Name: Skuteczne techniki kompleksowego pobierania próbek dostępnych tkanek u dorosłych Xenopus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Poznaj metodę szybkiego pobierania próbek tkanek od dorosłych Xenopus w ciągu godziny. Protokół zapewnia świeżość materiału do analiz biochemicznych i minimalizuje liczbę używanych zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez grant NIH OD R24 ODO31956. Chcielibyśmy również podziękować Samancie Jalbert i Jill Ralston za ich pomoc i wsparcie.

Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z zasadami i przepisami Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee IS 00001365_3). Jeśli przed próbkowaniem przestrzegany jest protokół perfuzji13, przejdź do kroku 2.3.
1. Przygotowanie (bez perfuzji)
<ol>
	<li>Upewnij się, że instytucja badawcza zatwierdziła technikę eutanazji opisaną w niniejszym protokole.</li>
	<li>Przygotować roztwór 5 g/l MS-222 (metanosulfonian trikainy) i 5 g/l wodorowęglanu sodu (patrz tabela materiałów). Sprawdź pH, aby upewnić się, że wynosi ≥7, 
	UWAGA: Objętość musi być większa niż objętość wymagana do całkowitego pokrycia zwierząt poddawanych eutanazji.</li>
	<li>Wykonaj pierwotną eutanazję, umieszczając Xenopus w roztworze MS-222 (od kroku 1.2), trzymając zwierzę zanurzone przez łącznie 1 h14.</li>
	<li>Umieść powierzchnię preparacyjną (tacę lub arkusz pianki) pod nachyleniem w pojemniku wtórnym lub w inny sposób ułóż ją tak, aby ułatwić drenaż krwi.</li>
	<li>Gdy żaba znajduje się w roztworze przez 1 godzinę, pierwotna eutanazja została zakończona. Usuń żabę i sprawdź utratę reakcji na ból, wykonując uszczypnięcie stopy.</li>
	<li>Należy odnotować wiek (jeśli jest znany), płeć i stan zdrowia zwierzęcia, od którego pobiera się próbkę, a także informację, czy została ona poddana perfuzji. Zważyć Xenopus i wykonać wszelkie dodatkowe wymagane pomiary przed pobraniem próbki.</li>
	<li>Ułóż żabę na grzbiecie i przypnij kończyny przednie bliżej ciała (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych przeciąć skórę, w górę linii środkowej, a następnie na boki, tworząc dwie klapy.</li>
	<li>Zidentyfikuj linea alba (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Użyj kleszczy, aby chwycić kresę białą i odciągnąć ją od jamy celomicznej. Ostrożnie użyj nożyczek, aby ciąć w kierunku głowy, przez mięśnie. Wykonaj dwie klapy ze ściany wnęki i odetnij lub przypnij wszystkie klapy.</li>
	<li>Zidentyfikuj serce, które powinno nadal bić. Jeśli serce nie jest łatwo dostępne, użyj nożyczek preparujących, aby zmniejszyć kości krucze (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	UWAGA: Jeśli serce przestało bić przed pobraniem próbki, świeżość próbki została zagrożona.</li>
	<li>W razie potrzeby wypełnij protokół szybkiej perfuzji9.</li>
</ol>
2. Pobieranie próbek
UWAGA: Jeśli zwierzę zostało poddane perfuzji, przejdź do kroku 2.3. Wszystkie marginesy powinny wynosić około 25 mm. Kleszcze i nożyczki należy wycierać do czysta lub wymieniać między próbkami. Próbki ze wszystkich tkanek należy pobrać w ciągu 1 godziny od eutanazji, aby zapewnić maksymalną świeżość.
<ol>
	<li>Za pomocą pipety transferowej przepłukać jamę celomiczną schłodzonym PBS lub 0,7x PBS15, aby usunąć krew i zachować widoczność.</li>
	<li>Zidentyfikuj cienki osierdzie (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A) i pociągnij go za pomocą kleszczy tkankowych. Za pomocą końcówki nożyczek do irydektomii delikatnie ją perforuj, uważając, aby nie przeciąć leżących pod spodem tkanek. Oderwij osierdzie od trzech komór serca (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B).</li>
	<li>Przytnij małżowiny uszne, przecinając je w miejscu, w którym stykają się z komorą i pniem tętniczym.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby chwycić komorę za wierzchołek i przeciąć ją poniżej miejsca, w którym styka się z pniem tętnicy, pozostawiając margines (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo komorę w powiększeniu, aby upewnić się, że nie są przyczepione żadne niechciane tkanki. 
	UWAGA: Środek komory może zawierać jasną tkankę zastawki spiralnej; To może być zachowane. U zwierząt, u których nie doszło do perfuzji, usunięcie komory może kwalifikować się jako wtórna eutanazja (zwana również znieczuleniem końcowym).</li>
	<li>Natychmiast po pobraniu próbek należy przepłukać próbki tkanek w schłodzonym PBS lub 0,7x PBS, w zależności od potrzeb eksperymentalnych15, 
	UWAGA: U zwierząt poddanych perfuzji oczekuje się, że wszystkie tkanki z wyjątkiem wątroby zostaną czysto wypłukane. Jeśli tak nie jest, należy sporządzić notatkę. W tkankach nieperfundowanych wszystkie media płuczące zostaną nasycone krwią. Kroki 2.5–2.6 należy wykonać po pobraniu próbki z każdej tkanki.</li>
	<li>Zauważ, że pień tętniczy rozdziela się na dwa pnie aorty (zwane również aortami bocznymi) i że każdy z nich dzieli się na trzy łuki tętnicze (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2D). Pociągnij pień tętniczy i przetnij pnie aorty natychmiast po miejscu, w którym te łuki się rozszczepiają.</li>
	<li>Obserwuj trzy płaty wątroby (<silna klasa="xfig">Ryc. 3A). Chwyć wargę lewego płata (po prawej stronie widza) i delikatnie unieś ją tak, aby widoczne były przewody wątrobowe i torbielowate. Próbka z dolnych 2/3 płata, poniżej tych nasadek (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Zidentyfikuj woreczek żółciowy, który może drastycznie różnić się kolorem. Chwyć woreczek żółciowy, odciągnij go od prawego płata wątroby i odetnij jego przyczep (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Jeśli nie pęknie, zerwij go nożyczkami do irydektomii.</li>
	<li>Chwyć wierzchołek płuca i pociągnij go mocno. Zwróć uwagę na teksturę pęcherzyków płucnych i określ, gdzie kończy się ta tekstura, a zaczyna oskrzela. Wytnij na tym marginesie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D). Jeśli płuco jest zrośnięte z otrzewną, ostrożnie je odłącz.</li>
	<li>Zidentyfikuj jajnik, który jest otoczony warstwą otrzewnej trzewnej zwaną nabłonkiem zarodkowym. Delikatnie przesuń płatki, aż znajdą się po odpowiednich stronach, aby obszar przyczepu był widoczny (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A); Te przyczepy są bezpośrednio brzuszne do sparowanej nerki. Za pomocą nożyczek usuń jajniki jak najbliżej nerek, nie uszkadzając ich (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). Podczas tego procesu, jeśli oocyty wyciekną, pobierz z nich próbkę, a następnie spłucz. 
	UWAGA: Usunięcie jajnika jest pomocne w uzyskaniu lepszego dostępu do tkanek samicy żaby.</li>
	<li>Sprawdź przedni płat (zwany również płatem środkowym) wątroby i zwróć uwagę, jak łączy się on z żołądkiem i dwunastnicą przez krezkę (<silna klasa = "xfig" >Rycina 3A i <silna klasa = "xfig" >Figura 4C). Przeciąć krezkę i więzadło wątrobowo-nerkowe za pomocą nożyczek do irydektomii. Pozostałą mięsistą masą jest trzustka i wspólny przewód żółciowy.</li>
	<li>Zerwij połączenie trzustki i wspólnego przewodu żółciowego z przednim płatem wątroby, pozostawiając margines. Chwyć żołądek kleszczami zębatymi i jeden koniec trzustki kleszczami tkankowymi. W powiększeniu delikatnie oderwij trzustkę od żołądka (<silna klasa="xfig">Ryc. 4D).
	<ol>
		<li>Jeśli trzustka nie odejdzie czysto, usuń pozostałą tkankę trzustki. Alternatywnie, odłącz trzustkę metodycznie za pomocą nożyczek do irydektomii i kleszczy do tkanek. 
		UWAGA: Oczekuje się, że oprócz wspólnego przewodu żółciowego w tej próbce znajdzie się część krezki i przewodu trzustkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zidentyfikuj śledzionę i pobierz z niej próbkę, przecinając jej przyczep do otrzewnej (<silna klasa="xfig">Ryc. 4E).</li>
	<li>Usunąć i usunąć pozostałe tkanki wątroby.</li>
	<li>Usuń drugie płuco i pozostałe oskrzela w miejscu, w którym przyczepiają się do krtani. Chwytając krtań za jej dolny koniec, zacznij wyjmować ją z jamy, zrywając wyraźne przyczepy, gdy staną się widoczne.</li>
	<li>Gdy krtań zostanie podniesiona, jej przyczepienie do przełyku stanie się zauważalne. Ostrożnie obierz i odetnij tkankę przełyku od krtani za pomocą zakrzywionych nożyczek do irydektomii (<silna klasa = "xfig">Rysunek 5A). Następnie pociągnij krtań w dół i odetnij ją od jamy ustnej. Wytnij wszystkie wyraźne załączniki, które stają się widoczne.</li>
	<li>Zwróć uwagę na krzywiznę żołądka, która odróżnia go od przełyku, a także na ograniczenie odźwiernika, które odróżnia żołądek od jelit (<silna klasa="xfig">Ryc. 5B). Przeciąć przewód pokarmowy bezpośrednio przed krzywizną żołądka, oddzielając go od przełyku.</li>
	<li>Otwórz usta i zidentyfikuj wspólny otwór trąbek Eustachiusza na jego dachu16. Przy otwartych ustach pociągnij za przełyk, aby zauważyć jego przyczepienie (<silna klasa="xfig">Rysunek 5C). Podnieś przełyk z jamy, odcinając po drodze wyraźne przyczepy. Odetnij przełyk od jamy policzkowej bezpośrednio pod otworem Eustachiusza.</li>
	<li>Chwyć żołądek i przetnij go w miejscu, w którym styka się z dwunastnicą, w miejscu ograniczenia odźwiernika (<silna klasa="xfig">Ryc. 5A,B).</li>
	<li>Napnij okrężnicę i przytnij ją jak najbliżej kloaki (<silna klasa="xfig">Rysunek 5D). Wyciągnij jelita, odcinając wszelkie wyraźne przyczepy otrzewnej.</li>
	<li>Jeśli żaba jest samcem, zidentyfikuj jądra i usuń je za pomocą nożyczek do irydektomii, uważając, aby nie uszkodzić leżącej poniżej nerki (<silna klasa = "xfig">Ryc. 6A).</li>
	<li>Rozsuń ciała tłuszczowe tak, aby znajdowały się po swojej stronie; widoczny będzie obszar nad nerką, gdzie ciało tłuszczowe łączy się z otrzewną. Chwyć podstawę jednego z tłustych ciał i użyj nożyczek, aby odciąć je od otrzewnej, pozostawiając margines (<silna klasa = "xfig">Ryc. 6B).</li>
	<li>Zidentyfikuj i usuń pęcherz moczowy, przecinając go jak najbliżej kloaki (<silna klasa="xfig">Ryc. 6C).</li>
	<li>Jeśli żaba jest samicą lub ma wyraźny szczątkowy jajowód, chwyć dolny koniec jajowodu, odciągnij go od kloaki i przytnij jak najbliżej kloaki (<silna klasa="xfig">Ryc. 6D). Wyciągnij jajowód z jamy celomicznej, odcinając wszelkie przyczepy otrzewnej, gdy staną się widoczne (<silna klasa = "xfig">Ryc. 6E).</li>
	<li>Usuń i usuń pozostałe ciała tłuszczowe i jądra lub jajowód.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby chwycić nerki u ich dolnej podstawy i zwróć uwagę, że są one pokryte przezroczystą otrzewnową (zaotrzewnową)17. Odetnij otrzewną u podstawy nerki (<klasa silna = "xfig">Ryc. 7A), a następnie wyjmij nerki z jamy celomicznej (<klasa silna = "xfig" >Ryc. 7B), używając nożyczek, aby w razie potrzeby przeciąć otrzewną.</li>
	<li>W powiększeniu odetnij nadmiar otrzewnej i wszelkie pozostałe tkanki tłuszczowe, jajnika lub jąder.</li>
	<li>Obserwuj wiązkę nerwów obwodowych łączących koniec kręgosłupa z każdą nogą; to jest splot kulszowy. Chwyć wiązkę nerwów kleszczami i odetnij je w miejscu, w którym wychodzą z jamy celomicznej (<silna klasa="xfig">Ryc. 7C). Wyjmij wiązkę z jamy i przetnij ją w miejscu, w którym nerwy opuszczają kręgosłup (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 7D). </li>
	<li>Usuń szpilki ze zwierzęcia, odwróć je na jego brzuch i ponownie przypnij kończyny zwierzęcia. Wybierz jedną z kończyn tylnych, z których chcesz pobrać próbkę, i przypnij stopę tej kończyny.</li>
	<li>Usuń płat skóry w kształcie migdała znad mięśnia brzuchatego łydki/kości piszczelowej (<silna klasa="xfig">Ryc. 8A,B).</li>
	<li>Chwyć skórę grzbietu i przetnij na boki, tak aby wokół środkowej części zwierzęcia znajdowało się ciągłe cięcie (<silna klasa="xfig">Ryc. 8C).</li>
	<li>Usuń szpilki, zabezpiecz nogi jedną ręką i chwyć przednią skórę grzbietową za pomocą ząbkowanych kleszczy. Oskóruj zwierzę, ciągnąc skórę grzbietową nad głową i ramionami, używając siły (<silna klasa="xfig">Rysunek 8D).</li>
	<li>Zidentyfikuj masę tłuszczową pokrywającą staw szczękowy, odetnij tylny brzeg masy od miejsca, w którym jest zrośnięta z różowymi tkankami mięśniowymi, a następnie użyj nożyczek do irydektomii, aby odciąć ją od leżącej poniżej kości (<silna klasa = "xfig">Rysunek 9A). W zależności od wieku i dojrzałości zwierzęcia pojawi się skupisko melanoforów (<silna klasa="xfig">Ryc. 9B). Przyciąć masę tak, aby nie były przyczepione mięśnie ani chrząstki.</li>
	<li>Przypnij zwierzę i wybierz oko. Włóż zakrzywione nożyczki do irydektomii do oczodołu wokół krzywizny oka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 9C). Delikatnie naciąć wokół oka, odcinając przyczepy mięśniowe.</li>
	<li>Wsuń nożyczki głębiej w orbitę i odłącz nerw wzrokowy za okiem. Użyj tych nożyczek, aby usunąć oko z orbity, a następnie jeszcze bardziej zmniejszyć przyczepy mięśniowe.</li>
</ol>

<ol><li>Duncan, A. R., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+as+a+model+organism+for+birth+defects%E2%80%94Congenital+heart+disease+and+heterotaxy%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus as a model organism for birth defects—Congenital heart disease and heterotaxy.</a> Semin Cell Biol. 51, 73(2016).</li>
<li>Kawasumi-Kita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hoxc12%2Fc13+as+key+regulators+for+rebooting+the+developmental+program+in+Xenopus+limb+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">hoxc12/c13 as key regulators for rebooting the developmental program in Xenopus limb regeneration.</a> Nat Commun. 15, 3340(2024).</li>
<li>Hoppler, S., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus%3A+experimental+access+to+cardiovascular+development%2C+regeneration+discovery%2C+and+cardiovascular+heart-defect+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus: experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200(2020).</li>
<li>Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tadpole+tissue+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Xenopus tadpole tissue harvest.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), (2017).</li>
<li>Porro, L. B., Richards, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+dissection+of+the+model+organism+Xenopus+laevis+using+contrast-enhanced+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography.</a> J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).</li>
<li>Laznovsky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+vertebrate+development+dynamics+in+frog+Xenopus+laevis+using+micro-CT+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Gigascience%22%5BJournal%5D)">Unveiling vertebrate development dynamics in frog Xenopus laevis using micro-CT imaging.</a> Gigascience. 13, giae037(2024).</li>
<li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice%E2%80%94Part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).</li>
<li>Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice%E2%80%94Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 413-431 (2004).</li>
<li>Morawietz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice%E2%80%94Part+3.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice—Part 3. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 433-449 (2004).</li>
<li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+rapidly+sampling+six+crucial+organs+in+adult+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult Xenopus.</a> J Vis Exp. (204), (2024).</li>
<li>Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Dissection of a frog (Rana sp.). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aL%C5%91w%2C+P+%22Atlas+of+animal+anatomy+and+histology%22">Atlas of animal anatomy and histology</a>. , Springer. Cham. 213-263 (2016).</li>
<li>O'Rourke, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibians+used+in+research+and+teaching%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Amphibians used in research and teaching.</a> ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).</li>
<li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+rapid+blood+perfusion+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Effective rapid blood perfusion in Xenopus.</a> J Vis Exp. (195), e65287(2023).</li>
<li>AVMA guidelines for the euthanasia of animals. 37, 2020 edition, AVMA Veterinary Medical Association. 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals">https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals</a> (2020).</li>
<li>Balls, M., Worley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibian+cells+in+vitro.+II.+Effects+of+variations+in+medium+osmolarity+on+a+permanent+cell+line+isolated+from+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cell line isolated from Xenopus.</a> Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).</li>
<li>Mason, M., Wang, M., Narins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+middle+ear+apparatus+of+the+aquatic+frog%2C+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Inst+Acoust%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the middle ear apparatus of the aquatic frog, Xenopus laevis.</a> Proc Inst Acoust. 31, 13-21 (2009).</li>
<li>Holz, P. H., Raidal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+renal+anatomy+of+exotic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Exot+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Comparative renal anatomy of exotic species.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).</li>
<li>Adamson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+frog+mesenteric+capillaries+after+partial+pronase+digestion+of+the+endothelial+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Permeability of frog mesenteric capillaries after partial pronase digestion of the endothelial glycocalyx.</a> J Physiol. 428, 1-13 (1990).</li>
<li>O'Rourke, K. P., Ackerman, S., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+maintenance+of+mouse+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and maintenance of mouse intestinal stem cells.</a> Bio Protoc. 6 (4), e1733(2016).</li>
<li>Vitt, L. J., Caldwell, J. P. Anatomy of amphibians and reptiles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVitt%2C+LJ+%22Herpetology%3A+An+Introductory+Biology+of+Amphibians+and+Reptiles%22">Herpetology: An Introductory Biology of Amphibians and Reptiles</a>. , Academic Press. 35-81 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Przedstawiony tutaj protokół ma na celu zapewnienie elastyczności użytkownikom na różnych poziomach doświadczenia, przy jednoczesnym zapewnieniu pobierania niezbędnych tkanek w sposób terminowy i skuteczny. Zaleca się, aby nowi użytkownicy postępowali zgodnie z każdym krokiem w protokole, aby zapewnić systematyczne pobieranie tkanek. Bardziej doświadczeni użytkownicy mogą jednak zdecydować się na pominięcie niektórych kroków i pobranie próbek tylko tych tkanek, których potrzebują. Na przykład dostęp do śledziony, która z...

Xenopus oferuje unikalną przewagę nad myszami, danio pręgowanymi i innymi organizmami modelowymi do badania chorób ludzkich, szczególnie w kontekście rozwojowym i ewolucyjnym. Jego zewnętrzny rozwój embrionalny i duże, łatwe do manipulowania zarodki umożliwiają obserwację w czasie rzeczywistym i interwencje eksperymentalne (np. przeszczep tkanki, edycję genów), które są trudne u myszy, które rozwijają się wewnętrznie i wymagają inwazyjnych procedur. Dodatkowo, trójkomorowe serce i czworonogi Xenopusa stanowią bardziej bezpośredni ewolucyjny pomost do badania wad wrodzonych1, regeneration kończyn2, oraz cardiac development3. W przeciwieństwie do myszy, kijanki Xenopus mogą regenerować kończyny i narządy, modelując procesy regeneracyjne nieobecne u ssaków, a ich wodne stadium życia pozwala na nieinwazyjne badanie wpływu środowiska lub toksyn. W połączeniu z szybszą hodowlą, niższymi kosztami i mniejszymi ograniczeniami etycznymi, Xenopus doskonale nadaje się do wysokoprzepustowych, mechanistycznych badań organogenezy i reakcji na stres, które są trudne do odtworzenia w systemach ssaków.
Ten artykuł ma na celu zaoferowanie jasnych wskazówek dotyczących precyzyjnego i powtarzalnego pobierania próbek narządów z tkanek dorosłych Xenopus, tak jak jest to dostępne dla kijanek Xenopus4. Chociaż dostępna jest "cyfrowa sekcja"5 i "obrazowanie mikro-CT"6 dorosłego Xenopus, osiągnięcie spójnego pobierania próbek narządów i tkanek u dorosłych Xenopus pozostaje trudne bez szczegółowych instrukcji dostarczonych dla innych dorosłych modeli, takich jak mice7,8,9.
Chociaż dostępny jest przewodnik po próbkach dla sześciu kluczowych tkanek10, obecnie nie jest dostępny żaden szczegółowy i obszerny przewodnik po sekcjach i próbkach dla Xenopus. Istnieje obszerny przewodnik po sekcjach dla Rana sp.11, a różne podręczniki do sekcji w klasie są dostępne dla innych anurans12, Jednak dla osób, które nie mają doświadczenia w technikach pobierania próbek lub anatomii, subtelne różnice między Xenopus a innymi anuranami sprawiają, że istniejące zasoby są niewystarczające do spójnego i powtarzalnego pobierania próbek tkanek.
Ten przewodnik został opracowany, aby nadać priorytet świeżości tkanek dla proteomiki i immunochemii. Dla doświadczonego użytkownika wszystkie tkanki mogą zostać pobrane od jednej osoby w mniej niż godzinę. Zaleca się, aby jeśli użytkownik nie ma doświadczenia, wypróbował ten protokół na osobnikach, które zostały poddane eutanazji z innych powodów, zanim złoży w ofierze jakiekolwiek zwierzę, które jest trudniejsze do zastąpienia.

<table><tbody><tr><td>1x PBS&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>5-krotne szkło powiększające ze światłem LED i podstawką</td><td></td><td>amazon.com B08QJ6J8P1</td><td>światło nie może wytwarzać ciepła</td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety transferowe</td><td>VWR</td><td>414004-036</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne drobno spiczaste</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne ostre, proste 6,5"</td><td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>Taca preparcyjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-370-284</td><td>arkusze styropianu są akceptowalną alternatywą</td></tr><tr><td>Pojemnik do eutanazji</td><td>US Plastic&nbsp;</td><td>Pozycja&nbsp; 2860</td><td>alternatywnych nieprzezroczystych pojemników dopuszczalne</td></tr><tr><td>pokrywy pojemnika do eutanazji</td><td>US Plastic&nbsp;</td><td>Pozycja&nbsp; 3047</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irydektomii 6-calowe</td> <td>nożyczki do irysa</td> <td>VWR</td><td>470018-938</td> są akceptowalną alternatywą</tr><tr><td>MS-222: Syncaina (dawniej trykaina)</td>Kleszczyki do tkanek zębów szczura <td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>5,5 cala, stal nierdzewna</td><td>Fisher Scientific</td><td>S08100</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu, proszek, USP</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do próbek, ząbkowane</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr><td>Kołki teowe do preparowania</td><td>Fisher Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczne techniki kompleksowego pobierania próbek dostępnych tkanek u dorosłych xenopus

Efficient Techniques for Comprehensive Sampling of Accessible Tissues in Adult Xenopus

Xenopus od dawna jest kluczowym organizmem modelowym do badania rozwoju i chorób kręgowców, oferując głęboki wgląd w procesy komórkowe i funkcje genów. Pomimo bogactwa informacji na temat embrionalnego Xenopusa, nadal istnieje znaczna luka w standaryzowanych metodach pobierania próbek z tkanek dorosłych, zwłaszcza w przypadku nowoczesnych podejść, takich jak proteomika ilościowa. Badanie to wprowadza kompleksowy protokół do szybkiego, precyzyjnego i wydajnego pobierania próbek z wielu tkanek u dorosłych Xenopus. Protokół odpowiada na wyzwania związane z subtelnymi różnicami anatomicznymi w porównaniu z innymi bezogonowcami, zapewniając powtarzalność nawet dla osób z ograniczonym doświadczeniem w sekcjach żab. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem wysokiej jakości analiz biochemicznych poprzez priorytetowe traktowanie świeżości próbki. Umożliwiamy szybkie pobranie do 18 tkanek w ciągu godziny. Ponadto metody te mają zastosowanie do warunków perfuzji i nieperfuzji, zapewniając elastyczność dla szeregu potrzeb eksperymentalnych. Prace te nie tylko wypełniają krytyczną lukę metodologiczną dotyczącą Xenopus laevis i tropicalis, ale także służą jako cenne źródło informacji dla badaczy dostosowujących techniki do podobnych modeli, zwiększając w ten sposób zakres i wiarygodność porównawczych badań biologicznych i ewolucyjnych.

Postępując zgodnie ze wszystkimi krokami tego protokołu, komora serca, pień tętniczy, lewy płat wątroby, pęcherzyk żółciowy, płuco, trzustka, śledziona, krtań, przełyk, żołądek, jelita, jądra, ciała tłuszczowe, jajowód, sparowane nerki, splot kulszowy, skóra, grasica i całe oko zostały czysto wycięte w ciągu godziny od eutanazji (zobacz Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4...

To jest pierwsza część kompleksowego protokołu próbkowania Xenopus. Pobrane tkanki to komora serca, pień tętniczy, lewy płat wątroby, pęcherzyk żółciowy, płuco, trzustka, śledziona, krtań, przełyk, żołądek, jelita, jądra, ciała tłuszczowe, jajowód, sparowane nerki, splot kulszowy, skóra, grasica i całe oko.

Skuteczne techniki kompleksowego pobierania próbek dostępnych tkanek u dorosłych Xenopus

Xenopus has long been a pivotal model organism for investigating vertebrate development and disease, offering deep insights into cellular processes and ...

Praca ta ma na celu stworzenie powtarzalnej metody szybkiego pobierania komory serca Xenopus, pnia tętniczego, lewego płata wątroby, pęcherzyka żółciowego, płuc, trzustki, śledziony, krtani, przełyku, żołądka, jelit, jąder, ciała tłuszczowego, jajowodu, sparowanych nerek, splotu kulszowego, skóry, grasicy i całego oka w czasie krótszym niż jedna godzina. Wyzwaniem eksperymentalnym jest optymalizacja świeżości tkanek. Z tego powodu protokół został zaprojektowany tak, aby można go było ukończyć w czasie krótszym niż jedna godzina. Priorytetowo traktując świeżość tkanek, tkanki te mogą być wykorzystywane do wykonywania wysokiej jakości analiz biochemicznych, takich jak proteomika, przy jednoczesnej minimalizacji liczby wykorzystywanych zwierząt. W przyszłości napiszemy protokół dotyczący tkanek, do których dostęp jest trudniejszy, takich jak mózg, mięśnie i kości.[Instruktor] Na początek ustaw uśpioną żabę do procedury sekcji i przygwoźdź kończyny. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przetnij skórę wzdłuż linii środkowej, a następnie bocznie, aby utworzyć dwa płaty skóry. Za pomocą kleszczy chwyć kreskę białą i odciągnij ją od jamy celomicznej. Ostrożnie przeciąć mięśnie w kierunku głowy i utwórz dwa płaty ściany jamy. Zmniejsz kości krucze, aby uzyskać lepszy dostęp do serca. Rozciągnij osierdzie, przedziurawij go i oderwij z powrotem, aby odsłonić trzy komory serca. Teraz przytnij wyrocznie na skrzyżowaniu, gdzie spotykają się z komorą i pniem tętniczym. Użyj kleszczy, aby chwycić wierzchołek komory i przeciąć go tuż poniżej jego połączenia z pniem tętnicy, pozostawiając margines. Obserwując rozwidlenie pnia tętniczego, napnij tułów i przetnij pnie aorty tuż za punktami, w których rozdzielają się na łuki. Następnie chwyć wargę lewego płata wątroby i delikatnie ją unieś, aby odsłonić przewody wątrobowe i torbielowate. Pobrać próbkę z dolnych dwóch trzecich lewego płata poniżej tych nasadek. Po zidentyfikowaniu pęcherzyka żółciowego chwyć go i odciągnij od prawego płata wątroby i odetnij jego przyczep. Następnie chwyć wierzchołek płuca i pociągnij go mocno. Przetnij płuco na granicy, gdzie przechodzi do oskrzela. Usuń oskrzela z krtani. W celu usunięcia jajników przesuń płaty jajników na odpowiednie strony, aby uwidocznić miejsca przyczepu brzusznego do nerek. Za pomocą nożyczek usuń jajniki w pobliżu nerek, nie powodując uszkodzeń. Następnie sprawdź przedni płat wątroby, znany również jako płat środkowy, i obserwuj jego połączenie z dwunastnicą przez mesentariusz. Użyj nożyczek do irydektomii, aby przeciąć więzadło wątrobowo-nerwowe. Pozostałą mięsistą masą jest trzustka i wspólny przewód żółciowy. Odetnij połączenie trzustki i wspólnego przewodu żółciowego z przednim płatem wątroby, pozostawiając margines. Chwyć żołądek kleszczami zębatymi i jeden koniec trzustki kleszczami tkankowymi. W powiększeniu delikatnie odsuń trzustkę od żołądka. Następnie zidentyfikuj śledzionę i pobierz z niej próbkę, przecinając jej przyczep do otrzewnej. Chwyć krtań za jej dolny koniec i zacznij podnosić ją z jamy, przecinając wszelkie przyczepy otrzewnej, gdy się napotkają. Gdy krtań jest uniesiona, użyj zakrzywionych nożyczek do irydektomii, aby ostrożnie oddzielić i odciąć tkankę przełyku od krtani. Następnie pociągnij krtań w dół i przytnij ją od jamy ustnej, jednocześnie odcinając pozostałe widoczne przyczepy. Obserwuj krzywiznę żołądka, która odróżnia go od przełyku i ograniczenie odźwiernika oznaczające początek jelita. Przetnij przewód pokarmowy tuż przed krzywizną żołądka, aby oddzielić go od przełyku. Otwórz usta i zlokalizuj wspólny otwór trąbek Eustachiusza na jego dachu. Trzymając usta otwarte, pociągnij przełyk, aby obserwować jego przyczepienie. Następnie odetnij przełyk od jamy policzkowej tuż pod otworem Eustachiusza. Następnie usuń przełyk. Teraz chwyć żołądek i przetnij go w miejscu ograniczenia odźwiernika, gdzie łączy się z dwunastnicą. Napnij okrężnicę i przytnij ją jak najbliżej kloaki. Usuń jelita, przecinając po drodze wszelkie widoczne przyczepy otrzewnej. Jeśli żaba jest samcem, zidentyfikuj jądra i usuń je za pomocą nożyczek do irydektomii, upewniając się, że nerka pozostaje nienaruszona. Rozsuń ciała tłuszczowe i ułóż je po odpowiednich stronach, aby odsłonić przyczep otrzewnowy w pobliżu nerki. Chwyć podstawę tłustego ciała i odetnij ją od otrzewnej, pozostawiając margines. Aby usunąć pęcherz moczowy, przyciąć jak najbliżej kloaki. Jeśli żaba jest samicą lub ma widoczny szczątkowy jajowód, chwyć dolny koniec jajowodu i odciągnij go od kloaki. Przetnij jajowód w pobliżu kloaki, a następnie wyciągnij go z jamy celomicznej, odcinając wszelkie przyczepy otrzewnej. Za pomocą kleszczy chwyć sparowane nerki zaotrzewnowe i odetnij otrzewną u ich podstawy. Wyjmij nerki z jamy, odcinając wszystkie przyczepy otrzewnej. Następnie chwyć pęczek nerwowy w splocie kulszowym za pomocą kleszczy i przetnij nerwy w miejscu, w którym wychodzą z jamy celomicznej. Podnieś pęczek nerwowy i przetnij go ponownie w miejscu jego połączenia z kręgosłupem. Teraz usuń szpilki i odwróć zwierzę na brzuszną stronę. Ponownie przypnij kończyny i wybierz jedną tylną kończynę do pobrania próbki, przypinając jej stopę. Wyciąć fragment skóry w kształcie migdała powyżej mięśnia brzuchatego łydki i okolicy piszczelowo-strzałkowej. Chwyć skórę grzbietową i wykonaj boczne nacięcie wokół środkowej części zwierzęcia. Aby utworzyć ciągłe cięcie kołowe. Usuń szpilki, zabezpiecz nogi jedną ręką i użyj kleszczy zębatych szczurów, aby chwycić przednią skórę grzbietu. Oskóruj zwierzę, mocno naciągając skórę grzbietową na głowę i ramiona. Aby pobrać próbkę grasicy, zidentyfikuj masę tłuszczową pokrywającą staw szczękowy i przetnij tylną krawędź masy, w miejscu, w którym łączy się ona z różową tkanką mięśniową. Użyj nożyczek do irydektomii, aby odciąć masę od kości, odsłaniając skupiska melanoforu, jeśli są obecne. Następnie przytnij tkankę, aby wyeliminować wszelkie mięśnie lub chrząstki. Następnie przypnij zwierzę i wybierz oko. Włóż zakrzywione nożyczki do irydektomii do oczodołu i delikatnie przetnij wokół krzywizny oka, aby uwolnić przyczepy mięśniowe. Na koniec wsuń nożyczki głębiej w orbitę i przetnij nerw wzrokowy za okiem. Wyjmij oko z oczodołu i odetnij pozostały mięsień. Postępując zgodnie z tą procedurą, wszystkie główne narządy zostały pobrane, opłukane i przycięte w ciągu jednej godziny od eutanazji.

efficient-techniques-for-comprehensive-sampling-accessible-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kapturki zwierzęce nadekspresujące produkty genów są transplantowane do boku rozwijających się embrionów Xenopus laevis w celu ustalenia, czy tkanka jest zdeterminowana.

Wyznaczanie rodzaju tkanki przy użyciu testu przeszczepu czapy zwierzęcej (ACT) u Xenopus laevis

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy protokół do wykorzystania map losu i znaczników linii do celowania w zastrzyki do poszczególnych blastomerów, które dają początek nerkom zarodków Xenopus laevis.

Technika celowania w mikrowstrzyknięcie do rozwijającej się nerki Xenopus

Ten artykuł przedstawia wygodną i szybką metodę wizualizacji różnych populacji komórek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym zarodków Xenopus za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na skrawkach.

Ocena pierwotnej neurogenezy w zarodkach Xenopus za pomocą barwienia immunologicznego

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Udostępniamy proste i solidne protokoły przetwarzania materiału biopsyjnego różnych gatunków, zarodków organizmów modelowych biomedycznych i próbek innych tkanek organicznych, aby umożliwić cyfrowe generowanie danych objętościowych za pomocą metody mikroskopii episkopowej o wysokiej rozdzielczości.

Mikroskopia episkopowa o wysokiej rozdzielczości (HREM) - proste i niezawodne protokoły przetwarzania i wizualizacji materiałów organicznych

Opisujemy kroki, które umożliwiają szybkie pobieranie próbek in situ małej części pojedynczej komórki z dużą precyzją i minimalną inwazją, przy użyciu mikropróbkowania opartego na kapilarach, aby ułatwić chemiczną charakterystykę migawki aktywności metabolicznej w żywych zarodkach przy użyciu specjalnie zbudowanej platformy do elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z pojedynczą komórką.

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Prezentowany tutaj jest skuteczny protokół szybkiej perfuzji krwi do przygotowania próbek tkanek od afrykańskich żab szponiastych do badań transkryptomicznych i proteomicznych.

Skuteczna szybka perfuzja krwi w Xenopus

Ten artykuł przedstawia przewodnik do pobierania próbek z sześciu ważnych i różnorodnych narządów u dorosłego Xenopus, do których można szybko i łatwo dotrzeć: komora serca, płat wątroby, trzustka, ciała tłuszczowe, sparowane nerki i skóra.

Techniki szybkiego pobierania próbek z sześciu kluczowych narządów u dorosłego Xenopus

Poznaj metodę szybkiego pobierania próbek tkanek od dorosłych Xenopus w ciągu godziny. Protokół zapewnia świeżość materiału do analiz biochemicznych i minimalizuje liczbę używanych zwierząt.

Skuteczne techniki kompleksowego pobierania próbek dostępnych tkanek u dorosłych Xenopus

Przeglądaj więcej filmów