj kleszczy zębatych szczurów, aby chwycić przednią skórę grzbietu. Oskóruj zwierzę, mocno naciągając skórę grzbietową na głowę i ramiona. Aby pobrać próbkę grasicy, zidentyfikuj masę tłuszczową pokrywającą staw szczękowy i przetnij tylną krawędź masy, w miejscu, w którym łączy się ona z różową tkanką mięśniową. Użyj nożyczek do irydektomii, aby odciąć masę od kości, odsłaniając skupiska melanoforu, jeśli są obecne. Następnie przytnij tkankę, aby wyeliminować wszelkie mięśnie lub chrząstki. Następnie przypnij zwierzę i wybierz oko. Włóż zakrzywione nożyczki do irydektomii do oczodołu i delikatnie przetnij wokół krzywizny oka, aby uwolnić przyczepy mięśniowe. Na koniec wsuń nożyczki głębiej w orbitę i przetnij nerw wzrokowy za okiem. Wyjmij oko z oczodołu i odetnij pozostały mięsień. Postępując zgodnie z tą procedurą, wszystkie główne narządy zostały pobrane, opłukane i przycięte w ciągu jednej godziny od eutanazji.