Tworzenie modeli in vitro hodowli zwojów korzenia grzbietowego: uzupełniające podejścia do badania przesłuchów rak-nerw
11 lipca 2025
Protokół ten opisuje metody tworzenia całych i zdysocjowanych kultur zwojów korzenia grzbietowego myszy (DRG) i ich zastosowanie do oceny interakcji guz-nerw.
Nasze badania koncentrują się na przesłuchach rak-nerw, wykorzystując 3D zwoje korzenia grzbietowego lub eksplantaty DRG i zdysocjowane hodowle 2D do ilościowego określenia migracji guza sterowanej neurologicznie i przetestowania strategii molekularnych w celu ograniczenia ich interakcji. Dzięki temu protokołowi ustaliliśmy komplementarne hodowle 3D i 2D DRG, zoptymalizowaliśmy wzrost neurytów i wykazaliśmy wzrost inwazji komórek rakowych wzdłuż rozszerzeń neurytów. Zajęliśmy się brakiem powtarzalnych modeli, które rejestrują zarówno skomplikowane interakcje na poziomie komórki, jak i nienaruszoną architekturę nerwową, tworząc komplementarne hodowle DRG 2D i 3D z jednej myszy.
Nasz protokół daje sparowane eksplantaty 3D i hodowle neuronów 2D z jednej myszy, zachowując teksturę kątową, umożliwiając obrazowanie o wysokiej zawartości, zmniejszając wykorzystanie zwierząt i pozwalając nam uzyskać dane na poziomie tkanek i pojedynczych komórek w jednym eksperymencie. Nasz model otworzył pytania o to, które czynniki stworzone przez DRG napędzają inwazję, w jaki sposób kształtuje ją aktywność neuronów, wiek i genotyp oraz czy celowanie w receptory czynników neurotroficznych może zmniejszyć rozprzestrzenianie się raka kierowane neurytami. Na początek połóż uświęconą mysz na jego brzuchu.
Ogol futro, skupiając się na obszarze nad kręgosłupem, aby odsłonić powierzchnię grzbietową. Spryskaj grzbiet zwierzęcia 70% etanolem. Za pomocą ręczników papierowych wytrzyj od ogona do czaszki, aby usunąć luźne futro i zapobiec zanieczyszczeniu podczas sekcji.
Za pomocą wysterylizowanych nożyczek wykonaj proste nacięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej od ogona do czaszki. Za pomocą kleszczy cofnij skórę po obu stronach nacięcia, aby odsłonić kręgosłup. Teraz użyj świeżej pary nożyczek i kleszczy, aby uniknąć zanieczyszczenia i wykonaj poziome nacięcie na końcu kręgosłupa.
Następnie wykonaj dwa równoległe podłużne nacięcia po obu stronach kręgosłupa, aby go uwolnić. Użyj kleszczy, aby delikatnie podnieść kręgosłup i usunąć otaczającą tkankę łączną. Aby całkowicie uwolnić kręgosłup, wykonaj nacięcie w górnej części kręgosłupa w pobliżu czaszki.
Przenieś kręgosłup na wstępnie schłodzoną 10-centymetrową płytkę zawierającą HBSS z penicyliną streptomycyną trzymaną na lodzie. Następnie za pomocą nożyczek sprężynowych usuń pozostałą tkankę łączną z kręgosłupa i odsłoń kręgi. Przenieś przycięty kręgosłup na stolik mikroskopowy.
Ostrożnie podziel kolumnę wzdłuż płaszczyzny strzałkowej za pomocą nożyczek sprężynowych. Za pomocą kleszczy z cienką końcówką usuń rdzeń kręgowy z kolumny, aby odsłonić zwoje korzenia grzbietowego wzdłuż korzeni nerwów rdzeniowych. Przetnij nerwy rdzeniowe za pomocą nożyczek sprężynowych.
Następnie usuń otaczającą tkankę łączną ze zwojów korzenia grzbietowego. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką delikatnie wyciągnij zwoje korzenia grzbietowego z korzeni grzbietowych. W przypadku hodowli w całości należy umieścić DRG na trzycentymetrowej płytce zawierającej HBSS z penicyliną streptomycyną trzymaną na lodzie.
Użyj wstępnie schłodzonych końcówek pipet, aby dozować dwa mikrolitry schłodzonego Matrigelu do każdej studzienki ośmiodołkowego szkiełka podstawowego umieszczonego w 10-centymetrowej płytce na lodzie. Aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji, pipetować tylko jedną kroplę na raz. Następnie za pomocą kleszczy z cienką końcówką umieść jeden zwój korzenia grzbietowego na suchej płytce.
Delikatnie obracaj, aby usunąć nadmiar HBSS. Następnie przenieś czysty ganglion korzenia grzbietowego do kropli Matrigel. Po przeniesieniu wszystkich ganglionów do kropel, inkubuj szkiełko ze szklanym dnem w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby umożliwić polimeryzację Matrigelu.
Następnie ostrożnie dodaj 200 mikrolitrów ciepłej uzupełnionej pożywki hodowlanej do każdej studzienki. Inkubuj szkiełko w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Użyj mikroskopii jasnego pola, aby codziennie monitorować zwoje korzenia grzbietowego pod kątem wzrostu neuronów i żywotności.
Odwirować 15-mililitrową stożkową probówkę zawierającą połączone zwoje korzenia grzbietowego o 200 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odpipetowaniu HBSS przepłukać zwoje jaj wstępnie podgrzanym dodatkowym podłożem i delikatnie postukać. Następnie odwiruj probówkę przez pięć minut w temperaturze 200G, aby granulować DRG.
Zastąp pożywkę jednym mililitrem roztworu papainy. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 20 minut, delikatnie mieszając co pięć minut. Następnie dodaj 10 mililitrów uzupełnionej pożywki, aby zneutralizować papainę i delikatnie wymieszaj.
Wirować przez pięć minut w temperaturze 400G, aby zagnieździć zwoje korzenia grzbietowego. Po odpipetowaniu supernatantu dodać jeden mililitr kolagenazy typu IV do roztworu Dispazy II i ponownie inkubować. Dodaj 4,5 mililitra uzupełnionej pożywki, aby zneutralizować roztwór enzymu, delikatnie wymieszaj i odwiruj.
Po odpipetowaniu supernatantu dodać pięć mililitrów dodanego podłoża. Następnie dodaj Dnazę I, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,2 miligrama na mililitr. Zwoje korzenia grzbietowego powinny teraz wyglądać jak luźna kępka, co wskazuje na całkowite trawienie.
Do dysocjacji mechanicznej użyj końcówki pipety z filtrem o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby rozcierać roztwór zwojów nerwowych, pipetując w górę iw dół cztery do pięciu razy. Zmień końcówkę do pipet na 200 mikrolitrów i powtórz rozcieranie, pipetując cztery do pięciu razy. Przefiltruj powstałą mętną zawiesinę przez sitko o długości 70 mikrometrów do 50-mililitrowej stożkowej probówki.
Następnie stopniowo przepłucz sitko 10 mililitrami pożywki, aby zapewnić całkowite przeniesienie komórek. Odwirować przefiltrowaną zawiesinę komórkową przez pięć minut przy 1 000 G, aby osadzać komórki. Usuń pożywkę z osadu i ponownie zawieś osad komórkowy w 500 mikrolitrach uzupełnionej pożywki.
Usunąć wszelkie pozostałości PBS z dołków szkiełka podstawowego z ośmiodołkowym dnem. Rozprowadzić zdysocjowaną zawiesinę zwojów korzenia grzbietowego do studzienek pokrytych kolagenem i inkubować. Użyj mikroskopii jasnego pola, aby codziennie monitorować komórki pochodzące ze zwojów korzenia grzbietowego, oceniając żywotność komórek i wzrost neuronów W przypadku kohodowli całych zwojów myszy z komórkami rakowymi najpierw odessaj pożywkę z całych kultur DRG na ośmiodołkowym szkiełku ze szklanym dnem.
Za pomocą pipety delikatnie dodaj 200 mikrolitrów zawiesiny komórek rakowych do studzienki zawierającej kroplę Matrigel i zwoje korzenia grzbietowego. Inkubuj szkiełko kokulturowe w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Odświeżaj podłoże codziennie, myjąc je raz 200 mikrolitrami podgrzanego podłoża uzupełniającego i dodając 300 mikrolitrów świeżego podłoża.
W przypadku kohodowli zdysocjowanych zwojów i komórek rakowych, należy odessać pożywkę ze zdysocjowanych kultur DRG na ośmiodołkowym szkiełku ze szklanym dnem. Następnie delikatnie rozprowadź 200 mikrolitrów zawiesiny komórek rakowych w każdym dołku przed inkubacją. Ustanowienie DRG było mniej skuteczne przy braku suplementów, a ekspansja neurytów była znacznie zmniejszona.
Całe DRG ze starszych zwierząt wytwarzały mniej obfite i bardziej rozpoznawalne rozszerzenie neurytów oraz minimalną liczbę komórek glejowych, co ułatwia wizualizację interakcji komórek raka nerwu. Dysocjacja neuronów DRG przy użyciu dwóch etapów enzymatycznych skutkowała większą regeneracją neuronów. W ciągu 24 godzin od hodowli komórki nieneuronalne, takie jak komórki Schwana, makrofagi i fibroblasty, stały się widoczne, podczas gdy neuryty kiełkujące z komórek pochodzących z DRG obserwowano i dalej wzrastały po 72 godzinach.
Komórki rakowe wysiane w wkładkach transwell pokrytych Matrigelem zaatakowały w kierunku komórek HEC293, ale nie w kierunku neuronów DRG po 24 godzinach inkubacji. Całe kultury DRG zanurzone w kropli Matrigel umożliwiły ekspansję neurytu na zewnątrz przez matrycę w kierunku peryferii. Dzięki starannemu umieszczeniu DRG centralnie w kropli, zapewniając maksymalne rozciągnięcie neurytów bez zarastania granic.
Komórki rakowe osiadły po 12 godzinach kohodowli wokół granicy kropli Matrigel zawierającej DRG. Po 72 godzinach wspólnej hodowli komórki rakowe zaatakowały Matrigel i przemieściły się w kierunku zwoju, z bezpośrednią interakcją między przedłużeniami komórek zwoju korzenia grzbietowego a komórkami rakowymi. Wspólna hodowla zdysocjowanych komórek pochodzących z DRG z komórkami nowotworowymi pozwoliła na szczegółową wizualizację interakcji między poszczególnymi komórkami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metody tworzenia hodowli całych oraz dysocjowanych zwojów korzeni grzbietowych (DRG) myszy i ich wykorzystanie do oceny interakcji między guzem a nerwami. Badanie koncentruje się na komunikacji między komórkami nowotworowymi a nerwami, wykorzystując hodowle DRG w 3D i 2D do badania migracji nowotworu sterowanej przez neurony.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia nowotworów
- Techniki hodowli komórkowych
Wprowadzenie
- Zrozumienie interakcji między guzem a nerwami ma kluczowe znaczenie w badaniach nad nowotworami.
- Obecnym modelom brakuje powtarzalności w oddawaniu interakcji na poziomie komórkowym.
- Hodowle zwojów korzeni grzbietowych (DRG) mogą dostarczyć wiedzy na temat rozprzestrzeniania się raka prowadzonego przez neurony.
- Optymalizacja wzrostu neurytów jest niezbędna do badania tych interakcji.
Cel badania
- Ustanowienie komplementarnych hodowli 3D i 2D zgrubień korzeni tylnych (DRG) z jednej myszy.
- Ocena czynników napędzających inwazję komórek nowotworowych wzdłuż wypustek neurytów.
- Zbadanie wpływu aktywności neuronów, wieku i genotypu na interakcje z guzem.
Zastosowane metody
- Tworzenie trójwymiarowych eksplantów zwojów korzeni grzbietowych.
- Rozwijanie dwuwymiarowych kultur dysocjowanych neuronów.
- Obrazowanie wysokotreściowe (high-content imaging) w celu analizy wzrostu neurytów i inwazji komórek nowotworowych.
- Zbieranie sparowanych danych na poziomie tkanki i pojedynczych komórek z jednej myszy.
Główne wyniki
- Pomyślne ustanowienie kultur DRG w układach 3D i 2D.
- Wykazanie zwiększonej inwazji komórek nowotworowych wzdłuż wypustek neurytów.
- Identyfikacja czynników z DRG, które mogą napędzać inwazję guza.
- Wskazanie potencjału ukierunkowania terapii na receptory czynników neurotroficznych.
Wnioski
- Opracowane modele stanowią odtwarzalną platformę do badania interakcji między guzem a nerwami.
- Uzyskane informacje mogą pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych ograniczających rozprzestrzenianie się nowotworu.
- Przyszłe badania mogą zgłębiać rolę czynników neuronalnych w biologii raka.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Utworzenie hodowli zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w formacie 3D i 2D umożliwia zespołom biofarmaceutycznym badanie interakcji między rakiem a nerwami z wysoką precyzją, co wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego na styku onkologii i neurobiologii. Te komplementarne modele in vitro ułatwiają prognostyczną ocenę migracji guza sterowanej przez neurony oraz pozwalają na rzetelne porównanie strategii interwencyjnych nakierowanych na ograniczanie rozsiewu nowotworu wzdłuż nerwów. Podejście to zwiększa ciągłość translacyjną poprzez integrację danych na poziomie tkankowym i pojedynczych komórek z jednego eksperymentu, co optymalizuje wykorzystanie zasobów i proces podejmowania decyzji w zakresie portfolio.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę oddziaływań między nowotworem a neuronami w celu wyjaśnienia mechanizmów napędzających inwazję guza.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez wizualizację migracji komórek nowotworowych kierowanej przez neuryty w kontrolowanych środowiskach.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez rozróżnienie wpływu aktywności neuronalnej, wieku oraz genotypu na rozprzestrzenianie się nowotworu.
- Zapewnia platformę do testowania hipotez dotyczących zaangażowania receptorów czynników neurotroficznych w dysseminację nowotworu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane układy kokultur do ilościowej oceny wypustek neurytów oraz ruchliwości komórek nowotworowych.
- Umożliwia powtarzalne obrazowanie wysokotreściowe (high-content imaging) do standaryzowanej oceny wpływu związków na interakcje między nerwami a nowotworem.
- Wspiera skalowalność testu i ponowne wykorzystanie platformy poprzez generowanie modeli 3D i 2D z jednego źródła zwierzęcego.
- Ułatwia wiarygodne przesiewanie strategii molekularnych mających na celu przerwanie migracji nowotworów kierowanej przez nerwy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki in vitro z mechanizmami inwazji neuralnej istotnymi dla rozwoju choroby, obserwowanymi w agresywnych nowotworach.
- Umożliwia dostosowanie ryzyka podczas rozwoju kandydatów terapeutycznych celujących w interakcje między nerwem a guzem.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez integrację odczytów na poziomie komórkowym i tkankowym.
- Stanowi podstawę do identyfikacji biomarkerów związanych z rozprzestrzenianiem się guza za pośrednictwem nerwów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda podwójnej hodowli DRG stanowi pomost pomiędzy wczesną fazą odkrywania a badaniami przedklinicznymi, wspierając identyfikację wiodących kandydatów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w portfelach onkologicznych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących sygnalizacji neurotroficznej i ścieżek inwazji komórek nowotworowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki do porównywania efektów interwencji w zakresie wzrostu neurytów i migracji guza.
- Analityka: Umożliwia obrazowanie wysokotreściowe (high-content imaging) i statystyczne porównanie warunków kokultury.
- Badania translacyjne: Łączy dane o interakcjach nerw-nowotwór in vitro z modelami progresji choroby in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zapewnia standaryzowaną, skalowalną platformę do prowadzenia ciągłych badań mechanistycznych i przesiewowych w ramach programów onkologicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji punktów uchwytu oraz zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w interakcjach między nowotworem a nerwami.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów interakcji nerw-guz.
- Wartość strategiczna: Wspiera świadome podejmowanie decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywną kapitałowo priorytetyzację zasobów onkologicznych ukierunkowanych na układ nerwowy.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowany do ryzyka postęp oraz porównywanie międzyprogramowe strategii terapeutycznych celujących w inwazję neuralną.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach hodowli komórek nowotworowych i neuronalnych.
- Wymaga dostępu do infrastruktury obrazowania wysokotreściowego (high-content imaging) oraz analizy ilościowej.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów kokultury oraz odczytów pomiędzy zespołami.
- Możlizna jest konieczność adaptacji dla różnych typów komórek nowotworowych lub tła genetycznego.
- Wydajność otrzymywania DRG i wzrostu neurytów może różnić się w zależności od wieku zwierząt oraz warunków suplementacji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:26
Dissection of Mouse Spinal Column and Isolation of Dorsal Root Ganglia for In Vitro Culture
3:50
Whole Mount Dorsal Root Ganglion Culture
5:09
Enzymatic and Mechanical Dissociation of Mouse Dorsal Root Ganglia for Primary Cell Culture
8:08
Establishing Co-Culture Systems of Dorsal Root Ganglia and Cancer Cells
9:16
Results
