Name: Powtarzalna produkcja SPOT jako wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Poznaj platformę SPOT do hodowli organoidów w formacie 96- i 384-well. Ta metoda wykorzystuje rusztowania hydrogelowe i automatyczne pipetowanie do badań przesiewowych leków oraz modelowania chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za pomoc Jennifer Lam w pozyskiwaniu obrazu. Rysunek 1, Rysunek 2 i Rysunek 7A zostały utworzone za pomocą BioRender.com. Praca ta była wspierana przez grant Discovery Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) (grant #RGPIN-2021-03488) dla APM; program Canada First Research Excellence (CFREF) Medicine by Design Grand Questions dla A.P.M.; Stypendia dla absolwentów NSERC Canada - program doktorancki dla RC; Nagroda Fundacji Charytatywnej Peterborough K.M. Hunter dla R.C.; stypendium CRAFT Narodowej Rady ds. Badań Naukowych (NRC) przyznane N.T.L.; NSERC CREATE TOeP do N.T.L.; Nagroda Naukowa dla Studentów Studiów Licencjackich NSERC dla Z. K.; oraz Nagroda Doskonałości Uniwersytetu w Toronto dla CMT

<ol><li>Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Cell+Culture%3A+A+Breakthrough+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in vivo.</a> Int J Mol Sci. 16 (3), 5517-5527 (2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Organoids.</a> Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-21 (2022).</li>
<li>Done, A. J., Birkeland, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+a+tool+in+drug+discovery+and+patient-specific+therapy+for+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22CR+Med%22%5BJournal%5D)">Organoids as a tool in drug discovery and patient-specific therapy for head and neck cancer.</a> CR Med. 4 (6), 101087(2023).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Schuster, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microfluidic+platform+for+dynamic+and+combinatorial+drug+screening+of+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids.</a> Nat Commun. 11 (1), 5271(2020).</li>
<li>Bozal, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+automated+3D+high+content+cell+screening+platform+for+organoid+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Disc%22%5BJournal%5D)">Development of an automated 3D high content cell screening platform for organoid phenotyping.</a> SLAS Disc. 29 (7), 100182(2024).</li>
<li>Seiler, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+automated+microfluidic+cell+culture+platform+reduces+glycolytic+stress+in+cerebral+cortex+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Modular automated microfluidic cell culture platform reduces glycolytic stress in cerebral cortex organoids.</a> Sci Rep. 12 (1), 20173(2022).</li>
<li>Costa, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroids%3A+an+overview+on+the+tools+and+techniques+used+for+their+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis.</a> Biotechnol Adv. 34 (8), 1427-1441 (2016).</li>
<li>Pinho, D., Santos, D., Vila, A., Carvalho, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Colorectal+Cancer+Organoids+in+Microfluidic-Based+System%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Establishment of Colorectal Cancer Organoids in Microfluidic-Based System.</a> Micromachines. 12 (5), 497(2021).</li>
<li>Töpfer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+colon+organoids%3A+From+3D+bioprinting+to+cryopreserved+multi-well+screening+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms.</a> Toxicol in Vitro. 61, 104606(2019).</li>
<li>Tong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+defined+ECM+and+small+molecule+based+monolayer+culture+system+for+the+expansion+of+mouse+and+human+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Towards a defined ECM and small molecule based monolayer culture system for the expansion of mouse and human intestinal stem cells.</a> Biomaterials. 154, 60-73 (2018).</li>
<li>Krebs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carrageenan-Based+Crowding+and+Confinement+Combination+Approach+to+Increase+Collagen+Deposition+for+In+Vitro+Tissue+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Gels%22%5BJournal%5D)">Carrageenan-Based Crowding and Confinement Combination Approach to Increase Collagen Deposition for In Vitro Tissue Development.</a> Gels. 9 (9), 705(2023).</li>
<li>Li, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-the-shelf+multi-well+scaffold-supported+platform+for+tumour+organoid-based+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An off-the-shelf multi-well scaffold-supported platform for tumour organoid-based tissues.</a> Biomaterials. 291, 121883(2022).</li>
<li>Phan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+high-throughput+approach+identifies+actionable+drug+sensitivities+in+patient-derived+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple high-throughput approach identifies actionable drug sensitivities in patient-derived tumor organoids.</a> Commun Biol. 2 (1), 78(2019).</li>
<li>Hofer, M., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Engineering organoids.</a> Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).</li>
<li>Landon-Brace, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Engineered+Patient-Derived+Tumor+Organoid+Model+That+Can+Be+Disassembled+to+Study+Cellular+Responses+in+a+Graded+3D+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Func+Mater%22%5BJournal%5D)">An Engineered Patient-Derived Tumor Organoid Model That Can Be Disassembled to Study Cellular Responses in a Graded 3D Microenvironment.</a> Adv Func Mater. 31 (41), 2105349(2021).</li>
<li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Automation+Workflow+for+High-Throughput+Manufacturing+and+Analysis+of+Scaffold-Supported+3D+Tissue+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">An Automation Workflow for High-Throughput Manufacturing and Analysis of Scaffold-Supported 3D Tissue Arrays.</a> Adv Healthcare Mater. 12 (19), 2202422(2023).</li>
<li>Rodenhizer, D., Dean, T., Xu, B., Cojocari, D., McGuigan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+engineered+heterogeneous+tumor+model+for+assessing+cellular+environment+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional engineered heterogeneous tumor model for assessing cellular environment and response.</a> Nat Protoc. 13 (9), 1917-1957 (2018).</li>
<li>Young, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRACER+3D+Co-Culture+tumour+model+for+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A TRACER 3D Co-Culture tumour model for head and neck cancer.</a> Biomaterials. 164, 54-69 (2018).</li>
<li>Dean, T., Li, N. T., Cadavid, J. L., Ailles, L., McGuigan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRACER+culture+invasion+assay+to+probe+the+impact+of+cancer+associated+fibroblasts+on+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cell+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">A TRACER culture invasion assay to probe the impact of cancer associated fibroblasts on head and neck squamous cell carcinoma cell invasiveness.</a> Biomater Sci. 8 (11), 3078-3094 (2020).</li>
<li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+miniaturized+3D+organoid+culture+platform+for+ultra-high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening.</a> J Mol Cell Biol. 12 (8), 630-643 (2020).</li>
<li>Shing, C. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShing%2C+CB+%22Automating+the+Generation+of+a+High-Throughput+Three-+Dimensional+Human+Adipocyte+Model%22">Automating the Generation of a High-Throughput Three- Dimensional Human Adipocyte Model</a>. , University of Toronto. (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W niniejszym protokole znajduje się szczegółowy przewodnik dotyczący wytwarzania i stosowania 96- i 384-dołkowego SPOT, obejmujący montaż, ręczny i wspomagany płynem wysiew żelu komórkowego. W przeciwieństwie do tradycyjnych systemów zatyczek hydrożelowych, SPOT eliminuje artefakty związane z łąkotką, ułatwiając nieniszczące obrazowanie organoidów in situ, jak opisano wcześniej 14,16,22. Dodatkowo rusztowanie zapewnia w...

Pomimo postępów w badaniach biomedycznych, opracowanie fizjologicznie istotnych testów in vitro wciąż stanowi wyzwanie. Idealny test powinien być dostosowany do różnorodnych typów komórek, formulacji terapeutycznych, ram czasowych, instrumentacji komercyjnej oraz odczytów analitycznych, aby sprostać potrzebom badaczy z różnych dyscyplin. Jednak ze względu na brak odpowiednich narzędzi, naukowcy często polegają na uproszczonych modelach, takich jak dwuwymiarowe monowarstwy unieśmiertelnionych linii komórkowych, które nie oddają złożoności i istotności klinicznej, szczególnie w badaniach nad nowotworami1,2. Aby temu zaradzić, szeroko zakrojone biobankowanie guzów oraz współpraca z klinicystami napędziły rozwój wysokiej wierności modeli in vitro, takich jak organoidy nowotworowe pochodzące od pacjentów (PDO), które zachowują bardziej specyficzne dla pacjenta profile genetyczne i terapeutyczne w porównaniu do linii komórkowych3,4,5. Jednocześnie postępy w automatyzacji laboratoryjnej i odkrywaniu leków wymagają platform, które bezproblemowo integrują się z przepływami pracy o wysokiej przepustowości. Chociaż istniejące platformy rozwiązują problem albo wierności biologicznej, albo skalowalności, niewiele z nich było w stanie rozwiązać oba te problemy jednocześnie6,7,8. Opracowanie zautomatyzowanych modeli o wysokiej przepustowości, które replikują kluczowe cechy chorób, jest niezbędne dla rozwoju badań biomedycznych i przyspieszenia generowania danych dla zastosowań translacyjnych.
Wiele powstających modeli ma na celu rozwiązanie problemów związanych z hodowlą wyspecjalizowanych typów komórek, takich jak PDO, w wysokiej przepustowości (Rysunek 1). Standardowe platformy, w których organoidy są mieszane z hydrożelem w płytkach 96- lub 384-dołkowych, wykazują szereg ograniczeń: (i) duża objętość mieszaniny komórki-żel prowadzi do niespójnego dostępu do składników odżywczych, (ii) krzywizna menisku w dołku tworzy artefakty obrazowania i gradienty komórkowe, (iii) wysiew hydrożelu nie jest jednolity w różnych partiach i zależnie od personelu, (iv) występuje brak kompatybilności z automatycznym wytwarzaniem i automatyczną mikroskopią oraz (v) stosowanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), która zazwyczaj jest miękka i krucha, stwarza ryzyko zniszczenia próbki przy fizjologicznej gęstości tkanki lub w przypadku włączenia kurczliwych typów komórek1,9. Obecnie większość badań nad PDO prowadzonych w płytkach odbywa się albo poprzez ręczny wysiew mieszaniny komórki-żel do płytki10,11, albo metodą nakładania żelu (gel-overlay), w której hydrożel jest rozcieńczany mniej lepkim medium, a komórki są wirowane na dno dołka, aby umieścić je w odpowiedniej płaszczyźnie optycznej12,13. Oba podejścia nie zapewniają wsparcia mechanicznego dla hodowli długoterminowej. Na podstawie naszych wcześniejszych obserwacji (niepublikowane dane), komercyjny hydrożel zmieszany z komórkami w standardowych płytkach dołkowych kurczy się od ścianek dołka w 9 z 12 dołków w ciągu 12 dni, natomiast metoda nakładania żelu nie zapewnia fizjologicznych oddziaływań komórka-macierz. Ponadto uzyskane hodowle nie mogą być utrzymywane przez długi czas ze względu na ograniczenia przestrzenne w obrębie dołka i są niekompatybilne z analizami wymagającymi wysokiego stosunku odczynnika do medium komórkowego14,15,16. Te bariery praktyczne utrudniają wdrażanie modeli 3D i ograniczają powtarzalność eksperymentów w całej dziedzinie.
<img alt="Schemat skalowalności badań nad rakiem; modele obejmują organoidy, systemy lab-on-chip oraz zwierzęta w zależności od przepustowości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68405/68405fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ocena modeli hodowli w oparciu o skalowalność i istotność biologiczną. Względne rozmieszczenie różnych systemów hodowli in vitro i in vivo w zależności od skalowalności (oś y), definiowanej przez przepustowość płyt wielodołkowych, oraz istotności biologicznej (oś x), z uwzględnieniem kompromisu między potencjałem przepustowości a wiernością fizjologiczną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68405/68405fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Motywując się tymi wyzwaniami, wykorzystano wysoką porowatość i wzmocnienie mechaniczne cienkiego rusztowania celulozowego do opracowania platformy SPOT (Scaffold-supported Platform for Organoid-based Tissues), dostępnej w formatach 96- i 384-dołkowych. SPOT zawiera polimerowe rusztowanie z nadanym wzorem, wykonane przy użyciu wcześniej opracowanej metody infiltracji17, która odpowiada układowi płytki, co umożliwia precyzyjne rozmieszczenie kropel żelu z komórkami i zapewnia wsparcie strukturalne dla fazy hydrożelu (Rysunek 2A. Kapilarnie wsysanie do wnętrza rusztowania prowadzi roztwór żelu z komórkami, tworząc mechanicznie wzmocnioną sieć biokompozytową (Rysunek 2B). Dzięki porowatej strukturze rusztowania żel z komórkami infiltruje je i tworzy cienką warstwę (o grubości około 70 µm), co sprawia, że do pokrycia dna dołka wymagana jest dziesięciokrotnie mniejsza ilość żelu z komórkami14. Kompatybilność SPOT z wysiewem organoidów pochodzących od pacjentów (PDO) z gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) została również wykazana poprzez ocenę ich wzrostu za pomocą testów metabolicznych i pomiarów obrazowych. Od momentu opracowania SPOT wykazuje znaczną wszechstronność i użyteczność dla badaczy zajmujących się hodowlą organoidów. Ponadto konstrukcja SPOT umożliwia łatwą skalowalność, z mniejszymi objętościami odczynników i lepszymi możliwościami obrazowania dzięki płaskiej geometrii mikrożelu bez menisku, co zapewnia jednorodną penetrację światła i dokładne obrazowanie wysokotreściowe (high-content imaging)14 (Rysunek 2C,D). SPOT wspiera również kokulturę z innymi istotnymi typami komórek, takimi jak fibroblasty, aby lepiej odwzorować mikrośrodowisko guza18.
<img alt="Wytwarzanie urządzenia: wielowarstwowa płytka z dołkami, wysiew komórek, mikroskopia, schemat analizy fluorescencyjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68405/68405fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przegląd urządzenia 96-SPOT i schematu analizy obrazu. (A) Schematyczne przedstawienie wytwarzania płytki SPOT: urządzenie składa się z komercyjnej płytki z dołkami bez dna (góra), rusztowania z PMMA (kolor niebieski) i folii poliwęglanowej (dół), połączonych warstwami dwustronnego kleju poliakrylowego (kolor żółty). (B) Wysiew komórek do dołka z rusztowaniem: komórki zawieszone są w niepolimeryzowanym hydrożelu (kolor różowy) i naniesione pipetą do każdego dołka, gdzie infiltrują rusztowanie. Następnie hydrożel żeluje, kapsułkując komórki wewnątrz hydrożelu wspieranego przez rusztowanie. (C) Mikroskopia: powstałą mikrotkankę można obrazować za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii szerokopolowej. (D) Analiza obrazu: nabyte obrazy fluorescencyjnych komórek (zielone) zawieszonych w żelu mogą być analizowane przy użyciu standardowych procedur analizy obrazu. Reprezentatywny obraz z mikroskopii epifluorescencyjnej komórek KP4 wykazujących ekspresję GFP w jednym dołku 96-SPOT. Pasek skali wynosi 500 µm. Rysunek zmodyfikowany na podstawie 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68405/68405fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Kolejną zaletą SPOT jest możliwość zintegrowania systemu z otwartym oprogramowaniem do obsługi cieczy, co ułatwia zautomatyzowaną i powtarzalną produkcję kultur PDO. To usprawnienie zmniejsza zmienność wynikającą z działania operatora i umożliwia stosowanie złożonych planów eksperymentalnych, w tym wysokoprzepustowych przesiewów leków oraz podejść medycyny spersonalizowanej18. Wcześniej wykazano również, że SPOT jest kompatybilny z multipleksową charakteryzacją fenotypów komórkowych w heterogenicznych środowiskach nowotworowych w oparciu o pojedyncze komórki, a także z odzyskiwaniem komórek z systemu SPOT na żądanie poprzez trawienie18. Cechy te czynią SPOT wszechstronnym narzędziem w zastosowaniach przesiewowych, w których podłużne dane o wysokiej rozdzielczości są niezbędne do oceny skuteczności leków i zachowania komórek w warunkach fizjologicznie istotnych14,18. Dzięki połączeniu tych innowacji technicznych SPOT rozwiązuje krytyczne ograniczenia tradycyjnych systemów kultur 3D.
Niniejszy protokół stanowi kompleksowy przewodnik po wytwarzaniu komponentów SPOT, montowaniu płytek oraz metodach wysiewania w celu uzyskania stabilnych i powtarzalnych kultur 3D organoidów. Zawiera on szczegółowe instrukcje dotyczące ręcznego wysiewania płytek za pomocą mikropipety oraz zautomatyzowanych przepływów pracy z wykorzystaniem robota do obsługi cieczy, który obsługuje formaty 96- oraz 384-dołkowe. Ponadto protokół ten opisuje kluczowe środki kontroli jakości, takie jak weryfikacja jednorodności rozkładu żelu i integralności rusztowania, w celu zachowania wysokich standardów eksperymentalnych. Przedstawiono również strategie rozwiązywania problemów w celu wyeliminowania częstych trudności, takich jak niepełna infiltracja żelu, parowanie podczas wysiewania oraz odklejanie się rusztowania, co dostarcza badaczom praktycznych rozwiązań optymalizujących przepływ pracy i pozwalających na uzyskanie wiarygodnych wyników.
SPOT został zaprojektowany w celu wypełnienia luk występujących w tradycyjnych analizach organoidów, w tym wyzwań związanych z przeprowadzaniem testów i wymianą pożywki przy jednoczesnym zachowaniu integralności żelu10,11,12,13. Ogólnym celem tej metody jest stworzenie platformy z rusztowaniem wspierającym hodowlę organoidów przez okres 12 dni. Ponadto metoda ta obejmuje generowanie macierzy tkankowych w systemie SPOT poprzez siew manualny lub wspomagany automatycznym dozownikiem cieczy, co pozwala użytkownikom na przeprowadzanie dowolnych dalszych perturbacji, w tym analiz IC50 leków oraz przesiewania cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej.

<table><tbody><tr><td>Probówki PCR 0,2 ml (paski po 8 sztuk)&nbsp;</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>72.985.002</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa 1,5 ml</td><td>FroggaBio powiedział:</td><td>Zobacz materiał LMCT1.7B</td><td></td></tr><tr><td>1000-&mu; Końcówki do pipet L</td><td>Zaćmienie</td><td>4-1019-260-000</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>FroggaBio powiedział:</td><td>394010</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>BD, Kanada</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>10x Minimalna pożywka (MEM 10x)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>11430030</td><td></td></tr><tr><td>Talerz 150 mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki dozujące o rozmiarze 16 ze złączem Luer lock</td><td>McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone</td><td>6699A2</td><td></td></tr><tr><td>20 i mikro; L stojaki na końcówki filtrów</td><td>Otwarte trony</td><td>999-00099</td><td></td></tr><tr><td>200 i mikro; L stojaki na końcówki filtrów</td><td>Otwarte trony</td><td>999-00081</td><td></td></tr><tr><td>200-&mu; Końcówki do pipet L</td><td>Zaćmienie</td><td>4-1030-260-000</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki dozujące o rozmiarze 20 z przyłączem Luer lock</td><td>McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone</td><td>6699A4</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka bez dna ()</td><td>Greiner</td><td>82051-544</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 3 ml&nbsp;</td><td>BD, Kanada</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa o pojemności 50 ml</td><td>Firma VWR</td><td>CA21008-940</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa o pojemności 50 ml</td><td>Firma VWR</td><td>CA21008-940</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka bez dna ()</td><td>Greiner</td><td>82050-714</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Naukowy</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rozszerzenie AxiDraw dla Inkscape (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Interfejs API AxiDraw w Pythonie (https://axidraw.com/doc/py_api/#installation)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>AxiDraw V3 Wysokowydajna osobista maszyna do pisania i rysowania</td><td>Źli szaleni naukowcy, Stany Zjednoczone</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen bydlęcy (PureCol 3 mg/ml)</td><td>Zaawansowana BioMatrix</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa do wyboru</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sztaluga z klipsem (zawarta w pakiecie AxiDraw V3)</td><td>Źli szaleni naukowcy, Stany Zjednoczone</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wybrane podłoża hodowlane</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Taśma ochronna zatrzymująca brud</td><td>3 mln</td><td>6851 PN36851</td><td></td></tr><tr><td>Dwustronna taśma klejąca poliakrylowa (800 mm x 1200 mm)</td><td>Badania nad klejami, ARcare</td><td>90106NB</td><td></td></tr><tr><td>Surowica płodowa bydlęca (FBS)</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Filtry do herbaty Finum XL&nbsp;</td><td>Riensch & Held GmbH & Co. KG, Hamburg, Niemcy</td><td>420.69.00</td><td></td></tr><tr><td>Płaskie nakrętki do probówek PCR 0,2 ml (paski po 8 sztuk)</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>65.989.002</td><td></td></tr><tr><td>Wytrzymałe zaciski sprężynowe z tworzywa sztucznego</td><td>PUNKT ODNIESIENIA</td><td>1024-554</td><td></td></tr><tr><td>Moduł HEPA &ndash; Model 110-130 V 60 Hz</td><td>Otwarte trony</td><td>999-00109</td><td></td></tr><tr><td>Worek z lodu (mrożony, 1400 mm x 1800 mm)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Inkscape</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wycinarka laserowa</td><td>Uniwersalny system laserowy</td><td>VLS3.75</td><td></td></tr><tr><td>Miniaturowe rurki z octanu etylu i winylu (EVA) o średnicy zewnętrznej 0,07 cala</td><td>McMaster-Carr, Illinois, Stany Zjednoczone</td><td>1883T3</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowa pipeta elektroniczna P20 (Gen2)</td><td>Otwarte trony</td><td>999-00005</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowa pipeta elektroniczna P300 (Gen2)</td><td>Otwarte trony</td><td>999-00006</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Sally Hansen</td><td>SBS-006861 powiedział:</td><td>Opcjonalnie, do pigmentacji tuszu PMMA</td></tr><tr><td>Opentrony OT-2</td><td>Otwarte trony</td><td>999-00111</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P1000</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 8-kanałowa P200</td><td>Gilson</td><td>F144072</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P200</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki papierowe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Firma Bemis, Inc.</td><td>52859-079</td><td></td></tr><tr><td>Papier pergaminowy&nbsp; &nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Firma VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (P/S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał P4333 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Poli(metakrylan metylu) (PMMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>182230</td><td></td></tr><tr><td>Folia poliwęglanowa (760 mm x 1300 mm)</td><td>McMaster-Carr powiedział:</td><td>Numer katalogowy: 85585K102</td><td></td></tr><tr><td>Monomer i środek sieciujący z polidimetylosiloksanu (PDMS, 1500 mm x 2700 mm)</td><td>Kleje Ellsworth</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Nóż precyzyjny</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sztywny wspornik akrylowy (rozmiar dopasowany do dna płyty studzienki)</td><td>McMaster-Carr powiedział:</td><td>Numer katalogowy: 8560K239</td><td></td></tr><tr><td>Wspornik ze sztywnej tektury</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Linijka</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (0,8 M w wodzie destylowanej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał S6014</td><td></td></tr><tr><td>Pokład temperaturowy z blokami aluminiowymi (Gen2)</td><td>Otwarte trony</td><td>999-00097</td><td></td></tr><tr><td>Koło kreślarskie&nbsp;</td><td>HEEPDD (Amazonka)</td><td>B07YQWB284</td><td></td></tr><tr><td>Taśma przezroczysta&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

powtarzalna produkcja spot jako wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach

Reproducible Manufacturing of SPOT as a High-throughput Scaffold-based Culture Platform

Organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) są coraz częściej wykorzystywane w dziedzinie badań nad rakiem do modelowania nowotworów. Łączą one w sobie zalety modeli in vivo i tradycyjnych modeli in vitro , podsumowując złożoność i niejednorodność tkanek, a jednocześnie składając się z komórek ludzkich. Rozwój fizjologicznie reprezentatywnych modeli PDO spowodował zapotrzebowanie na urządzenia, które umożliwiają prostą analizę zachowania organoidów. Protokół ten wyjaśnia, jak złożyć i używać platformy SPOT (Scaffold-supported Platform for Organoid-based Tsites), wysokowydajnego, trójwymiarowego (3D) urządzenia do hodowli organoidów. Platforma ta eliminuje łąkotkę zwykle tworzoną przez hydrożele z nasionami, aby umożliwić dokładne, szybkie obrazowanie, podobne do procesu obrazowania w przypadku kultur dwuwymiarowych (2D). W rezultacie, organoidy i kokultury wysiane w SPOT można łatwo obrazować za pomocą mikroskopii wysokoprzepustowej. Zaprojektowany do użytku od ręki, SPOT jest dostępny dla badaczy z podstawowym doświadczeniem w hodowlach tkankowych i jest kompatybilny zarówno z ręcznymi, jak i automatycznymi przepływami pracy wysiewu. Protokół ten szczegółowo opisuje wytwarzanie SPOT w formatach 96- i 384-dołkowych, w tym instrukcje krok po kroku dotyczące montażu, wysiewu, kontroli jakości i rozwiązywania problemów. Podczas gdy produkcja wymaga 3-4 godzin, nie licząc czasu bezczynności, można jednocześnie produkować wiele płyt, co poprawia skalowalność. Usprawniając hodowlę i analizę PDO, SPOT zapewnia solidne narzędzie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i translacyjnych badań nad rakiem.

Wzornik z PMMA na rusztowaniu papierowym służy jako bariera fizyczna zapobiegająca wymianie treści między studniami. Taka konstrukcja jest kluczowa dla zapewnienia chemicznej i biologicznej izolacji sąsiednich studni, co zapobiega niezamierzonej dyfuzji mediów, leków, czynników wydzielniczych, a nawet komórek14. Zastosowanie PMMA umożliwia precyzyjną kompartymentację, czyniąc SPOT niezawodną platformą do wysokoprzepustowego skryningu i badań kokultur, w których należy zminimalizować ryzyko kontami...

Protokół ten dokumentuje wytwarzanie i montaż SPOT, wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach, w formatach 96- i 384-dołkowych. Szczegółowo opisuje również proces wysiewu dla SPOT, zarówno ręczny, jak i przy użyciu dostępnego na rynku urządzenia do obsługi cieczy.

Powtarzalna produkcja SPOT jako wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach

Patient-derived organoids (PDOs) are becoming increasingly used in the field of cancer research to model tumors. They combine the benefits of in vivo and ...

Nasze badania koncentrują się na opracowywaniu wysokowydajnych, wspieranych przez rusztowania platform dla solidnych, powtarzalnych, pochodzących od pacjentów kultur orgonomicznych, aby usprawnić przepływ pracy w testach przesiewowych leków i pomóc w zaawansowanym modelowaniu chorób.Zautomatyzowane urządzenia do obsługi cieczy, platformy hydrożelowe oparte na rusztowaniach, technologie narządów na chipie oraz testy jednokomórkowe, takie jak cytometria przepływowa i CYTOP, to tylko niektóre z obecnie dostępnych technologii.Obecne wyzwania obejmują zachowanie integralności hydrożelu, pokonanie menisku żelowego na potrzeby obrazowania w czasie rzeczywistym oraz zapewnienie równomiernego rozmieszczenia komórek w długoterminowych testach opartych na organoidach.Nasz protokół umożliwia spójne, wspierane przez rusztowania ładowanie hydrożelu, minimalizuje problemy z łąkotkami, wspiera długoterminową hodowlę organoidów i płynnie integruje się z automatycznymi urządzeniami do obsługi cieczy i systemem obrazowania o wysokiej zawartości.Najbardziej ekscytuje nas wykorzystanie naszych platform do modelowania chorób w celu zbadania mechanizmów progresji choroby w nowotworach i rozwoju otyłości.[Instruktor] Aby rozpocząć, weź rusztowanie wzorca PMMA dla 96 lub 384 SPOT. Przytnij nadmiar papieru wokół niebieskiego obszaru rusztowania, pozostawiając pięciomilimetrowy biały margines na obwodzie. Upewnij się, że wynikowy arkusz ma wymiary około 760 milimetrów na 1,300 milimetrów. Aby przygotować rusztowanie 96 SPOT do montażu, należy położyć kawałek folii polietylenowej na sztywnym wsporniku akrylowym. Umieść ten pokryty folią wspornik na powierzchni roboczej i połóż rusztowanie na folii polietylenowej. Wyrównaj krawędź linijki między pierwszymi dwoma rzędami rusztowania, aby uniknąć śledzenia w studniach. Umieść koło śledzące na dole rusztowania i zwiń je do góry do góry, kierując się linijką. W przypadku rusztowania 384 SPOT nie należy wykonywać perforacji. Następnie połóż rusztowanie szorstką stroną skierowaną do góry na płycie PDMS, upewniając się, że rzędy przebiegają poziomo. Użyj linii gruntowania, aby określić, która strona jest szorstka, a następnie wygładź rusztowanie na płycie, aby usunąć zmarszczki lub pęcherzyki. Usuń warstwę ochronną z niegrawerowanej strony taśmy dwustronnej. Lekko zapnij taśmę na środku i wyrównaj dwie środkowe kolumny taśmy z rusztowaniem. Teraz dociśnij środek taśmy do rusztowania, aby zapewnić wyrównanie. Wygładź taśmę na zewnątrz od środka, aby przymocować ją równomiernie. Za pomocą pęsety delikatnie podnieś rusztowanie z płyty PDMS. Przechowuj płytę do wykorzystania w przyszłości. Aby przymocować rusztowanie do drugiej taśmy studziennej, odwróć rusztowanie tak, aby gładka, niezaklejona taśmą strona była skierowana do góry na stole warsztatowym. Usuń środkową warstwę ochronną z wygrawerowanej strony drugiej taśmy, aby odsłonić dwie środkowe kolumny. Lekko zapnij środek drugiej taśmy i wyrównaj ją ze środkowymi kolumnami rusztowania, a następnie naciśnij środek taśmy, aby ją zamocować. Jeśli używana jest grawerowana taśma, usuń pozostałe warstwy ochronne przylegające do odsłoniętego środka. Wygładź taśmę, zaczynając od środka i przesuwając się na zewnątrz. Aby przymocować rusztowanie do płyty bez dna, usuń warstwę ochronną. Wyrównaj rusztowanie pod płytą bez dna z pokrywką. Po wyrównaniu dociśnij jego środek do talerza. Jeśli używasz grawerowanej taśmy, usuń sąsiednie warstwy i wygładź rusztowanie na płycie na zewnątrz od środka. Aby przymocować rusztowanie do folii poliwęglanowej, za pomocą pęsety ostrożnie poluzuj warstwę ochronną z jednej strony folii poliwęglanowej, a następnie powoli odklej warstwę ochronną, nie powodując żadnych wgłębień w folii. Powtórz proces dla drugiej strony, a następnie odłóż folię na stół warsztatowy. Oderwij warstwę taśmy ochronnej od spodu płyty i dociśnij folię poliwęglanową do rusztowania od środka na zewnątrz. Następnie mocno dociśnij folię poliwęglanową do rusztowania, aby upewnić się, że każda studzienka ma określoną granicę. Za pomocą precyzyjnego noża ostrożnie odetnij nadmiar materiału od spodu płyty. Po pełnym montażu umieść płytkę 96 SPOT w przezroczystej, zamykanej plastikowej torbie i wynieś ją na zewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Umieść sztywny wspornik akrylowy pod płytą i clamp oba w przeciwległych rogach. Przechowuj płytkę w czystym, suchym miejscu do czasu dalszego użycia. Nie zaobserwowano wycieku ani wymiany pożywki, gdy naprzemienne studzienki na płytce 384 SPOT zostały wypełnione fluoresceiną i PBS podczas 30-dniowego okresu testowego, potwierdzając skuteczność bariery PMMA w utrzymywaniu izolacji od studni do studni. Organoidy guza trzustki wykazujące ekspresję GFP wysiane na 96 płytkach SPOT pozostały żywotne i rozwijały się stopniowo od dnia zerowego do dnia 12 hodowli. W 12 dniu organoidy wyhodowane na SPOT wykazywały silną ekspresję cytokeratyny 19 i Zonula Occludens-1, wraz z obecnością wewnętrznych struktur świetlnych. Suboptymalne i optymalne wyniki wysiewu tkanek na 384 płytkach SPOT można było wizualnie odróżnić na podstawie definicji krawędzi i jednorodności rozmieszczenia komórek. Równomierny wysiew został osiągnięty na wszystkich 96 płytkach SPOT i 384 SPOT za pomocą automatycznego doładowacza cieczy.

reproducible-manufacturing-spot-as-high-throughput-scaffold-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W przeszłości wiele systemów hodowli in vitro – głównie hodowle monowarstwowe – często obarczonych było wadą polegającą na tym, że zróżnicowane komórki pierwotne miały stosunkowo krótki czas życia i ulegały dedyferencjacji podczas hodowli. W konsekwencji większość ich funkcji swoistych dla danego organu była szybko utracona. Aby zatem odtworzyć lepsze warunki dla tych komórek in vitro, wprowadzono modyfikacje i adaptacje do konwencjonalnych hodowli monowarstwowych.

Wywiad: Bioreaktory i rusztowania 3D z modyfikowaną powierzchnią w badaniach nad komórkami macierzystymi

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Opisane protokoły pozwalają laboratoriom na przeprowadzanie skalowalnych, przylegających hodowli komórek macierzystych z dużą wydajnością przy minimalnym nakładzie pracy, doświadczenia i inwestycji w sprzęt przy użyciu programowalnego robota do obsługi cieczy i 96-dołkowych płytek.  iPSC pasażowane ponad 20 razy w tym systemie utrzymywały pluripotencję, prawidłowe kariotypy i różnicowały się w kardiomiocyty.

Skalowalna hodowla i produkcja iPSC na 96-dołkowych płytkach przy użyciu zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Ten protokół służy jako obszerny samouczek do ustandaryzowanego i powtarzalnego mieszania lepkich materiałów za pomocą nowatorskiej technologii automatyzacji open source. Znajdują się tam szczegółowe instrukcje dotyczące obsługi nowo opracowanej stacji roboczej typu open source, korzystania z projektanta protokołów open source oraz walidacji i weryfikacji w celu identyfikacji powtarzalnych mieszanin.

Platforma technologiczna typu open source do produkcji modeli kultur 3D na bazie hydrożelu w zautomatyzowany i ustandaryzowany sposób

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nowego typu substratu hodowlanego z setkami mikropojemników namm2, w których organoidy mogą być hodowane i obserwowane za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Szczegółowo opisano również protokoły wysiewu komórek i barwienia immunologicznego.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Tutaj prezentujemy protokół dla zautomatyzowanego systemu hodowli komórek. Ten zautomatyzowany system hodowli zmniejsza nakład pracy i przynosi korzyści użytkownikom, w tym naukowcom niezaznajomionym z obsługą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), od utrzymania komórek iPS po różnicowanie w różne typy komórek.

Zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Tradycyjne, dwuwymiarowe techniki hodowli komórkowej często prowadzą do zmian w charakterystyce markerów różnicowania, cytokin i czynników wzrostu. Trójwymiarowa hodowla komórkowa w rotacyjnym systemie hodowli komórkowej (RCCS) przywraca ekspresję wielu z tych czynników, co zaprezentowano tutaj na przykładzie linii komórkowej trofoblastu pozawillousowego.

Rotacyjne systemy hodowli komórkowych dla hodowli ludzkich komórek: ludzkie komórki trofoblastyczne jako model

Poznaj platformę SPOT do hodowli organoidów w formacie 96- i 384-well. Ta metoda wykorzystuje rusztowania hydrogelowe i automatyczne pipetowanie do badań przesiewowych leków oraz modelowania chorób.

Powtarzalna produkcja SPOT jako wysokoprzepustowej platformy hodowlanej opartej na rusztowaniach

Przeglądaj więcej filmów