Powtarzalna produkcja SPOT jako wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach

Nasze badania koncentrują się na opracowywaniu wysokowydajnych, wspieranych przez rusztowania platform dla solidnych, powtarzalnych, pochodzących od pacjentów kultur orgonomicznych, aby usprawnić przepływ pracy w testach przesiewowych leków i pomóc w zaawansowanym modelowaniu chorób.

Zautomatyzowane urządzenia do obsługi cieczy, platformy hydrożelowe oparte na rusztowaniach, technologie narządów na chipie oraz testy jednokomórkowe, takie jak cytometria przepływowa i CYTOP, to tylko niektóre z obecnie dostępnych technologii.

Obecne wyzwania obejmują zachowanie integralności hydrożelu, pokonanie menisku żelowego na potrzeby obrazowania w czasie rzeczywistym oraz zapewnienie równomiernego rozmieszczenia komórek w długoterminowych testach opartych na organoidach.

Nasz protokół umożliwia spójne, wspierane przez rusztowania ładowanie hydrożelu, minimalizuje problemy z łąkotkami, wspiera długoterminową hodowlę organoidów i płynnie integruje się z automatycznymi urządzeniami do obsługi cieczy i systemem obrazowania o wysokiej zawartości.

Najbardziej ekscytuje nas wykorzystanie naszych platform do modelowania chorób w celu zbadania mechanizmów progresji choroby w nowotworach i rozwoju otyłości.

[Instruktor] Aby rozpocząć, weź rusztowanie wzorca PMMA dla 96 lub 384 SPOT. Przytnij nadmiar papieru wokół niebieskiego obszaru rusztowania, pozostawiając pięciomilimetrowy biały margines na obwodzie. Upewnij się, że wynikowy arkusz ma wymiary około 760 milimetrów na 1,300 milimetrów. Aby przygotować rusztowanie 96 SPOT do montażu, należy położyć kawałek folii polietylenowej na sztywnym wsporniku akrylowym. Umieść ten pokryty folią wspornik na powierzchni roboczej i połóż rusztowanie na folii polietylenowej. Wyrównaj krawędź linijki między pierwszymi dwoma rzędami rusztowania, aby uniknąć śledzenia w studniach. Umieść koło śledzące na dole rusztowania i zwiń je do góry do góry, kierując się linijką. W przypadku rusztowania 384 SPOT nie należy wykonywać perforacji. Następnie połóż rusztowanie szorstką stroną skierowaną do góry na płycie PDMS, upewniając się, że rzędy przebiegają poziomo. Użyj linii gruntowania, aby określić, która strona jest szorstka, a następnie wygładź rusztowanie na płycie, aby usunąć zmarszczki lub pęcherzyki. Usuń warstwę ochronną z niegrawerowanej strony taśmy dwustronnej. Lekko zapnij taśmę na środku i wyrównaj dwie środkowe kolumny taśmy z rusztowaniem. Teraz dociśnij środek taśmy do rusztowania, aby zapewnić wyrównanie. Wygładź taśmę na zewnątrz od środka, aby przymocować ją równomiernie. Za pomocą pęsety delikatnie podnieś rusztowanie z płyty PDMS. Przechowuj płytę do wykorzystania w przyszłości. Aby przymocować rusztowanie do drugiej taśmy studziennej, odwróć rusztowanie tak, aby gładka, niezaklejona taśmą strona była skierowana do góry na stole warsztatowym. Usuń środkową warstwę ochronną z wygrawerowanej strony drugiej taśmy, aby odsłonić dwie środkowe kolumny. Lekko zapnij środek drugiej taśmy i wyrównaj ją ze środkowymi kolumnami rusztowania, a następnie naciśnij środek taśmy, aby ją zamocować. Jeśli używana jest grawerowana taśma, usuń pozostałe warstwy ochronne przylegające do odsłoniętego środka. Wygładź taśmę, zaczynając od środka i przesuwając się na zewnątrz. Aby przymocować rusztowanie do płyty bez dna, usuń warstwę ochronną. Wyrównaj rusztowanie pod płytą bez dna z pokrywką. Po wyrównaniu dociśnij jego środek do talerza. Jeśli używasz grawerowanej taśmy, usuń sąsiednie warstwy i wygładź rusztowanie na płycie na zewnątrz od środka. Aby przymocować rusztowanie do folii poliwęglanowej, za pomocą pęsety ostrożnie poluzuj warstwę ochronną z jednej strony folii poliwęglanowej, a następnie powoli odklej warstwę ochronną, nie powodując żadnych wgłębień w folii. Powtórz proces dla drugiej strony, a następnie odłóż folię na stół warsztatowy. Oderwij warstwę taśmy ochronnej od spodu płyty i dociśnij folię poliwęglanową do rusztowania od środka na zewnątrz. Następnie mocno dociśnij folię poliwęglanową do rusztowania, aby upewnić się, że każda studzienka ma określoną granicę. Za pomocą precyzyjnego noża ostrożnie odetnij nadmiar materiału od spodu płyty. Po pełnym montażu umieść płytkę 96 SPOT w przezroczystej, zamykanej plastikowej torbie i wynieś ją na zewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Umieść sztywny wspornik akrylowy pod płytą i clamp oba w przeciwległych rogach. Przechowuj płytkę w czystym, suchym miejscu do czasu dalszego użycia. Nie zaobserwowano wycieku ani wymiany pożywki, gdy naprzemienne studzienki na płytce 384 SPOT zostały wypełnione fluoresceiną i PBS podczas 30-dniowego okresu testowego, potwierdzając skuteczność bariery PMMA w utrzymywaniu izolacji od studni do studni. Organoidy guza trzustki wykazujące ekspresję GFP wysiane na 96 płytkach SPOT pozostały żywotne i rozwijały się stopniowo od dnia zerowego do dnia 12 hodowli. W 12 dniu organoidy wyhodowane na SPOT wykazywały silną ekspresję cytokeratyny 19 i Zonula Occludens-1, wraz z obecnością wewnętrznych struktur świetlnych. Suboptymalne i optymalne wyniki wysiewu tkanek na 384 płytkach SPOT można było wizualnie odróżnić na podstawie definicji krawędzi i jednorodności rozmieszczenia komórek. Równomierny wysiew został osiągnięty na wszystkich 96 płytkach SPOT i 384 SPOT za pomocą automatycznego doładowacza cieczy.